СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА РИККЕТСИАЛЬНОГО СИБИРИКА КОРПУСКУЛЯРНОГО Российский патент 1998 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при производстве риккетсиальных диагностических и профилактических препаратов.

В литературе имеются указания на получение корпускулярных антигенов из желточных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных риккетсиями сибирика, очищенных методом дифференциального центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой (Е.М.Голиневич. Сухие корпускулярные антигены из риккетсий. - Ж. микробиол. , эпидемиол,иммунобиол., 1955, N 6, с. 35 - 37 и П.Ф.Здродовский, Е. М. Голиневич. Учение о риккетсиях и риккетсиозах.- М.: Медицина, 1972, с. 114 - 117).

Известен способ-прототип получения корпускулярного антигена риккетсий сибирика (П. Ф.Здродовский, Е.М.Голиневич. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. - М.: Медицина, 1972, с. 114 - 117). Способ заключается в культивировании риккетсий сибирика в желточных оболочках куриных эмбрионов, гомогенизации и инактивации полученной биомассы с последующим центрифугированием гомогената при 1500 об/мин в течение 10 мин с целью удаления крупных тканевых частиц. Отобранную надосадочную жидкость подвергают длительному центрифугированию при 3500 - 5000 об/мин в течение 2 ч для осаждения риккетсий (первое длительное центрифугирование). Полученный осадок ресуспендируют в растворе консерванта и оставляют на ночь при комнатной температуре. На следующий день к взвеси добавляют равный объем эфира, встряхивают и после разделения слоев (спустя 1 ч) водную фазу, содержащую риккетсии, отсасывают. К остатку эфира и тканевого слоя приливают раствор консерванта и после встряхивания и разделения слоев водную фазу отсасывают. Обе водные фазы объединяют и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 2 ч (второе длительное центрифугирование). Полученный осадок ресуспендируют в растворе консерванта и оставляют при комнатной температуре на ночь. На следующий день проводят вторую эфирную обработку осадка по методике, описанной выше. Полученные при второй обработке водные фазы объединяют и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 2 ч (третье длительное центрифугирование). Осадок, содержащий риккетсии, микроскопируют, стандартизуют и лиофильно высушивают. По описанному способу выход целевого продукта составляет 0,2 - 0,4 мл с одной желточной оболочки при концентрации риккетсий 500 млн в 1 мл. Однако получение корпускулярных антигенов по способу-прототипу многостадийно, а продолжительность процесса очистки составляет 21 ч. Кроме того, такие манипуляции, как гомогенизация до консервации и инактивации риккетсий формалином, а также воздействие органическими растворителями (эфир) способствуют удалению специфических антигенов и не позволяют получать риккетсии с антигенной структурой, максимально приближенной к нативной. Наличие в антигене тканевых компонентов и спонтанных агглютинатов не позволяет использовать их в таких высокочувствительных реакциях, как реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), метод флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментном анализе (ИФА), иммунофлуорометрическом анализе (ИФМА).

Исходя их этих негативных явлений был предложен безэфирный, упрощенный и ускоренный способ получения диагностикума риккетсиального сибирика корпускулярного.

Изобретение направлено на решение задачи: получение диагностикума риккетсиального сибирика корпускулярного многоцелевого назначения (для РСК, МФА, РНАГ, ИФА, ИФМА) за счет повышения чистоты и специфичности препарата, обусловленных способом очистки, упрощение и ускорение процесса очистки.

Решение данной задачи достигается путем инактивации биомассы до стадии гомогенизации с целью сохранения легко отторгающегося поверхностного специфического слоя, а также применения мембранной фильтрации (взамен эфирной обработки) в комбинации с дифференциальным центрифугированием.

Существенные признаки заявляемого способа: ограничительные - инактивация желточной культуры риккетсий сибирика, ее гомогенизация, дифференциальное центрифугирование, ресуспендирование осадка, стандартизация, лиофилизация;
отличительные - инактивация до стадии гомогенизации, мембранная фильтрация с предварительными высокоскоростным и низкоскоростным центрифугированиями и последующим высокоскоростным центрифугированием, процесс очистки длится 7 ч.

Способ осуществляется следующим образом: желточные оболочки, инфицированные риккетсиями сибирика, инактивируют путем добавления формалинизированного гипертонического раствора хлорида калия, выдерживают 5 суток для инактивации риккетсий и затем гомогенизируют с помощью размельчителя тканей. Риккетсии и тканевые компоненты гомогената осаждают при высокоскоростном центрифугировании. Осадок ресуспендируют в растворе консерванта и вновь гомогенизируют. После этого из гомогената путем низкоскоростного центрифугирования осаждают крупные тканевые частицы. Надосадочную жидкость, содержащую риккетсии, декантируют в микрофильтрационную ячейку с магнитным перемешиванием. Фильтрацию проводят через мембрану типа "Сынпор" с размерами частиц 2 мкм при давлении 0,3 МПа. Полученный фильтрат подвергают высокоскоростному центрифугированию для осаждения риккетсий. Осадок ресуспендируют в физрастворе, стандартизируют до содержания риккетсий 1 млрл. в 1 мл, затем оценивают в различных серологических реакциях: РСК, РНАГ, МФА, ИФА, ИФМА.

При соответствии результатов регламентированным данным в препарат добавляют сахарозу и разливают в ампулы по 0,5 мл и стабилизируют методом лиофильного высушивания.

Пример 1 получения целевого продукта по заявляемому способу.

К 50 г желточных оболочек, инфицированных риккетсиями сибирика, добавляли 150,0 мл 1 М раствора хлорида калия с содержанием формальдегида в конечной концентрации 0,1%, выдерживали 5 суток при температуре 4 - 10^oC. Затем инактивированные желточные оболочки гомогенизировали на микроизмельчителе тканей РТ-2 при 5000 об/мин в течение 5 мин. Из полученного гомогената осаждали риккетсии и тканевые частицы путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендировали в 150 мл фосфатного буферного раствора (ФБР) pH 7,4 и вновь гомогенизировали на микроразмельчителе тканей при 5000 об/мин в течение 5 мин. Гомогенизированный осадок центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость декантировали в микрофильтрационную ячейку с магнитным перемешиванием. Фильтрацию проводили через мембрану "Сынпор" с размерами пор 2 мкм в течение 1 ч при давлении 0,3 МПа. Получили 140 мл фильтрата, который подвергали высокоскоростному центрифугированию при 10000 об/мин в течение 30 мин. Осадок, содержащий риккетсии, ресуспендировали в ФБР и стандартизировали до содержания риккетсий 1 млрд. в 1 мл. Выход составил 50 мл, т.е. 1 мл на 1 г желточной оболочки при концентрации риккетсий 1 млрд. в 1 мл. Продолжительность процесса очистки составила 7 ч. Отстандартизированный диагностикум испытывали в серологических реакциях: РСК, реакции нейтрализации антигена (РНАГ), МФА, ИФА, ИФМА (табл. 1).

Как следует из данных, представленных в табл. 1, антиген риккетсий сибирика, полученный по заявляемому способу, взаимодействует со специфическими антителами сыворотки к риккетсиям сибирика во всех испытанных серологических реакциях и не реагирует с гетерологичными антителами (сывороткой к риккетсиям Провачека и противожелточной сывороткой). При исследовании методом флуоресцирующих антител было установлено, что антиген имеет яркую специфическую флуоресценцию (4+), не содержит агглютинатов и тканевых компонентов.

Таким образом, антиген риккетсий сибирика, полученный по заявляемому способу, пригоден для применения в качестве диагностикума риккетсиального сибирика корпускулярного в различных серореакциях.

Пример 2 получения целевого продукта по способу-прототипу.

50 г желточных оболочек, инфицированных риккетсиями сибирика, гомогенизировали с помощью стеклянных бус на шуттель-аппарате и в гомогенат добавляли 500 мл физраствора без консерванта. Взвесь встряхивали и добавляли 500 мл физраствора с консервантом (0,8% формалина). Инактивация взвеси проходила в течение 5 суток при температуре 4 - 10^oC. Очистку проводили методом центрифугирования в сочетании с эфирной обработкой. Для этого взвесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали, а к осадку добавляли 250 мл физраствора с консервантом, встряхивали и вновь центрифугировали при тех же параметрах. Надосадочную жидкость объединяли с первой. Объединенные объемы надосадочных жидкостей центрифугировали при 500 об/мин в течение 2 ч. Не содержащую риккетсии надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 500 мл физраствора с 0,4% формалина и 0,5% фенола и оставляли при комнатной температуре. На следующий день к взвеси добавляли 500 мл эфира, встряхивали в делительной воронке и выдерживали 1 ч для разделения слоев. Через 1 ч водную фазу, содержащую риккетсии, отделяли, а к осадку тканевого слоя и эфирного слоя добавляли 250 мл физраствора с фенолом и формалином, встряхивали и через 1 ч собирали водный слой. Объединенные объемы первого и второго водных слоев центрифугировали при 5000 об/мин в течение 2 ч. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в физрастворе с фенолом и формалином и оставляли на ночь. На следующий день повторяли эфирную обработку ресуспендированного осадка. Для этого к нему добавляли 500 мл эфира, встряхивали и выдерживали 1 ч для разделения слоев, отбирали водную фазу. К оставшемуся тканевому слою и эфиру добавляли физраствор с формалином и фенолом, встряхивали и собирали водную фазу. Объединенные водные фазы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 2 ч. Осадок ресуспендировали в минеральном объеме физраствора и разбавляли до концентрации 1 млрд. риккетсий в 1 мл. Получено 12,5 мл риккетсиальной взвеси, т.е. 0,25 мл из 1 г желточной оболочки при концентрации риккетсий 1 млрд. в 1 мл. Продолжительность процесса очистки 21 ч. Отконтролированный препарат был изучен в различных серологических реакциях (табл. 2).

Из представленных в табл. 2 данных следует, что антиген риккетсий сибирика, полученный по способу-прототипу, взаимодействует со специфическими антителами сыворотки к риккетсиям сибирика в более низких (в 2 - 4 раза) разведениях. Кроме того, полученный антиген реагирует в низких разведениях с гетерологичными антителами (сыворотки к риккетсиям Провачека и противожелточной сыворотки). При исследовании в МФА установлено, что антиген имеет спонтанные агглютинаты и тканевые компоненты, интенсивность специфической флуоресценции ниже регламентированной (2+).

Таким образом, антиген риккетсий сибирика, полученный по способу-прототипу, может быть использован только в РСК.

Использование: медицина, иммунология, при производстве риккетсиальных диагностических и профилактических препаратов. Задача: получение препарата многоцелевого назначения за счет повышения его чистоты и специфичности, упрощение и ускорение процесса очистки. Сущность изобретения: способ заключается в гомогенизации желточной культуры риккетсий сибирика, ее инактивации, высоко- и низкоскоростных центрифугирований, ресуспендирования осадка, стандартизации и лиофилизации. Новым в способе является то, что инактивацию культуры проводят до стадии гомогенизации, а очистку риккетсиальной взвеси осуществляют с помощью мембранной фильтрации с предварительным высоко- и низкоскоростным и последующим высокоскоростным центрифугированиями.

Способ получения диагностикума риккетсиального сибирика корпускулярного путем гомогенизации желчной культуры риккетсий сибирика, ее инактивации, центрифугирований, расуспендирования осадка, стандартизации с последующей лиофилизацией, отличающийся тем, что инактивацию культуры проводят до стадии гомогенизации, а очистку риккетсиальной взвеси осуществляют с помощью мембранной фильтрации с предварительным высоко- и низкоскоростным и последующим высокоскоростным центрифугированиями.