СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБ ДЛЯ СПЕКТРАЛЬНОГО БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ Российский патент 2014 года по МПК G01N30/02 G01N33/48 G01N33/12 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при анализе сыворотки венозной крови человека и животных методом жидкостной хроматографии, а также любым другим методом, непосредственным объектом исследования которого может являться водно-метанольный экстракт, получаемый из высушенной сыворотки крови.

Биохимический анализ крови - одно из самых распространенных в современной медицине лабораторных исследований, отражающее функциональное состояние органов и систем организма (печени, почек, поджелудочной железы и др.), позволяющее оценить состояние обменных процессов (белковый, углеводный, жировой обмен, водно-электролитный обмен, дисбаланс микроэлементов). Биохимический анализ крови - базовое исследование для оценки состояния здоровья, которое помогает поставить диагноз, определить форму или стадию заболевания, назначить и проконтролировать лечение.

Благодаря большому количеству исследуемых показателей биохимический анализ крови используется во всех областях медицины. Он позволяет выявить нарушения в работе органов и систем организма, когда еще нет никаких внешних симптомов болезни, и поэтому широко применяется для ранней диагностики многих заболеваний: эндокринологических, урологических, гинекологических, кардиологических и других.

Известен способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей, предусматривающий взятие анализируемого образца, его нанесение на реагентную зону диагностической полоски, выдерживание для проведения реакции, размещение диагностической полоски в приборе - анализаторе изображения и считывание полученных результатов анализа (см. RU №2157994, G01N 33/48, 20.10.2000 г.). Использование диагностических полосок малоэффективно при верификации заболеваний, кроме того, оно отличается относительно высокой стоимостью аналитических работ из-за высокой стоимости самих расходуемых индикаторов.

Известен способ проведения иммунологического анализа биологических жидкостей, характеризующийся тем, что аппликатор с микростержнями погружают в латексную суспензию, сенсибилизированную антителами, с взятием микрокапель латексной суспензии, эти микрокапли наносят на носитель в геометрически определенных местах в виде упорядоченной матрицы, затем другим аппликатором берут образцы биологической жидкости и наносят на тот же носитель так, чтобы образцы смешались с латексной суспензией, перемешивают и инкубируют 2-3 мин и помещают в видеоцифровое устройство для регистрации агглютинации (см. RU №2325644, G01N 33/48, G01N 33/53, 20.10.2000 г.). Способ ограничен количеством диагностируемого параметра, что также в целом способствует снижению эффективности верификационных работ.

Известный способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови n-гексаном, очистку от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование n-гексанового экстракта (см. RU №2414711, G01N 33/50, G01N 33/48, G01N 33/00, G01N 1/10, G01N 30/02, 20.03.2011 г.), отличается тем, что для исследования берут 5-7 см³ крови и предварительно перед экстракцией пробу обрабатывают 2 см³ 60% серной кислоты, экстракцию проводят 30 см³ n-гексана однократно и перед газохроматографическим исследованием n-гексановый экстракт однократно обрабатывают 10 см³ концентрированной серной кислоты. Способ также разработан для определения конкретного параметра, в данном случае наличия пестицидов в крови.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является способ подготовки проб сыворотки крови, описанный в медицинской технологии (см. Разрешение Росздравсоцнадзора №2008/246 от 18.09.2008 г.), который предусматривает следующие манипуляции: сыворотка крови в количестве 1 мл, полученная стандартным путем, наливается в чашку Петри (d=40 мм), высушивается при комнатной температуре до состояния сухой корочки, после чего помещается в эксикатор с хлоридом кальция и досушивается в течение 14 дней. Полученный сухой остаток перемалывается на планетарной мельнице при 750 об/мин в течение 3 мин. Готовится навеска перемолотой пробы в количестве 40 мг, насыпается в пробирку типа «Эппендорф», заливается 85% раствором метанола. Экстракция происходит в течение 1 часа при комнатной температуре и постоянном встряхивании на шейкере при 500 об/мин. После чего проба центрифугируется при 12000g в течение 3 мин. Полученный экстракт в количестве 50 мкл помещается в пробирку автодозатора хроматографа.

Несовершенство данного способа заключается в недостаточно четком регламентировании условий и сроков, отсутствии критериев готовности пробы к анализу, а также в высокой трудоемкости производимых операций и их количестве, что неизбежно приводит к влиянию человеческого фактора на результаты анализа.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в упрощении процедуры пробоподготовки и сокращении сроков при спектральном биохимическом анализе крови.

Технический эффект, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в получении воспроизводимого, нетрудоемкого способа подготовки проб с четко обозначенными режимами и минимальным количеством операций.

Для решения поставленной задачи способ получения проб для спектрального биохимического анализа крови, включающий этапы подготовки, высушивания сыворотки крови и получения экстракта для хроматографических исследований, отличается тем, что процесс получения сухого остатка сыворотки крови проводится в условиях постоянного встряхивания при температуре 50-60°C в течение 21-27 часов до получения сухого остатка в виде пробки с уплотнением в центре и пленкой на поверхности, которая прокалывается стерильным и химически интактным предметом, после чего в пробирку с сухим остатком помещается 85% раствор метанола. Полученная смесь снова помещается в устройство для встряхивания при температуре 48-52°C в течение 21-27 часов, после чего уплотняется в центрифуге при ускорении 11500-12500g. Готовая проба переносится в пробирку автосемплера жидкостного хроматографа в объеме, занимающем 3/4-2/3 объема пробирки.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают ускорение процедуры получения пробы с высокой воспроизводимостью хроматограммы.

Сущность данного способа заключается в приготовлении водно-метанольного экстракта сыворотки крови по строго детерминированным алгоритму и условиям его приготовления.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Для подготовки проб используется сыворотка крови, полученная стандартным путем, в количестве 500 мкл, которая помещается в микропробирку (например, типа «Эппендорф») емкостью 1,5 мл. Открытая пробирка помещается в ячейку устройства для встряхивания с возможностью температурного контроля (например, термошейкер) и перемешивается в режиме постоянного встряхивания при температуре 50-60°C в течение 21-27 часов до получения осадка из сухой сыворотки в виде прозрачной пробки желто-коричневого цвета. Для получения экстракта пробка в нескольких местах прокалывается чистым наконечником на 200 мкл. В пробирку помещается 85% раствор метанола в количестве 500 мкл, приготовленный из реактивов градации не ниже: «химически чистый». Закрытая пробирка со смесью инкубируется в термошейкере при температуре 48-52°C в течение 21-27 часов при скорости встряхивания 500 об/мин. Полученная проба центрифугируется при ускорении 12000g в течение 3 мин. Готовый экстракт в количестве 200 мкл помещается в пробирку автодозатора хроматографа или непосредственно инжектируется в хроматографическую колонку.

Поставленная задача была решена путем подбора оптимальных условий высушивания и экстракции, полагаясь на основные принципы влияния внешних факторов на протекание этих двух процессов. Кроме того, количество операций, производимых с сывороткой, было минимизировано. Получаемые хроматограммы обладают воспроизводимостью с относительной погрешностью не более 5% в пределах одной пробы, что является достаточным уровнем воспроизводимости, обеспечивающим достоверность результатов анализа сыворотки с использованием жидкостной хроматографии.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при анализе сыворотки венозной крови человека и животных методом жидкостной хроматографии, а также любым другим методом, непосредственным объектом исследования которого может являться водно-метанольный экстракт, получаемый из высушенной сыворотки крови. Способ получения проб для спектрального биохимического анализа крови, включающий этапы подготовки, высушивания сыворотки крови и получения экстракта для хроматографических исследований, отличается тем, что процесс получения сухого остатка сыворотки крови проводится в условиях постоянного встряхивания при температуре 50-60°C в течение 21-27 часов до получения сухого остатка в виде пробки с уплотнением в центре и пленкой на поверхности, которая прокалывается стерильным и химически интактным предметом, после чего в пробирку с сухим остатком помещается 85% раствор метанола. Полученная смесь снова помещается в устройство для встряхивания при температуре 48-52°C в течение 21-27 часов, после чего уплотняется в центрифуге при ускорении 11500-12500g. Готовая проба переносится в пробирку автосемплера жидкостного хроматографа в объеме, занимающем 3/4-2/3 объема пробирки. Использование настоящего изобретения позволяет получить хроматограммы с воспроизводимостью с относительной погрешностью не более 5% в пределах одной пробы, что является достаточным для обеспечения достоверности результатов анализа сыворотки с использованием жидкостной хроматографии.

Способ получения проб для спектрального биохимического анализа крови, включающий этапы подготовки, высушивания сыворотки крови и получения экстракта для хроматографических исследований, отличающийся тем, что процесс получения сухого остатка сыворотки крови проводится в условиях постоянного встряхивания при температуре 50-60°C в течение 21-27 часов, причем сухой остаток для получения экстракта пробы перемешивается с 85% раствором метанола в условиях постоянного встряхивания при температуре 48-52°C в течение 21-27 часов, после чего осаждается в центрифуге при ускорении 11500-12500g.