Способ подготовки проб цельного и сухого молока для определения в них химических загрязнителей Российский патент 2022 года по МПК G01N1/28 G01N30/06 

Изобретение относится к химическим методам анализа и может быть применено в аналитической химии, в частности, для подготовки проб цельного и сухого молока для последующего определения в них содержания химических загрязнителей. К таким химическим загрязнителям относят полициклические ароматические углеводороды, пестициды и антибиотики, которые представляют опасность для здоровья человека. Поэтому определение содержания химических загрязнителей в цельном и сухом молоке играет важную роль для обеспечения потребителей безопасной продукцией.

В настоящее время традиционными методами подготовки проб молока для его последующего химического анализа являются жидкостная и твердофазная экстракция, которые предполагают длительные, многостадийные и трудоемкие процедуры выделения определяемых веществ из сложных по составу проб молока с применением больших объемов токсичных органических растворителей.

В частности, для определения полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах в соответствии с национальным стандартом ГОСТ 31745-2012 [1] выполняют щелочной гидролиз жиров при нагревании пробы со спиртовым раствором щелочи в течение 3 ч, фильтрацию раствора пробы и экстракцию определяемых веществ в н-гексан (90 см³ на один анализ) с последующим роторным упариванием экстракта. Содержание полициклических ароматических углеводородов в экстрактах устанавливают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ВЭЖХ-ФЛД).

Для определения пестицидов в молоке и молочных продуктах с помощью метода газовой хроматографии с детектором электронного захвата в соответствии с национальным стандартом ГОСТ ISO 3890-1-2013 [2] осуществляют предварительное экстракционное выделение аналитов. При этом реализуют два способа выполнения экстракции. В первом случае пробу смешивают со смесью песка и сульфата натрия, затем переносят эту смесь в экстракционную колонку, предварительно наполненную небольшим количеством стекловаты и сульфата натрия, далее промывают колонку смесью н-гексана и ацетона и упаривают полученный элюат. Во втором способе молоко встряхивают с раствором оксалата натрия в метаноле (100 см³ на один анализ) в делительной воронке, затем последовательно встряхивают с диэтиловым эфиром (50 см³ на один анализ) и петролейным эфиром (50 см³ на один анализ) и упаривают полученный экстракт.

Для определения антибиотиков в молочных продуктах в соответствии с национальным стандартом ГОСТ 33526-2015 [3] выполняют выделение аналитов при смешении пробы с ацетонитрилом (3 см³ на один анализ), центрифугирование и выделение антибиотиков из вытяжки методом твердофазной экстракции. Для проведения твердофазной экстракции специальный картридж предварительно кондиционируют метанолом и деионизированной водой. Затем пропускают полученный раствор аналитов в метаноле (вытяжка). Антибиотики элюируют с сорбента. Полученный элюат упаривают в токе азота под вакуумом, затем растворяют в мобильной фазе, которая применяется для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС).

Общей тенденцией развития методологии химического анализа является поиск и разработка способов снижения объемов применяемых реагентов и токсичных органических растворителей и их замена на экологически безопасные и доступные.

В этом направлении наиболее близким прототипом изобретения является способ пробоподготовки жидкого молока для определения в нем органических загрязнителей (бутахлора и фипронила) на принципах жидкостно-жидкостной микроэкстракции в ионные жидкости [CN 105738512 (А)]. Пробподготовка включает в себя добавление 0,1-0,5 г хлорида натрия к 5,00 мл жидкого молока, доведение рН до 5-7 с помощью хлорной кислоты с концентрацией 0,1-0,5 моль/л, последующее центрифугирование и отбор надосадочной жидкости. На следующей стадии отобранную фазу смешивают с 50-80 мкл ионной жидкости (1-октил-3-метилимидазол гексафторфосфорной кислоты) с добавлением 800-1200 мкл ацетонитрила, центрифугируют смесь и отбирают нижний слой, который разбавляют. Аналиты затем определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием в УФ области спектра. Существенными недостатками данного способа являются высокая стоимость экстрагента - ионной жидкости, а таже применение токсичного органического растворителя - ацетонитрила. Кроме того, процедура синтеза ионной жидкости является длительной и многостадийной и требует дорогостоящих прекурсоров.

Поэтому существует задача разработки экологически безопасного, более экспрессного и дешевого с точки зрения применяемых растворителей и универсального способа подготовки сухого и цельного молока для определения в нем химических загрязнителей (ароматических углеводородов, пестицидов и антибиотиков).

Методическим решением, наиболее адекватным сформулированной задаче, является использование в качестве экстрагента глубокого эвтектического растворителя (ГЭР). При этом исходные компоненты молока - жиры - служат прекурсорами для образования эвтектической смеси. Образование ГЭР заключается в предварительном щелочном гидролизе пробы молока с образованием жирных кислот из триглицеридов. Данные жирные кислоты в дальнейшем при добавлении в пробу молока природного происхождения терпеноида (ментол или тимол) образуют ГЭР. При этом происходит выделение определяемых веществ в фазу образующегося ГЭР с последующим их определением методами высокоэффективной жидкостной или газовой хроматографии.

Технический результат заявленного изобретения по сравнению с прототипом [CN 105738512 (А)] состоит: в увеличении экспрессности и снижении стоимости, т.к. исключена стадия предварительного синтеза экстрагента, экстрагент образуется непосредственно в процессе пробоподготовки из исходных компонентов молока; в экологической безопасности, т.к. полностью исключено использование органических растворителей на стадии пробоподготовки; в универсальности, т.к. способ позволяет выделять различные классы аналитов (полициклические ароматические углеводороды, антибиотики, пестициды) как из сухого, так и цельного молока.

Разработанный способ представлен в следующих примерах:

Пример 1.

К 100 мг пробы сухого молока, содержащего полициклические ароматические углеводороды (нафталин, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бенз[а]антрацен, хризен, бензо[b]флуорантен, бензо[k]флуорантен, бенз[a]пирен, дибенз[a,h]антрацен, бенз[ghi]перилен) с концентрацией 100 мкг/кг, добавляли 2,5 см³ водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 3 моль/дм³, смесь перемешивали в течение 15 мин при температуре 80°С. При этом происходил гидролиз триглицеридов жирных кислот с образованием их водорастворимых солей. На следующем этапе раствор нейтрализовали 2,5 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 4 моль/дм³, в результате чего образовались свободные жирные кислоты. Затем в раствор вводили 300 мг ментола и перемешивали смесь в течение 10 мин при 80°С с целью образования ГЭР и извлечения в него полициклических ароматических углеводородов. Далее отделяли фазу экстракта и выполняли анализ методом ВЭЖХ-ФЛД. Правильность результатов подтверждали методом сравнения в соответствии с национальным стандартом ГОСТ 31745-2012 [1]. Разработанный способ обеспечивает степень извлечения полициклических ароматических углеводородов от 55 до 93%. Из полученных результатов (таблица 1) видно, что расхождение установленных концентраций с помощью разработанного способа и метода сравнения незначимо (не превышает 11%).

Пример 2.

К 1 мл молока, содержащего хлорорганические пестициды (α-1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексан, β-1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексан, γ-1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексан, 1,1,1-трихло-2,2-ди(4-хлорофенил)этан, 1,1-дихлоро-2,2-ди(4-хлорофенил)этилен, 1,1-дихлоро-2,2-ди(4-хлорофелен)этан, гептахлор, гептахлорэпоксид, хлордан, оксихлордан, эндрин, кетоэндрин, гесахлорбензол) с концентрацией 100 мкг/кг, добавляли 2,5 см³ водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 3 моль/дм³, смесь перемешивали в течение 15 мин при температуре 80°С. При этом происходил гидролиз триглицеридов жирных кислот с образованием их водорастворимых солей. На следующем этапе раствор нейтрализовали 2,5 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 4 моль/дм³, в результате чего образовались свободные жирные кислоты. Затем в раствор вводили 300 мг тимола и перемешивали смесь в течение 10 мин при 80°С с целью образования ГЭР и извлечения в него пестицидов. Далее отделяли фазу экстракта и выполняли анализ методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Правильность результатов подтверждали методом сравнения в соответствии с национальным стандартом ГОСТ ISO 3890-1-2013 [2]. Разработанный способ обеспечивает степень извлечения пестицидов от 81 до 97%. Из полученных результатов (таблица 2) видно, что расхождение установленных концентраций с помощью разработанного способа и метода сравнения незначимо (не превышает 9%).

Пример 3.

К 1 мл пробы молока, содержащего антибиотики (демеклоциклин, доксициклин, бензилпенициллин, окситетрациклин, стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол, хлортетрациклин, феноксиметилпенициллин) с концентрацией 100 мкг/л, добавляли 2,5 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 3 моль/дм³, смесь перемешивали в течение 15 мин при 80°С. При этом происходил гидролиз триглицеридов жирных кислот с образованием их водорастворимых солей. На следующем этапе раствор нейтрализовали 2,5 см³ раствора соляной кислоты концентрацией 4 моль/дм³, в результате чего образовались свободные жирные кислоты. Затем вводили 300 мг ментола и перемешивали 10 мин при 80°С с целью образования ГЭР и извлечения в него антибиотиков. Далее отделяли фазу экстракта и выполняли анализ методом ВЭЖХ-МС. Правильность результатов подтверждали методом сравнения в соответствии с национальным стандартом ГОСТ 33526-2015 [3]. Разработанный способ обеспечивает степень извлечения антибиотиков от 83-94%. Из полученных результатов (таблица 3) видно, что расхождение установленных концентраций с помощью разработанного способа и метода сравнения незначимо (не превышает 10%).

Как показывают результаты проведенного анализа на примерах конкретной реализации, заявленное изобретение подтверждает достижение указанного технического результата и наглядно демонстрирует возможность эффективного извлечения химических загрязнителей, таких как полициклические ароматические углеводороды, пестициды и антибиотики, из проб сухого и цельного молока за счет использования в качестве экстрагента глубокого эвтектического растворителя, образующегося из природных терпеноидов и компонентов проб молока - жирных кислот, образующихся непосредственно в процессе пробоподготовки молока за счет щелочного гидролиза триглицеридов жирных кислот. Продемонстрирована возможность исключения необходимости предварительного синтеза экстрагента и использования органических растворителей на стадии пробоподготовки, что упрощает процедуру анализа и сокращает время его проведения. Изобретение применимо для определения широкого круга химических загрязнителей как в цельном, так и сухом молоке.

Список литературы

1. ГОСТ 31745-2012. Продукты пищевые. Определение содержания полициклических ароматических углеводородов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. М.: Стандартинформ, 2019

2. ГОСТ ISO 3890-1-2013. Молоко и молочные продукты. Определение остаточного содержания хлорорганических соединений (пестицидов). Часть 1. Общие положения и методы экстракции. М.: Стандартинформ, 2016;

3. ГОСТ 33526-2015. Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. М.: Стандартинформ, 2019.

Изобретение относится к способу подготовки проб сухого и цельного молока и может быть использовано для определения химических загрязнителей, таких как полициклические ароматические углеводороды, пестициды и антибиотики. Способ подготовки проб цельного и сухого молока для последующего определения в нем химических загрязнителей, основанный на жидкостно-жидкостной микроэкстракции загрязнителей с использованием экстрагента, способного выделять полициклические ароматические углеводороды, пестициды и антибиотики из цельного и сухого молока, при этом в качестве экстрагента применяют глубокие эвтектические растворители, которые получают непосредственно в процессе щелочного гидролиза жиров пробы при нагревании при 80°С 1 мл цельного молока или 100 мг сухого молока с 2,5 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 3 моль/дм³ в течение 15 мин и последовательном добавлении 2,5 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 4 моль/дм³ и 100-300 мг терпеноида. Техническим результатом является высокая степень извлечения аналитов из проб сухого и цельного молока, а также исключение использование токсичных органических растворителей. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ подготовки проб цельного и сухого молока для последующего определения в нем химических загрязнителей, основанный на жидкостно-жидкостной микроэкстракции загрязнителей с использованием экстрагента, способного выделять полициклические ароматические углеводороды, пестициды и антибиотики из цельного и сухого молока, отличающийся тем, что в качестве экстрагента применяют глубокие эвтектические растворители, которые получают непосредственно в процессе щелочного гидролиза жиров пробы при нагревании при 80°С 1 мл цельного молока или 100 мг сухого молока с 2,5 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 3 моль/дм³ в течение 15 мин и последовательном добавлении 2,5 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 4 моль/дм³ и 100-300 мг терпеноида.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве терпеноидов используют ментол и тимол.