НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК КОРОНАВИРУСА Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/6806 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды.

Коронавирус SARS-CoV-2 является причиной заболевания COVID-2019, вызвавшей пандемию в 2020 году. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].

Известные протоколы исследования направлены на выявление специфичных нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:

- ORF1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];

- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2];

- ORF1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];

- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];

- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];

- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];

- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].

Однако проведенный авторами настоящего изобретения анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2, которые получены посредством секвенирования изолятов или клинических образцов, показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка. Поэтому выявление РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР с использованием известных синтетических олигонуклеотидов не является универсально информативным при выявлении РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР.

Главной задачей, решаемой изобретением, является обеспечение универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.

Поставленная задача реализуется за счет того, что набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров.

В основу заявленного изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков - выбранных синтетических олигонуклеотидов, которые отжигаются на консервативных участках генома коронавируса SARS-CoV-2 и при этом находятся в геноме SARS-CoV-2 на расстоянии, позволяющем проводить ОТ-ПЦР, а именно: около 300 нуклеотидов или около 900 нуклеотидов.

Указанные консервативные участки генома, фланкирующие вариабельные участки генома и находящиеся на расстоянии друг от друга, составляющем или около 300 нуклеотидов, или около 900 нуклеотидов, которое позволяет проводить ОТ-ПЦР, были выявлены в результате проведенного авторами настоящего изобретения биоинформатического анализа известных полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2.

Из патентно-технической литературы и практики лабораторной диагностики COVID-19 неизвестно о наборе синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, который был бы идентичен заявленному.

Отсюда правомерен вывод о соответствия заявленного решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - обеспечения универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.

Предлагаемый набор может быть получен многократно, а, значит, заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих получение набора, обеспечивающего универсальную информативность выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. При этом приведенные примеры набора показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР. Анализ графиков кривых плавления и полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей показал наличие мутации в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала в сравнении с положительным контролем.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 2. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3', имеющего флуоресцентную метку, и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймера 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', флуоресцентно меченного праймера 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 3. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 4. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', - а также флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-TCACTCTTGTAATGTAAACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда, частично комплементарного нуклеотидной последовательности 5'-TCACTCTTGTAATGTAAACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 5. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=aflaac73_4]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной высокоточной ДНК-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования по Сэнгеру.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 6. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из смыва с поверхности предмета быта (расчески) от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4]. Проводили ОТ-ПЦР в одной пробирке с использованием пары праймеров 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации и анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Анализ графиков кривых плавления показал наличие мутации в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала в сравнении с положительным контролем.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Пример 7. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', - а также флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-GTATGTCCGCAATTTACAACACAGAC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4]. Проводили ОТ-ПЦР в одной пробирке с использованием пары праймеров 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда, комплементарного нуклеотидной последовательности 5'-GTATGTCCGCAATTTACAACACAGAC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'.

На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.

Таким образом, приведенные примеры доказывают возможность применения при диагностике COVID-19 заявляемого набора синтетических олигонуклеотидов, которые отжигаются на консервативные участки генома коронавируса SARS-CoV-2, что обеспечивает универсальную информативность выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Технический результат изобретения заключается в обеспечении универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. 2 з.п. ф-лы, 7 пр.

1. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров, выбранную из ряда:

5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';

5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';

5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';

5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';

5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';

5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'.

2. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид имеет флуоресцентную метку.

3. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров.