СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВНУТРИУТРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ПЛОДА ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР Российский патент 2006 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и перинаталогии, и найдет применение как метод обследования беременных высокого перинатального риска в 2-3 триместрах гестации для прогнозирования степени риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) является одной из важнейших медико-социальных проблем современного акушерства и перинаталогии. ВУИ неблагоприятно влияет на течение беременности, родов, послеродового периода. По данным разных авторов ВУИ развивается у 27,4-36,6% детей, рожденных живыми, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает 1-3 места (О.А.Пустотина, Н.И.Бубнова // Диагностика внутриутробной инфекции (компоненты последа и амниотической жидкости). - Акушерство и гинекология - 1999, 4, - с.3-5; Б.Л.Гуртовой, А.С.Анкирская, Л.В.Ванько, Н.И.Бубнова // Внутриутробные бактериальные и вирусные инфекции плода и новорожденного. - Акушерство и гинекология - 1994, 4, - с.20-26). По данным некоторых авторов, только в течение 6 мес наблюдения в г. Киеве ВУИ была выявлена у 23% обследованных младенцев, при этом в структуре ВУИ 62,1% составил вирус Эпштейна-Барра (И.С.Марков и др. /PCR-мониторинг основных TORCH-инфекций (токсоплазмоз, CMV, HSV, TBV) в патологии новорожденных в г.Киеве. - Репродуктивное здоровье женщины. - 2002. - №2(11), - с.122-129).

Вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ) содержит ДНК в форме двойной спирали, относится к группе герпес-вирусов человека, обладает лимфотропностью к В-клеткам. Вирус Эпштейна-Барра отвечает за множество заболеваний, сходных с инфекционным мононуклеозом, лимфомой Беркитта, а также носоглоточной карциномой. Кроме того, роль вируса обсуждалась в связи с болезнью Ходжкина. Главным образом у подростков появляется синдром воспаления гланд, который называется инфекционным мононуклеозом (острый эпизод ВЭБ инфекции). Первичная инфекция в основном поражает детей раннего возраста, а также малообеспеченные слои населения и популяции в развивающихся странах. Инфекционный мононуклеоз обусловливает большинство случаев данного заболевания среди подростков и молодых взрослых. Внутриутробное инфицирование ВЭБ приводило к поражению ЦНС у новорожденных, энцефалиту и отеку головного мозга, врожденным порокам развития ((К.Фризе, В.Кахель // Инфекционные заболевания беременных и новорожденных. - М., - Медицина, - 2003, - с.107), И.С.Марков и др., 2002).

Выявление внутриутробно инфицированных плодов имеет особое значение еще и потому, что ВУИ протекает во время беременности без выраженной симптоматики, при этом либо отсутствуют клинические проявления у матери, либо они неспецифичны и инфекция протекает по типу "острого респираторного заболевания". Окончательный диагноз внутриутробной инфекции в большинстве случаев ставится после рождения ребенка на основании лабораторных методов исследования. У некоторых новорожденных специфические симптомы инфекции отсутствуют. В этом случае особое значение приобретают методы дородовой диагностики, которые позволяют выявить внутриутробно инфицированный плод, уточнить этиологию инфекции у матери и провести необходимую терапию матери и ребенку до и сразу после рождения. По данным мировой литературы и опыту нашей страны достоверных методов дородовой диагностики ВУИ еще не найдено.

В настоящее время возможность развития внутриутробной инфекции (ВУИ) допускают, как правило, при вираже серологических реакций /РСК, ИФА и др./ у беременной женщины, т.е. в тех случаях, когда серонегативность крови обследуемых сменяется серопозитивностью, что указывает на недавнее инфицирование. Еще более веским аргументом, указывающим на острый процесс, является обнаружение специфических 1g М-антител. Однако установлено, что находки последних в крови обследуемых возможны в ограниченном интервале времени от 2-х недель до 4-х месяцев с момента инфицирования / Базаламах А.Г., Серебур Ф.Е. Инфицирование плода и новорожденного, В кн. Репродуктивное здоровье / под ред. Кейта Л.Г. и др./. М., Медицина, 1988, т.2, с.251-262/. В этих случаях назначают соответствующие профилактические и лечебные мероприятия с целью предупреждения манифестации внутриутробной инфекции у новорожденного ребенка. Однако серологический профиль, незаменимый еще несколько лет назад, в настоящее время лишь косвенно может дать представление об истинной роли ВУИ. Низкая информативность серологических методов обследования у новорожденных связывают с иммунологической толерантностью, обусловленной незрелостью иммунной системы и супрессивным действием вирусных агентов в результате их трансплацентарной передачи плоду, поэтому актуальным остается вопрос пренатальной диагностики ВУИ (Нисевич Л.Л. и др. // К вопросу о диагностике внутриутробной инфекции у новорожденных. - Акушерство и гинекология. - 1998, - №3, - с.16-20).

Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода генерализованной формы по патенту РФ №2205406 (2003.05.2).

Способ включает исследование клеточного состава амниотической жидкости, отличающийся тем, что в амниотической жидкости определяется абсолютное содержание в десяти полях зрения макрофагов (М), лимфоцитов (Л), нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов (N) и эпителиальных клеток кожи плода (Э), рассчитывают показатель развития у плода генерализованной формы внутриутробного инфицирования по уравнению 1.007М. -0,723N. -0.826Л. +0.00Э и в случае, если полученный показатель ниже порогового значения, равного "-12,51", диагностируют генерализованную форму внутриутробного инфицирования плода. Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет диагностировать только генерализованную форму ВУИ непосредственно после рождения ребенка.

Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода локальной формы по патенту РФ №2171990 (2001.08.10). У беременной извлекают амниотическую жидкость, в которой исследуют ее клеточный состав. В амниотической жидкости определяют абсолютное содержание в 10 полях зрения макрофагов (М), лимфоцитов (Л), нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов (N) и эпителиальных клеток кожи плода (Э), рассчитывают показатель развития локальной формы внутриутробного инфицирования плода по уравнению 1,329 М - 1,646 N - 0,229 Л+0,013 Э и в случае, если полученный показатель ниже порогового значения, равного "-13,05", диагностируют локальную форму внутриутробного инфицирования плода.

Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет диагностировать только локальную форму ВУИ непосредственно после рождения ребенка.

Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода во второй половине беременности по патенту РФ №2121687 (1998.11.10).

Проводят однократное малоинвазивное исследование цервикальной слизи, в которой определяют уровень секреторного иммуноглобулина А и лизоцимную активность, и при значении суммы произведений этих параметров на коэффициенты соответственно - 0,11 и +8,6 и константы, равной - 1,86, превышающей 1,0, прогнозируют вероятное внутриутробное инфицирование плода, если же значение суммы меньше - 0,9, констатируют отсутствие вероятности возникновения этого осложнения, а при сумме меньше 1,0, но больше - 0,9 беременную относят к группе риска по внутриутробному инфицированию плода.

Недостаток данного способа состоит в том, что неизвестен этиологический фактор, вызывающий инфицирование плода и соответственно не может быть назначена этиотропная терапия.

Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода по патенту РФ №2202790.(2003.04.20), который заключается в том, что при массовом скрининге альфа-фетопротеина, который проводится всем беременным, выделяют группу женщин с уровнем альфа-фетопротеина более 2 МоМ, при условии отсутствия пороков развития плода проводят определение специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови женщин к возбудителям внутриутробных инфекций: токсоплазме, цитомегаловирусам, хламидиям.

При лабораторно доказанной острой инфекции у матери или обосрении хронической оценивали степень повреждения плаценты и плода с помощью ультразвукового исследования.

Недостаток способа заключается в том, что не всегда инфицирование плодов происходит с увеличением уровня альфа-фетопротеина и наличие острого инфекционного процесса или реактивации можно диагностировать в течение двух недель с момента заражения.

Известен способ прогнозирования степени риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных по патенту РФ №2168946 (2001.06.20).

Определяют воспалительные и дистрофические изменения последа, при этом определяют воспалительно-дистрофические изменения во всех частях последа: в различных участках плаценты, ворсинках и межворсинчатом пространстве, в оболочках последа, плаценте и ее сосудах; воспалительные и дистрофические изменения в плаценте определяют в центре на периферии, на материнской и плодовой поверхностях и по сочетанию выявленных воспалительно-дистрофических изменений в различных структурных частях последа прогнозируют степень риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных.

Недостаток данного способа: сложность и многофакторность исследования, а также то, что диагностика ВУИ возможна только после рождения ребенка.

Известен способ диагностики внутриутробной инфекции плода по патенту РФ №2158927(2000.11.10). У беременных женщин извлекают амниотическую жидкость и приготовляют из нее для биохимического исследования препараты, в которых подсчитывают количество клеточных элементов макрофагов, лимфоцитов и сегментоядерных лейкоцитов в 10 полях зрения. При определенных показателях макрофагов, лимфоцитов, сегментоядерных лейкоцитов диагностируют внутриутробную инфекцию плода.

Недостаток способа состоит в том, что он осуществляется в поздние сроки беременности (34-41 нед), что ухудшает прогноз для плода из-за возможного более длительного контакта с инфекционным агентом и отсроченной этиотропной терапии.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ диагностики внутриутробной инфекции, описанный в работе Baschat A.A. и др. в журнале J. Matern Fetal Neonatal Med. 2003 Jun; 13.

Сущность прототипа: у беременных женщин во втором триместре в амниотической жидкости определяют методом ПЦР ДНК вируса Эпштейн-Барр, ЦМВ и простого герпеса.

К недостаткам прототипа следует отнести низкую эффективность способа.

Следует отметить то, что определение риска развития внутриутробной инфекции в большинстве случаев осуществляют у женщин с предварительно выявленной серопозитивностью. В то же время вирусоносительство у матери далеко не всегда предполагает реализацию этой инфекции у плода.

Однако ни один из этих способов не позволяет осуществить прогнозирование степени риска развития внутриутробного инфицирования плода конкретным этиологическим фактором.

Задача изобретения - разработка способа прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр с 16 недель беременности.

Поставленная задача решается тем, у беременных производят трансабдоминальный амниоцентез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр при длине волны 450 нм, и при выявлении иммуноглобулина класса IgG оптическая плотность исследуемого образца выше 1.4 Х ОПкрит, где ОПкрит = ОпсрК^-+0,1, где ОпсрК^- - средняя величина отрицательных контролей амниотических вод, прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра.

Подробное описание метода

Беременным в 16-40 недель гестации по медицинским показаниям осуществляют трансабдоминальный амниоцентез и производят аспирацию амниотической жидкости. В лабораторию ИФА поступало 5 мл околоплодных вод, которые центрифугировали 3 мин. При 5000 об/мин надосадочную жидкость отбирали в объеме 1 мл, в дальнейшем в этой жидкости определяли титр антител.

Для определения иммуноглобулинов IgG к возбудителям вируса Эпштейна-Барр (EBV) использовалась надосадочная жидкость в разведении 1:100. Для выявления иммуноглобулинов класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр использовалась тест-система "Вектор ВЭВ-NA-IgG-стрип". Согласно методике исследуемую надосадочнаую жидкость разводят предварительно в 10 раз, 90 мкл раствора для разведения сывороток (РРС) вносят в микротитражные лунки вспомогательного планшета и добавляют по 10 мкл надосадочной жидкости, тщательно перемешивают.

В лунки микропланшета с иммобилизированными ядерными антигенами вируса Эпштейна-Барр вносят по 90 мкл РРС и по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых сывороток. Таким образом исследуемая сыворотка в лунке разбавляется в 100 раз. Одновременно в свободные лунки вносят по 100 мкл положительных контрольных образцов, содержащих определенное количество инактивированных IgG и по 100 мкл отрицательных контрольных образцов. Инкубируют планшет 30 мин при t=37°C во влажной камере. После пятикратной промывки лунок фосфатно-солевым буфером (ФСБ) лунки хорошо встряхивают и вносят 100 мкл раствора конъюгата (антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена), инкубируют во влажной камере 30 мин при t=37°C. Промывают также, как описано выше, планшет встряхивают и вносят в лунки по 100 мкл тетраметилбензидин (ТМБ), инкубируют в темноте 25 мин, добавляют 50 мкл стоп-реагента (0,9 N H₂SO₄). Оптическую плотность цветной реакции регистрируют на фотометре (1420 MULTILABEL COUNTER, Финляндия) при длине волны 450 нм. Рассчитывают критическое значение оптической плотности исследуемого образца (ОПкрит) по формулам

ОПкрит = ОпсрК^-+0,1, где ОпсрК^- - средняя оптическая плотность отрицательных контролей.

Если значение оптической плотности исследуемого образца ОПисл≤0,9 × ОПкрит, то результат анализа считают отрицательным.

Если ОПисл попадает в интервал 0,9 × ОПкрит - 1,4 × ОПкрит - результат сомнительный.

Если ОПисл≥1,4 × ОПкрит - результат анализа положительный. Беременную в последних двух случаях относят к группе риска по внутриутробному инфицированию плода вирусом Эпштейна-Барр. Способ несложен в исполнении, имеет высокую диагностическую ценность и позволяет прогнозировать, диагностировать и проводить профилактику внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр.

Пример 1

Больная С-ова Н. Н., 38 лет, история болезни №386. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии с 6 недель беременности. В анамнезе: бесплодие первичное 9 лет, гипофункция яичников (ановуляция), дисбиоз, трихомониаз, олигозооспермия у супруга 2-3 степени. Беременность наступила на фоне индукции овуляции клостилбегитом после проведения ИИСМ.

При динамическом акушерском наблюдении и в соответствии со стандартами обследования беременной было проведено полное клинико-лабораторное обследование. Выявлен гестационный пиелонефрит в стадии латентного течения. При уточнении инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. При обследовании беременной в 16 недель гестации выявлены изменения в уровнях сывороточных белков крови, таких как хориогонический гонадотропин, прогестерон, альфа-фетопротеин и эстриол, которые были не характерны для хромосомных заболеваний и указывали на возможность развития фетоплацентарной недостаточности. При ультразвуковом исследовании - умеренно выраженное многоводие. С целью диагностики причины многоводия был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Амниотическая жидкость методом ИФА исследовалась на наличие ВУИ. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости была больше 1,4 Х ОПкрит, т. е. выявлена высокая вероятность инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр (положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр).

Это было рассчитано следующим образом:

ОП образца пациента 0,450

Средняя ОП отрицательных контролей ОПсрК^- = 0,178

ОПкрит = 0,278, т.к. ОПкрит = ОпсрК^-+0,1

ОПкрит X 1,4=0,389

Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОП Крит Х 1,4 (0,450>0,389).

Проведено лечение с использованием противовирусных препаратов по одной из стандартных схем, разрешенных для применения во время беременности. Ребенок родился путем операции кесарево сечение в нижнем сегменте матки. Масса при рождении 3200 г, длина 49 см, оценка по шкале Апгар 7-9 баллов. При исследовании пуповинной крови новорожденного антитела к вирусу Эпштена-Барр не обнаружены.

Пример 2

Больная П-ева Н. А., 30 лет, история болезни №502. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии после программы ЭКО. В анамнезе бесплодие первичное в течение 11 лет. В первом триместре беременности при ультразвуковом исследовании выявлен участок отслойки хориона, в связи с чем проводилась сочетанная гормональная коррекция. При обследовании инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. При обследовании беременной в 18 недель гестации обнаружены изменения в уровнях сывороточных белков крови (хориогонический гонадотропин, прогестерон, альфа-фетопротеин и эстриол), которые были не характерны для хромосомных заболеваний и указывали на возможность развития фетоплацентарной недостаточности. При ультразвуковом исследовании выявлено незначительное расширение желудочков мозга и умеренно выраженное многоводие. При допплерометрическом исследовании отмечалось нарушение маточно-плацентарной гемодинамики 1А степени. Был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости равна 0,480 (больше 1,4 Х ОПкрит), т. е. выявлена вероятность инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр (в амниотической жидкости методом ИФА выявлен положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр). Это было рассчитано следующим образом:

ОП образца пациента 0,480

Средняя ОП отрицательных К - 0,186

ОПкрит = 0,286, т.к. ОПКрит = ОпсрК^-+0,1

ОПкрит X 1,4=0,400

Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОПкрит Х 1,4 (0,480>0,400).

От проведения этиотропного лечения беременная отказалась. Проведена метаболическая терапия для улучшения фетоплацентарной гемодинамики. Роды в срок. Масса при рождении 2600 г, длина 46 см. Состояние при рождении средней тяжести, синдром задержки развития плода, внутриутробная инфекция вирусно-бактериальной этиологии, перинатальное гипоксически-ишемическая энцефалопатия, гипертензионный синдром. При инфекционном обследовании у ребенка в пуповинной крови новорожденного обнаружены иммуноглобулины класса М и G к вирусу Эпштейна-Барр.

Пример 3

Больная Б - ян О. А., 29 лет, история болезни №695. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии с 15 недель беременности. При обследовании инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. В 16 недель беременности биохимические маркеры указывали на наличие фетоплацентарной недостаточности. В 22-23 недели беременности при ультразвуковом исследовании выявлено многоводие, преждевременное созревание плаценты и нарушение маточно-плацентарной гемодинамики при допплерометрическом исследовании. Был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости равна 0,520 (больше 1,4 Х ОПкрит), т. е. выявлена высокая вероятность инфицирования плода вирусам Эпштейна-Барр (в амниотической жидкости выявлен положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр). Это было рассчитано следующим образом:

ОП образца пациента 0,520

ОпсрК^- = 0,223

ОПкрит - 0,323, т.к. ОПкрит = ОпсрК^-+0,1

ОПкрит Х 1,4=0,452

Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОПкрит Х 1,4 (0,520>0,452).

Проведено этиотропное лечение по одной из стандартных схем, разрешенных для применения во время беременности.

Ребенок родился в срок. Масса при рождении 3400 г, длина 50 см. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. При исследовании пуповинной крови новорожденного антитела к вирусу Эпштена-Барр не обнаружены.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выделить группу беременных, требующих дополнительного обследования, выявить инфекцию у матери, оценить состояние плода и провести при необходимости антенатальную терапию (этиопатогенетическую) задолго до рождения ребенка. Своевременно начатое лечение в антенатальном периоде позволит снизить заболеваемость и смертность новорожденных в неонатальном и младенческом периодах. Использование заявляемого способа прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр позволяет экономить затраты финансов и времени и своевременно профилактировать возможные осложнения.

Данный способ прогнозирования внутриутробного инфицирования плода позволяет проводить дифференциальную диагностику между вирусоносительством матери и внутриутробным инфицированием плода и, таким образом, значительно снизить процент гипердиагностики данной патологии.

Предлагаемый способ обладает очевидными преимуществами по сравнению с известными

- позволяет выявить риск развития внутриутробной инфекции;

- снижает гипердиагностику внутриутробной инфекции и соответственно медикаметозную нагрузку на организм матери и плода;

- снижает затраты на необоснованное лечение;

- может широко использоваться в специализированных акушерских стационарах;

- может использоваться в амбулаторно-поликлинических отделениях.

Способ позволяет выявить риск развития внутриутробной инфекции, уточнить этиологический фактор и степень влияния инфекции на плод, своевременно проводить обоснованное лечение, а также снизить затраты на реабилитацию новорожденных.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и перинатологии, и найдет применение как метод обследования беременных высокого перинатального риска в 2-3 триместрах гестации для прогнозирования степени риска развития внутритрубной инфекции у новорожденных. Способ осуществляют путем исследования аминиотической жидкости, заключающегося в том, что производят трансабдоминальный амниоцентез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштпейна-Барр и при оптической плотности исследуемого образца выше 1.4 Х ОПкрит, где ОПкрит = ОпсрК^-+0,1, где ОпсрК^- - средняя величина отрицательных контролей аминотических вод прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа прогнозирования.

Способ прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр путем исследования амниотической жидкости, отличающийся тем, что у беременных производят трансабдоминальный амниоцнетез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр при длине волны 450 нм, и при выявлении в исследуемом образце иммуноглобулина класса IgG оптическая плотность которого выше 1.4 Х ОПкрит., где ОПкрит. = ОпсрК^-+0,1, где ОпсрК^- - средняя величина отрицательных контролей аминотических вод, прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра.