СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/92 

Способ относится к области медицины и может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы оценки эффективности лечения ИБС путем оценки уровня липопротеинов (ЛП) крови (А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева //Липиды, липопротеиды и атеросклероз, 1995, Питерпресс, стр. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н. Н. Шацкая //Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. Методы исследований в профпатологии, М., 1988, стр. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лабораторные методы исследования. Под редакцией В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, с. 248-249).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить ЛП (а), кроме ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ХМ. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови. Концентрация ЛП (а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 2х20 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови для исследования.

Целью предлагаемого способа является повышение его точности.

Указанная цель достигается техническим решением, представляющим собой проведение дополнительной инкубации сыворотки крови с красителем суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате и исследование образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом и последующей денситометрией фракций ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

Новым в данном способе является дополнительная инкубация пробы сыворотки крови с суданом Б в течение часа в темном термостате при температуре 40^oС и заготовка лунки в геле агарозы для внесения исследуемого образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой в способе-прототипе. Лунка изготавливается с помощью стального бруска с площадью основания 4•20 мм, а не 2•20 мм как в способе-прототипе. Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Дополнительная инкубация сыворотки крови с красителем суданом Б повышает сродство красителя к ЛП крови, а увеличение объема, взятого для исследований образца крови, позволяет выявить ЛП (а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях, что позволяет повысить точность способа и получить желаемый результат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие классы ЛП: ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а) и проводить последующую денситометрию фракций ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

В случае снижения уровня ЛП (a) у больных ИБС после лечения на 50% и более терапию заболевания считают эффективной. Впервые эффективность терапии ИБС оценивалась по изменению уровня ЛП (а) после денситометрии электрофореграммы ЛП крови.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения "Новизна", "Практическая применимость", "Изобретательский уровень".

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови, относящийся к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%. НЭХС - 14%, ФЛ - 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания-противосвертывания крови. При росте концентрации ЛП(а) в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин гетерогенен. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) в атерогенезе.

ЛП(а) может взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на В, Е - активность ГМК - Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длиннее, чем у ЛПНП и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л и обычными методами исследования ЛП(а) определить невозможно. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^а, II^б типами гиперлипопротеидемий. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а). Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет па повышенный уровень ЛП(а). Результаты мировых популяционных исследований показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а).

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лабораторное дело, 1980, 5, стр.287-290).

Метод основан на электрофоретической подвижности ЛП крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных чертежей.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55^oС, добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 20х4 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) к 0,3 мл сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;
4) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
5) электрофореграмму фиксируют в 5%-ном растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96%-ным этиловым спиртом;
6) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика на хроматограмме по формуле S= h•B1/2h, где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине его высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе, и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП и ЛП(а), если она есть по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракции ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (n=10) и предлагаемого способа (n=12) выявлены ХМ, ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП (фиг.1 и 2).

Авторами обследованы 2 группы больных ИБС по 14 для способа-прототипа - I группа и 21 пациент - II группа для проведения электрофореза ЛП с помощью предлагаемого способа.

У пациентов I группы до лечения выявились ХМ, ЛПНП и ЛПОНП, реже ЛПВП (фиг.3, 4 и 5).

У пациентов П группы до лечения с наличием гиперхолестеролемии (ГХС) в пределах 7,5-14,6 ммоль/л холестерола в крови (среднее значение ХС 8,3±0,6 ммоль/л) кроме фракций ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП в зоне между ЛПНП и ЛПОНП выявлена фракция ЛП(а).

В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца с суданом Б 1 ч в темном термостате при температуре 40^oС и внесении его в лунку 2•20 мм либо только увеличении объема лунки до 4х20 мм без дополнительной инкубации пробы фракции ЛПНП и ЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а ЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно (фиг.5, 6).

У остальных пациентов этой группы фракция ЛП(а) не выявлена. Их было 5 человек.

После лечения ИБС через 24 дня у пациентов I группы фракции ЛПНП и ЛПОНП были менее интенсивными (фиг.7 и 8).

После лечения ИБС через 24 дня у пациентов II группы выявились менее интенсивно выраженные фракции ЛПНП и ЛПОНП, как и в предыдущей группе. Фракция же ЛП(а) либо полностью отсутствовала у 12 пациентов, либо ее интенсивность снижалась более чем на 50% у 9 больных ИБС этой группы (см. клинические примеры). Среднее значение снижения уровня ЛП(а) у больных ИБС этой группы после лечения по сравнению с исходным составило 58±4%. Результаты лабораторного исследования анализировались в комплексе с клиническими данными. Заключение специалистов - лечение ИБС эффективное, о чем свидетельствуют не только данные клинического обследования пациентов, но и результаты лабораторных анализов.

Пример 1. Больной Б, 44 года, история болезни 69, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца колющего характера. На ЭКГ рубцовые изменения в переднеперегородочной области. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине повышения артериального давления. АД 160/100 мм рт.ст., пульс в покое 60 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 8,1 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,8 ммоль/л
ХС ЛПВП - 0,9 ммоль/л,
Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по способу-прототипу представлены на фиг.9, а по предлагаемому способу - на фиг.10. Фракция ЛП(а) присутствует.

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-II.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 6,0 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,4 ммоль/л
ХС ЛПВП-1,3 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу представлены на фиг.11.

Фракция ЛП(а) отсутствует.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь, стенокардия напряжения, ФК-II. Заключение: лечение эффективное.

Пример 2. Больной А, 47 лет, история болезни 41, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска с жалобами на боли в области сердца, иррадиирующие под лопатку. На ЭКГ значительных изменений не выявлено. ВЭМ прекращена при нагрузке 75 Вт по причине возникшей боли за грудиной. На ЭКГ появилась косовосходящая депрессия сегмента ST в отведениях V4-V6. АД 130/90 мм рт.ст., пульс в покое 65 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 9,4 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,5 ммоль/л
ХС ЛПВП- 1,0 ммоль/л.

Результаты электрофореза ЛП крови до лечения по предлагаемому способу представлены на фиг. 12. Результаты денснтометрии ЛП: ЛПНП - 58%, ЛПОНП - 21%, ЛПВП - 16%, ЛП(а) - 5%.

Диагноз при поступлении: ИБС, стенокардия напряжения, ФК-III.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 6,3 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,4 ммоль/л
ХС ЛПВП - 1,2 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.13.

Результаты денситомегрии ЛП: ЛПНП - 41%, ЛПОНП - 27%, ЛПВП - 30%, ЛП(а)-2%.

Диагноз при выписке: ИБС, стенокардия напряжения, ФК-II. Снижение уровня ЛП(а) на 60% по сравнению с исходным свидетельствовало об эффективности лечения ИБС.

Итак, при применении способа-прототипа оценка эффективности терапии ИБС проводилась по клинической картине заболевания и уровню липидов крови, что свидетельствовало о недостаточной точности способа (см. фиг.7 и 8). Оценка эффективности терапии по способу-прототипу не превышала 60%.

У пациентов II группы (21 человек) ЛП(а) выявлены не были, поэтому оценка эффективности терапии в этой подгруппе пациентов проводилась по клинико-лабораторным данным общепринятым методом.

У остальных 16 пациентов фракция ЛП(а) выявлена и точность определения эффективности лечения ИБС составила у них 100%, т.к. после лечения фракция ЛП(а) либо не выявлялась, либо значительно снижалась. Следовательно, после комплексной терапии ИБС с помощью диеты, дозированной физической нагрузки, назначения препаратов, содержащих никотиновую кислоту с витаминами, применения нитратов пролонгированного действия, физиотерапевтического лечения ЛП(а) в сыворотке крови либо значительно снижались, либо достигали исходного значения и не выявлялись при электрофоретическом исследовании ЛП крови.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволило выявить у больных ИБС с выраженной ГЛП наличие ЛП(а) во фракции ЛП до лечения заболевания и полное отсутствие этой фракции либо снижение ее интенсивности на 50 и более процентов после лечения ИБС, что свидетельствовало о высокой эффективности проведенной терапии. Способ применен у 57 пациентов.

Применение предлагаемого способа определения эффективности лечения ИБС в отличие от способа-прототипа позволило выявить дополнительную фракцию ЛП(а), оценить ее снижение после проведенной курсовой терапии заболевания и повысить точность способа. С помощью способа-прототипа такие результаты получить не удалось, т.к. фракцию ЛП(а) выявить было невозможно ни до, ни после лечения ИБС. Ложноположительных случаев оценки эффективности лечения ИБС не наблюдалось.

При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов и может быть внедрен в клиническую практику.

Способ относится к медицине, а именно к кардиологии. Способ обеспечивает повышение точности оценки эффективности лечения ИБС. Определяют уровень ЛП(а) путем инкубации сыворотки крови больного с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4•20 мм для электрофореза и последующей денситометрии. При снижении уровня ЛП(а) после их денситометрии на 50% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение ИБС как эффективное. Способ прост в использовании интерпретации полученных результатов. 13 ил.

Способ оценки эффективности лечения ишемической болезни сердца путем исследования сыворотки крови до и после лечения, отличающийся тем, что определяют уровень ЛП(а) путем инкубации сыворотки крови больного с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС, и затем внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4•20 мм для электрофореза и последующей денситометрии и при снижении уровня ЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение ишемической болезни сердца как эффективное.