СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2020 года по МПК C12M3/00 C12N5/09 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области диагностирования и разработке новых методов лечения злокачественных опухолей.

Известен способ консервации клеток, образующих ядро, а именно способ снижения апоптоза хранящихся клеток и к охлажденной композиции, содержащей клетки, где клетки находятся в контейнере. Способ включает: 1) хранение клеток, образующих ядро, в контейнере; 2) добавление газа в указанный контейнер таким образом, чтобы давление внутри контейнера достигало 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды, где указанный газ представляет собой или включает газ ксенона; 3) сохранение указанного давления в указанном контейнере в продолжение первого периода времени, в течение которого температура в указанном контейнере равна 22°С-37°С; 4) после указанного первого периода времени снижение указанной температуры в контейнере до 0,1°С-10°С с одновременным сохранением указанного давления на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды; 5) сохранение указанного контейнера при указанной более низкой температуре и при давлении на 0,5 атм - 4 атм выше давления окружающей среды в течение второго периода времени, где указанный второй период времени больше чем указанный первый период времени; и 6) после указанного второго периода времени, снижение давления в указанном контейнере до давления окружающей среды и повышение температуры в указанном контейнере до 22°С-37°С.Осуществление указанного способа позволяет снизить апоптоз клеток.

К недостаткам известного способа относится:

- использование для хранения сложного оборудования, а именно контейнера сложной конструкции, которая с одной стороны обеспечивала герметичность контейнера при избыточном давлении, а с другой стороны обеспечивала бы подачу газовой смеси для консервации;

- использование для консервации смеси среды с инертным газом, что усложняет и делает более дорогим процесс консервации и хранения;

- способ консервирует клетки. А не обеспечивает их процесс жизнедеятельности.

Известен способ выделения и размножения раковых клеток, описанный в патенте США №5529903. Способ выделения и размножения раковых клеток с помощью центрифугирования с использованием центрифуги Haemonetics V50, которая снабжена байпасом, в случае двух пациентов с различными типами опухолей (рак предстательной железы, меланома) была извлечена клеточная фракция соответственно 120 мл крови. Лейкоциты из клеточной фракции отбирали в пробирку со средой для культивирования клеток (RPMI 1640) и исследовали следующим образом. Клетки культивировали в течение ночи в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂, 95% влажность воздуха). В качестве среды использовали RPMI 1640 с 10% эмбриональной сыворотки теленка с добавлением антител, специфичных к В- и Т-клеткам (гамма-специфические антитела к CD 8-, CD 25-, IL-2- и ИФН), и с добавление пептида, ингибирующего макрофаги, в следующих концентрациях: анти-ИФН: 100 мкг / 500 мл среды анти-CD 25: 100 мкг / 500 мл среды анти-CD 8: 1 мг / 500 мл среды, макрофаг-ингибирующий пептид (MIP): 50 мг / 500 мл среды. Партию распределяли по планшетам для микротитрования с соответственно 200000 клеток на 100 мкл на лунку. В течение всего периода культивирования его постоянно газировали 5% CO₂ при 37°С. Раковые клетки были четко видны после деления в виде клонов через четыре дня в фазово-контрастном микроскопе.

К недостаткам известного способа относится недостаточный срок культивации (жизни раковых клеток) всего в четыре дня, что по нашему мнению объясняется повреждением клеток в результате механических повреждений при центрифугировании и в результате процессов разложении.

Задача на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа хранения клеток злокачественных образований более дешевого при его осуществления, не требующего сложного оборудования для хранения и обеспечивающего жизнедеятельность и развитие хранимой культуры в течении длительного срока.

Поставленная задача решается путем применения способа выделения и культивирования клеток злокачественных опухолей с помощью центрифугирования. Способ заключается в заборе пробы тела опухоли, механическом измельчении полученного материала до получения частиц размером до 100 микрон, подготовке материала к центрифугированию, центрифугирование и инкубацией в термостате при температуре 37°С, в среде 5% СО₂ и 95% влажности воздуха. При этом забор пробы производился в стерильные пробирки с охлажденной до 0-+4°С питательной средой с ингибирующим развитие бактерий компонентом. Центрифугирование проводилось в две стадии где первая стадия проводилась в течении времени не превышающем 30 мин, со скоростью не более 650 оборотов в мин, с минимальной скоростью разгона и остановки с последующим отбором опухолевого субстрата. Вторая стадия на протяжении времени не превышающем 10 мин, со скоростью не превышающем 1200 оборотов\мин, с минимальной скоростью разгона и остановки.

Применение в стерильных пробирок с охлажденной до 0-+4°С питательной средой с ингибирующим развитие бактерий компонентом, центрифугирование в две стадии где первая стадия проводилась при малых оборотах а вторая при высоких в течении указанных временных интервалов позволяет избежать механических, химических и механохимических повреждений забираемых клеток опухолей, что позволяет избежать их преждевременного апоптоза и позволяет клеткам вести нормальную жизнедеятельность и размножение в течении длительного, до одного месяца, времени.

Для приготовления органных культур использовались биопсии опухолей лимфоидной природы, полученные в ФГБУ НМИЦ Гематологии МЗ РФ в период с мая 2017 года по январь 2019 года, суммарно 42 культуры. Из 42 культур: 21 образец - фолликулярная лимфома (16 из которых фолликулярная лимфома 1-2 цитологического типа, 5-3А цитологического типа), 4 образца - лимфома из клеток мантийной зоны, 7 образцов - лимфома из клеток маргинальной зоны, 2 образца - лимфома Беркитта, 3 образца- В-хронический лимфолейкоз, 2 образца - диффузная В-крупноклеточная лимфома, В клеточная лимфома высокой степени злокачественности - 2 образца, 1 образец - волосато-клеточный лейкоз.

Забор биологического материала производился во время операций и биопсий в стерильные пробирки с охлажденной до +4 С (со средой ДМЕМ + стрептомицин + пенициллин). Пробирки в асептических условиях хранились при температуре +2-4 С. Далее материал транспортировался в лабораторию при постоянном охлаждении +4 С в сроки, не превышающие 72 часа. Первичные культуры получали путем механической обработки биопсийного материала с помощью специального фильтра, представляющего собой сито с размером отверстий 100 микрон и плоский пластиковый поршень, с помощью которого кусочки опухоли продавливались через него (Cell Strainer). После чего клеточный материал промывался через фильтр с помощью фосфатно-солевого буфера PBS в объеме 15 мл. Далее полученный материал переносился на раствор фиколла с плотностью 1,077 г/см3 в объеме, в соотношении 10 мл раствора фиколла и 15 мл опухолевый субстрат.

Проводилось центрифугирование в течении примерно 30 минут, 650 оборотов в минуту, с минимальной скоростью разгона и остановки. В результате на границе фиколла и опухолевого субстрата, отмечалось так называемое «кольцо опухолевых клеток», которое собиралось с помощью пипетки в отдельную пробирку с добавлением промывочного буфера PBS. Повторное центрифугирование на протяжении примерно 10 минут, 1200 оборотов\мин, с минимальной скоростью разгона и остановки, проводилось с целью минимизировать риски повреждение клеток. В результате повторного центрифугирования, необходимый субстрат оседал на дно пробирки, остальная часть удалялась. Последовательно добавлялись среда RPMI-1640 с глутамином, содержащая 10% бычью сыворотку и антибиотики-пенициллин и стрептомицин в объеме 5-10 мл, с дальнейшем перемешиванием пипеткой и рассадкой во флаконы объемом 40 мл и инкубацией в термостате при температуре 37С и 5% CO2, предварительно оценивался % процент живых клеток путем подсчета в аппарате.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделению и культивированию клеток злокачественных опухолей с помощью центрифугирования. Способ включает забор пробы тела опухоли в стерильные пробирки с охлажденной до 0-4°С питательной средой с ингибирующим развитие бактерий компонентом. Затем осуществляют механическое измельчение полученного материала до получения частиц размером, не превышающим 100 микрон, подготовку материала к центрифугированию и центрифугирование, которое проводится в две стадии, где первая стадия проводится в течение времени, не превышающего 30 мин, со скоростью не более 650 оборотов в мин, с минимальной скоростью разгона и остановки с последующим отбором опухолевого субстрата, вторая стадия на протяжении времени, не превышающего 10 мин, со скоростью, не превышающей 1200 об/мин, с минимальной скоростью разгона и остановки. Затем осуществляют инкубацию в термостате при температуре 37°С, в среде 5% СО₂ и 95% влажности воздуха. Изобретение позволяет получить культуру клеток с длительным сроком хранения.

Способ выделения и культивирования клеток злокачественных опухолей с помощью центрифугирования, заключающийся в заборе пробы тела опухоли, механическом измельчении полученного материала до получения частиц размером, не превышающим 100 микрон, подготовке материала к центрифугированию, центрифугировании и последующей инкубации в термостате при температуре 37°С, в среде 5% СО₂ и 95% влажности воздуха, отличающийся тем, что забор пробы производится в стерильные пробирки с охлажденной до 0-4°С питательной средой с ингибирующим развитие бактерий компонентом, центрифугирование проводилось в две стадии, где первая стадия проводилась в течение времени, не превышающего 30 мин, со скоростью не более 650 оборотов в мин, с минимальной скоростью разгона и остановки с последующим отбором опухолевого субстрата, вторая стадия на протяжении времени, не превышающего 10 мин, со скоростью, не превышающей 1200 об/мин, с минимальной скоростью разгона и остановки.