НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК КОРОНАВИРУСА Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/6806 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды.

Коронавирус SARS-CoV-2 является причиной заболевания COVID-2019, вызвавшей пандемию в 2020 году. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].

Уровень техники

Известные протоколы исследования направлены на выявление специфичных нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках SARS-CoV-2:

- ORF1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];

- RdRP, E, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2];

- ORF1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];

- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];

- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];

- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];

- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].

Однако представленные протоколы исследований, а также доступные на рынке диагностические наборы на основе ОТ-ПЦР не позволяют проводить исследования генетической вариабельности SARS-CoV-2, в том числе оценивать в сочетании участки его генома, определяющие инфективность и степень репликации (синоним -продуктивность) данного вируса.

Известен способ выявления генетического варианта SARS-CoV-2, имеющего делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, ассоциированной с легкой формой течения COVID-19 в связи с низкой степенью его репликации (Effects of а major deletion in the SARS-CoV-2 genome on the severity of infection and the inflammatory response: an observational cohort study. The Lancet, 2020, vol. 396, issue 10251, p.603-611. DOI: https://doi.org/10.l016/S0140-6736(20)31757-8).

Недостатком известного аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Известен способ выявления генетического варианта SARS-CoV-2, имеющего замену D614G в S-белке короновируса, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2 (Tracking changes in SARS-CoV-2 spike: Evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus. Cell, 2020, vol. 182, issue 4, p. 794-795. DOI: https://doi.org/l0.1016/j.cell.2020.06.043).

Недостатком известного аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом -является набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020), включающий в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по прототипу устраняет риск получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. Кроме того прототип позволяет проводить выявление генетических вариантов SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР посредством анализа кривых плавления продуктов реакции.

Недостатком прототипа является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Решаемой технической проблемой в настоящем изобретении является выявление SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Раскрытие сущности изобретения

Достигаемым техническим результатом является выявление SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Достижение указанного технического результата обусловлено следующей совокупностью существенных признаков - комбинацией синтетических олигонуклеодитов, которые специфически отжигаются на участках кДНК, комплементарных участкам генома коронавируса, позволяющим выявлять замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 при проведении мультиплексной ОТ-ПЦР. Пара синтетических олигонуклеотидов 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном определяющему инфективность коронавируса участку генома SARS-CoV-2 с заменой D614G в S-белке, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 524 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' способна отжигаться на участке кДНК, комплементарном определяющему степень репликации коронавируса делецируемому участку генома SARS-CoV-2, как при наличии, так и при отсутствии делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 с образованием продукта ОТ-ПЦР около 316 пар нуклеотидов или около 698 пар нуклеотидов, соответственно.

Из патентно-технической литературы и практики лабораторной диагностики COVID-19 неизвестно о наборе синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК и генетического типирования коронавируса SARS-CoV-2, который был бы идентичен заявленному.

Отсюда правомерен вывод о соответствия заявленного решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - выявления SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Предлагаемый набор может быть получен многократно, а, значит, заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Осуществление изобретения

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих получение набора, обеспечивающего выявление SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2. При этом приведенные примеры набора показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5 '-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парой праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' и парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены две нуклеотидные последовательности, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала замены D614G в S-белке, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2, и наличие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, снижающей степень репликации коронавируса. Выявление замены D614G в S-белке и наличия делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 с повышенной инфективностью и низкой степенью репликации (легкой формой течения COVID-19).

Пример 2. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 C1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР только с парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов горизонтального как гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал отсутствие в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала замены D614G в S-белке, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2, и наличие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, снижающей степень репликации коронавируса. Выявление наличия делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 с неизмененной инфективностью и низкой степенью репликации (легкой формой течения COVID-19).

Пример 3. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 C1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР только с парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал отсутствие в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала замены D614G в S-белке, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2, и отсутствие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, снижающей степень репликации коронавируса. Отсутствие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 с неизмененной инфективностью и степенью репликации.

Пример 4. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 C1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена отрицательная ОТ-ПЦР с парой праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' и парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'.

На основании результатов ОТ-ПЦР было подтверждено отсутствие инфекция, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 5. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-TCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTT-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пару праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частичнокомплементарный нуклеотидной последовательности 5'-CTCGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGA-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' при наличии делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-AGGAATCATCACAACTGTAGCTGCATTTCACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGT-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' при отсутствии делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был положительным при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 C1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, трех указанных выше в данном примере флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парой праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' и парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены две нуклеотидные последовательности, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала замены D614G в S-белке, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2, и наличие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, снижающей степень репликации коронавируса. Выявление замены D614G в S-белке и наличия делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 с повышенной инфективностью и низкой степенью репликации (легкой формой течения COVID-19).

Пример 6. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3' флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-TCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTT-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пару праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-CTCGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGA-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' при наличии делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-AGGAATCATCACAACTGTAGCTGCATTTCACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGT-3', специфично отжигающийся на нуклеотидной последовательности, фланкируемой парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3' при отсутствии делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был положительным при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 C1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3', 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2, содержащего замену D614G в S-белке и делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3', пары праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, трех указанных выше в данном примере флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР только с парой праймеров 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал отсутствие в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала замены D614G в S-белке, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2, и отсутствие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, снижающей степень репликации коронавируса. Отсутствие замены D614G в S-белке и отсутствие делеции 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8 в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 с неизмененной инфективностью и степенью репликации.

Таким образом, приведенные примеры использования предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов доказывают возможность выявления SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.

Изобретение относится к медицине и биологии. Описан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3''. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Технический результат изобретения заключается в выявлении SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК и генетического типирования коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3'.

2. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид имеет флуоресцентную метку.

3. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров.