ДОЗИРОВАННАЯ ФОРМА ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Область техники к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при производстве наборов для амплификации нуклеиновых кислот, в том числе при производстве наборов для этиологической диагностики COVID-19.

Уровень техники

Увеличение срока сохранения реакционной активности использующихся в качестве реагентов компонентов реакции амплификации нуклеиновых кислот, в том числе при температурах выше 0°С (например, при комнатной температуре), а также универсальное увеличение точности, уменьшение и упрощение ручных манипуляций при постановке (например, ПЦР, изотермической амплификации) в любых емкостях (в том числе имеющих различный объем отдельных пробирках, стрипированных пробирках и планшетах любых размеров и форм) являются важными задачами производителей наборов для амплификации нуклеиновых кислот.

Известно использование для увеличения срока сохранения реакционной активности реагентов для амплификации нуклеиновых кислот лиофильного высушивания их смесей с добавлением различных стабилизаторов: глюцитола, глюкозы, фиколла, сахарозы и других (Klatser P.R., Kuijper S., van Ingen C.W., Kolk A.H. Stabilized, freeze-dried PCR mix for detection of mycobacteria // Journal of clinical microbiology. - 1998. - Vol.36, №6. - P. 1798-1800; US 5565318 от 15.10.1996; US 5861251 от 19.01.1999; US 6153412 от 28.11.2000; RU 2259401 от 27.08.2005).

Основным недостатком аналогов является общеизвестная частичная инактивация используемого фермента при его высушивании и растворении (регидратации) даже с использованием стабилизаторов, которые уменьшают инактивацию фермента при лиофилизации, что может снижать эффективность реакции амплификации нуклеиновых кислот; необходимость использования дорогостоящих лиофильных сушек и процесса лиофилизации при изготовлении наборов для амплификации нуклеиновых кислот.

Известен способ изотермической амплификации нуклеиновых кислот, согласно которому для раздельного нагревания компонентов реакции (реагентов) и их смешивания при более высоких температурах по меньшей мере один из компонентов реакции (в том числе мезофильный фермент для амплификации нуклеиновых кислот, праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты - dNTP, нуклеозидтрифосфаты - NTP, кофакторы и другие реагенты) помещается в матрицу (матрикс), которая дезинтегрируется при температуре 60°С или более (US 9133508 от 15.09.2015). Известная матрица может быть выбрана из группы, включающей полисахариды, белки, воски и синтетические полимеры с гидрофильными свойствами, так как матрица должна образовывать гидрогель. Согласно известному способу в качестве полисахаридов, могут использоваться агароза, легкоплавкая агароза, пектин, амилоза, агар-агар, ксантан, карраген, карбоксиметилцеллюлоза, гуар, карубин, инулин или декстран, в качестве белков - желатин или фибриллярные белки, в качестве воска и синтетических полимеров - поливиниловый спирт или дериваты целлюлозы.

Основным недостатком этого аналога заявляемого технического решения является возможность подсыхания гидрофильных матриц со смесями реагентов для амплификации нуклеиновых кислот без масел, воска или парафина с гидрофобными свойствами, которые не предусмотрены в известном способе.

Также известен восковой шарик, содержащий внутри водный раствор одного из реагентов, в том числе: термостабильного фермента, меченых и немеченых нуклеотидов, дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозидтрифосфаты и их аналоги, соль металла, выбранного из Mg, Mn, Fe, Со, Си и Zn, меченого вещества (US 5413924 от 09.05.1995). В качестве воска могут быть использованы натуральные, модифицированные или дериватизированные воски, парафины, консистентные смазки и масла, другие подходящие воскообразные полимеры.

Основными недостатками этого аналога являются: сложность отбора амплификата из-под слоя воска, если необходимы электрофоретическое исследование ампликонов или их секвенирование, так как воском забивается наконечник дозатора, и требуется усилие для разрушения восковой пленки над амплификатом, увеличивающееся при использовании тугоплавкого воска; возможность деформации и слипания мягких шариков с жидким центром и восковой оболочкой, увеличивающееся при использовании легкоплавкого воска; непрозрачность слоя воска, препятствующая вертикальному считыванию флуоресцентного сигнала при реакции амплификации в реальном времени, которое используется, например, в амплификаторах производства Bio-Rad Laboratories, Inc. (США) и ООО «ДНК-Технология» (Россия), что ограничивает перечень используемых амплификаторов и емкостей для амплификации (могут использоваться только пробирки, но не планшеты). Также к недостаткам данного аналога относится невозможность увеличения срока сохранения реакционной активности компонентов для реакции амплификации в связи с отсутствием ингредиента (реагента, подготовленного определенным образом), не только повышающего продуктивность реакции амплификации нуклеиновых кислот, но и пригодного для предварительного дозирования смесей реагентов вне емкостей для постановки ПЦР, при этом, во-первых, обеспечивающего заданное варьирование вида дозированной формы (глобулы или таблетки) в зависимости от используемого дозатора (диспенсера), во-вторых, снижающего риск слипания, деформирования и слияния отдельных дозированных форм (глобул или таблеток), в-третьих, обеспечивающего дезинтеграцию дозированной формы без образования геля.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения является дозированная форма для одной из реакций амплификации нуклеиновых кислот - полимеразной цепной реакции, которая включает ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую, по меньшей мере, из одного гидрофобного ингредиента, выбранного из ряда: парафин, воск и минеральное масло, причем содержание сахарозы и водного раствора в ядре, мас. %: сахароза - 23,0-58,0 и водный раствор - 42,0-77,0. Дозированная форма может быть выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм и предпочтительную толщину 2,0-4,0 мм. В качестве компонентов известный аналог может дополнительно включать меченый зонд и краситель для гель-электрофореза (RU 171152 от 22.05.2017).

Основным недостатком прототипа является неконтролируемое истирание дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот за счет хрупкости прессованной сахарозы, смоченной водным раствором.

Технической проблемой, решаемой нами в изобретении, является предотвращение неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является решение технической проблемы, а именно предотвращение неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Технический результат достигается за счет того, что дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот включает стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, и выполнена в форме глобулы или таблетки.

В качестве термостабильного фермента ДНК-полимеразы используют, например: Tag-полимеразу, Bst-полимеразу, Bsm-полимеразу, SD-полимеразу, Tth-полимеразу, Pfu-полимеразу (US 5814506 от 29.09.1998; WO 2007046556 от 26.04.2007; US 9896671 от 20.02.2018; Cai D., Behrmann О., Hufert F., Dame G., Urban G. Capacity of rTth polymerase to detect RNA in the presence of various inhibitors // PLoS One. - 2018. - Vol. 13, №1ю - e0190041. - DOI: 10.1371/journal.pone.0190041; Cline J., Braman J.C., Hogrefe H.H. PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases // Nucleic acids research. - 1996. - Vol. 24, №18. - P. 3546-3551. - DOI: 10.1093/nar/24.18.3546). При этом использование глицерина в качестве добавочного компонента нежелательно в связи с его возможным негативным влиянием на стеклообразную непористую матрицу ядра.

В качестве фиколла предпочтительно используют фиколл 400 (Ficoll 400, Ficoll РМ400) или полисахарозу 400 (Polysucrose 400).

В настоящем изобретении под понятием «водный раствор» перечисленных выше компонентов понимается - водный раствор компонентов или водный раствор, или раствор.

В качестве гидрофобного ингредиента оболочки дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот используют минеральное масло, обычно применяемое при амплификации нуклеиновых кислот в качестве пароизолятора и барьера, предотвращающих перекрестную контаминацию реакционных смесей (Sparkman D.R. Paraffin wax as a vapor barrier for the PCR // PCR methods and applications. - 1992. - V. 2, N 2. - P. 180-181; Gilgen M., Hydroxyquinoline overcomes PCR inhibition by UV-damaged mineral oil // Nucleic acids research. - 1995. - V. 23, N 19. - P. 4001-4002; Mineral oil. PCR Reagent. -URL: http://www.sigmaaldrich.corn/catalog/product/sigma/m8662?lang=en&region=RU&gclid=Cj0KEOjwouW9BRCN0ozIifTI6_cBEiQAD9gNsdft4K 8NnQkHhNReRTsD6vBQe01jOZdlwgeZOM_zeHcaAiv58P8HAQ; US 5411876 от 02.05.1995; US 5413924 от 09.05.1995; US 5576197 от 19.11.1996).

Фиколл, галактоманнан и водный раствор содержатся в ядре при следующем их предпочтительном соотношении, мас. %: фиколл - 10-30, галактоманнан - 0,1-5,0, водный раствор - остальное.

Дозированная форма согласно заявляемого изобретения может быть выполнена в форме глобулы с предпочтительным диаметром 0,5-4,0 мм, соответствующим внутренним диаметрам пробирок, стрипированных пробирок и планшетов, обычно используемых для реакций амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР, ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР, LAMP, RT-LAMP).

Дозированная форма согласно заявляемого изобретения может быть также выполнена в форме в форме таблетки преимущественно двояковыпуклой или сфероидальной формы с предпочтительным диаметром 0,5-4,0 мм и с предпочтительной максимальной толщиной 0,5-4,0 мм, которые соответствуют внутренним диаметрам пробирок, стрипированных пробирок и планшетов, обычно используемых для реакций амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР, ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР, LAMP, RT-LAMP).

Водный раствор может дополнительно включать в качестве компонента любой меченый зонд для реакции амплификации нуклеиновых кислот и обратную транскриптазу.

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков.

Во-первых, это новая стеклообразная непористая матрица ядра, полученная с использованием фиколла, галактоманнана в сочетании с водным раствором праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, которая, согласно проведенным авторами заявляемого технического решения исследованиям, удерживает необходимый объем раствора компонентов (реагентов) для реакции амплификации нуклеиновых кислот и дезинтегрируется только при нагревании до температур реакций амплификации нуклеиновых кислот и обратной транскрипции без образования геля в окончательном объеме реакционной смеси (смеси раствора компонентов для реакции амплификации нуклеиновых кислот, подготовленной пробы и растворителя), внесенных в любую емкость для реакции амплификации нуклеиновых кислот. Ядро дозированной формы получено в результате авторских исследований, показавших возможность взаимодействия фиколла и галактоманнана в водном растворе с образованием стеклообразной непористой гидратированной матрицы без высушивания и прессования входящих в ее состав ингредиентов. Этот процесс значительно упрощает и удешевляет получение дозированных твердых форм, сохраняя активность всех реагентов в течение длительного срока.

До этих авторских исследований фиколл и галактоманнан использовались только для получения высушенных и прессованных твердых форм композиций (например: US 5565318 от 15.10.1996; US 6153412 от 28.11.2000; RU 2311172 от 27.11.2007). Однако такое использование фиколла и галактоманна не исключает общеизвестную частичную инактивацию используемого фермента при высушивании, прессовании и растворении (регидратации) твердых форм (композиций). При этом даже небольшие различия в технологическом процессе высушивания приводят к тому, что разные серии наборов могут отличаться друг от друга по активности ДНК-полимеразы, так как небольшое изменение степени высушивания, приводящее к избыточному отъему воды из центра белковой петли фермента, может привести к значительному изменению его активности.

При получении заявляемой дозированной формы активность ДНК-полимеразы не меняется благодаря отсутствию дегидратации фермента при образовании стеклообразной непористой гидратированной матрицы.

Кроме того, использование стеклообразной непористой матрицы ядра обеспечивает получение заданной формы и заданных размеров дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот, при необходимости варьирование вида (формы) и размеров заявляемой дозированной формы с сохранением или изменением в обеспечивающих проведение реакции амплификации нуклеиновых кислот в пределах объема раствора компонентов для реакции амплификации нуклеиновых кислот и количества этих реагентов. При этом стеклообразное непористое ядро позволяет использовать в качестве оболочки заявляемой дозированной формы гидрофобный барьер - минеральное масло, универсально пригодное для разных методов амплификации нуклеиновых кислот, применяемое в качестве пароизолятора, предотвращающее перекрестную контаминацию реакционных смесей. Жесткая стеклообразная непористая матрица ядра предотвращает истирание, деформирование и слияние отдельных дозированных форм для амплификации нуклеиновых кислот. Важно то, что стеклообразное непористое ядро при растворении в окончательном объеме реакционной смеси сокращает продолжительность амплификации.

Во-вторых, оригинальным отличительным признаком является наличие в дозированной форме сплошной оболочки с гидрофобными свойствами (минерального масла), универсально пригодной для разных методов амплификации нуклеиновых кислот, первоначально обеспечивающей изоляцию от внешних воздействий и защищающей от высыхания ядро дозированной формы, а затем создающей при реакции амплификации нуклеиновых кислот пароизолирующий гидрофобный барьер, предотвращающий перекрестную контаминацию реакционных смесей. Минеральное масло в сочетании с использованием стеклообразной непористой матрицы ядра дает возможность изменять толщину оболочки в очень широких пределах. При этом соблюдение условия наличия сплошной гидрофобной оболочки (минерального масла) заявляемой дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот обеспечивает полное покрытие реакционных смесей в известных емкостях для реакции амплификации нуклеиновых кислот гидрофобным слоем из минерального масла при дезинтеграции вариантов дозированной формы с эффективным проведением реакции амплификации нуклеиновых кислот. Вышеизложенное позволяет при характеристике оболочки заявляемой дозированной формы не указывать предельные значения ее толщины в качестве отличительных признаков. Для облегчения извлечения продукта классической ПЦР из емкости, в которой проходила реакция, предпочтительно использовать толщину оболочки, минимально необходимую для предотвращения испарения воды из ядра заявляемой дозированной формы, что обеспечивается предпочтительными размерами глобул и таблеток заявляемой дозированной формы.

Основными известными формами (видами) комплектации выпускаемых наборов для амплификации нуклеиновых кислот являются нераскапанные наборы, раскапанные наборы (Инструкция по применению набора реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Parainfluenza virus-FL». - URL: http:www.interlabservice.ru/upload/iblock/fa3/Parainfluenza%20virus-FL_VV_040215.pdf; Рабочая инструкция по применению набора реагентов для обнаружения ДНК возбудителей гельминтозов (Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Opisthorchis felineus, Taenia solium, Diphyllobothrium latum) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах биоматериала человека «Гельмо-скрин». - URL: https://alphalabs.ru/assets/files/РФБОЧАЯ%20ИНСТРУКЦИЯ%20ГЕЛЬМОС

КРИН_август%202018.pdf; Инструкция по применению медицинского изделия для диагностики in vitro Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией ПОЛИВИР SARS-CoV-2. - URL: http:/www.lytech.ru/upload/iblock/429/ins_POLIVIR_SARS-CoV-2^o/o202020-03-27.pdf) и наборы с готовыми лиофилизированными смесями (Для выявления ДНК/РНК возбудителей опасных и особо опасных инфекций методом ПЦР в реальном времени. - URL:

http://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-

vremeni/dlya-viyavleniya-dnk-rnk-vozbuditeley-osobo-opasnykh-infektsiy-

metodom-pcr-v-realnom-vremeni.html).

Разработанная нами дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот - это основа новых форм комплектации наборов для амплификации нуклеиновых кислот: пеллетированных наборов (pelleted kit) и таблетированных наборов (tableted kit).

Из патентно-технической литературы и практики использования реакций амплификации нуклеиновых кислот неизвестно о дозированной форме для амплификации нуклеиновых кислот, включающая твердые ингредиенты, которая была бы идентична заявляемой.

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - предотвращения неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Предлагаемая дозированная форма апробирована в Обществе с ограниченной ответственностью «Микро Тех».

Осуществление изобретения

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих предотвращение неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот при использовании вариантов заявляемой дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот. При этом приведенные примеры дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 0,5 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 20,0 мас. % и 5,0 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для SARS-CoV-2 (5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3', 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'), меченый зонд для SARS-CoV-2 (5'-GTATGTCCGCAATTTACAACACAGAC-3', меченый цианиновым красителем Су5 на 5' конце и гасителем Black Hole Quencher-3 (BHQ-3) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 месяца при комнатной температуре. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ОТ-ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли РНК из биологического материала (материала слизистой оболочки задней стенки глотки человека, инфицированного SARS-CoV-2) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для SARS-CoV-2 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 2.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 0,5 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 18,0 мас. % и 4,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы прямые и обратные праймеры для

четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 месяца при комнатной температуре. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакций амплификации нуклеиновых кислот в виде RT-LAMP использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 46 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0.3 мл).

Первоначально выделяли РНК из биологического материала (материала слизистой оболочки задней стенки глотки человека, инфицируя много SARS-CoV-2) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для SARS-CoV-2 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 3.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 4,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 10,0 мас. % и 0,1 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum (U5 - 5'-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3', U4 -5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 лет при 8°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Ureaplasma urealyticum во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,6-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 4.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 1,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 20,0 мас. % и 3,0 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Simian virus 40 (SV40) (F+- 5'-GGGTCTTCTACCTTTCTCTTCTTT-3', А -5'-GCAGTGGTGGAATGCCTTT-3'), меченый зонд для SV40 (ТМ - 5'-AACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCA-3', меченый 6-карбоксифлуоресином (FAM) на 5' конце и гасителем 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 лет при 10-15°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР-РВ использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (крови обезьяны вида Макак резус, инфицированной SV40) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами и меченым зондом для SV40 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 5.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 0,5 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 30,0 мас. % и 5,0 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 -5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался- в течение 1 года при комнатной температуре. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 МЛ и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен

положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Candida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение рунных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 6.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров; термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 4,0 мм и максимальной толщиной 4,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 12,0 мас. % и 1,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5' '-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3' ', ITS4 -5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' '), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 10-15°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот С праймерами для Cnndida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 7.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабилыюго фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 4,0 мм и максимальной толщиной 2,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 10,0 мас. % и 0,1 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Trichiuris trichiuris (NC5 - 5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3', NC2 - 5'-GGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 8-12°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кал больного, инфицированного Trichiuris trichiuria) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Trichiuris trichiuria во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 8.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 2,0 мм и максимальной толщиной 4,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 11,0 мас. % и 1,0 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для вируса гепатита В (HBV A - 5'-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-3', HBV S -5'-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 лет при 8-12°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кровь больного гепатитом В) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для вируса гепатита В во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,7-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 9.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 0,5 мм и максимальной толщиной 0,5 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 30,0 мас. % и 5,0 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Simian virus 40 (SV40) (F+ - 5'-GGGTCTTCTACCTTTCTCTTCTTT-3', А - 5'-GCAGTGGTGGAATGCCTTT-3'), меченый зонд для SV40 (ТМ - 5'-AACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCA-3', меченый 6-карбоксифлуоресцином (FAM) на 5' конце и гасителем 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1 года при комнатной температуре.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР-РВ использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (крови обезьяны вида Макак резус, инфицированной SV40) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами и меченым зондом для SV40 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 10.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 3,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 11,0 мас. % и 0,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum (U5 - 5'-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3', U4 - 5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 8-12°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Ureaplasma urealyticum во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 11.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 2,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 14,0 мас. % и 1,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 10-15°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Candida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,8-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 12.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 2,0 мм и максимальной толщиной 2,0 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 10,0 мас. % и 0,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для вируса гепатита В (HBV А - 5'-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-3', HBV S - 5'-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 6-10°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кровь больного гепатитом В) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для вируса гепатита В во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке реакции амплификации нуклеиновых кислот, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 13.

Для получения ядра дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот использовалась смесь фиколла, галактоманнана и водного раствора следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, помещенная в сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, причем соотношение фиколла и галактоманнана составляло 9,5 мас. % и 0,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное, а диаметр глобулы составлял 0,4 мм.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Simian virus 40 (SV40) (F+ - 5'-GGGTCTTCTACCTTTCTCTTCTTT-3', А - 5'-GCAGTGGTGGAATGCCTTT-3'), меченый зонд для SV40 (ТМ - 5'-AACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCA-3', меченый 6-карбоксифлуоресцином (FAM) на 5' конце и гасителем 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

При указанных в данном примере запредельных количественных значениях существенных признаков дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот стеклообразное непористое ядро не образовывалось.

Пример 14.

Для получения ядра дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот использовалась смесь фиколла, галактоманнана и водного раствора следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, помещенная в сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, причем соотношение фиколла и галактоманнана составляло 9,5 мас. % и 0,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное, а диаметр и максимальная толщина таблетки должны были составлять 0,4 мм.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

При указанных в данном примере запредельных количественных значениях существенных признаков дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот стеклообразное непористое ядро не образовывалось.

Пример 15.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 4,2 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 30,5 мас. % и 5,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum (U5 - 5'-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3', U4 - 5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 2 лет при 8°С.При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для Ureaplasma urealyticum во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Однако по сравнению с примером 3 была снижена интенсивность свечения электрофоретических полос ампликонов и уменьшена ширина этих полос, что свидетельствовало о негативном влиянии на реакцию амплификации фиколла в сочетании с галактоманнаном при концентрации в реакционной смеси, получаемой в результате использования глобулы с диаметром 4,2 мм, включавшей стеклообразное непористое ядро, содержавшее фиколл, галактоманнан и водный раствор при соотношении фиколла и галактоманнана, составлявшем 30,5 мас. % и 5,5 мас. %, соответственно, а водный раствор -остальное, за счет известной стабилизации сахарозой и ее производными двойной спирали ДНК. Поэтому данные количественные значения существенных признаков дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот являются запредельными.

Пример 16.

Получена дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабилыюго фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, выполненную в форме таблетки с диаметром 4,2 мм и максимальной толщиной 4,2 мм. Соотношение фиколла и галактоманнана составляло 30,5 мас. % и 5,5 мас. %, соответственно, и водный раствор - остальное.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для вируса гепатита В (HBV А - 5'-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-3', HBV S - 5'-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед Постановкой реакции хранился и периодически транспортировался в течение 1,5 лет при 6-10°С. При хранении и транспортировании полученного варианта заявляемой дозированной формы установлено отсутствие неконтролируемого истирания дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот.

Для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот в виде ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кровь больного гепатитом В) и вносили в буфер для постановки реакции.

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат реакции амплификации нуклеиновых кислот с праймерами для вируса гепатита В во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Однако по сравнению с примером 12 была снижена интенсивность свечения электрофоретических полос ампликонов и уменьшена ширина этих полос, что свидетельствовало о негативном влиянии на реакцтю амплификации фиколла в сочетании с галактоманнаном при копией грации в реакционной смеси, получаемой в результате использования глобулы с диаметром 4,2 мм, включавшей стеклообразное непористое ядро, содержавшее фиколл, галактоманнан и водный раствор при соотношении фиколла и галактоманнана, составлявшем 30.5 мас. % и 5,5 мас. , соответственно, а водный раствор - остальное, за счет известной стабилизации сахарозой и ее производными двойной спирали ДНК. Поэтому данные количественные значения существенных признаков дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот являются запредельными.

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при производстве наборов для амплификации нуклеиновых кислот, в том числе при производстве наборов для этиологической диагностики COVID-19. Дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот включает стеклообразное непористое ядро, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, причем содержание фиколла, галактоманнана и водного раствора в ядре, мас. %: фиколл - 10,0-30,0, галактоманнан - 0,1-5,0 и водный раствор - остальное. Дозированная форма может быть выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 0,5-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 0,5-4,0 мм и предпочтительную максимальную толщину 0,5-4,0 мм. Водный раствор может включать в качестве дополнительных компонентов любой меченый зонд для реакции амплификации нуклеиновых кислот и обратную транскриптазу. Изобретение позволяет предотвратить неконтролируемое истирание дозированной формы для амплификации нуклеиновых кислот. 3 з.п. ф-лы, 16 пр.

1. Дозированная форма для амплификации нуклеиновых кислот, включающая ядро и сплошную оболочку, отличающаяся тем, что ядро стеклообразное непористое, содержащее фиколл, галактоманнан и водный раствор следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента ДНК-полимеразы и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, сплошную оболочку, состоящую из минерального масла, причем содержание фиколла, галактоманнана и водного раствора в ядре, мас.%:

Фиколл 10,0-30,0 галактоманнан 0,1 -5,0 водный раствор остальное

2. Дозированная форма по п. 1, отличающаяся тем, что она выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 0,5-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 0,5-4,0 мм и предпочтительную максимальную толщину 0,5-4,0 мм.

3. Дозированная форма по п. 1, отличающаяся тем, что водный раствор дополнительно включает в качестве компонента меченый зонд.

4. Дозированная форма по любому из пп. 1 или 2, или 3, отличающаяся тем, что водный раствор дополнительно включает в качестве компонента обратную транскриптазу.