Способ оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца по показателям карбонил-зависимой модификации эритроцитарной супероксиддисмутазы Российский патент 2020 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и может быть использовано для определения эффективности подавления проявлений окислительного стресса при терапии ишемической болезни сердца (ИБС), для оценки эффективности проводимой терапии.

Окислительный стресс играет важную роль в этиологии и патогенезе различных заболеваний, включая болезни сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет, нейродегенеративные болезни, злокачественный рост, аутоиммунные патологии и т.п. В качестве маркеров окислительного стресса в настоящее время наиболее часто используются показатели, отражающие окислительную деструкцию ДНК (снижение длины теломеров в лейкоцитах крови, увеличение содержания 8-гидроксигуанина в плазме крови и моче), а также параметры, связанные с накоплением в плазме крови активных карбонильных соединений низкомолекулярных альфа-оксоальдегидов (дикарбонилов), образующихся в организме при свободнорадикальном окислении полиеновых липидов и 6-и атомных сахаров (глюкозы и фруктозы). В большинстве клинических исследований в качестве маркера окислительного стресса определяют содержание малонового диальдегида (МДА) при помощи реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК).

(Lankin V.Z., Tikhaze А.K.. Curr Aging Sci. 2017. 10(1): 18-25).

Однако, этот тест малопригоден в качестве маркера окислительного стресса вследствие низкой специфичности, поскольку с 2-ТБК в условиях определения могут реагировать различные вещества плазмы крови, отличные от МДА.

Известен способ определения в крови пациента уровня МДА-модифицированных ЛНП в качестве маркера окислительного стресса при ИБС.

(Панкин В.З., Тихазе А.К. Кардиология, 2016, 56 (12): 97-105).

Несмотря на высокую диагностическую и прогностическую значимость данного способа при ИБС, проведение его трудно осуществимо вследствие высокой стоимости анализов и отсутствия на отечественном рынке тест-наборов на основе моноклональных антител, пригодных для выявления модификаций апобелка ЛНП.

Известен также способ оценки эффективности лечения ишемической болезни сердца путем исследования крови, про котором определяют до и после лечения модифицированные ЛП(а) и при снижении уровня модифицированных ЛП(а) на 30% и более и увеличением в крови уровня ЛПВП до 30% и более, холестерина ЛПВП с 0,8 до 1,6 ммоль/л и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение ишемической болезни сердца как эффективное.

(Патент РФ №2462722, МПК G01N 33/92, опубл. 27.09.2012, Бюл. №27).

Данный способ имеет большое количество недостатков, основным из которых является то, что при анализе не используются стандартные образцы «модифицированных ЛП(а)», получение которых с оснащением клинических лабораторий представляется невозможным. Для получения таких стандартов требуется выделение ЛП(а) из плазмы крови методом препаративного дифференциального ультрацентрифугирования, очистка препарата ЛП(а) при помощи аффинной хроматографии на колонке с адсорбированными на носителе моноклональными антителами к ЛП(а) и, кроме того, модификация очищенного препарата ЛП(а) при инкубации с природными дикарбонилами. Поскольку авторы патента подобной работы не проводили, корректная идентификация их анализов ЛП(а) на электрофорезе невозможна. Следует отметить также, что использованный авторами денситометрический метод определения является полуколичественным и, следовательно, недостаточно точным и чувствительным. Можно утверждать, что предлагаемый способ является недоработанным и плохо аргументированным. Парадоксально, что дополнительно к определению «модифицированных ЛП(а)» авторы в своем способе для оценки эффективности терапии ИБС предлагают определять изменение уровней ЛПВП и холестерина ЛПВП, что является стандартной процедурой при соответствующих биохимических анализах и применяется везде и повсеместно.

Задачей изобретения является создание доступного и простого в осуществлении способа оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца по показателям карбонил-зависимой модификации эритроцитарной супероксиддисмутазы, обладающего высокой чувствительностью и возможностью длительного хранения образцов эритроцитов до проведения анализа, что способствует повышению точности оценки.

Технический результат заключается в доступности осуществления способа и повышении точности оценки.

Технический результат достигается тем, что в заявляемом способе оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца путем исследования крови, согласно изобретению, в эритроцитах крови больных ишемической болезнью сердца определяют активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД), ед/г гемоглобина и содержание Cu,Zn-СОД, нг/г гемоглобина, вычисляют коэффициент модификации Cu,Zn-СОД по формуле: КФМ_СОД=активность Cu,Zn-СОД / содержание Cu,Zn-СОД и при изменении исходных значений КФМ_СОД от 1,5 и выше свидетельствует об эффективности проводимой терапии.

Способ осуществляется следующим образом.

Активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД) определяют в эритроцитах, выделенных из взятой натощак венозной крови испытуемых в присутствии 1 мг/мл ЭДТА в качестве антикоагулянта и антиоксиданта. Эритроциты выделяют центрифугированием в рефрижераторной лабораторной центрифуге Sigma 3-16KL (Япония), а затем лизируют в 5 мМ К,Na-фосфатном буфере рН 7,4 в течение 15 минут в ледяной бане. Лизат эритроцитов вновь центрифугируют в течение 10 мин при 20000 об/мин в рефрижераторной лабораторной центрифуге Sigma 3-16KL (Япония), после чего к 5 объемам супернатанта добавляют 2 объема смеси хлороформ/этанол (3:5) и встряхивают на Vortex Elmi SkyLine (Литва). Выпавший осадок гемоглобина удаляют центрифугированием. Активность Cu,Zn-СОД в супернатанте определяют по подавлению скорости восстановления нитротетразолия синего супероксидным анион-радикалом, генерируемым в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой. Кинетику восстановления нитротетразолия синего регистрируют при 560 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-2600 (Япония). За единицу активности СОД принимают количество фермента, необходимое для 50%-ного подавления восстановления нитротетразолия синего в условиях реакции. Активность Cu,Zn-СОД выражают в единицах активности на 1 г гемоглобина (Hb). При наличии возможностей активность Cu,Zn-СОД в эритроцитах может быть определена в полуавтоматическом режиме при использовании диагностического тест-набора RANSOD фирмы RANDOX (USA). Содержание Cu,Zn-СОД в гемолизате эритроцитов определяют иммуноферментным методом с помощью тест-набора Human Cu/Zn SOD Platinum Elisa (США).

Нормальные значения активности эритроцитарной Cu,Zn-СОД=800-1500 ед/г гемоглобина. Значения активности Cu,Zn-СОД на 15-20% менее 800 ед/г гемоглобина могут свидетельствовать об окислительной модификации эритроцитарной Cu,Zn-СОД. Тем не менее, очевидно, что активность Cu,Zn-СОД может быть снижена не только вследствие окислительной модификации молекул фермента, но и при действии других факторов, таких как мутации гена, кодирующего биосинтез Cu,Zn-СОД и, значительно чаще, вследствие алиментарного дефицита меди и/или цинка, входящих в активный центр фермента. Очевидно, что в этих случаях сниженная активность Cu,Zn-СОД в эритроцитах никоим образом не связана с окислительной модификацией молекул фермента.

Исходя из этого, для однозначно корректного выявления наличия окислительной модификации эритроцитарной Cu,Zn-СОД, одновременно с исследованием активности фермента, проводят определение его содержания в эритроцитах иммунохимическим методом с помощью моноклональных антител. Нормальные значения уровня Cu,Zn-СОД в эритроцитах человека составляют 300-500 нг/г гемоглобина (Hb). Далее рассчитывают коэффициент модификации Cu,Zn-СОД (КФМ_СОД), т.е. отношение: активность Cu,Zn-СОД (в ед/г Hb) / содержание Cu,Zn -СОД (в нг/г Hb).

Значение КФМ_СОД более 2 (нормальное значение) свидетельствует об отсутствии проявлений окислительной модификации фермента. Изменение исходных значений КФМ_СОД от 1,5 и выше свидетельствует об эффективности проводимой терапии.

Клинический пример 1:

Пациент Щ., мужчина 51 г. поступил в ГБУ «ГКБ им. В.В. Вересаева» Департамента здравоохранения г. Москвы с диагнозом: закрытый перелом правой бедренной кости со смещением. АД в пределах нормальных значений (125/75 мм рт.ст.). ИБС, стенокардию напряжения ранее не диагностировали. Антигипертензивную, липидснижающую терапию не получал. При поступлении уровень общего холестерина в пределах нормальных значений - 3,9 ммоль/л, холестерина ЛНП - 1,6 ммоль/л. Анализ крови на исследование эритроцитарной Cu,Zn-СОД проведен через 14 дней пребывания в стационаре (при выписке). Активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД=897 ед/г Hb. Содержание эритроцитарной Cu,Zn-СОД=354 нг/г Hb. Значение КФМ_СОД составило 2,54 (норма).

Клинический пример 2:

Пациент Б., мужчина 60 лет поступил в ГБУ «ГКБ им. В.В. Вересаева» Департамента здравоохранения г. Москвы с диагнозом: ИБС, острый нижний инфаркт миокарда без подъема ST, гипертоническая болезнь III ст. На догоспитальном этапе постоянно принимал антигипертензивные препараты из группы иАПФ, БАБ; холестеринснижающая терапия не проводилась. При поступлении уровень общего холестерина 8,2 ммоль/л, холестерина ЛНП - 6,3 ммоль/л (гиперхолестеринемия). Активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД=151 ед/г Hb. Содержание эритроцитарной Cu,Zn-СОД=393 нг/г Hb. Значение КФМ_СОД составило 0,38 (окислительный стресс). Назначена гиполипидемическая терапия: аторвастатин в дозе 80 мг 1 раз в день. Через 3 мес.выявлено снижение гиперхолестеринемии - уровень общего холестерина 5,6 ммоль/л, холестерина ЛНП 4,3 ммоль/л.). Активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД=598 ед/г Hb. Содержание эритроцитарной Cu,Zn-СОД=342 нг/г Hb. Увеличение КФМ_СОД от 0,38 до 1,74 свидетельствует об эффективности терапии и о значительном уменьшении выраженности окислительного стресса.

Клинический пример 3:

Пациент К., мужчина 59 лет поступил в ГБУ «ГЛБ им. В.В. Вересаева» Департамента здравоохранения г. Москвы с диагнозом: ИБС, постинфарктный кардиосклероз, гипертоническая болезнь III ст. На догоспитальном этапе постоянно принимал антигипертензивные препараты из группы иАПФ, БАБ; холестеринснижающая терапия не проводилась. При поступлении уровень общего холестерина 7,5 ммоль/л, холестерина ЛНП - 6,7 ммоль/л (гиперхолестеринемия). Активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД=189 ед/г Hb. Содержание эритроцитарной Cu,Zn-СОД=489 нг/г Hb. Значение КФМ_СОД составило 0,39 (окислительный стресс). Назначена гиполипидемическая терапия: аторвастатин в дозе 40 мг 1 раз в день. Через 2,5 мес.выявлено снижение гиперхолестеринемии - уровень общего холестерина 4,8 ммоль/л, холестерина ЛНП 3,2 ммоль/л. Активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД=687 ед/г Hb. Содержание эритроцитарной Cu,Zn-СОД=365 нг/г Hb. Увеличение КФМ_СОД от 0,39 до 1,88 свидетельствует об эффективности терапии и о значительном уменьшении выраженности окислительного стресса.

В практическом отношении значительно проще использовать тест, основанный на выявлении карбонил-зависимой модификации других белков крови. Определено, что при ИБС происходит значительное снижение активности, но не содержания Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД) в эритроцитах больных, тем не менее содержание фермента остается практически неизменным. В таблице 1 показана активность Cu,Zn-СОД и содержание Cu,Zn-СОД в эритроцитах больных ИБС.

В модельных экспериментах было установлено, что в процессе инкубации эритроцитов человека в присутствии МДА молекулы МДА быстро проникают через весьма ригидную эритроцитарную мембрану, вызывая подавление активности Cu,Zn-СОД. Следовательно, альдегид-зависимая модификация Cu,Zn-СОД действительно приводит к ингибированию активности фермента.

Учитывая сравнительную простоту метода измерения активности Cu,Zn-СОД и доступность тест-наборов для осуществления такого рода определений, можно утверждать, что выявление снижения активности Cu,Zn-СОД в эритроцитах указывает на наличие окислительного стресса, причем, на основании полученных ранее данных, нормализация активности Cu,Zn-СОД при ИБС, может свидетельствовать об эффективности проводимой терапии. Тем не менее, более надежным показателем, однозначно свидетельствующим об окислительной модификации Cu,Zn-СОД, может быть отношение активности Cu,Zn-СОД к содержанию Cu,Zn-СОД в эритроцитах больных.

Таким образом, предлагаемый принципиально новый маркер окислительного стресса имеет неоспоримые преимущества перед существующими маркерами вследствие простоты и быстроты осуществления анализов, высокой чувствительности, доступности необходимого оборудования и реагентов, а также возможности длительного хранения образцов эритроцитов до анализа (в течение 2-3 месяцев при температуре не выше -20°С). Теоретическое обоснование использования предлагаемого маркера в качестве параметра, отражающего физиологическое действие МДА in vivo позволяет полностью отказаться от широко распространенного теста на окислительный стресс по определению «уровня МДА» с 2-ТБК, являющегося источником многочисленных ошибок и основы некорректной интерпретации получаемых данных.

Таким образом, определение КФМ_СОД может быть альтернативным и точным показателем оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни. Способ оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца путем исследования крови, включающий определение активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД), ед/г гемоглобина и содержание Сu,Zn-СОД, нг/г гемоглобина в эритроцитах крови больных ишемической болезнью сердца, до начала терапии и после неё, по полученным данным проводят расчет коэффициента модификации Cu,Zn-СОД по формуле: КФМ_СОД = активность Cu,Zn-СОД / содержание Cu,Zn-СОД, и при изменении исходных значений КФМ_СОД от 1,5 и выше свидетельствует об эффективности проводимой терапии. Вышеописанный способ позволяет точно оценить эффективность проводимой терапии. 1 табл., 3 пр.

Способ оценки эффективности лекарственной терапии ишемической болезни сердца путем исследования крови, отличающийся тем, что в эритроцитах крови больных ишемической болезнью сердца определяют активность Cu,Zn-супероксидцисмутазы (Cu,Zn-CОД), ед/г гемоглобина и содержание Cu,Zn-СОД, нг/г гемоглобина, вычисляют коэффициент модификации Cu,Zn-СОД по формуле: КФМ_СОД = активность Cu,Zn-СОД / содержание Cu,Zn-СОД и при изменение исходных значений КФМ_СОД от 1,5 и выше свидетельствует об эффективности проводимой терапии.