СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА АНТИБИОТИКОВ (ТЕТРАЦИКЛИНОВАЯ ГРУППА, ЛЕВОМИЦЕТИН, БАЦИТРАЦИН) В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2020 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам одновременного определения комплекса антибиотиков (тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, хлорамфеникола, бацитрацина) методом обращеннофазовой высокоэффективной хроматографии.

Проблема загрязнения пищевой продукции животного происхождения остаточными количествами антибиотиков и возрастающей устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам остается актуальной в мире. Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы.

Антибиотики тетрациклиновой группы (тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин), амфениколы (хлорамфеникол) и кормовой антибиотик бацитрацин - часто используются в ветеринарии, поэтому остаточные их количества могут встречаться в пищевых продуктах животного происхождения.

Антибиотики тетрациклинового ряда являются препаратами широкого спектра действия и в связи с высокой биологической активностью и относительной дешевизной до сих пор активно используются в ветеринарной медицине для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний скота, а также как стимуляторы роста молодняка животных.

Хлорамфеникол является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. Антибиотик применяют при острых желудочно-кишечных заболеваниях микробной этиологии животных, а также при хирургических инфекциях, гинекологических болезнях.

Бацитрацин применяется в качестве антимикробного профилактического и ростостимулирующего средства при выращивании и откорме животных и птицы.

В связи с тем, что группы применяемых антибиотиков у людей и животных в сельском хозяйстве одинаковы, остаточные количества антибиотиков в пищевых продуктах способствуют появлению устойчивых штаммов и у людей. Соответственно у людей, употребляющих такие продукты, развивается иммунитет к приему антибиотиков, и для получения ожидаемого эффекта при лечении требуются все более сильные препараты.

Под действием антибиотиков организм теряет способность самостоятельно противостоять различным инфекциям. И, кроме того, их широкое применение привело к появлению штаммов бактерий, устойчивых к этим препаратам, и, в конце концов, человек может оказаться незащищенным перед инфекциями и микроорганизмами. Наличие антибиотиков в организме может вызвать сильные аллергические реакции, сопровождающиеся сильным зудом, высыпаниями, в редких случаях - отеком.

Так как употребление в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, негативно сказывается на организме человека, в связи с этим их содержание нормируется.

Согласно Приложению 21 к СанПиН 2.3.2.1078-01 сумма всех остатков антибиотиков тетрациклиновой группы не должна превышать в пищевых продуктах (мясо, жир, печень, почки) 0,01 мг/кг, хлорамфеникола 0,0003 мг/кг и бацитрацина 0,02 мг/кг.

Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, для исключения возможности попадания антибиотиков в продукты животноводства, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов их одновременного анализа.

В РФ отсутствуют нормативные документы по одновременному определению остатков антибиотиков тетрациклиновой группы, хлорамфеникола и бацитрацина в продукции животноводства.

В настоящее время предложено множество методов раздельного определения тетрациклинов, амфениколов и бацитрацина, среди которых можно выделить метод микробиологический и иммуноферментный.

Микробиологический метод основан на чувствительности бактерий к этим антибиотикам, способности диффузии их в агаровую среду со спорами тест-микробов, препятствующих их росту с образованием прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в мясе устанавливают по диаметру зон ингибиции.

Для скрининговых целей при определении антибиотиков хлорамфеникола и бацитрацина применяют метод иммунохимического анализа. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными. Системы соответствуют «Методическим указаниям по определению остаточных количеств левомицетина (МУК 4.1.1912-04) и бацитрацина (МУК 4.1.3379-16) в продуктах животного происхождения»

Однако эти методы имеют ряд недостатков:

- низкая специфичность. В настоящее время в продуктах питания используется большое количество добавок (консерванты, красители, усилители вкуса и т.д.), которые могут давать ложноположительный эффект;

- длительный период проведения анализа. Требуется время для выращивания спор тест-культур (от 1 до 7 суток) и для проведения самого анализа (18 часов), т.е. одно исследование занимает от 2 до 8 суток. Кроме того, для исследования необходимо постоянно поддерживать чистоту тест-культур.

- высокая стоимость тест-планшетов.

Известны так же способы определения тетрациклиновой группы и цинкбацитрацина в мясе и мясных продуктах, включающий отбор пробы, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента (ГОСТ 33934-2016. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной экстракции с масс-спектрометрическим детектором. МКС 67, 120.10 введен 2018-01-01 и ГОСТ 31694-2012 Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Определение остаточного содержания тетрациклиновой группы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором).

Существенным недостатком этих способов, ограничивающих их повсеместное использование, является применение дорогостоящего, технически сложного в освоении оборудования, с жесткими требованиями к качеству реактивов и расходным материалам.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по патенту RU N2696010 (опуб. 30.07.2019 г), который включает отбор пробы, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску тканей или органов животных массой 5 г, экстракцию проводят 5 мл 1,5 мМ водным раствором трилона Б и 5 мл 15 раствором трихлоруксусной кислоты в течение 15 мин, раствор перемешивают 20 мин, центрифугируют 15 мин, фильтруют, после фильтрации проводят очистку экстракта путем трехфазной экстракции (ТФЭ) на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 мг, который предварительно перед использованием конденсируют 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты рН=4,0, полученный экстракт пропускают со скоростью 1 мл/мин через картридж, затем сушат в вакууме под давлением 20 мм. рт.ст. и промывают 5 мл бидистиллированной водой, элюируют по 2,5 мл метанолом 2 раза, полученный элюат выпаривают под слабым током азота при t+25°C до 1 мл, полученный остаток растворяют в 4 мл раствора смеси - 0,05М калия фосфорнокислого однозамещенного, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 соответственно, а в качестве хроматографа используют хроматограф Agilent 1260 Infmiti с ультрафиолетовым детектором и колонкой Reprosil ODS -АС 18 мм (250×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм.

Недостатком данного способа является определение только одного антибиотика - бацитрацина, тогда как в мясе и мясных продуктах разных видов антибиотиков много, и которые требуют тоже дополнительных анализов и времени для их определения, а для одновременного их определения способа, обладающего высокой чувствительностью, в настоящее время не существует.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа одновременного выделения и концентрирования комплекса антибиотиков [тетрациклиновая группа, левомицетин (хлорамфеникол), бацитрацин] из биологических объектов и их количественного определения методом ВЭЖХ-УФ.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в одновременном извлечении и количественном определении комплекса антибиотиков тетрациклиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и бацитрацина, а также в расширении диапазона применения способа, в простоте использования и в сокращении времени проведения анализа при сохранении высокой чувствительности способа.

Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе одновременного определения комплекса антибиотиков (тетрациклиновая группа, левомицетин, бацитрацин) в мясе и мясных продуктах с использованием ВЭЖХ, включающем взятие навески тканей или органов животных массой 5 г, перемешивание в течение 20 мин, экстракцию, центрифугирование, фильтрацию, очистку экстракта путем твердофазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 с предварительным конденсированием его, пропускание полученного экстракта через картридж со скоростью 1 мл/мин, промывку бидистиллированной водой, элюирование метанолом, выпаривание полученного элюента под слабым током азота при t+25°C, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, экстракцию проводят 20 см³ смеси метанола, ацетонитрила и буфера MclLvaine в объемном соотношении 37,5/37,5/25 соответственно с добавлением 0,6 см³ 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугируют при 4500 об/мин на предварительно охлажденной до 4°С центрифуге, в течение 20 мин, затем процедуру экстракции и центрифугирования повторяют последовательно еще раз, затем полученные экстракты объединяют, фильтруют и осуществляют очистку полученного экстракта на картридже, который перед использованием конденсируют 6 см³ метанолом и 6 см³ бидистиллированной водой, промывают 6 см³ бидистиллированной водой, элюируют 6 см³ метанолом при скорости 1 мл/мин, полученный элюат выпаривают досуха, и полученный осадок растворяют в 5 см³ раствора смеси - 0,07М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 соответственно с добавлением 1М ЭДТА. В качестве хроматографа используют хроматограф Agilent 1260 Infiniti с ультрафиолетовым детектором G 1315 D и колонкой Reprosil ODS -AC 18 мм (250×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм.

Отличительными признаками предложенного способа являются проведение экстракции 20 см³ смеси метанола, ацетонитрила и буфера MclLvaine в объемном соотношении 37,5:37,5:25 соответственно с добавлением к смеси 0,6 см³ 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугирование при 4500 об/мин, на предварительно охлажденной до 4°С центрифуге, в течение 20 мин, повторение последовательно еще раз процедур экстракции и центрифугирования, объединение полученных экстрактов, фильтрование, осуществление очистки полученного экстракта на картридже, конденсирование картриджа перед использованием 6 см³ метанола и 6 см³ бидистиллированной воды, промывание 6 см³ бидистиллированной водой, элюирование 6 см³ метанолом при скорости потока 1 мл/мин, выпаривание полученного элюента досуха, растворение полученного остатка в 5 см³ раствора смеси - 0,07М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 соответственно с добавлением 1М ЭДТА. Это позволяет одновременно выделить, сконцентрировать и количественно определить комплексы таких антибиотиков как левомицетин (хлорамфеникол), тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин, бацитрацин, упростить процесс использования, сократить время анализа при сохранении высокой чувствительности способа и расширить диапазон применения способа - одновременно можно определить комплекс антибиотиков (тетрациклиновая группа, левомицетин, бацитрацин).

Способ одновременного определения комплекса антибиотиков (тетрациклиновая группа, хлорамфеникол, бацитрацин) в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом. Берут навеску мяса измельчают в гомогенизаторе-лабораторном MPW-302 в количестве 5 г, взвешенной с записью результата до второго десятичного знака на весах лабораторных ВЛТЭ-500, помещают в центрифужную пробирку и добавляют к 20 см³ смеси метанола, ацетонитрила и буфера MclLvaine в объемном соотношении 37,5:37,5:25 соответственно добавляют 0,6 см³ 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), перемешивают в течение 20 мин на встряхивателе, экстрагируют на ультразвуковой бане при температуре 20°С в течение 15 мин. Раствор центрифугируют при 4500 об/мин на предварительно охлажденной до 4°С в течение 20 мин центрифуге SORVALL RC-6. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.

Очистку экстракта осуществляют путем твердофазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³ × 60 мг. Предварительно картридж конденсируют 6 см³ метанола и уравновешивают 6 см³ бидистиллированной водой. Затем пропускают через картридж объединенный экстракт со скоростью потока 1 мл/мин и промывают 6 см³ бидистиллированной водой, элюируют 6 см³ метанолом при скорости потока 1 мл/мин, полученный элюат выпаривают под слабым током азота на термостатируемом нагревательном модуле с системой отдувки растворителей инертным газом при температуре +25°С досуха, полученный остаток растворяют в 5 см³ раствора смеси 0,07М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола взятых в соотношении 40:15:45 с добавлением 1М ЭДТА.

При необходимости полученный раствор пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.

Конечный объем вносят в жидкостной хроматограф Agilent 1260 Inflniti тип G 1315 D с ультрафиолетовым детектором G 1315 D.

Условия проведения анализа жидкостной хроматографии соответствует следующим параметрам:

Обработка результатов производится вычислением показателя, площадь хроматографического пика, исследуемого образца и раствора стандарта по формуле:

S=hW_h;

где h - высота пика, то есть расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора, W_h - ширина пика у основания, то есть отсекаемый пиком отрезок линии, проведенный параллельно основанию пика на середине его высоты.

Обработку результатов анализа проводят методом абсолютной градуировки, содержание антибиотика в биологических объектах (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где

X - содержание антибиотика в пробе, мг/кг;

С - концентрация стандартного раствора антибиотика, мкг/мл;

S₁ - площадь пика антибиотика в стандартном растворе, мм²;

S₂ - площадь пика антибиотика в анализируемой пробе, мм²;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Анализ метрологических характеристик способа одновременного определения комплекса антибиотиков (тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, бацитрацин) в мясе и мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показывает высокую чувствительность и избирательность и доступность метода соответствует разработанной нормативной документации за счет точного подбора экстрагента смеси метанола, ацетонитрила и буфера MclLvaine в объемном соотношении 37,5:37,5:25 соответственно с содержанием 1,5 мМ водного раствора ЭДТА, использования твердофазной экстракции на картриджах Oasis HLB 3 см³ × 60 мг и колонки (250×4) мм Reprosil ODS -AC 18 с размером частиц 5 мкм, а также подвижной фазы смеси 0,07М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 позволяет и 1 М водного раствора ЭДТА позволяет одновременно извлечь и определить тетрациклиновую группу, левомицетин (хлорамфеникол) и полипептидный антибиотик - бацитрацин в мясе методом ВЭЖХ-УФ на уровне установленных норм СанПиН 2.3.2.1078-01, использовать быстрый и безопасный прием пробоподготовки и сохранить высокую чувствительность анализа и сократить время одновременного определения антибиотиков до 3-3,5 раза.

Предлагаемый способ одновременного определения комплекса антибиотиков (тетрациклиновая группа, хлорамфеникол, бацитрацин) в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на УФ-детекторе был апробирован в лаборатории химического анализа ФГБНУ «Казанского Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

Экспериментальные данные представлены на фиг. 1 и 2.

Фиг. 1 представляет идентификацию комплекса антибиотиков (хлорамфеникол, тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин, бацитрацин) в стандартном растворе, содержащий 90% действующих веществ (European Pharmacopeia Reference Standard) методом ВЭЖХ.

На фиг. 1 представлена хроматограмма антибиотиков хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, бацитрацина в стандартном растворе с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infiniti с УФ-детектором G 1315 D при длине волны возбуждения 235 нм. При данных условиях установлено время удержания пиков антибиотиков: хлорамфеникола - 3,267 мин, тетрациклина гидрохлорида - 3,884 мин, окситетрациклина - 4,114 мин, хлортетрациклина - 4,388 мин, бацитрацина А - 16,488 мин, площадь хроматографического пика хлорамфеникола - 15,99555 мм², тетрациклина гидрохлорида - 149,58323 мм², окситетрациклина - 224,65234 мм², хлортетрациклина - 153,58354 мм², бацитрацина А - 442,79001 мм².

Фиг. 2 представляет идентификацию хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, мажорного пика А бацитрацина в опытной пробе мяса. Искусственная затравка мяса комплексом антибиотиков проводилась на уровне МДУ для хлорамфеникола в дозе 0,0003 мг/кг, для тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина и хлортетрациклина - 0,01 мг/кг и бацитрацина А - 0,02 мг/кг.

На фиг. 2 представлена хроматограмма комплекса антибиотиков хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина. бацитрацина в опытной пробе с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infiniti с УФ-детектором G 1315 D при длине волны возбуждения 235 нм. При данных условиях установлено время удержания пиков антибиотиков хлорамфеникола - 3,259 мин, тетрациклина гидрохлорида - 3,890 мин, окситетрациклина - 4,121 мин, хлортетрациклина - 4,395 мин, бацитрацина А - 16,507 мин, площадь хроматографического пика хлорамфеникола - 12,63648 мм², тетрациклина гидрохлорида - 121,16242 мм², окситетрациклина - 181,96839 мм² хлортетрациклина - 122,86683 мм², бацитрацина А - 354,23201 мм².

Приводим расчет площадей пиков хлорамфеникола в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁ = 15,99555 мм² (площадь пика хлорамфеникола в стандартном растворе)

S₂ = 12,6364845 мм (площадь пика хлорамфеникола в анализируемой пробе)

(содержание хлорамфеникола в анализируемой пробе)

Извлекаемость в процентом отношении составляет 79%.

Приводим расчет площадей пиков тетрациклина гидрохлорида в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁ = 149,58323 мм² (площадь пика тетрациклина гидрохлорида в стандартном растворе)

S₂ = 121,16242 мм² (площадь пика тетрациклина гидрохлорида в анализируемой пробе)

(содержание тетрациклина гидрохлорида в анализируемой пробе)

Извлекаемость в процентом отношении составляет 81%.

Приводим расчет площадей пиков окситетрациклина в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁ = 224,65234 мм (площадь пика окситетрациклина в стандартном растворе)

S₂ = 181,96839 мм (площадь пика окситетрациклина в анализируемой пробе)

(содержание окситетрациклина в анализируемой пробе)

Извлекаемость в процентом отношении составляет 80%.

Приводим расчет площадей пиков хлортетрациклина в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁ = 153,58354 мм² (площадь пика хлортетрациклина в стандартном растворе)

S₂ = 122,86683 мм² (площадь пика хлортетрациклина в анализируемой пробе)

(содержание хлортетрациклина в анализируемой пробе)

Извлекаемость в процентом отношении составляет 80%.

Приводим расчет площадей пиков бацитрацина А в стандартном растворе и в анализируемой пробе.

S₁ = 442,79001 мм² (площадь пика бацитрацина А в стандартном растворе)

S₂ = 354,23201 мм² (площадь пика бацитрацина А в анализируемой пробе)

(содержание бацитрацина А в анализируемой пробе) Извлекаемость в процентом отношении составляет 80%.

Отработка оптимальных жидкостно-хроматографических параметров для определения хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, бацитрацина в мясе и мясной продукции предлагаемым способом осуществлялась с использованием жидкостного хроматографа «Agilent 1260 Infiniti», оснащенного термостатом колонок, градиентным насосом и с ультрафиолетовым детектором G 1315 D.

Полнота разделения комплекса антибиотиков (хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, бацитрацина) в присутствии компонентов матрицы достигнута на колонке Reprosil ODS - AC 18 длиной 250 мм и внутренним диаметром 4 мм с сорбентом Eclipse РАН (АС 18) зернением 5 мкм при температуре колонки +25°С, при использовании режимов указанного выше градиентного состава подвижной фазы. Максимальный сигнал ультрафиолетового детектора получен при длине волны возбуждения 235 нм.

Таким образом, предлагаемый способ определения хлорамфеникола, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина, бацитрацина в мясе и мясных продуктах с использованием ВЭЖХ обладает высокой чувствительностью, прост и экономичен в осуществлении и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостной хроматограф с УФ - детектором. Стандартное отклонение измерения составляет 0,45% для концентрации хлорамфеникола до 0,0003 мг/кг, тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина и хлортетрациклина до 0,01 мг/кг и бацитрацина А до 0,02 мг/кг.

Источники информации

1. ГОСТ 33934-2016 МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Межгосударственный стандарт. - М. Стандартинформ, 2017. - 12 с.

2. ГОСТ 31694-2012 ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. - М. Стандартинформ, 2012. - 21 с.

3. МУК 4.1.1912-04 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Утв. Гл. гос. сан. врач РФ, Пер. зам. Министра здравоохранения РФ Г.Г. Онищенко, 06.03.2004 г., 7 с.

4. МУ 3049-84 Определение остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения. Утв. Зам. Гл. гос. сан. врача А.И. Заиченко, 1984. - 25 с.

5. МУК 4.1.3379-16 Определение остаточных количеств бацитрацина в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. - 10 с.

Изобретение относится к области аналитической химии и представляет собой способ одновременного определения комплекса антибиотиков тетрациклиновой группы: левомицетина, бацитрацина, в мясе и мясных продуктах с использованием ВЭЖХ. Способ одновременного определения комплекса антибиотиков, таких как тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, бацитрацин в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий взятие навески тканей или органов животных массой 5 г, экстракцию, перемешивание в течение 20 мин, центрифугирование, фильтрацию, очистку экстракта путем трехфазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³×60 мг с предварительным конденсированием картриджа, пропускание полученного экстракта через картридж со скоростью 1 мл/мин, промывку бидистиллированной водой, элюирование метанолом, выпаривание полученного элюата под слабым током азота при t=25°C, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, при этом в качестве хроматографа используют хроматограф Agilent 1260 Infiniti с ультрафиолетовым детектором G 1315D и колонкой Reprosil ODS-AC 18, 250×4 мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, экстракцию проводят 20 см³ смеси метанола, ацетонитрила и буфера McILvaine в объемном соотношении 37,5:37,5:25 соответственно с добавлением к смеси 0,6 см 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугируют при 4500 об/мин на предварительно охлажденной до 4°С центрифуге в течение 20 мин, затем процедуру экстракции и центрифугирования повторяют последовательно еще раз и полученные экстракты объединяют, фильтруют и осуществляют очистку полученного экстракта на картридже, который предварительно перед использованием конденсируют 6 см³ метанола и 6 см³ бидистиллированной воды, элюируют 6 см метанолом при скорости 1 мл/мин, полученный элюант выпаривают досуха и полученный остаток растворяют в 5 см³ раствора смеси - 0,07 М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 соответственно с добавлением 1М ЭДТА. Способ позволяет одновременно определять комплекс указанных антибиотиков, сократить время проведения анализа в 3-3,5 раза с сохранением высокой чувствительности способа. 1 табл., 2 ил.

Способ одновременного определения комплекса антибиотиков, таких как тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, бацитрацин в мясе и мясных продуктах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий взятие навески тканей или органов животных массой 5 г, экстракцию, перемешивание в течение 20 мин, центрифугирование, фильтрацию, очистку экстракта путем трехфазной экстракции на картридже Oasis HLB 3 см³×60 мг с предварительным конденсированием картриджа, пропускание полученного экстракта через картридж со скоростью 1 мл/мин, промывку бидистиллированной водой, элюирование метанолом, выпаривание полученного элюата под слабым током азота при t=25°C, введение растворенного остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве хроматографа используют хроматограф Agilent 1260 Infiniti с ультрафиолетовым детектором G 1315D и колонкой Reprosil ODS-AC 18, 250×4 мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, экстракцию проводят 20 см³ смеси метанола, ацетонитрила и буфера McILvaine в объемном соотношении 37,5:37,5:25 соответственно с добавлением к смеси 0,6 см 1,5 мМ водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугируют при 4500 об/мин на предварительно охлажденной до 4°С центрифуге в течение 20 мин, затем процедуру экстракции и центрифугирования повторяют последовательно еще раз и полученные экстракты объединяют, фильтруют и осуществляют очистку полученного экстракта на картридже, который предварительно перед использованием конденсируют 6 см³ метанола и 6 см³ бидистиллированной воды, элюируют 6 см метанолом при скорости 1 мл/мин, полученный элюант выпаривают досуха и полученный остаток растворяют в 5 см³ раствора смеси - 0,07 М ацетат аммония, ацетонитрила и метанола в соотношении 40:15:45 соответственно с добавлением 1М ЭДТА.