ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В КАЧЕСТВЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ Российский патент 2020 года по МПК A61K38/46 A61P25/16 A61P25/28 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/165255, поданной 22 мая 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к применению фермента дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) для ингибирования прогрессирования и для предотвращения и лечения нейродегенерации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Нейродегенерация представляет собой отдельное клиническое патологическое состояние с прогрессирующей потерей структуры и/или функции нейронов, включая гибель нейронов. Молекулярные пути, приводящие к нейродегенерации, в большой степени определяются заболеванием (например, накопление аномально сложенных амилоидных бета- и тау-белков в головном мозге у пациентов с болезнью Альцгеймера, накопление альфа-синуклеина при болезни Паркинсона, накопление мутантного хантингтина при болезни Хантингтона, накопление TDP-43 и FUS-белковых агрегатов при боковом амиотрофическом склерозе (ALS), накопление мутаций митохондриальной ДНК и нарушение механики деления митохондрий при старении) и приводят к гибели нейронов на поздних стадиях прогрессирования заболевания. Запрограммированная гибель клеток, включая апоптоз, по всей видимости играет ключевую роль в прогрессировании нейродегенерации на поздней стадии заболевания, о чем свидетельствуют исследования на животных моделях и клеточных линиях (Radi Е. и др., J. Alzheimers Dis. 2014; 42).

Заболевания, включающие связанные с нейродегенерацией клинические проявления, затрагивают почти 30 миллионов человек и приводят к инвалидности и смерти. Нейродегенерация обычно приводит к прогрессирующей дисфункции нервной системы и часто ассоциирована с атрофией пораженных заболеванием центральных или периферических структур нервной системы. Нейродегенерация ассоциирована с большой группой неврологических состояний с гетерогенными клиническими и патологическими проявлениями, затрагивающими специфические подмножества нейронов в конкретных функциональных анатомических системах. Ниже приводится неограничивающий список нарушений, при которых нейродегенерация оказывает значительное влияние на клиническую и патологическую картину:

- Болезнь Альцгеймера

- Сенильная деменция (старческое слабоумие) альцгеймеровского типа

- Болезнь Пика (лобарная атрофия)

- Болезнь Хантингтона

- Множественная системная атрофия, сочетающая деменцию с атаксией и/или проявлениями болезни Паркинсона

- Прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-Ричардсона-Ольшевского)

- Болезнь диффузных телец Леви

- Кортико-базальная дегенерация

- Болезнь Галлервордена-Шпатца

- Прогрессирующая семейная миоклоническая эпилепсия

- Дрожательный паралич (болезнь Паркинсона)

- Стриатонигральная дегенерация

- Прогрессирующий супрануклеарный паралич

- Торсионная дистопия (торсионный спазм, деформирующая мышечная дистопия)

- Спастическая кривошея и другие дискинезии

- Семейный тремор

- Синдром Жиля де ла Туретта

- Дегенерация коры мозжечка

- Оливопонтоцеребеллярная атрофия (ОРСА)

- Спиноцеребеллярная дегенерация (атаксия Фридрейха и связанные с ней нарушения)

- Синдром центральной недостаточности вегетативной нервной системы (синдром Шая-Дрейджера)

- Боковой амиотрофический склероз

- Спинальная мышечная атрофия

- Первичный боковой склероз

- Наследственная спастическая параплегия

- Перонеальная мышечная атрофия (болезнь Шарко-Мари-Тута)

- Гипертрофическая интерстициальная полиневропатия (синдром Дежерина-Сотта)

- Различные формы хронической прогрессирующей невропатии

- Пигментная дегенерация сетчатки (пигментный ретинит)

- Наследственная атрофия зрительного нерва (болезнь Лебера)

- Биполярное расстройство

- Эпилепсия

- Мигрень

- Шизофрения

Традиционно поиски новых методов лечения нейродегенерации были сфокусированы на модуляции молекулярных путей внутри нервных клеток для предотвращения гибели нервных клеток и улучшения функциональности нервных клеток. Активаторы гистонацетилтрансферазы (патент США №20150119466), ингибиторы циклинзависимой протеинкиназы 5 (патент США №20150119348), миметики нейротрофинов (патент США №20150111903), блокаторы семафорин-40 (патент США №20150110800), ингибиторы микросомальной простагландин Е-синтазы-1 (патент США №20150087646), ингибиторы рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) были предложены в качестве подходящих агентов при лечении нейродегенеративных нарушений. Ингибитор NMDA-рецептора, мемантин, применяли в клинической практике для лечения многих нейродегенеративных нарушений, включая болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезни Паркинсона и Хантингтона. Мемантин также представляет собой перспективное средство для лечения других заболеваний, ассоциированных с чрезмерной активацией NMDA-рецептора в центральной нервной системе (ЦНС), включая глаукому, рассеянный склероз, эпилепсию и нейропатию (J. Johnson и др., Current Opinion in Pharmacology, 2006, том 6. стр. 61-67).

Циркулирующие внеклеточные (также называемые «бесклеточные») нуклеиновые кислоты были обнаружены более 60 лет назад (Anker P., Circulating DNA in plasma or serum. Clin. Chim. Acta. 2001; 313(1-2): 143-6). Уровни ДНК в образцах нормальной (здоровой) плазмы достаточно низкие, их концентрация варьируется от 3,6 до 5,0 нг/мл. Образцы нормальной плазмы в основном содержат фрагменты ДНК в приблизительно 180 п.о., и в гораздо меньшей степени более крупные фрагменты (например, фрагменты в 500 п.о. или более). Циркулирующая внеклеточная ДНК была описана в качестве мишени для терапевтического воздействия при некоторых заболеваниях и состояниях, включая рак, инфекцию, диабет, гиперчувствительность замедленного типа и фертильность (см., например, патенты США №№8916151; 8871200; 8796004; 8710012; 8535663; 8431 123; 8388951; 7612032; PCT/IL 2007/001250; PCT/IB 2013/056321).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано в разделе «Уровень техники», в данной области техники существует значительная потребность в разработке новых композиций и способов лечения нейродегенерации. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие потребности, обеспечивая композиции и способы на основе фермента ДНКазы.

В частности, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации (например, первичной нейродегенерации) у нуждающегося в этом пациента (например, млекопитающее, такое как, человек, или экспериментальная животная модель), включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества фермента ДНКазы.

В соответствующем аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая фермент ДНКазу для применения в предотвращении, лечении и/или ингибировании прогрессирования нейродегенерации (например, первичной нейродегенерации).

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение фермента ДНКазы для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у пациента, нуждающегося в этом.

В одном варианте реализации нейродегенерация ассоциирована с повышенным уровнем внеклеточной ДНК (например, прокариотической и/или человеческой) в крови или спинномозговой жидкости или кишечнике пациента, уровень которой выше контрольного уровня (например, уровня внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике здорового индивидуума соответствующей возрастной группы или среднего уровня внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике нескольких здоровых индивидуумов соответствующей возрастной группы). В одном варианте реализации нейродегенерация ассоциирована с нейродегенеративным нарушением. Неограничивающие примеры охватываемых нейродегенеративных нарушений включают, например, болезнь Альцгеймера (например, болезнь Альцгеймера с поздним началом болезни), болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Хантингтона. В одном варианте реализации нейродегенерация ассоциирована с дисфункцией нервной системы, такой как, например, шизофрения или биполярное расстройство.

В одном варианте реализации терапевтически эффективное количество фермента ДНКазы является достаточным для разрушения указанной внеклеточной ДНК (например, достаточным для уменьшения средней молекулярной массы указанной внеклеточной ДНК (например, измеренной методом гель-электрофореза)) в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике пациента.

В одном варианте реализации указанная ДНКаза представляет собой рекомбинантную ДНКазу. В одном варианте реализации ДНКаза представляет собой ДНКазу I. В одном варианте реализации ДНКаза имеет удлиненный период полувыведения (например, за счет конъюгирования с полисиаловой кислотой или защиты от связывания с актином путем модификации актинсвязывающего сайта, см., например, Gibson и др., (1992) J. Immunol. Methods, 155, 249-256).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ДНКазу вводят внутривенно, подкожно или внутримышечно. В одном конкретном варианте реализации указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день или 0,05-10000 единиц Кунитца (Kunitz) на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

В другом варианте реализации указанную ДНКазу вводят энтерально (например, перорально). В одном конкретном варианте реализации указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день или 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

В еще одном варианте реализации указанную ДНКазу вводят в спинномозговую жидкость. В одном конкретном реализации указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,1 мг в день.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники в нижеследующем описании, формуле изобретения и чертежах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 показано накопление меченной внеклеточной ДНК в паренхиме головного мозга крысы после ее введения в сонную артерию.

На Фигуре 2 показаны электрофореграммы внеклеточной ДНК в крови пациента перед введением ДНКазы (левая колонка) и через месяц после начала лечения ДНКазой (правая колонка).

На Фигурах 3А-В представлены Т1-взвешенные МРТ-изображения (T1 MRI), показывающие атрофию и обширный глиоз левой лобно-теменной области головного мозга пациента с тяжелой болезнью Альцгеймера. Изображения (А) и (В) отображают потерю объема в конечной стадии болезни Альцгеймера с умеренными изменениями в перивентрикулярном белом веществе. (А) Фронтальное Т1 МРТ-изображсние, показывающее выраженную прогрессирующую атрофию коры головного мозга теменных областей. (В) Поперечное Т1 МРТ-изображение, показывающее двустороннюю атрофию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что внеклеточная ДНК (как эукариотическая, так и прокариотическая) присутствует в повышенных уровнях в крови и спинномозговой жидкости (CSF) пациентов, страдающих нейродегенерацией (например, нейродегенерация, ассоциированная с болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Хантингтона, шизофренией и биполярным расстройством), и что указанная внеклеточная ДНК проникает через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) и проявляет токсичность в отношении нейронов. В настоящем документе также продемонстрировано, что введение ферментов ДНКазы приводит к лечению/улучшению нейродегенерации и сопровождается снижением уровня циркулирующей внеклеточной ДНК.

Определения

В контексте настоящего описания термин «нейродегенерация» применяют для обозначения отдельного клинического патологического состояния с прогрессирующей потерей структуры и/или функции нейронов, включая гибель нейронов. Нейродегенерация может быть первичной или вторичной. Неограничивающие примеры заболеваний, включающих первичную нейродегенерацию, включают, например, болезнь Альцгеймера (AD), умеренное когнитивное расстройство (MCI), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), прионные заболевания, лобно-височпую демснцию (FTD), деменцию телец Леви, сосудистые деменции, боковой амиотрофический склероз (ALS), хроническую травматическую энцефалопатию (СТЕ), прогрессирующий супрануклеарный паралич (PSP), множественную системную атрофию (MSA), кортикобазальную дегенерацию (CBGD), болезнь Пика, оливопонтоцеребеллярную атрофию (ОРСА), сенильную деменцию (старческое слабоумие) альцгеймеровского типа, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-Ричардсона-Олыневского), кортикодентатонигральную дегенерацию, болезнь Галлервордена-Шпатца, прогрессирующую семейную миоклоническую эпилепсию, стриатонигральную дегенерацию, торсионную дистопию (например, торсионный спазм, деформирующую мышечную дистонию), спастическую кривошею и другие дискинезии, семейный тремор, синдром Жиля де ла Туретта, дегенерацию коры мозжечка, спиноцеребеллярную дегенерацию (атаксию Фридрейха и связанные с ней нарушения), синдром Шая-Дрейджера. спинальную мышечную атрофию, первичный боковой склероз, наследственную спастическую параплегию, перонеальную мышечную атрофию (болезнь Шарко-Мари-Тута), гипертрофическую интерстициальную полиневропатию (синдром Дежерина-Сотта), хроническую прогрессирующую невропатию, пигментную дегенерацию сетчатки (пигментный ретинит), наследственную атрофию зрительного нерва (болезнь Лебера), биполярное расстройство. Вторичная нейродегенерация вызывается прежде всего некрозом. Неограничивающие примеры состояний, которые могут привести к вторичной нейродегенерации, включают разрушение нейронов в результате новообразования, отека, кровоизлияния, инсульта, травмы, иммунной атаки, гипоксии, отравления, метаболических дефектов и инфекций.

Термины «внеклеточная ДНК» и «бесклеточная ДНК» применяют взаимозаменяемо для обозначения внеклеточной ДНК (эукариотического или прокариотического происхождения), обнаруживаемой в крови, спинномозговой жидкости (CSF) или кишечнике пациента.

В контексте настоящего описания термины «дезоксирибонуклеаза» и «ДНКаза» применяют для обозначения любого фермента, который катализирует гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в остове ДНК. Известно широкое разнообразие дезоксирибонуклеаз, и их можно применять в способах согласно настоящему изобретению. Неограничивающие примеры подходящих ДНКаз включают, например, ДНКазу I (например, человеческую рекомбинантную ДНКазу I или ДНКазу I из поджелудочной железы быка), аналоги ДНКазы I (такие как, например, ДНКаза X, ДНКаза гамма и DNAS1L2), ДНКазу II, фосфодиэстеразу I, лактоферрин и ацетилхолинэстеразу. ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК по фосфодиэфирным связям вблизи пиримидинового нуклеотида, что приводит к образованию полинуклеотидов с концевым 5'-фосфатом и со свободной гидроксильной группой в 3'-положении, в среднем образуются тетрануклеотиды. ДНКаза I действует на одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК и хроматин.

Термин «приблизительно» для конкретного значения означает, что он «находится в допустимом диапазоне погрешностей», определяемом специалистом в данной области техники, что будет частично зависеть от того, как измеряется или определяется значение, т.е., от ограничений измерительной системы. Например, «приблизительно» может означать «находится в пределах среднеквадратичного отклонения» согласно практике в данной области техники. В альтернативном варианте термин «приблизительно» может означать диапазон вплоть до ±20%, в предпочтительном варианте вплоть до ±10%, в более предпочтительном варианте вплоть до ±5% и в более предпочтительном варианте еще вплоть до ±1% от заданного значения. В альтернативном варианте, в особенности в отношении биологических систем или процессов, указанный термин может означать «в порядке величины», в предпочтительном варианте в 2-кратном значении. Если конкретные значения описаны в заявке и формуле изобретения, до тех пор, пока не указано иное термин «приблизительно» является неявным и в данном контексте означает, что конкретное значение находится в допустимом диапазоне погрешностей.

В контексте настоящего изобретения, поскольку оно относится к нейродегенерации или какому-либо из конкретных болезненных состояний, указанных в настоящем документе, термины «лечить», «лечение» и им подобные означают облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление прогрессирования такого состояния или его регресс. По смыслу настоящего изобретения термин «лечить» также обозначает остановку, задержку начала заболевания (т.е. период до клинического проявления заболевания) и/или снижение риска развития или ухудшения заболевания.

В контексте настоящего описания термин «терапевтически эффективный», применяемый к дозе или количеству, относится к такому количеству соединения или фармацевтической композиции, которое является достаточным для достижения желаемой активности при введении субъекту, нуждающемуся в этом. В контексте настоящего изобретения, в том случае, когда термин «терапевтически эффективный» используют в отношении применения дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации или конкретного заболевания, ассоциированного с указанной нейродегенерацией, он относится к количеству ДНКазы или фармацевтической композиции, содержащей ДНКазу, которая эффективна для облегчения или ослабления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с нейродегенерацией или таким заболеванием, или замедления прогрессирования нейродегенерации или такого заболевания или их регресса. Следует отметить, что в случае введения комбинации активных ингредиентов (например, комбинации ДНКазы и другого соединения, эффективного для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования заболевания, ассоциированного с нейродегенерацией) эффективное количество указанной комбинации может включать или не включать количества каждого ингредиента, которые были бы эффективны при их индивидуальном введении.

Фраза «фармацевтически приемлемый», применяемая применительно к композициям согласно настоящему изобретению, относится к молекулярным объектам и другим ингредиентам таких композиций, которые переносимы с физиологической точки зрения и обычно не приводят к неблагоприятным реакциям при введении субъекту (например, млекопитающему, такому как человек). В предпочтительном варианте в контексте настоящего описания термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительством штата или внесенный в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для применения у млекопитающих и, более конкретно, у людей.

В контексте настоящего описания термины «субъект» и «пациент» относятся к любому млекопитающему. В предпочтительном варианте реализации указанный субъект/пациент представляет собой человека.

В контексте настоящего описания и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественные ссылки в том случае, если контекст явно не указывает на иное.

В соответствии с настоящим изобретением можно применять обычные методы фармакологии и молекулярной биологии в рамках уровня техники. Полное объяснение таких методов приводится в литературе. Среди прочих, см., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк (здесь «Sambrook и др., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, Тома I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins cds. (1985)); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986»; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel и др. (cds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Терапевтические способы согласно настоящему изобретению

Как ниже показано в разделе «Примеры», уровень как прокариотической, так и эукариотической внеклеточной ДНК в крови и спинномозговой жидкости увеличивается с ухудшением неврологического статуса у пациентов с сенильной деменцией (старческим слабоумием), болезнями Паркинсона и Альцгеймера. В контексте настоящего документа также показано, что значительная часть внеклеточной ДНК в крови и CSF представляет собой кишечную бактериальную ДНК (например, полученную из желудочно-кишечной микробиоты). Следовательно, мониторинг внеклеточной ДНК эукариотического или прокариотического происхождения может быть подходящим для прогнозирования или отслеживания прогрессирования нейродегенерации. Мониторинг может включать, например, одно или более из следующего: определение количества внеклеточной ДНК, определение типа внеклеточной ДНК (прокариотический или эукариотический. например, определенный на основе pPHK), определение наличия и/или количества специфичных фрагментов ДНК (например, CpG-мотивов. CpG-подобных мотивов, гиперконсервативных областей 16S, rpoD, например, определенные с применением ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR) или метагеномного анализа).

В настоящем документе также описано, что внеклеточная ДНК, полученная из кишечника, крови и CSF пациентов, страдающих нейродегенеративными нарушениями, может преодолевать гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Это неожиданно, поскольку ВВВ всегда считался непроницаемым для крупных молекул нуклеиновых кислот (Evers MM. Antisense oligonucleotides in therapy for neurodegenerative disorders. Adv. Drug Deliv. Rev. 2015).

В настоящем документе также описано, что внеклеточная ДНК, полученная из кишечника, крови и CSF пациентов, страдающих нейродегенерацией, вызывает гибель нервных клеток и апоптоз. Обработка ДНКазой, разрушающей такую внеклеточную ДНК, значительно улучшает функцию нервной системы у этих пациентов. Оценку улучшения проводили согласно общепринятым клинико-диагностическим критериям снижения когнитивных способностей, таким как краткая шкала оценки психического статуса (MMSE), шкала оценки позитивных и негативных синдромов (PANSS), физическая функция и/или функциональные задачи (см., например, Holmes и др., (1999) The British Journal of Psychiatry, 174 (1), 45-50, Os и др., (2006) Acta Psychiatrica Scandinavica, 113 (2), 91-95: и др., (2002) Physical therapy, 82 (9), 888-897; Rochester и др., (2004) 85 (10), 1578-1585).

В одном аспекте настоящего изобретение предложен способ предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у субъекта, нуждающегося в этом, причем данный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества фермента ДНКазы (например, ДНКазы I, аналогов ДНКазы 1 [таких как, например, ДНКаза X, ДНКаза гамма, DNAS1L2], ДНКазы II, фосфодиэстеразы I, лактоферрина или ацетилхолинэстеразы), при этом указанное количество фермента ДНКазы эффективно для предотвращения или улучшения по меньшей мере одного симптома нейродегенерации.

Дозы ДНКазы, подходящие для применения в способах согласно настоящему изобретению, зависят от тяжести и течения нейродегенерации, предшествующей или текущей терапии, истории болезни пациента и реакции на ДНКазу, а также определяются на усмотрение лечащего врача. В предпочтительном варианте такие дозы составляли от 0,5 до 20 мг/кг/день или от 500 до 20000 единиц Кунитца (KU)/кг/день.

Введение фермента ДНКазы согласно способам настоящего изобретения можно осуществить любым подходящим путем. Конкретные неограничивающие примеры подходящих путей введения включают внутривенный, подкожный, внутримышечный, доставку в спинномозговую жидкость (CSF), энтеральный (например, пероральный), ректальный (например, через клизму) и интраназальный.

Согласно способам настоящего изобретения ДНКазу можно вводить либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами лечения, подходящими для ингибирования прогрессирования или лечения нейродегенеративных заболеваний или других связанных с нервной системой дисфункций (например, биполярного расстройства, мигрени, шизофрении, эпилепсии). Неограничивающие примеры таких дополнительных средств лечения включают, например, активаторы гистон-ацетилтрансферазы, ингибиторы циклинзависимой протеинкиназы 5, миметики нейротропина, блокаторы семафорин-40, ингибиторы микросомальной простагландин Е-синтазы-1, леводопу и ингибиторы рецептора N-метил-В-аспартата (NMDA) (например, мемантин).

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению

В определенных вариантах реализации фермент ДНКазу можно включить в состав фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом.

Составы, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, могут быть подходящим образом представлены в виде дозированной лекарственной формы, и могут быть получены при помощи способов, известных в данной области техники. Количество активных ингредиентов, которые можно объединять с материалом-носителем для получения единичной дозированной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, получающего лечение, и конкретного способа введения. Количество активных ингредиентов, которые можно объединять с материалом-носителем для получения единичной дозированной лекарственной формы, в целом будет представлять собой такое количество соединения, которое дает терапевтический эффект.

В целом указанные составы могут быть получены с использованием жидкого носителя или тонко измельченного твердого носителя или того и другого, а затем, при необходимости, формованием продукта.

Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать ДНКазу в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые можно восстановить в стерильных растворах для инъекции или дисперсиях непосредственно перед применением, которые могут содержат антиоксиданты, буферы, бактериостатики, растворенные вещества, которые делают указанный состав изотоничным крови предполагаемого реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и им подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, как, например, оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащий уровень текучести можно поддерживать, например, применяя материалы для покрытия, такие как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий, а также применяя поверхностно-активные вещества.

Данные композиции могут также содержать консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение воздействия микроорганизмов можно обеспечить за счет включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенольной сорбиновой кислоты и им подобных. Также может быть желательным включение в композицию изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и им подобных. Кроме того, длительную абсорбцию фармацевтической формы для инъекций можно обеспечить включением замедляющих абсорбцию агентов, как, например, моностеарата алюминия и желатина.

Депо-формы для инъекций можно получить путем формирования микроинкапсулированных матриц одного или более активных ингредиентов в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения активного ингредиента и полимера, а также природы конкретного используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения активного ингредиента. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо-составы для инъекций также получают путем захвата активных ингредиентов в липосомах или микроэмульсиях, которые совместимы с тканями организма.

Составы для перорального введения могут быть в форме капсул, крахмальных капсул, пилюль, таблеток, порошков, гранул или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости (например, в виде жидкости для полоскания рта, в виде композиции для глотания или в виде клизмы), или в виде жидкой эмульсии тина масло-вводе или вода-в-масле и им подобных, каждая из которых содержит заданное количество одного или более активных ингредиентов.

В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулы, таблетки, пилюли, драже, порошки, гранулы и им подобные) один или более активных ингредиентов (например, ДНКаза и необязательно другое соединение для лечения нейродегенеративного заболевания) можно смешивать с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, таким как цитрат натрия или дикальция фосфат, и/или любым из следующего: (1) наполнители или добавки, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или гуммиарабик; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) замедлители образования растворов, такие как парафин; (6) ускорители процесса абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные агенты. Твердые композиции аналогичного типа также можно использовать в качестве наполни] елей в мягких и твердых желатиновых капсулах с применением таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочные сахара, а также полиэтиленгликолей с высокой молекулярной массой и им подобных.

Суспензии, в дополнение к одному или более активным ингредиентам, могут содержать суспендирующие агенты, как, например, этоксилированные изостсариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сорбитановые эфиры, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант и их смеси.

Содержащие ДНКазу композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать агенты, которые способствуют доставке ДНКазы через гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Неограничивающие примеры таких подходящих агентов включают, например, имплантируемый резервуар (резервуар Омайя), агенты для полисиализации ДНКазы, функционализированные наноносители (например, наночастицы, покрытые антителами против трансферрина или рецептора трансферрина [TR]), экзосомы, липосомы (например, липосомы, покрытые молекулами для нацеливания, как, например, антителами, липосомы, выполняющие роль «троянского коня» (THL)), антитела (например, антитела против рецептора трансферрина [TR] или рецептора инсулина [HIR], однодоменные антитела (sdAb) Llama, способные к миграции в ВВВ), химерные пептиды (например, ангиопепы (angiopep), полученные из белков, экспрессирующих Kunitz-домен), белки 1 и 2, родственные рецепторам липопротеинов низкой плотности (LRP-1 и 2), рецепторы дифтерийного токсина (DTR), стволовые клетки мезенхимы, ассоциированный с рецептором белок, аполипопротеин Е, меланотрансферрин/р97 и т.п.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение также описывается и демонстрируется при помощи следующих примеров. Однако использование этих и других примеров в любом месте описания изобретения является только иллюстративным и никоим образом не ограничивает объем и значение настоящего изобретения или какого-либо приводимого в качестве примера термина. Аналогичным образом, настоящее изобретение не ограничивается какими-либо конкретными предпочтительными вариантами реализации, описанными в настоящем документе. В действительности многие модификации и вариации изобретения могут быть очевидны для специалистов в данной области техники после прочтения этого описания изобретения, и такие вариации можно осуществить без отступления от сущности или объема настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение будет ограничиваться только положениями прилагаемой формулы изобретения совместно с полным объемом эквивалентов, которые охвачены данной формулой изобретения.

Пример 1. Полученная из крови и спинномозговой жидкости (CSF) внеклеточная циркулирующая ДНК способствует гибели нервных клеток

Для получения культур нейронов, у эмбрионов крысы Sprague Dawley удаляли кору головного мозга на 15-17 день эмбрионального развития (Е). Эксплантаты коры головного мозга разрезали на кусочки размером приблизительно 200-400 мкм² с применением тонких игл и диссоциировали при помощи Papain Dissociation System (Worthington Biochemicals) согласно инструкциям производителя, и далее хранили в ледяной минимальной эссенциальной среде (Gibco). Нейроны накрывали стеклянными покровными стеклами диаметром 13 мм, которые сначала покрывали поли-D-лизином (10 мкг/мл в ФСБ), а затем ламинином (10 мкг/мл в ФСБ) (Gibco), и культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере 8% СО₂ (об./об.) в течение 24-48 часов в нейробазальной среде с 1% (об./об.). смесью антибиотик-антимикотик (Gibco).

Внеклеточную ДНК экстрагировали из плазмы и CSF пациента с тяжелой стадией болезни Альцгеймера, применяя набор циркулирующих нуклеиновых кислот QIΛamp согласно инструкциям производителя. Для того, чтобы оценить биологическое воздействие такой внеклеточной ДНК на нейроны, образцы внеклеточной ДНК добавляли к культурам нейронов коры головного мозга. Гибель нервных клеток определяли в культуре диссоциированных нейронов коры головного мозга, культивируемых в течение 48 часов. После начального периода образцы внеклеточной ДНК (уровни дозы 100 и 200 мкг/мл) применяли еще в течение 24 часов. Гибель нервных клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности CytoTox-Glo™ (Promega). Люминесценцию, пропорциональную количеству погибших клеток, измеряли с применением люминометра Promega GloMax 96 и выражали в относительных единицах люминесценции (RLU).

Индукцию маркера апоптоза каспазы 3 определяли в культуре диссоциированных нейронов коры головного мозга, культивируемых в течение 48 часов. После начального периода образцы внеклеточной ДНК (уровни дозы 100 и 200 мкг/мл) применяли еще в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали в 4% (масс/об.) параформальдегиде (PFA) и инкубировали в течение 1 часа с расщепленным антителом против каспазы 3 (Abeam), разбавленным в соотношении 1:500 в ФСБ. Клетки промывали и инкубировали в течение 1 часа с поликлональными антителами козы к антителам кролика, конъюгированными с Alexa Fluor 488, против каспазы 3 (Invitrogen) в ФСБ перед промывкой и подсчетом.

* Применяемая ДНКаза I представляла собой человеческую рекомбинантиую ДНКАЗУ 1 производства компании Catalent (Мадисон, США)

Из данных, приведенных в Таблице 1, следует, что внеклеточная ДНК, полученная как из крови, так и из CSF индуцирует цитотоксичность и повышающую регуляцию маркера апоптоза каспазы 3 в культивируемых нейронах дозозависимым образом. ДНКаза I защищает нейроны от токсичности, вызванной внеклеточной ДНК.

Пример 2. Оценка бактериальной внеклеточной ДНК в крови и CSF пациента с болезнью Альцгеймера

Внеклеточную ДНК экстрагировали из плазмы и CSF пациента с тяжелой стадией болезни Альцгеймера и здорового добровольца (из соответствующей половозрастной группы) с применением набора циркулирующих нуклеиновых кислот QIAamp согласно инструкциям производителя. Количественную оценку бактериальной внеклеточной ДНК проводили, применяя ПЦР-анализатор реального времени CFX96 Touch™. Авторы настоящего изобретения применяли универсальные ПЦР-праймеры с использованием бактериальной ДНК 1369F и 1492R (бактериальная 16S pPHK).

Пороговые циклы представлены в таблице ниже:

Как следует из данных Таблицы 2, сыворотка и CSF пациента с тяжелой стадией болезни Альцгеймера содержат значительно большее количество бактериальной ДНК по сравнению со здоровым добровольцем.

Пример 3. Полученная из крови внеклеточная циркулирующая ДНК проникает через гематоэнцефалический барьер

Внеклеточную ДНК экстрагировали из плазмы пациента с диагнозом сен ильная деменция (старческое слабоумие), применяя набор циркулирующих нуклеиновых кислот QIAamp. Йодирование внеклеточной ДНК проводили с применением реагента Iodo-Gen, описанного у Piatyszek А. и др., Analytical Biochemistry, 1988, том 172. стр. 356-359). Специфическая активность меченой внеклеточной ДНК составляла приблизительно 30 мкКи/мкг. Полученную меченую внеклеточную ДНК в 1 мл раствора ФСБ (приблизительно 3,0 мкКи, 100 нг) медленно вводили (0,1 мл/мин) в сонную артерию анестезированной самки крысы Sprague Dawley. Через час крысу умерщвляли при помощи хлороформа, удаляли мозг и фиксировали его в растворе формалина. Парафиновые срезы окрашивали эмульсией Ilford L4. Накопление меченой внеклеточной ДНК в головном мозге изучали с применением стандартной визуальной гистоавторадиографической методики (Фигура 1). Накопление введенной при помощи инъекции внеклеточной ДНК в паренхиме головного мозга крысы указывает на то, что она проникает через гематоэнцефалический барьер (ВВВ).

Пример 4. Применение ДНКазы для лечения сенильной деменции (старческого слабоумия)

Пациент К., 72 года, мужчина, у которого 4 года назад диагностировали сенильную деменцию (старческое слабоумие) с постепенным развитием брадикинезии, ухудшением кратковременной памяти и внимания. Постепенно развивались следующие симптомы: аспонтанность, отсутствие инициативы, эмоциональная лабильность, сонливость. В течение 3 лет этот пациент принимал препарат леводопа. Наблюдался умеренный положительный эффект. Однако в течение последних 18 месяцев предшествующие симптомы стали более выраженными, также проявились гипокинезия и постуральные расстройства.

Пациенту вводили ДНКазу I из поджелудочной железы быка (Samson Med, Россия) в количестве 2500 единиц Кунитца/кг три раза в день перорально в капсулах. Эффективность лечения ДНКазой оценивали при помощи краткой шкалы оценки психического статуса (MMSE) на 14 и 30 день. Результаты исследования показаны в Таблице 3.

ДНК из полученной от указанного пациента плазмы крови человека определяли количественно с применением ПЦР-анализа в реальном времени (RT-PCR) для трех различных маркерных последовательностей: ALU (Л), c-MYC и b-GLOB (ALU-праймер представлял собой , ираймер c-MYC представлял собой , праймер b-GLOB представлял собой за два месяца до лечения ДНКазой и непосредственно перед началом лечения ДНКазой. Ниже в таблице представлены пороговые циклы.

Электрофореграммы (с применением агарозных гелей) полученной из крови пациента внеклеточной ДНК перед лечением ДНКазой (левая колонка) и через один месяц после начала лечения (правая колонка) представлены на Фигуре 2.

Как это показано выше, прогрессирование клинических симптомов у пациента с сенильной деменцией (старческим слабоумием) сопровождается повышением уровня циркулирующей внеклеточной ДНК в крови. Лечение ДНКазой, разрушающей внеклеточную ДНК в крови, оказывает положительный клинический эффект на симптомы деменции.

Пример 5. Уменьшение обострения биполярного расстройства с применением ДНКазы

Пациент: М., 63 года, мужчина. Диагноз: первичная болезнь - обострение биполярного расстройства, маниакальный эпизод. В начале лечения жаловался на раздражительность, желание закричать, ночные кошмары. Экспертиза показала, что этот пациент был очень активным, внезапно выходил из комнаты, проявлял расторможенность (постоянно задавал вопросы, часто мог начать петь) и раздражительность (легко раздражался при повторяющихся вопросах).

До начала лечения ДНКазой общий показатель оценки с применением описывающего возбуждение компонента шкалы оценки позитивных и негативных синдромов (PANSS-EC) составил 29. Пациент получал однократную внутривенную инъекцию человеческой рекомбинантной ДНКазы I (Catalent, Мадисон, США) в количестве 50 единиц Кунитца/кг в течение 3 часов. После лечения ДНКазой наблюдали значимое облегчение симптомов, общий балл по шкале PANSS-EC составил 8, психомоторного возбуждения не наблюдали.

Таким образом, введение ДНКазы оказывает положительный эффект при лечении обострения биполярного расстройства.

Пример 6. Применение ДНКазы для лечения шизофрении

Пациент: Л., 38 лет, женщина. Диагноз: шизофрения, параноидальный тип, пароксизмальное течение заболевания, параноидально-галлюцинаторный синдром. До лечения ДНКазой этот пациент жаловался на то, что слышал голоса «внутри своей головы», она также считала, что ее коллеги пытались ее отравить. Пациент сидел в неестественной позе, также наблюдался выраженный тремор верхних конечностей, тремор ослабевал при движении. Были обнаружены эмоциональные нарушения, а также нарушения мыслительного процесса (его соскальзывание, замедленное мышление, нелогичность). Общий показатель оценки с применением шкалы оценки позитивных и негативных синдромов (PANSS) составил 24 и 22 соответственно.

Пациент принимал ДНКазу I из поджелудочной железы быка (Samson Med, Россия) перорально в капсулах в количестве 3000 единиц Кунитца (KU)/кг три раза в день. Результаты исследования показаны в Таблице 5.

Таким образом, введение ДНКазы оказывает положительный эффект при лечении шизофрении.

Пример 7. Применение ДНКазы для лечения болезни Альцгеймера

Пациент Г. в возрасте 77 лет, мужчина. У этого пациента диагностировали болезнь Альцгеймера на основании клинических данных и характеристических изменений МРТ. Начиная с 14 месяца после постановки диагноза, пациент начал принимать мемантин. Тем не менее, клинические симптомы продолжали ухудшаться: прогрессировало ухудшение памяти, начинали проявляться нарушения речи и координации, а также дезориентация. К 20 месяцу после постановки диагноза у пациента прогрессировали все вышеупомянутые симптомы, и он перестал самостоятельно передвигаться. К началу введения ДНКазы, этот пациент находился в ступоре, также наблюдали недержание мочи и фекалий.

ДНКазу I из поджелудочной железы быка (Samson Med, Россия) вводили перорально в капсулах в количестве 4000 единиц Кунитца/кг три раза в сутки. Эффективность оценивали с применением краткой шкалы оценки психического статуса MMSE на 5 и 30 дней после начала лечения ДНКазой. Результаты исследования показаны в Таблице 6.

ДНК из полученной от указанного пациента плазмы крови человека определяли количественно с применением обычного ПЦР-анализа в реальном времени (RT-PCR) для трех различных маркерных последовательностей: ALU (J1), c-MYC и b-GLOB (ALU-праймер представлял собой , ираймер с-MYC представлял собой , праймер b-GLOB представлял собой в общей фракции внеклеточной ДНК пациента за один месяц до лечения ДНКазой, до начала лечения, и через 30 дней после начала лечения ДНКазой. Результаты представлены в Таблице 7.

Уже на 5 день после начала лечения ДНКазой наблюдали значимое улучшение когнитивных функций. Речь и мышление вернулись к нормальному уровню, пациент смог вставать, одеваться и ходить без посторонней помощи.

Таким образом, введение ДНКазы оказывает положительный эффект на лечение болезни Альцгеймера. Положительный клинический эффект лечения ДНКазой развивается наряду с уменьшением уровня циркулирующей внеклеточной ДНК в крови.

Пример 8. Применение ДНКазы для лечения варианта болезни Альцгеймера с тельцами Леви

У 77-летнего мужчины европеоидной расы за 30 месяцев до его появления в клинике была диагностирована деменция, вторичная на фоне позднего начала болезни Альцгеймера, проявляющаяся через поведенческие расстройства, снижение когнитивных способностей и снижение способности заниматься повседневной жизнью. Примерно через 14 месяцев после первоначального диагноза, этот пациент начал получать лечение мемантином в количестве 10 мг в день (Reisberg и др., N. Engl. J. Med., 2003; 348: 1333-1341; Danysz и др., Br. J. Pharmacol., 2012; 167: 324-352), хотя его когнитивное состояние продолжало ухудшаться, быстро прогрессируя и включая такие поведенческие изменения, как агрессивность и расторможенность, в дополнение к прогрессирующему амнестическому синдрому, афазии, брадикинезии, шаркающей походке, потере равновесия и недержанию мочи. Кроме того, у пациента наблюдали 20-фунтовую потерю массы тела (приблизительно 9 кг), что обычно свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (Soto и др., Journal of Alzheimer's Disease (2012) 28: 647-654, Soto и др., J. Am. Geriatr. Soc., 2015; 63: 651-658; White и др., J. Am. Geriatr. Soc. 1998; 46: 1223-1227). Анализ MPT-изображений черепа показал возрастные потери объема и умеренные изменения в перивентрикулярном белом веществе (Фигуры 3А-В).

Через тринадцать месяцев после начала лечения мемантином общие показатели пациента по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE) и функциональной оценке определения стадии заболевания (FAST-тест) составляли 10 и 5 баллов соответственно. Пациент потерял баллы по показателям ориентации во времени и пространстве, вниманию, памяти и способности к визуально-пространственному построению, и он заметно медленнее выполнял такие задачи. Пациент испытывал дополнительную трудность в определении поворотов и углов при ходьбе, что приводило к его неоднократным падениям, у него проявлялись колебания уровня сознания с чередованием периодов откровенной спутанности и ясности. Однако он не испытывал зрительных или слуховых галлюцинаций.

Еще три месяца спустя, и в общей сложности через 16 месяцев после начала лечения мемантином, у пациента наблюдали дальнейшее ухудшение когнитивной функции. У пациента колебался уровень сознания. Его когнитивные способности колебались между периодами откровенной спутанности и ясности, однако у него не было визуальных или слуховых галлюцинаций. Он не мог вспомнить свое имя, дату, день недели, год или место и не мог узнать членов семьи. Дополнительные нарушения включали невнятную речь, экспрессивную афазию, потерю контроля над кишечником/мочевым пузырем и отсутствие координации, отмеченной неспособностью сидеть, стоять или ходить без посторонней помощи. Указанный пациент стал невосприимчив к стимулам, и показатели по шкале MMSE и FAST-тесту составляли 3 и 7 соответственно.

Через месяц родственники пациента предоставили информированное согласие на его лечение человеческой рекомбинантной ДНКазой I (1500 KU/мг, Samson Med, Россия) в количестве 40 мг, получаемой перорально 3 раза в день в сочетании с непрерывной терапией с применением мемантина (10 мг в день). ДНКаза 1 хорошо переносилась, и никаких неблагоприятных или непредвиденных явлений зарегистрировано не было.

Пациент продемонстрировал значительное улучшение когнитивных способностей, начиная со второго дня лечения ДНКазой I, стал частично ориентироваться во времени и пространстве и снова стал узнавать и запоминать имена членов семьи. Он также мог самостоятельно одеваться, в том числе завязывать шнурки и застегивать пуговицы, а также самостоятельно прогуливаться, есть и ездить на велосипеде. Неврологические аномалии, влияющие на походку, были значительно снижены. Его показатель по шкале MMSE резко возрос с 3 до 16, а его показатель по FAST-тесту снизился с 7 до 5. Однако он продолжал набирать минимальные оценки по шкале MMSE по показателям ориентации во времени и пространстве, памяти и способности к визуально-пространственному построению.

Через два месяца после начала лечения ДНКазой I (через 19 месяцев после начала лечения мемантином), у указанного пациента показатель но шкале MMSE составлял 18, а по FAST-тесту - 4. Наблюдали умеренные улучшения в памяти, хотя способность к визуально-пространственному построению продолжала снижаться. Он лучше говорил и общался с другими, лучше узнавал родственников и мог активно воспринимать телевизионные программы. Пациент также мог производить вычисления, играть на фортепиано, играть в шахматы и самостоятельно ходить.

Вышеприведенные данные показывают, что введение ДНКазы оказывает положительный эффект на лечение болезни Альцгеймера. Лечение ДНКазой I в данном случае позволило пациенту выйти из предсмертного (терминального) состояния, и привело к значимым улучшениям когнитивной и поведенческой функции, включая способность ходить и почти самостоятельно выполнять повседневные задачи. Значимое восстановление наблюдали во всех областях когнитивной и двигательной функции, что указывало на возможность присутствия чувствительной к ДНКазе мишени, участвующей в образовании симптомов болезни Альцгеймера. Одна из таких мишеней может представлять собой внеклеточную ДНК, включая ДНК, полученную из бактерий (Holdenrieder и др., Clin. Chem., 2005; 51: 1544-1546).

Пример 9. Применение ДНКазы для лечения болезни Паркинсона

Пациент С., возраст 58 лет, женщина, страдает болезнью Паркинсона на протяжении 7 лет. За последние 5 лет она получала лечение препаратом леводопа. За месяц до начала исследования наблюдали значимое ухудшение состояния пациента, а именно: значимое увеличение тремора правой руки, появление непроизвольных движений рук в виде распространенного хореоатетоза, ригидность конечностей, затруднение при подъеме с кровати по утрам, частое ночное мочеиспускание (6-7 раз).

Пациент начал перорально принимать ДНКазу I из поджелудочной железы быка (Samson Med, Россия) в капсулах в количестве 1500 единиц Кунитца/кг три раза в день. Оценку проводили с применением единой рейтинговой шкалы оценки болезни Паркинсона (UPDRS), наблюдение проводили в течение 6 месяцев.

ДНК из полученной от пациента плазмы крови человека определяли количественно с применением обычного ПЦР-анализа в реальном времени (RT-PCR) для ALU-последовательности в общей фракции внеклеточной ДНК пациента за один месяц до лечения ДНКазой, непосредственно перед лечением и через 3 месяца после начала лечения. Пороговые циклы представлены в Таблице 8.

К 6 месяцу приема ДНКазы I наблюдали значимое улучшение состояния пациента: уменьшились утренняя акинезия, ригидность движений и тремор рук; количество ночных мочеиспусканий снизилось до одного раза за ночь.

Из этого следует, что введение ДНКазы оказывает положительный эффект на лечение болезни Паркинсона. Этот положительный эффект развивается наряду с уменьшением уровня циркулирующей внеклеточной ДНК в крови.

Пример 10. Применение ДНКазы для лечения бокового амиотрофического склероза

Исследования проводили на мышах с нокаутом фермента супероксиддисмутазы-1 (SOD1), с гиперэкспрессией белка G93A-hSOD1, который является общепринятой моделью бокового амиотрофического склероза (ALS) (Gurney, New England Journal of Medicine, 1994) 331: 1721-1722). Сформировали две группы животных, каждая из которых состояла из 10 животных (Jackson Laboratory, Бар Харбор, штат Мэн). Животных размещали в комнате с 12-часовым световым циклом и обеспечивали свободный доступ к воде и пище. Полисиалированную ДНКазу получали, как описано в публикации PCT/GB 2007/002839. Вкратце: 20-молярный избыток окисленной 26 кДа полисиаловой кислоты (PSA) растворяли в буфере и доводили рН до 6,0. Затем добавляли человеческую рекомбинантную ДНКазу I DNAse (Catalent) и 50 мМ (конечная концентрация) цианоборгидрида натрия, рН повторно доводили до 6,0, а реакционную смесь доводили до требуемого объема. Реакцию проводили при 37±1°C с осторожным встряхиванием в течение 18 часов. Конъюгаты DNAse-PSA очищали с применением метода хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) - матрицы (фенилсефарозы), исходного буфера, содержащего 2,0 М сульфата аммония, элюирования в буфере без сульфата аммония. Элюирующие фракции затем наносили на ионообменную матрицу Q-сефароза Fast Mow и элюировали буфером, содержащим хлорид натрия. Очистку конъюгатов подтверждали методом экслюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC).

Мыши из Группы 1 не получали лечения (контрольная группа); мыши из Группы 2 получали полисиалированную человеческую рекомбинантную ДНКазу I человека в дозе 50 мг/кг подкожно один раз в день. В качестве критерия оценки применяли время выживаемости животных. Результаты показаны в Таблице 9.

Из этого следует, что введение ДНКазы I оказывает положительное влияние на выживаемость мышей, страдающих от ALS.

Пример 11. Применение ДНК для лечения системной атрофии ЦНС

Болезнь Хантингтона выбрали в качестве примера системных атрофий центральной нервной системы. Исследования проводили на трансгенных мышах R6/2, экспрессирующих экзон 1 гена, кодирующего глутамин, который является общепринятой моделью болезни Хантингтона (Miller и др., Neuroscience (2008) 153: 329-337). Сформировали три группы животных, каждая из которых состояла из 10 животных (Charles River Laboratories). Животных размещали в комнате с 12-часовым световым циклом и обеспечивали им свободный доступ к воде и пище. Мыши из Группы 1 лечение не получали; мыши Группы 2 получали человеческую рекомбинантную ДНКазу I (Catalent, Мадисон, США) в количестве 25000 мг/кг (2 раза в сутки, внутримышечно); мыши Группы 3 получали ДНКазу в количестве 25 мг/кг (один раз в неделю, введение в спинномозговую жидкость методом интрацеребрального болюсного введения). В качестве критерия оценки применяли время выживаемости животных. Результаты показаны в Таблице 10.

Таким образом, введение ДНКазы I оказывает положительный эффект на лечение болезни Хантингтона.

Настоящее изобретение не должно ограничиваться в объеме описанными в настоящем документе конкретными вариантами реализации. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации предназначены для того, чтобы входить в объем прилагаемой формулы изобретения.

Все патенты, заявки, публикации, способы исследований, литература и другие материалы, приведенные в настоящем документе, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки, как если бы они физически присутствовали в данном описании.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у пациента, нуждающегося в этом, включающего введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества фермента ДНКазы, причем указанная нейродегенерация ассоциирована с повышенным уровнем внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике указанного пациента, причем указанная внеклеточная ДНК имеет прокариотическое происхождение. Группа изобретений также касается фармацевтической композиции, содержащей фермент ДНКазу, для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации; применения фермента ДНКазы для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у пациента. Группа изобретений обеспечивает лечение или ингибирование прогрессирования нейродегенерации у пациента. 3 н. и 76 з.п. ф-лы, 10 табл., 11 пр., 3 ил.

1. Способ лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества фермента ДНКазы, причем указанная нейродегенерация ассоциирована с повышенным уровнем внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике указанного пациента, причем указанная внеклеточная ДНК имеет прокариотическое происхождение.

2. Способ по п. 1, где нейродегенерация представляет собой первичную нейродегенерацию.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где указанное терапевтически эффективное количество фермента ДНКазы является достаточным для разрушения указанной внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике указанного пациента.

4. Способ по любому из пп. 1, 2, где указанное терапевтически эффективное количество фермента ДНКазы является достаточным для уменьшения средней молекулярной массы указанной внеклеточной ДНК, измеренной методом гель-электрофореза.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанная ДНКаза представляет собой рекомбинантную ДНКазу.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанная ДНКаза имеет удлиненный период полувыведения.

8. Способ по п. 7, где указанная ДНКаза конъюгирована с полисиаловой кислотой.

9. Способ по п. 7, где указанная ДНКаза защищена от связывания с актином путем модификации актинсвязывающего сайта.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где указанную ДНКазу вводят внутривенным, подкожным или внутримышечным путем.

11. Способ по п. 10, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

12. Способ по п. 10, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

13. Способ по любому из пп. 1-9, где указанную ДНКазу вводят энтерально.

14. Способ по п. 9, где указанную ДНКазу вводят перорально.

15. Способ по п. 13 или 14, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

16. Способ по п.13 или 14, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

17. Способ по любому из пп. 1-9, где указанную ДНКазу вводят в спинномозговую жидкость.

18. Способ по п. 17, где указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,1 мг в день.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностирована болезнь Альцгеймера.

20. Способ по п. 19, где указанная болезнь Альцгеймера представляет собой болезнь Альцгеймера с поздним началом.

21. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностирована болезнь Паркинсона.

22. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностирован боковой амиотрофический склероз.

23. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностирована болезнь Хантингтона.

24. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностирована шизофрения.

25. Способ по любому из пп. 1-18, где у указанного пациента диагностировано биполярное расстройство.

26. Способ по любому из пп. 1-25, где указанный пациент является человеком.

27. Способ по любому из пп. 1-25, где указанный пациент представляет собой экспериментальную животную модель.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая фермент ДНКазу, для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации, причем указанная нейродегенерация ассоциирована с повышенным уровнем внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике пациента, причем указанная внеклеточная ДНК имеет прокариотическое происхождение.

29. Фармацевтическая композиция по п. 28, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация представляет собой первичную нейродегенерацию.

30. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28, 29, отличающаяся тем, что ДНКазу следует вводить в количестве, достаточном для разрушения внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике пациента.

31. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28, 29, отличающаяся тем, что ДНКазу следует вводить в количестве, достаточном для уменьшения средней молекулярной массы указанной внеклеточной ДНК, измеренной методом гель-электрофореза.

32. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-31, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза представляет собой рекомбинантную ДНКазу.

33. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-32, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I.

34. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-33, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза имеет удлиненный период полувыведения.

35. Фармацевтическая композиция по п. 34, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза конъюгирована с полисиаловой кислотой.

36. Фармацевтическая композиция по п. 34, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза защищена от связывания с актином путем модификации актинсвязывающего сайта.

37. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-36, отличающаяся тем, что указанную ДНКазу вводят внутривенным, подкожным или внутримышечным путем.

38. Фармацевтическая композиция по п. 37, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, которую вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

39. Фармацевтическая композиция по п. 37, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, которую вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

40. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-36, отличающаяся тем, что указанную ДНКазу вводят энтерально.

41. Фармацевтическая композиция по п. 40, отличающаяся тем, что указанную ДНКазу вводят перорально.

42. Фармацевтическая композиция по п. 40 или 41, отличающаяся тем, что ДНКаза представляет собой ДНКазу I, которую вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

43. Фармацевтическая композиция по п. 40 или 41, отличающаяся тем, что ДНКаза представляет собой ДНКазу I, которую вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

44. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-36, отличающаяся тем, что указанную ДНКазу вводят в спинномозговую жидкость.

45. Фармацевтическая композиция по п. 44, отличающаяся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I, которую вводят в количестве по меньшей мере 0,1 мг в день.

46. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с болезнью Альцгеймера.

47. Фармацевтическая композиция по п. 46, отличающаяся тем, что указанная болезнь Альцгеймера представляет собой болезнь Альцгеймера с поздним началом.

48. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с болезнью Паркинсона.

49. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с боковым амиотрофическим склерозом.

50. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с болезнью Хантингтона.

51. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с шизофренией.

52. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 28-45, отличающаяся тем, что указанная нейродегенерация ассоциирована с биполярным расстройством.

53. Применение фермента ДНКазы для предотвращения, лечения и/или ингибирования прогрессирования нейродегенерации у пациента, нуждающегося в этом, причем указанная нейродегенерация ассоциирована с повышенным уровнем внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике указанного пациента, причем указанная внеклеточная ДНК имеет прокариотическое происхождение.

54. Применение по п. 53, отличающееся тем, что нейродегенерация представляет собой первичную нейродегенерацию.

55. Применение по любому из пп. 53, 54, отличающееся тем, что указанное терапевтически эффективное количество фермента ДНКазы является достаточным для разрушения указанной внеклеточной ДНК в крови, или спинномозговой жидкости, или кишечнике указанного пациента.

56. Применение по любому из пп. 53, 54, отличающееся тем, что указанное терапевтически эффективное количество фермента ДНКазы является достаточным для уменьшения средней молекулярной массы указанной внеклеточной ДНК, измеренной методом гель-электрофореза.

57. Применение по любому из пп. 53-56, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой рекомбинантную ДНКазу.

58. Применение по любому из пп. 53-57, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I.

59. Применение по любому из пп. 53-58, отличающееся тем, что указанная ДНКаза имеет удлиненный период полувыведения.

60. Применение по п. 59, отличающееся тем, что указанная ДНКаза конъюгирована с полисиаловой кислотой.

61. Применение по п. 59, отличающееся тем, что указанная ДНКаза защищена от связывания с актином путем модификации актинсвязывающего сайта.

62. Применение по любому из пп. 53-61, отличающееся тем, что указанную ДНКазу вводят внутривенным, подкожным или внутримышечным путем.

63. Применение по п. 62, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

64. Применение по п. 62, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

65. Применение по любому из пп. 53-62, отличающееся тем, что указанную ДНКазу вводят энтерально.

66. Применение по п. 65, отличающееся тем, что указанную ДНКазу вводят перорально.

67. Применение по п. 64 или 65, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,04 мг на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

68. Применение по п. 64 или 65, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве 0,05-10000 единиц Кунитца на кг в день в течение по меньшей мере одного дня.

69. Применение по любому из пп. 53-61, отличающееся тем, что указанную ДНКазу вводят в спинномозговую жидкость.

70. Применение по п. 69, отличающееся тем, что указанная ДНКаза представляет собой ДНКазу I и ее вводят в количестве по меньшей мере 0,1 мг в день.

71. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностирована болезнь Альцгеймера.

72. Применение по п. 71, отличающееся тем, что указанная болезнь Альцгеймера представляет собой болезнь Альцгеймера с поздним началом.

73. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностирована болезнь Паркинсона.

74. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностирован боковой амиотрофический склероз.

75. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностирована болезнь Хантингтона.

76. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностирована шизофрения.

77. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что у указанного пациента диагностировано биполярное расстройство.

78. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что указанный пациент является человеком.

79. Применение по любому из пп. 53-70, отличающееся тем, что указанный пациент представляет собой экспериментальную животную модель.