Способ диагностики врожденного вирусного заболевания плода Российский патент 2020 года по МПК G01N33/53 

Данное изобретение относится к области медицины, точнее к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано в клинической практике для комплексной диагностики врожденных вирусных инфекций в антенатальном периоде с целью предупреждения развития заболевания плода и новорожденного.

Врожденные инфекции (ВИ) являются актуальной мировой медико-социальной проблемой в виду повсеместного распространения, высокого уровня инвалидизации и перинатальной смертности. Истинная частота ВИ до настоящего времени не установлена, но, по данным ряда авторов, распространенность указанной инфекционной патологии в человеческой популяции может достигать 10% и выше от числа живорожденных детей. В то время как частота выявления ВИ в патологоанатомической практике колеблется от 2 до 65,5%. Разноречивые статистические показатели по ВИ объясняются трудностями этиологической верификации данной патологии во всем мире.

Основу современной диагностики рисков развития ВИ у женщин и новорожденных составляют различные методы лабораторной идентификации маркеров инфекционных заболеваний (серологические, молекулярные, культуральные). В настоящее время известно около 50 инфекционных агентов, которые могут быть переданы от матери плоду с развитием ВИ, среди которых доминируют вирусные инфекции. Однако в стандарт наблюдения за беременными в РФ не входит обследование на такие распространенные в популяции вирусные инфекции, как: герпесвирусная инфекция 1,2 типа (ВПГ 1,2) и цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), кроме острого заболевания, сопровождавшегося мононуклеозоподобным синдромом (лимфоаденопатия, длительный субфебрилитет и т.д.), а также парвовирусная инфекция.

Принимая во внимание широкое распространение врожденных вирусных инфекций, высокий уровень перинатальной смертности, тяжесть прогноза заболеваний, а также учитывая низкую настороженность в отношении вирусных врожденных инфекций, трудность их этиологической диагностики, недостаточный уровень взаимодействия между системой оказания акушерско-гинекологической помощи и службой инфекционистов, можно сделать вывод, что разработка методов комплексной пренатальной диагностики врожденных инфекций является одной из приоритетных задач современной медицины.

Известен «Способ диагностики внутриутробной инфекции (ВУИ)» (RU №2444293 С1), в котором рекомендовано во втором триместре беременности у женщин из группы риска по внутриутробной инфекции оценивать комплекс показателей, выражаемых в баллах. Преимуществом данного подхода является интегративная ранжированная полуколичественная оценка ряда несвязанных между собой показателей, что позволяет снизить влияние субъективного мнения пользователя на окончательный результат. К недостаткам можно отнести отсутствие связи между собственно диагностированной внутриутробной инфекцией и ее этиологией, что делает невозможным дифференцированные терапевтические подходы.

Известен способ выделения среди беременных групп риска развития врожденного токсоплазмоза на основании интегративных данных эпид. анамнеза и первичного определения специфических Ig М и Ig G в первом триместре гестации (Лобзин Ю.В. Токсоплазмоз у беременных / Лобзин Ю.В., Тимченко В.Н., Васильева И.С.// Российский медицинский журнал. - 2001. - №4. - С. 24-27.). Авторы предлагают распределять беременных на 4 группы (инфицированные Т. gondii до беременности; инфицирование во время данной беременности; инфицирование отсутствует; пациенты, которые не могут быть отнесены к первым трем группам на основании однократного обследования).

К недостаткам описанной методики можно отнести ограниченность ее одной патологией (токсоплазмоз) и необходимость применения высокоспецифичных тест-систем для определения антител, что увеличивает стоимость обследования.

Известен метод применения алгоритмов оценки результатов определения специфических антител и авидности Ig G (Савичева A.M. Проблемы диагностики и терапии репродуктивно значимых инфекций / Савичева A.M. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Т. LV, №2. - С. 76-84.). В данном способе наличие в крови специфических IgM при отсутствии IgG отражает начало острой инфекции, что определяет показания к терапии при инвазии токсоплазмами или прерывания беременности при краснухе. Наличие у беременной лишь IgG к антигенам токсоплазмам, вируса краснухи свидетельствует о наличии инфекции, перенесенной до настоящей беременности и, соответственно, об отсутствии необходимости в терапевтических мероприятиях. При этом, по мнению автора, об инфекции, впервые возникшей во время беременности, свидетельствует величина авидности IgG ниже 30%, а об инфекции в относительно далеком прошлом - величина авидности выше 40%. Недостатком этого способа является неизвестная до сегодняшнего дня числовая характеристика динамики авидности специфических антител, определяемая на тест-системах отечественного производства (для обоих заболеваний) и импортных аналогах (для краснухи).

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ прогнозирования риска внутриутробного инфицирования новорожденного» (RU №2518541). Авторы предлагают для прогнозирования риска внутриутробного инфицирования новорожденного определять показатели, характеризующие течение беременности: экстрагенитальная патология матери во время беременности, гинекологические заболевания в анамнезе, инфекционные заболевания, перенесенные матерью во время беременности, данные УЗ-исследования плода в период беременности, полученные показатели оценивают в баллах. Полученные баллы суммируют, определяя тем самым значение индекса риска внутриутробного инфицирования новорожденного (ИРВИ). При величине ИРВИ 1-4 балла определяют низкую степень риска, 5-9 баллов - среднюю, 10-19 баллов - высокую степень риска внутриутробного инфицирования новорожденного. Однако данный способ, несмотря на попытку объединить целый комплекс факторов риска внутриутробного инфицирования, обладает рядом недостатков. Так, по словам авторов, способ позволяет прогнозировать риск развития внутриутробного инфицирования новорожденного, однако все перечисленные критерии оценивают в антенатальном периоде, что свидетельствует скорее о риске инфицирования плода. Как уже упоминалось ранее, в ситуации с новорожденным целесообразнее подтверждать или исключать наличие конкретной врожденной инфекции, а не заниматься оценкой рисков, что неминуемо удлинит сроки диагностического поиска и негативно отразится тем самым на прогнозе заболевания в случае его наличия. В данном способе предпринята попытка комплексной оценки ряда имеющихся клинико-лабораторных и инструментальных данных, характеризующих течение беременности, с определением ранжированных границ групп риска по внутриутробному инфицированию, что в целом повышает объективность восприятия полученных результатов, однако демонстрирует тем самым унифицированный подход к диагностике внутриутробных инфекций, что можно отнести к недостаткам способа, так как в этом случае диагностируется не конкретное инфекционное заболевание, а некий его риск, который сам по себе не позволяет прогнозировать тактику ведения таких пациентов. Кроме того, в описании способа одним из критериев является наличие у беременной инфекционной патологии, относящейся к TORCH-комплексу, а именно: токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная инфекция, герпесвирусная инфекция, хламидиоз, микоплазмоз. Однако не указано, какими методами и в какие конкретно сроки проводится обследование, не оговорены показания к диагностике перечисленных инфекций, учитывая, что при скрининговом обследовании беременных в РФ некоторые из перечисленных инфекций не являются обязательными для диагностики. Так в РФ в стандарт наблюдения за беременными не входит обследование на герпетические инфекции (ВПГ 1,2 типа и ЦМВИ), кроме острого заболевания, сопровождавшегося мононуклеозоподобным синдромом - лимфоаденопатия, длительный субфебрилитет и т.д. (Приказ МЗ РФ №572н от 2012 г). Обследование беременных с целью оценки риска врожденной ПВИ федеральными документами не предусмотрено. Таким образом, данный способ не обеспечивает точности диагностики врожденного вирусного инфекционного заболевания (ВИЗ).

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ диагностики врожденного вирусного инфекционного заболевания. Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности диагностики за счет комплексной оценки факторов риска.

Это достигается тем, что путем комплексной оценки факторов риска, авторы предлагают последовательно в крови беременных определять величину специфических IgM и IgG антител, затем при значении специфических IgM выше порога чувствительности реакции более чем в два раза количественно определяют вирусные нагрузки методом полимеразной цепной реакции, при значении их более 10⁴ копий в мл сыворотки крови осуществляют УЗИ-мониторинг плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели и, при выявлении визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более диагностируют врожденное вирусное заболевание плода.

При анализе результатов собственных многолетних исследований нами было обнаружено, что оценка риска развития наиболее частных врожденных вирусных инфекционных заболеваний (ЦМВИ, парвовирусная инфекция, инфекция вирусами простого герпеса) в антенатальном периоде и их антенатальная диагностика во многом определяются параметрами отбора беременных для углубленного обследования. Наиболее часто возбудители этих заболеваний передаются от матери плоду в острой инфекции (первичном заражении) во время беременности (частота передачи в этом случае в среднем составляет 50%, при реактивации - в 10-15 раз реже). Этот фактор определяет убеждает нас в целесообразности определения тех групп беременных, которые в первую очередь нуждаются в лабораторном обследовании с целью выявления острых инфекций.

Широкая распространенность латентной формы этих инфекций в популяции, технические трудности в разграничении острой и реактивированной инфекции обусловливают экономическую нецелесообразность тотального лабораторного скрининга беременных. Нами установлено, что с эпидемиологической точки зрения в число беременных, подлежащих лабораторному обследованию, целесообразно включать тех из них, у кого имеются наибольшие шансы первичного заражения: возраст, частота контакта с возможными источниками инфекции с учетом механизмов передачи возбудителей.

При обследовании более 1000 беременных нами было обнаружено, что наибольшая частота острой цитомегаловирусной инфекции регистрируется у женщин в возрастной группе до 20-25 лет, что определяется особенностями реализации естественных путей передачи: частый контакт с потенциальными источниками инфекций с воздушно-капельным механизмом передачи в процессе обучения в школе и ВУЗе, начало половой жизни с возрастающей возможностью реализации контактного механизма. Кроме того, в рамках указанного возраста (до 25 лет) у части женщин уже есть дети, которые могут посещать детские образовательные учреждения (а сами женщины - в них работать), что определяет более высокую частоту контакта с детьми дошкольного возраста, которые становятся источниками вирусных инфекций как для своих родителей, так и для персонала детских учреждений.

Нами было доказано, что частота острых вирусных инфекций (частота сероконверсии) в этой возрастной группе беременных (до 25 лет) составляет около 1% в год, в то время как в более старших группах не превышает 0,5%. Этот факт обусловливает необходимость включения возрастного ценза в критерии отбора беременных для обследования на предмет наличия острой вирусной инфекции.

Кроме того, нами установлено, что частота первичной (острой) вирусной инфекции среди беременных, работающих в детских образовательных учреждениях или имеющих старших детей, посещающих такие учреждения, также существенно выше и составляет до 1,2% в год (у беременных, не соответствующих этим критериям - около 0,4-0,7% в год, р=0,53).

Нами обнаружено, что при обследовании беременных, имевших в ходе беременности ОРЗ-подобные заболевания, примерно в 2% случаев имевшиеся симптомы были обусловлены именно вирусными инфекциями, возбудители которых способны передаваться от матери плоду (в первую очередь - цитомегаловирус и парвовирус B19V). При этом, с учетом того, что риск тяжелого поражения плода максимален при острой инфекции у беременной в ее первой половине, эта категория беременных также подлежит лабораторному обследованию.

Исходя из полученных данных мы и рекомендуем, при установлении беременности и принятии беременной решения о ее сохранении, с целью отбора для лабораторного обследования для определения риска врожденных ВИЗ исходить из возраста беременной, наличия (отсутствия) ОРЗ-подобного заболевания в первой половине беременности и наличия (отсутствия) относительно более тесного контакта с основными источниками инфекции (наличие в ближайшем окружении детей, посещающих детские образовательные учреждения, или работа в таких учреждениях самой беременной). Естественно, что чем больше таких факторов риска выявляется у отдельной беременной, тем больше показаний для ее обследования. Однако, учитывая сопоставимость частоты выявления отдельных факторов риска острых вирусных инфекций (в пределах 0,5-1,5%), обнаружение любого из них позволяет включать этих беременных в группу, подлежащую лабораторному обследованию.

На основании многочисленных собственных исследований, нами было показано, что наиболее доступным, экономически оправданным и, вместе с тем, достаточно информативным методом лабораторного обследования беременных на наличие риска острых инфекционных заболеваний, возбудители которых могут быть переданы плоду, является определение величин специфических IgM и IgG к антигенам вирусов в сыворотке крови методом ИФА. При этом различия в чувствительности и специфичности тест-систем разных производителей или эффективности аппаратуры учета разного происхождения на сегодняшний день не принципиальны.

Мы обнаружили, что выявление специфических IgM величиной выше порога чувствительности реакции более чем в два раза является маркером острой инфекции, либо ее реактивации, либо заражения другим штаммом того же возбудителя. Все три ситуации несут риск передачи возбудителя от матери плоду, поэтому величина специфических IgG, равно как и сам факт их наличия или отсутствия, самостоятельного значения не имеют.

Для точной оценки «активности» возбудителей вирусных инфекций нами используется ПЦР в «реальном времени», позволяющая посчитать примерное количество копий ДНК (РНК) микроорганизма в единице объема исследуемого субстрата (вирусная нагрузка, ВН). При этом более высокое количество копий рассматривается как маркер более активной репликации и более активно протекающего инфекционного процесса.

Нами впервые показано, что для большинства вирусов, чаще всего являющихся причиной ВИЗ (цитомегаловирус, парвовирус B19V, вирусы простого герпеса, энтеровирусы), критическим порогом является ВН более 10⁴ копий в мл лейкоконцентрата. Именно при такой ВН чаще всего происходит передача вирусов от матери плоду, что позволяет рекомендовать этот маркер в качестве ключевого для дальнейшего отбора беременных с более высокими рисками ВИЗ и их последующего мониторинга.

Мы впервые показали, что при выявлении специфических IgM величиной выше порога чувствительности реакции более чем в два раза и выявление признаков высокой репликации вируса (ВН более 10⁴ копий в мл лейкоконцентрата) в крови у беременной с целью сохранения беременности и рождения здорового ребенка, необходимо проведение УЗИ-мониторинга плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели для выявления возможных признаков патологии.

Нами показано, что обнаружение визуализационных признаков патологии развития плода в антенатальном периоде является поводом к выполнению кордоцентеза в сроке гестации 20 недель и более с исследованием пуповинной крови методом ПЦР методикой качественного определения (без учета ВН).

По выявленным нами данных диагностика врожденного вирусного заболевания плода осуществляется при наличии визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более.

В доступной нам литературе подобных способов диагностики врожденного вирусного заболевания плода не обнаружено, а совокупность предложенных признаков, неочевидность, новизна, эффективность и изобретательский уровень позволяет нам представить способ, как заявочный материал на изобретение. Объектом исследования стали более 1000 беременных.

Способ реализуется следующим образом: последовательное применение отбора беременных для выявления группы максимального риска врожденных вирусных инфекционных заболеваний и их обследования. Определяют женщин группы высокого риска врожденных ВИЗ, исходя из возраста беременной, наличия (отсутствия) ОРЗ-подобного заболевания во время беременности и наличия (отсутствия) относительно более тесного контакта с основными источниками инфекции (наличие в ближайшем окружении детей, посещающих детские образовательные. К группе высокого риска по развитию ВИЗ относят беременных в возрасте до 25 лет, перенесших ОРЗ-подобное заболевание во время беременности, имеющих старших детей, посещающих детские образовательные учреждения.

При первичной постановке на учет у беременной, относящейся к группе высокого риска по ВИЗ, в венозной крови методом ИФА определяют специфические иммуноглобулины классов М (с расчетом коэффициента) и G (количественно) к вирусам простого герпеса 1/2 типов, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V. При выявлении специфических IgM величиной выше порога чувствительности реакции более чем в два раза (независимо от величины IgG), беременную относят к группе максимального риска развития врожденного ВИЗ.

Вирусные нагрузки в сыворотке крови беременной определяют количественно в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением наборов реагентов для амплификации и/или обратной транскрипции и амплификации ДНК вирусов простого герпеса 1/2 типов, цитомегаловируса, парвовируса B19V.

При величине вирусной нагрузки более 10⁴ копий в мл осуществляют УЗИ-мониторинг плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели.

В случае выявления, по данным ультразвукового исследования беременной, визуализационных признаков поражения плода на сроке гестации 20 недель и более выполняют кордоцентез с последующим забором пуповинной крови плода на исследование методом ПЦР методикой качественного определения ДНК вирусов простого герпеса 1/2 типов, цитомегаловируса, парвовируса B19V.

Диагностика врожденного вирусного заболевания плода осуществляется при выявлении визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более.

Врожденное вирусное инфекционное заболевание плода диагностируют при наличии визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM в венозной крови беременной в отсутствии или наличии IgG в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и в пуповинной крови.

Эффективность предполагаемого способа диагностики врожденного вирусного заболевания плода может быть подтверждена конкретными клиническими примерами.

Пример 1.

Первородящая молодая (25 лет) беременная Е. Из анамнеза известно, что антител к ЦМВИ не выявлено. На сроке 18-20 недель беременности женщина перенесла ОРВИ, после которого была повторно обследована: обнаружены антитела IgM и IgG к ЦМВ, выделена ДНК ЦМВ в сыворотке крови (10⁶ копий/мл). На II УЗ-скрининге на сроке беременности 20 недель 4 дня впервые за время наблюдения диагностировали патологию развития плода в виде долихоцефалической деформации головы, повышения эхогенности перивентрикулярных зон белого вещества головного мозга с очагом окостенения в периорбитальной зоне, гиперэхогенного кишечника, асцита.

Пациентка была экстренно госпитализирована на 21-ой неделе беременности. С диагностической целью был проведен трансабдоминальный кордрцентез с забором пуповинной крови плода для исследования. Вирусологическое исследование методом ПЦР выявило наличие ДНК ЦМВ в пуповинной крови плода. По совокупности данных, была диагностирована врожденная цитомегаловирусная инфекция плода.

В данном примере продемонстрирован случай впервые выявленной острой ЦМВИ у молодой беременной женщины из группы риска развития ВИЗ, которая, была своевременно последовательна обследована на ЦМВИ после перенесенной ОРВИ во II триместре, что позволило своевременно выявить патологию развитию плода, по данным УЗИ и провести вирусологическое исследование плода, подтвердившее внутриутробную цитомегаловирусную инфекцию в антенатальном периоде.

Пример 2.

Повторнородящая женщина (беременность 2-я), 24 год. Первая беременность закончилась рождением здоровой девочки; на момент настоящей беременности девочке исполнилось 4 года.. На сроке 13 недель женщина перенесла ОРВИ с лихорадкой до 39°С, выраженным ознобом без катарального синдрома. Через 10 дней от начала заболевания (на 15-й неделе беременности) у женщины появилась сыпь на щеках, груди, предплечьях, голенях. На 17-ой недели беременности пациентка была проконсультирована инфекционистом, при обследовании выявлено: ДНК ПВВ19 (+) методом ПЦР в крови, IgM (+) IgG (+) к ПВ в крови методом ИФА. По совокупности данных у пациентки диагностировали острую парвовирусную инфекцию, был рекомендован УЗИ-мониторинг плода. На сроке 20 недель беременности, по данным УЗ-исследования плода (II скрининг), впервые была определена патология развития плода - неиммунный отек плода (асцит). На 22-й неделе беременности проведено дополнительное УЗИ плода с доплерометрией, подтвержден неимунный отек плода, впервые выявлены признаки тяжелой анемии у плода. По результатам обследования беременная была госпитализирована в отделение патологии беременности родильного дома. На сроке 22 4/7 недель беременности пациентке был проведен трансабдоминальный кордоцентез с забором пуповинной крови плода на исследование. При вирусологическом исследовании в пуповинной крови плода методом ПЦР выявлена ДНК ПВВ19. Анализ пуповинной крови плода подтвердил наличие у него анемии (гематокрит - 16%). По совокупности данных, была диагностирована врожденная парвовирусная инфекция плода.

Данный случай демонстрирует пример острой парвовирусной инфекции у женщины из группы риска по развитию ВИЗ, которая привела к инфекционному поражению плода с развитием симтомакомплекса врожденной парвовирусной В19 - инфекции, которую благодаря комплексной оценке факторов риска удалось подтвердить антенатальном периоде.

В заключение следует отметить, что по экспертным данным экономический ущерб от врожденных инфекций в РФ может ежегодно составлять до 10 млрд. рублей. Реализация современного способа комплексной диагностики врожденных инфекций вирусной этиологии позволит значительно сократить финансовые затраты государства, предотвратив рождение детей с тяжелыми органными нарушениями, снизить уровень младенческой смертности от инфекционных заболеваний, перенесенных внутриутробно. Кроме того, своевременная пренатальная диагностика ВИЗ открывает новые терапевтические возможности с использованием современных высокотехнологических методов медицинской помощи, способствуя тем самым улучшению исходов ВУИ и, как следствие, оздоровлению нации в целом. Полученный успешный опыт совместной работы акушерско-гинекологической помощи и инфекционной службы в этой области является перспективным и может служить основой для внесения ряда изменений в порядок оказания медицинской помощи по данному профилю, способствуя тем самым модернизации научных представлений в области инфекционных заболеваний матери, плода и ребенка.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для диагностики врожденного вирусного заболевания плода. Для этого в крови беременных определяют величину специфических IgM и IgG антител, и при значении специфических IgM выше порога чувствительности реакции более чем в два раза количественно определяют вирусную нагрузку методом полимеразной цепной реакции. При ее значении более 10⁴ копий в мл сыворотки крови осуществляют УЗИ-мониторинг плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели, и при выявлении визуализационных признаков поражения плода на сроке гестации 20 недель и более выполняют кордоцентез с последующим забором пуповинной крови для исследования методом ПЦР. При выявлении визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более диагностируют врожденное вирусное заболевание плода. Способ позволяет предотвратить рождение детей с тяжелыми органными нарушениями и снизить уровень младенческой смертности от инфекционных заболеваний, перенесенных внутриутробно, за счет своевременной пренатальной диагностики. 2 пр.

Способ диагностики вирусного заболевания плода, включающий комплексную оценку факторов риска у беременных, перенесших ОРВИ, определение специфических IgM и IgG антител в крови беременной, УЗ-исследование плода, отличающийся тем, что последовательно в крови беременных определяют величину специфических IgM и IgG антител, и при значении специфических IgM выше порога чувствительности реакции более чем в два раза количественно определяют вирусную нагрузку методом полимеразной цепной реакции, при ее значении более 10⁴ копий в мл сыворотки крови осуществляют УЗИ-мониторинг плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели, и при выявлении визуализационных признаков поражения плода на сроке гестации 20 недель и более выполняют кордоцентез с последующим забором пуповинной крови для исследования методом ПЦР, и при выявлении визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более диагностируют врожденное вирусное заболевание плода.