Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области антитела, в которые была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и), и которые, по сравнению с Fc-областью, не имеющей такой(их) аминокислотной(ых) модификации(й), обладают более высокой FcγRIIb-связывающей активностью и/или более высокой селективностью связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIа (типа R); и к полипептидам, содержащим указанные варианты Fc-области, а также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды.

Предшествующий уровень техники

Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в крови и имеют мало побочных эффектов (непатентные документы 1 и 2). В настоящее время почти все терапевтические антитела, имеющиеся в продаже, представляют собой человеческие антитела подкласса IgG1. Одной из известных функций антител класса IgG является антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (далее называемая ADCC-активностью) (непатентный документ 3). В антителе, обладающим ADCC-активностью, Fc-область должна связываться с Fcγ-рецептором (далее обозначаемым FcγR), который представляет собой антитело-связывающий рецептор, присутствующий на поверхности эффекторных клеток, таких как клетки-киллеры, природные клетки-киллеры и активированные макрофаги.

Сообщалось, что человеческие изоформы FcγRIa (CD64A), FcγRIIa (CD32A), FcγRIIb (CD32B), FcγRIIIa (CD16A), FcγRIIIb (CD16B) представляют собой белки семейства FcγR, и были также описаны их соответствующие аллотипы (непатентный документ 7). FcγRIa, FcγRIIa и FcγRIIIa называются активирующими FcγR, поскольку они обладают иммунологически активными функциями, а FcγRIIb называется ингибирующим FcγR, поскольку он обладает иммуносупрессорными функциями (непатентный документ 8).

Было показано, что при связывании Fc-области с FcγR важную роль играют некоторые аминокислотные остатки, присутствующие в шарнирной области и в CH2-домене антитела, а также сахарная цепь, присоединенная к аминокислоте Asn в положении 297 (в соответствии с Европейской нумерацией), которая связана с CH2-доменом (непатентные документы 4, 5 и 6). Были проведены исследования различных вариантов, обладающих FcγR-связывающими свойствами, главным образом, антител с мутациями, введенными в их сайты, и были получены варианты Fc-области, обладающие более высокой активностью связывания с активирующим FcγR (патентные документы 1, 2, 3 и 4).

Если активирующий FcγR перекрестно связан с иммунным комплексом, то он фосфорилирует тирозиновые активирующие мотивы иммунорецептора (ITAM), содержащиеся во внутриклеточном домене, или общую γ-цепь FcR (партнера по связыванию); активирует SYK, осуществляющий передачу сигнала, и запускает воспалительный иммунный ответ посредством инициации каскада сигналов активации (непатентный документ 9).

FcγRIIb представляет собой FcγR, экспрессирующийся только на В-клетках (непатентный документ 10). Сообщалось, что взаимодействие Fc-области антитела с FcγRIIb приводит к подавлению первичного иммунного ответа В-клеток (непатентный документ 11). Кроме того, сообщалось, что если FcγRIIb, присутствующий на В-клетках, и В-клеточный рецептор (BCR) перекрестно связываются посредством иммунного комплекса в кровотоке, то наблюдается подавление активации В-клеток и подавление продуцирования антитела В-клетками (непатентный документ 12). Для такой передачи иммуносупрессорного сигнала, опосредуемого BCR и FcγRIIb, необходимо присутствие тирозинового ингибирующего мотива иммунорецептора (ITIM), содержащегося во внутриклеточном домене FcγRIIb (непатентные документы 13 и 14). При фосфорилировании ITIM после передачи сигнала происходит рекрутинг SH2-содержащей инозитполифосфат-5-фосфатазы (SHIP), ингибирование передачи других каскадов сигналов активирующего FcγR и подавление воспалительного иммунного ответа (непатентный документ 15). Кроме того, сообщалось, что агрегация лишь одного FcγRIIb приводит к временному подавлению притока кальция, обусловленного перекрестным связыванием BCR, и к пролиферации В-клеток по BCR-независимому механизму без индуцирования апоптоза IgМ-продуцирующих В-клеток (непатентный документ 16).

Кроме того, FcγRIIb также экспрессируется на дендритных клетках, макрофагах, активированных нейтрофилах, тучных клетках и базофилах. FcγRIIb ингибирует функции активирующего FcγR, такие как фагоцитоз и высвобождение воспалительных цитокинов в этих клетках, и подавляет воспалительные иммунные ответы (непатентный документ 8).

Важная роль иммуносупрессорных функций FcγRIIb была выявлена в исследованиях, проводимых на FcγRIIb-дефицитных мышах (нокаут-мышах). Сообщалось, что у FcγRIIb-дефицитных мышей не наблюдается соответствующей регуляции гуморального иммунного ответа (непатентный документ 17), а также наблюдается повышенная чувствительность к индуцированному коллагеном артриту (CIA) (непатентный документ 18), наличие симптомов, напоминающих волчанку, и симптомов, напоминающих синдром Гудпасчера (непатентный документ 19).

Кроме того, сообщалось, что такая неадекватная регуляция FcγRIIb ассоциируется с развитием аутоиммунных заболеваний у человека. Так, например, сообщалось о наличии взаимосвязи между генетическим полиморфизмом в трансмембранной области и в промоторной области FcγRIIb и частотой развития системной красной волчанки (СКВ) (непатентные документы 20, 21, 22, 23 и 24), а также о снижении уровня экспрессии FcγRIIb на поверхности В-клеток у пациентов с СКВ (непатентные документы 25 и 26).

Исследования, проводимые на мышиных моделях, и клинические исследования показали, что FcγRIIb играет определенную роль в подавлении аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний посредством связывания с конкретными В-клетками, а поэтому такая молекула представляет особый интерес как мишень для подавления аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний.

Известно, что IgG1, используемый, главным образом, в качестве коммерчески доступного терапевтического антитела, связывается не только с FcγRIIb, но также обладает высокой активностью связывания с активирующим FcγR (непатентный документ 27). Поэтому, с использованием Fc-области, обладающей более высокой активностью связывания с FcγRIIb или более высокой селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активирующим FcγR, могут быть разработаны терапевтические антитела, обладающие более эффективными иммуносупрессорными свойствами по сравнению с IgG1. Так, например, было высказано предположение, что использование антитела, имеющего вариабельную область, которая связывается с BCR, и Fc-область, которая обладает повышенной способностью связываться с FcγRIIb, дает возможность ингибировать активацию В-клеток (непатентный документ 28). Сообщалось, что перекрестное связывание FcγRIIb на В-клетках и IgE, связанного с B-клеточным рецептором, приводило к подавлению дифференцировки В-клеток в клетки плазмы, что, в свою очередь, приводило к подавлению продуцирования IgЕ, а у мышей, которым были трансплантированы человеческие МКПК, концентрации человеческого IgG и IgМ сохранялись, тогда как концентрация человеческого IgЕ снижалась (непатентный документ 29). Сообщалось, что если FcγRIIb и CD79b, которые представляют собой молекулы-компоненты комплекса В-клеточного рецептора, перекрестно связываются не только с IgЕ, но с другим антителом, то пролиферация В-клеток подавляется in vitro, и при этом может наблюдаться ослабление симптомов артрита у модели с артритом, индуцированным коллагеном (непатентный документ 30).

Сообщалось, что перекрестное связывание FcεRI и FcγRIIb не только на В-клетках, но и на тучных клетках, посредством молекул, в которых Fc-часть IgG, обладающего повышенной активностью связывания с FcγRIIb, присоединена к Fc-части IgЕ, связывающейся с рецептором FcεRI IgE, приводит к фосфорилированию FcγRIIb и, тем самым, к подавлению FcεRI-зависимого притока кальция. Это дает основание предположить, что ингибирование дегрануляции посредством стимуляции FcγRIIb может быть обусловлено повышением активности связывания с FcγRIIb (непатентный документ 31).

В соответствии с этим было высказано предположение, что антитело, имеющие Fc с повышенной активностью связывания с FcγRIIb, может представлять особый интерес как терапевтическое средство для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания.

Кроме того, сообщалось, что активация макрофагов и дендритных клеток посредством Toll-подобного рецептора 4, обусловленная стимуляцией ЛПС, подавляется в присутствии иммунного комплекса «антитело-антиген», и, предполагается, что такой эффект также обусловлен действием иммунного комплекса, опосредуемым FcγRIIb (непатентные документы 32 и 33). Поэтому ожидается, что использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb позволит усиливать подавление активации сигнала, опосредуемого TLR, и, таким образом, можно предположить, что такие антитела представляют особый интерес как терапевтические средства для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания.

Кроме того, было высказано предположение, что мутанты с повышенной активностью связывания с FcγRIIb представляют особый интерес как терапевтические средства для лечения рака, а также как терапевтические средства для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания. Было обнаружено, что FcγRIIb играет важную роль в агонистической активности антител-агонистов против суперсемейства рецепторов TNF. В частности, было высказано предположение, что взаимодействие с FcγRIIb необходимо для агонистической активности антител против CD40, DR4, DR5, CD30 и CD137, которые принадлежат к семейству рецепторов TNF (непатентные документы 34, 35, 36, 37, 38, 39 и 40). В непатентном документе 34 описано использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb в целях усиления противоопухолевого эффекта анти-CD40 антител. В соответствии с этим, можно предположить, что антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIb обладают действием, направленным на повышение агонистической активности антител-агонистов, включая антитела против суперсемейства рецепторов TNF.

Кроме того, было показано, что пролиферация клеток может быть ингибирована с использованием антитела, которое распознает Kit, то есть тирозинкиназный рецептор (RTK), и перекрестно связывается с FcγRIIb на Kit-экспрессирующих клетках. Аналогичные эффекты наблюдались даже в тех случаях, когда этот рецептор Kit является конститутивно активированным и имеет мутации, приводящие к онкогенезу (непатентный документ 41). Поэтому предполагается, что использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb будет приводить к усилению ингибирующего действия на клетки, экспрессирующие RTK, имеющий конститутивно активированные мутации.

Имеются также данные об антителах, содержащих Fc с повышенной активностью связывания с FcγRIIb (непатентный документ 28). В этом документе FcγRIIb-связывающая активность была усилена путем введения модификаций, таких как S267E/L328F, G236D/S267E и S239D/S267E, в Fc-область антитела. Из этих антител, антитело, в которое была введена мутация S267E/L328F, исключительно сильно связывалось с FcγRIIb и сохраняло на том же уровне свою способность связываться с FcγRIа и FcγRIIа типа H, где остаток в положении 131 FcγRIIа представляет собой His, соответствующий остатку природного IgG1. Однако в другой работе показано, что при введении такой модификации уровень связывания антитела с FcγRIIа типа R, где остатком в положении 131 FcγRIIа является Arg, в несколько сотен раз выше, чем уровень связывания этого антитела с FcγRIIb, что означает, что его селективность связывания с FcγRIIb не отличается от селективности связывания с FcγRIIа типа R (патентный документ 5).

Считается, что на клетки, такие как тромбоциты, которые экспрессируют FcγRIIа, но не экспрессируют FcγRIIb, влияет только эффект усиления связывания с FcγRIIа, но не эффект усиления связывания с FcγRIIb (непатентный документ 8). Так, например, известно, что у группы пациентов, которым вводили бевацизумаб, то есть антитело против VEGF, наблюдался повышенный риск развития тромбоэмболии (непатентный документ 42). Кроме того, аналогичным образом, тромбоэмболия наблюдалась в клинических испытаниях на образование антител против лиганда CD40, а поэтому такое клиническое испытание было прервано (непатентный документ 43). В результате последних исследований, проводимых на животных-моделях с использованием этих антител, было высказано предположение, что вводимые антитела способствуют агрегации тромбоцитов посредством связывания с FcγRIIа на тромбоцитах и образуют кровяные сгустки (непатентные документы 44 и 45). В случае системной красной волчанки, которая является аутоиммунным заболеванием, тромбоциты активируются по FcγRIIа-зависимому механизму, и сообщалось, что такая активация тромбоцитов коррелирует с тяжестью симптомов (непатентный документ 46). Введение антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIа таким пациентам с высоким риском развития тромбоэмболии приводит к повышению риска развития тромбоэмболии и, таким образом, представляет исключительную опасность для пациента.

Кроме того, сообщалось, что антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIа усиливают опосредуемый макрофагами антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) (непатентный документ 47). Если антигены, связанные с антителами, подвергаются фагоцитозу под действием макрофагов, то считается, что сами эти антитела также одновременно подвергаются фагоцитозу. Если антитела вводят в качестве фармацевтических средств, то предполагается, что пептидные фрагменты, происходящие от вводимых антител, также присутствуют в качестве антигена, что тем самым повышает риск продуцирования антител против терапевтических антител (антитерапевтические антитела). Более конкретно, при повышении активности связывания с FcγRIIа повышается риск продуцирования антител против терапевтических антител, что значительно снижает ценность этих антител как фармацевтических средств. Кроме того, было высказано предположение, что FcγRIIb на дендритных клетках вносит свой вклад в периферическую толерантность посредством ингибирования активации дендритных клеток, вызываемой иммунными комплексами, образованными между антигенами и антителами, или посредством супрессии презентации антигена Т-клеткам посредством активирующих Fcγ-рецепторов (непатентный документ 48). Поскольку FcγRIIа также экспрессируется на дендритных клетках, то в случае использования антител, имеющих Fc с повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, в качестве фармацевтических средств презентация антигенов этими дендритными клетками становится маловероятной, и вследствие повышения селективности связывания с FcγRIIb риск продуцирования антитела против лекарственного средства может быть относительно снижен. А поэтому, такие антитела также могут представлять определенную ценность.

Более конкретно, при повышении активности связывания с FcγRIIа, ценность антител как фармацевтических средств значительно снижается, что приводит к повышению риска образования тромбов в результате агрегации тромбоцитов и к повышению риска продуцирования антител против терапевтических средств из-за повышенной иммуногенности.

С этой точки зрения, вышеупомянутый Fc-вариант с повышенной активностью связывания с FcγRIIb обладает значительно более высокой активностью связывания с FcγRIIа типа R по сравнению с природным IgG1. Поэтому его ценность как фармацевтического средства для пациентов, имеющих FcγRIIа типа R, значительно снижается. FcγRIIа типа Н и R встречается у людей индоевропейской расы и у афроамериканцев приблизительно с одинаковой частотой (непатентные документы 49 и 50). Поэтому, если такой Fc-вариант используется для лечения аутоиммунных заболеваний, то число пациентов, у которых может наблюдаться безопасный и благоприятный эффект от введения этого фармацевтического средства, ограничено.

Кроме того, сообщалось, что дендритные клетки, дефицитные по FcγRIIb, или дендритные клетки, в которых взаимодействие между FcγRIIb и Fc-частью антитела ингибируются анти-FcγRIIb антителом, способны к созреванию (непатентные документы 51 и 52). Эти данные позволяют предположить, в дендритных клетках в стабильном состоянии не наблюдаются воспаление и активация, а поэтому предполагается, что FcγRIIb активно подавляет созревание дендритных клеток. FcγRIIа, помимо FcγRIIb, экспрессируются на поверхности дендритных клеток, поэтому, даже при повышении активности связывания с ингибирующим FcγRIIb, а также при повышении активности связывания с активирующим FcγR, таким как FcγRIIа, может происходить стимуляция созревания дендритных клеток. Более конкретно, повышение активности связывания не только FcγRIIb, но также и отношение активности связывания с FcγRIIb к активности связывания с FcγRIIа, рассматривается как важный фактор при получении антител, обладающих иммуносупрессорным действием.

Поэтому, при получении фармацевтических средств, обладающих иммуносупрессорным действием, опосредуемым связыванием с FcγRIIb, необходимо создать Fc-вариант, который будет обладать не только повышенной активностью связывания с FcγRIIb, но также и способностью связываться с FcγRIIа аллотипов типа Н и R, где такое связывание будет сохраняться на уровне, аналогичном уровню связывания природного IgG1, или на более низком уровне.

С другой стороны, сообщалось, что в некоторых случаях аминокислотные модификации могут быть введены в Fc-область для повышения селективности связывания с FcγRIIb (непатентный документ 53). Однако все варианты, которые якобы имеют повышенную селективность к FcγRIIb, как упоминается в этом документе, обладают более низкой способностью связываться с FcγRIIb по сравнению с природным IgG1. Поэтому считается, что фактически индуцирование этими вариантами иммуносупрессорной FcγRIIb-опосредуемой реакции, которая была бы более сильной, чем реакция под действием IgG1, представляет определенные трудности.

Кроме того, поскольку FcγRIIb играет важную роль в продуцировании вышеупомянутых антител-агонистов, то предполагается, что усиление их активности связывания будет приводить к усилению агонистической активности. Однако, при аналогичном усилении активности связывания с FcγRIIа, может наблюдаться непредусмотренная активность, такая как ADCC-активность и ADCP-активность, а поэтому могут возникать побочные эффекты. С этой точки зрения также предпочтительно, чтобы такая повышенная активность связывания с FcγRIIb была селективной.

Исходя из этих результатов, важно отметить, что при продуцировании терапевтических антител, используемых для лечения аутоиммунных заболеваний и рака с применением FcγRIIb, активность связывания с FcγRIIа обоих аллотипов сохранялась на том же уровне как и для природного IgG, либо такая активность была более низкой, а активность связывания с FcγRIIb была более высокой. Однако, последовательность рецептора FcγRIIb во внеклеточной области на 93% идентична последовательности рецептора FcγRIIа, который является одним из активирующих FcγR, и такие последовательности по своей структуре являются почти аналогичными. Существуют аллотипы FcγRIIа типа Н и R, в которых аминокислотой в положении 131 является His (типа Н) или Arg (типа R), и реакции каждого из них с антителами отличаются друг от друга (непатентный документ 54). Поэтому проблема продуцирования варианта Fc-области, обладающего более высокой селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с селективностью связывания с FcγRIIа каждого аллотипа, заключается в трудности идентификации в высокой степени гомологичных последовательностей FcγRIIа и FcγRIIb. До сих пор, фактически, еще не получены варианты, обладающие достаточной активностью и селективностью связывания с FcγRIIb. В патентном документе 5 описаны варианты, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb, однако, степень такого повышения является низкой, а поэтому необходимо разработать варианты, которые обладали бы свойствами, аналогичными свойствам, описанным выше.

Документы предшествующего уровня техники

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 2000/42072

[Патентный документ 2] WO 2006/019447

[Патентный документ 3] WO 2004/99249

[Патентный документ 4] WO 2004/29207

[Патентный документ 5] US 2009/0136485

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Nat Biotechnol, 23, 1073-1078, 2005

[Непатентный документ 2] Eur J Pharm Biopharm, 59 (3), 389-96, 2005

[Непатентный документ 3] Chem Immunol, 65, 88-110, 1997

[Непатентный документ 4] J Biol Chem, 276, 16478-16483, 2001

[Непатентный документ 5] Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993

[Непатентный документ 6] Immunology, 86, 319-324, 1995

[Непатентный документ 7] Immunol Lett, 82, 57-65, 2002

[Непатентный документ 8] Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010

[Непатентный документ 9] Nat Rev Immunol, 8, 34-47, 2008

[Непатентный документ 10] Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989

[Непатентный документ 11] J Exp Med 129, 1183-1201, 1969

[Непатентный документ 12] Immunol Lett 88, 157-161, 2003

[Непатентный документ 13] Science, 256, 1808-1812, 1992

[Непатентный документ 14] Nature, 368, 70-73, 1994

[Непатентный документ 15] Science, 290, 84-89, 2000

[Непатентный документ 16] J Imunol, 181, 5350-5359, 2008

[Непатентный документ 17] J Immunol, 163, 618-622, 1999

[Непатентный документ 18] J Exp Med, 189, 187-194, 1999

[Непатентный документ 19] J Exp Med, 191, 899-906, 2000

[Непатентный документ 20] Hum, Genet, 117, 220-227, 2005

[Непатентный документ 21] J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007

[Непатентный документ 22] Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006

[Непатентный документ 23] Nat Med, 11, 1056-1058, 2005

[Непатентный документ 24] J Immunol, 176, 5321-5328, 2006

[Непатентный документ 25] J. Exp Med, 203, 2157-2164, 2006

[Непатентный документ 26] J Immunol 178, 3272-3280, 2007

[Непатентный документ 27] Blood, 113, 3716-3725, 2009

[Непатентный документ 28] Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008

[Непатентный документ 29] J Allergy Clin Immunol, 2012, 129: 1102-1115

[Непатентный документ 30] Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010

[Непатентный документ 31] Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008)

[Непатентный документ 32] J. Immunol, 2009, 183: 4509-4520

[Непатентный документ 33] J. Immunol, 2009, 182: 554-562

[Непатентный документ 34] Science, 333, 1030-1034, 2011

[Непатентный документ 35] Cancer Cell 19, 101-113, 2011

[Непатентный документ 36] J Clin Invest, 122 (3), 1066-1075, 2012

[Непатентный документ 37] J Immunol 171, 562-, 2003

[Непатентный документ 38] Blood, 108, 705-, 2006

[Непатентный документ 39] J Immunol 166, 4891, 2001

[Непатентный документ 40] doi: 10.1073/pnas.1208698109

[Непатентный документ 41] Immunol let, 2002, 143: 28-33

[Непатентный документ 42] J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007

[Непатентный документ 43] Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003

[Непатентный документ 44] J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008

[Непатентный документ 45] J Immunol, 185, 1577-1583, 2010

[Непатентный документ 46] Sci Transl Med, vol 2, issue 47, 47-63, 2010

[Непатентный документ 47] Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008

[Непатентный документ 48] J. Immunol, 2007, 178: 6217-6226

[Непатентный документ 49] J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996

[Непатентный документ 50] Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998

[Непатентный документ 51] J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005

[Непатентный документ 52] Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005

[Непатентный документ 53] Mol Immunol, 40, 585-593, 2003

[Непатентный документ 54] J Exp Med, 172, 19-25, 1990

Описание сущности изобретения

[Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения]

Настоящее изобретение было разработано с учетом вышеупомянутых факторов. Целью настоящего изобретения является получение варианта Fc-области путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область антитела, где указанный вариант обладает повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью с FcγRIIа (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была введена аминокислотная модификация; получение полипептида, содержащего вариант Fc-области; и получение фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид.

[Способ решения указанных проблем]

Авторами настоящего изобретения были проведены исследования, посвященные получению варианта Fc-области, обладающей повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа (типа R), в отличие от немодифицированной Fc-области, путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область, и получению полипептида, содержащего указанный вариант Fc-области. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что активность связывания с FcγRIIb и/или селективность связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью связывания с FcγRIIа (R-типа) может быть повышена путем объединения варианта Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области была заменена другой(ими) аминокислотой(ами).

Более конкретно, настоящее изобретение относится:

[1] к варианту Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией и по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 233, 234, 235, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 в соответствии с Европейской нумерацией, заменены другими аминокислотами, где активность связывания варианта с Fcγ-рецепторами [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 15,0 или более;

[2] к варианту Fc-области [1], где аминокислоты в положениях 238, 268 и 271 в соответствии с Европейской нумерацией заменены другими аминокислотами, и где, кроме того, по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 в соответствии с Европейской нумерацией, заменена другими аминокислотами;

[3] к варианту Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией представляет собой Asp, и который содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, состоящей из аминокислоты Asp в положении 233, аминокислоты Tyr в положении 234, аминокислоты Phe в положении 235, аминокислоты Asp в положении 237, аминокислоты Ile в положении 264, аминокислоты Glu в положении 265, аминокислот Phe, Leu или Met в положении 266, аминокислот Ala, Glu, Gly или Gln в положении 267, аминокислот Asp, Gln или Glu в положении 268, аминокислоты Asp в положении 269, аминокислоты Gly в положении 271, аминокислот Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro или Gln в положении 272, аминокислоты Gln в положении 274, аминокислот Asp или Phe в положении 296, аминокислот Ala или Asp в положении 326, аминокислоты Gly в положении 327, аминокислот Lys, Arg или Ser в положении 330, аминокислоты Ser в положении 331, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 332, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 333, аминокислот Arg, Ser или Thr в положении 334, аминокислот Ala или Gln в положении 355, аминокислоты Glu в положении 356, аминокислоты Met в положении 358, аминокислот Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении 396, аминокислоты Arg в положении 409 и аминокислоты Glu в положении 419, где активность связывания варианта с Fcγ-рецепторами [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 15,0 или более;

[4] к варианту Fc-области [3], где аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией, и где указанный вариант Fc-области также содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аминокислоты Asp в положении 233, аминокислоты Asp в положении 237, аминокислоты Ile в положении 264, аминокислоты Ala или Gly в положении 267, аминокислоты Asp или Pro в положении 272, аминокислоты Asp в положении 296, аминокислоты Gly в положении 327, аминокислоты Arg в положении 330, аминокислоты Thr в положении 332 и аминокислоты Leu или Met в положении 396;

[5] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[4], где величина [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 50,0 или более;

[6] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[4], где величина [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 100,0 или более;

[7] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[6], где величина [величина KD для FcγRIIа (R-типа) полипептида, содержащего вариант Fc-области]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 10,0 или более;

[8] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[6], где величина [величина KD для FcγRIIа (R-типа) полипептида, содержащего вариант Fc-области]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 20,0 или более;

[9] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[8], где указанный вариант Fc-области содержит любую из нижеследующих групп аминокислотных модификаций (а)-(х), таких как:

(а) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(b) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(c) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(d) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(е) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(f) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(g) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 327 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(h) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(i) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(j) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(k) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(l) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(m) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(n) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(o) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(p) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(q) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 327, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(r) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(s) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(t) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(u) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(v) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

(w) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области; и

(x) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;

[10] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[8], где указанный вариант Fc-области содержит любую из нижеследующих аминокислотных последовательностей (а)-(х), таких как:

(a) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(b) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(c) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;

(d) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Gly или Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(e) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;

(f) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;

(g) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(h) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;

(i) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(j) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;

(k) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(l) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(m) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;

(n) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;

(o) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(p) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;

(q) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met в соответствии с Европейской нумерацией;

(r) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;

(s) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(t) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(u) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;

(v) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Gly, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;

(w) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией; и

(x) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;

[11] к варианту Fc-области, состоящему из любой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NО: 43-68, SEQ ID NО:70, SEQ ID NО: 71 и SEQ ID NО: 75-77;

[12] к полипептиду, содержащему по меньшей мере два варианта Fc-области по любому из п.п. [1]-[11], где указанные два варианта Fc-области являются связанными;

[13] к полипептиду по п. [12], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области в полипептиде являются одинаковыми;

[14] к полипептиду по п. [12], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области в полипептиде являются различными;

[15] к полипептиду по п. [14], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области имеют отличающуюся(иеся) аминокислоту(ы) по меньшей мере в одном положении, выбранном из положений 235, 236, 237, 238 и 239 в соответствии с Европейской нумерацией в указанном варианте Fc-области;

[16] к полипептиду по п. [15], где одной из аминокислотных последовательностей двух связанных вариантов Fc-области является аминокислотная последовательность, содержащая по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аминокислот Asp, Gln, Glu или Thr в положении 235, аминокислоты Asn в положении 236, аминокислот Phe или Trр в положении 237, аминокислот Glu, Gly или Asn в положении 238 и аминокислот Asp или Glu в положении 239 в соответствии с Европейской нумерацией;

[17] к полипептиду по любому из п.п. [12]-[16], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является антитело IgG;

[18] к полипептиду по любому из п.п. [12]-[16], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является молекула слитого Fc-белка; и

[19] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из п.п. [12]-[18].

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения активности связывания Fc-области с FcγRIIb и к повышению селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа (R-типа) путем введения в Fc-область согласно изобретению аминокислотной(ых) модификации(й). Настоящее изобретение также относится к способу подавления продуцирования антител против полипептида, содержащего Fc-область, путем введения в Fc-область согласно изобретению аминокислотной(ых) модификации(й).

Настоящее изобретение также относится к терапевтическому или профилактическому средству для лечения иммунных воспалительных заболеваний, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный способ включает стадию введения индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического или профилактического средства для лечения иммунных воспалительных заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний согласно изобретению.

Настоящее изобретение относится к ингибитору активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный ингибитор содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к набору для его применения в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению для продуцирования ингибиторов активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов согласно изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма.

Кроме того, настоящее изобретение относится к средству для подавления пролиферации вируса, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу подавления пролиферации вируса, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе подавления пролиферации вируса, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения средства для подавления пролиферации вируса. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для подавления пролиферации вируса.

[Эффекты настоящего изобретения]

Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, которые, в отличие от немодифицированной Fc-области, обладают повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа (R-типа). С использованием полипептидов, содержащих варианты Fc-области, могут быть усилены сигналы, ингибирующие воспалительные иммунные ответы, опосредуемые фосфорилированием ITIM FcγRIIb. Кроме того, благодаря сообщению Fc-области такого свойства, как селективное связывание с FcγRIIb, может быть ингибировано продуцирование антитела против лекарственного средства. Кроме того, с использованием вариантов Fc-области согласно изобретению в виде полипептида, обладающего активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН и содержащего антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьируется в зависимости от концентрации ионов, может быть стимулировано удаление полипептид-связывающих антигенов, которые присутствуют в плазме.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 представлен график, на котором показаны результаты оценки агрегации тромбоцитов, вызываемой иммунным комплексом «омализумаб-G1d-3/IgE» в анализе на агрегацию тромбоцитов, проводимом с использованием тромбоцитов, выделенных у донора, имеющего полиморфизм FcγRIIа (R/H).

На фиг. 2 представлен график, на котором показаны результаты оценки агрегации тромбоцитов, вызываемой иммунным комплексом «омализумаб-G1d-3/IgE» в анализе на агрегацию тромбоцитов, проводимом с использованием тромбоцитов, выделенных у донора, имеющего полиморфизм FcγRIIа (Н/H).

На фиг. 3 представлен график, на котором показаны результаты оценки экспрессии CD62p на промытой мембранной поверхности тромбоцитов. На залитой черным кривой показан результат, полученный при проведении реакции с PBS с последующей стимуляцией путем добавления ADP, а на незаштрихованной кривой показан результат, полученный при проведении реакции с иммунным комплексом с последующей ADP-стимуляцией.

На фиг. 4 представлен график, на котором показаны результаты оценки экспрессии активного интегрина на промытой мембранной поверхности тромбоцитов. На залитой черным кривой показан результат, полученный при проведении реакции с PBS с последующей стимуляцией путем добавления ADP, а на незаштрихованной кривой показан результат, полученный при проведении реакции с иммунным комплексом с последующей ADP-стимуляцией.

На фиг. 5 показан комплекс Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенный с помощью рентгеноструктурного анализа. Для CH2-домена и CH3-домена Fc-области, часть, показанная слева, определена как домен A, а часть, показанная справа, определена как домен В.

На фиг. 6 проиллюстрировано сравнение, сделанное путем суперпозиции кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb и кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIа, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, (код PDB: 3RY6) для CH2-домена А Fc-области, где такое сравнение проводили методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Cα. На этой фигуре, структура комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb показана жирными линиями, а структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIа показана тонкими линиями. Следует отметить, что структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIа показана только для СН2-домена А Fc-части.

На фиг. 7 детально представлена структура вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) CH2-домена A Fc-части, главная цепь которой образует водородную связь с Tyr в положении 160 FcγRIIb, как показал рентгеноструктурный кристаллографический анализ комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 8 представлена структура аминокислотных остатков вокруг боковой цепи Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) CH2-домена A Fc-части, главная цепь которой образует водородную связь с Tyr в положении 160 FcγRIIb, как показал рентгеноструктурный анализ комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 9 графически проиллюстрирована суперпозиция определенных с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, описанного в сравнительном примере 7, и комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb для CH2-домена В Fc-части, где такую суперпозицию осуществляли для сравнения области вокруг петли в положениях 266-271, соответствующих Европейской нумерации, с применением метода наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Cα. В этой петле вариант Fc(P208) имеет модификацию Н268D в положении 268 (в соответствии с Европейской нумерацией) и модификацию Р271G в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) по сравнению с вариантом Fc(P238D).

На фиг. 10 представлена структура вокруг Ser239 CH2-домена B Fc-части вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.

На фиг. 11 проиллюстрировано сравнение, сделанное путем суперпозиции трехмерной структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIа R-типа и трехмерной структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, где такое сравнение было осуществлено методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Cα.

На фиг. 12 проиллюстрировано сравнение кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIа R-типа, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, и кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в CH2-домене А Fc-части, вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.

На фиг. 13 проиллюстрировано сравнение кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIа R-типа, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, и кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в CH2-домене В Fc-части, вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.

На фиг. 14 проиллюстрировано сравнение последовательностей константных областей G1d и G4d. На этой фигуре обведенные рамкой аминокислоты означают части, в которых аминокислотные остатки G1d и G4d отличаются друг от друга.

На фиг. 15 представлены величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIb на горизонтальной оси и величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIаR на вертикальной оси. Модификации, показанные на этой фигуре, а именно, G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, P238E и P238D, означают модификации, введенные в GpH7-B3. A5/B3 означает GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, цепи которых не содержат каких-либо модификаций, а вариант, содержащий P238D только в одной цепи, обозначен GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0.

На фиг. 16 представлены величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb на горизонтальной оси и величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIаR на вертикальной оси. На этой фигуре IL6R-B3/IL6R-L и IL6R-G1d/IL6R-L означают антитела, имеющие нативные человеческие последовательности IgG, которые служат в качестве сравнительного контроля при оценке каждого из этих вариантов. IL6R-BP264/IL6R-L представляет собой исходный вариант, используемый для продуцирования каждого из вариантов. IL6R-BP404/IL6R-L представляет собой вариант, полученный путем введения модификации L234Y в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L и обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с вариантом IL6R-BP264/IL6R-L до введения в него указанной модификации.

На фиг. 17 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.

На фиг. 18 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIа Н-типа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.

На фиг. 19 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIа R-типа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.

На фиг. 20 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIIа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.

На фиг. 21 показано сходство между аминокислотными остатками, составляющими константные области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и пронумерованными в соответствии с Европейской нумерацией (соответствующей здесь индексу EU).

На фиг. 22 представлен график, где на горизонтальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого PD-варианта с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого PD-варианта с FcγRIIа R-типа. Величину активности связывания каждого PD-варианта с каждым из FcγR делят на величину активности связывания IL6R-F652/IL6R-L, которое представляет собой контрольное антитело до введения модификации (модификации Fc с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) с каждым FcγR, и полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания каждого PD-варианта с каждым FcγR. На графике F652 представлена величина для IL6R-F652/IL6R-L.

На фиг. 23 представлен график, где на вертикальной оси отложены относительные величины FcγRIIb-связывающей активности вариантов, полученных путем введения модификации в вариант GpH7-B3, который не имеет модификации P238D, а на горизонтальной оси отложены относительные величины FcγRIIb-связывающей активности вариантов, полученных путем введения модификации в вариант IL6R-F652, который имеет модификацию P238D. Величину активности связывания каждого варианта с FcγRIIb делят на величину активности связывания FcγRIIb с антителом до его модификации, а затем полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания. В данном случае область А содержит модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb в обоих случаях, где модификацию вводят в вариант GpH7-B3, который не имеет модификации P238D, и в IL6R-F652/IL6R-L, который имеет модификацию P238D. Область В содержит модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb, если данная модификации была введена в вариант GpH7-B3, который не имеет модификации P238D, но не повышающие активности связывания с FcγRIIb, если данная модификации была введена в вариант IL6R-F652, который имеет модификацию P238D.

На фиг. 24 представлена кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 25 графически проиллюстрирована суперпозиция кристаллической структуры комплекса внеклеточной области Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуры-модели комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb на внеклеточную область FcγRIIb и CH2-домен А Fc, где указанную суперпозицию осуществляют методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Cα.

На фиг. 26 проиллюстрировано детальное сравнение структуры вокруг замены P238D после суперпозиции кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуры-модели комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb только на СН2-домен А Fc или только на СН2-домен В Fc, где указанное сравнение проводят методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Cα.

На фиг. 27 показано, что водородная связь присутствует между главной цепью Gly в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене А Fc и Tyr в положении 160 FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 28 показано, что электростатическое взаимодействие наблюдается между Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене В Fc и Arg в положении 131 FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточной области FcγRIIb.

На фиг. 29 представлен график, где на горизонтальной оси отложены величины относительной активности связывания каждого варианта 2В с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта 2В с FcγRIIа R-типа. Величину активности связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR делят на величину активности связывания с контрольным антителом до модификации (модификации Fc с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) в каждом FcγR, и полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR.

На фиг. 30 показаны Glu в положении 233 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи А Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 31 показаны Ala в положении 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи А Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 32 проиллюстрировано сравнение структуры с Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи В Fc после суперпозиции кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb со структурой цепи В Fc, где указанное сравнение проводили методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Cα.

На фиг. 33 проиллюстрировано изменение концентраций антигенсвязывающих молекул человеческого FcγRIIb в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1 или Fv4-P587.

На фиг. 34 проиллюстрировано изменение концентраций человеческого IL-6R или человеческого FcγRIIb в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1 или Fv4-P587.

На фиг. 35 проиллюстрирован неограничивающий механизм выведения растворимых антигенов из плазмы при введении антител, которые связываются с антигенами в зависимости от концентрации ионов, где указанные антитела обладают повышенной активностью связывания с FcγR при нейтральном рН по сравнению с активностью связывания известных нейтрализующих антител.

На фиг. 36 проиллюстрировано изменение концентраций антигенсвязывающих молекул человеческого FcγRIIb и человеческого FcRn в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1, Fv4-P587 или Fv4-P587_LS.

На фиг. 37 проиллюстрировано изменение концентраций человеческого IL-6R, человеческого FcγRIIb и человеческого FcRn в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1, Fv4-P587 или Fv4-P587_LS.

Способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, обладающему повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью связывания с FcγRIIа (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и); и к полипептиду, содержащему вариант Fc-области.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет комбинацию аминокислотной замены в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) и другой(их) специфической(их) аминокислотной(ых) модификации(й); и к полипептиду, содержащему такой вариант Fc-области. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения активности связывания с FcγRIIb и/или селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и), где указанный способ включает введение аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область. Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования продуцирования антител против Fc-области путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область и последующего введения такого варианта Fc-области в организм, причем такого ингибирования не происходит, если в Fc-область не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и).

Термин «полипептиды» согласно изобретению в общих чертах означает пептиды или белки, длина которых составляет приблизительно десять или более аминокислот. Кроме того, такие полипептиды могут быть получены от любых организмов без каких-либо ограничений, и такие полипептиды могут представлять собой, например, полипептиды, содержащие искусственно сконструированную последовательность. Кроме того, такими полипептидами могут быть природные полипептиды, синтетические полипептиды, рекомбинантные полипептиды или т.п.

Предпочтительными примерами полипептидов согласно изобретению являются антитела. Более предпочтительными примерами являются природные IgG, а в частности, природные человеческие IgG. Термин «природные (нативные) IgG» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает природный человеческий IgG1, природный человеческий IgG2, природный человеческий IgG3, природный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG.

Если константная область типа IgK (каппа-цепь, k-цепь), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6 и IgL7 (лямбда-цепь, λ-цепь) присутствует в константной области легкой цепи антитела, то она может представлять собой любую константную область легкой цепи. Для константной области человеческого IgK (каппа) и константной области человеческого IgL7 (лямбда), множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. Кроме того, в настоящем изобретении константной областью легкой цепи может быть константная область легкой цепи, в которую были введены аминокислотные замены, добавления, делеции, инсерции и/или модификации или т.п. В антителах, например, в антителах IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM имеются Fc-области. Так, например, Fc-областью антитела согласно изобретению может служить Fc-область человеческого антитела IgG, а предпочтительными являются Fc-области человеческого антитела IgG1. Fc-областями, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, например, Fc-области, происходящие от константных областей природного IgG, или, в частности, константных областей природного человеческого IgG1 (SEQ ID NO:11), константных областей природного человеческого IgG2 (SEQ ID NО:12), константных областей природного человеческого IgG3 (SEQ ID NО:13) и константных областей природного человеческого IgG4 (SEQ ID NО:14). На фиг. 21 представлены последовательности константной области природных IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константными областями природных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG. Для константных областей человеческих антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. В частности, аминокислотная последовательность человеческого IgG1 в положениях 356-358 (в соответствии с Европейской нумерацией) может представлять собой DEL или EEM.

Термин «Fcγ-рецепторы» (называемые здесь Fcγ-рецепторами, FcγR или FcgR) означает рецепторы, которые могут связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и, практически, означает любой член семейства белков, кодируемых генами Fcγ-рецептора. У человека это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIа (включая аллотипы H131 (H-типа) и R131 (R-типа)), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIb-с; а также FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIа (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) и любые неограничивающие примеры человеческих изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Сообщалось, что FcγRIIb1 и FcγRIIb2 представляют собой варианты сплайсинга человеческого FcγRIIb. Кроме того, в литературе также описан вариант сплайсинга, обозначаемый FcγRIIb3 (J. Exp Med, 1989, 170: 1369). Человеческий FcγRIIb, помимо этих вариантов сплайсинга, включает все варианты сплайсинга, зарегистрированные в NCBI под номерами NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 и NP_003992.3. Кроме того, человеческий FcγRIIb включает любой ранее описанный генетический полиморфизм, а также FcγRIIb (Arthritis Rheum., 2003, 48: 3242-52, Hum. Mol. Genet, 2005, 14: 2881-92, и Arthritis Rheum, 2002 May; 46(5): 1242-54) и каждый генетический полиморфизм, который будет описан в будущем.

Неограничивающими примерами FcγR являются человеческие, мышиные, крысиные, кроличьи и обезьяньи FcγR, а также FcγR, которые могут происходить от любого организма. Мышиными FcγR являются FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), и любые неограничивающие примеры мышиных изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Предпочтительными примерами таких Fcγ-рецепторов являются человеческие FcγRI (CD64), FcγRIIА (CD32), FcγRIIВ (CD32), FcγRIIIА (CD16) и/или FcγRIIIВ (CD16).

Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO:1 (NM_000566.3) и 2 (NP_000557.1), соответственно;

полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIА представлены в SEQ ID NO:3 (BC020823.3) и 4 (AAH20823.4), соответственно;

полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIB представлены в SEQ ID NO:5 (BC146678.1) и 6 (AAI46679.1), соответственно;

полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIА представлены в SEQ ID NO:7 (BC033678.1) и 8 (AAH33678.1), соответственно; и

полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIВ представлены в SEQ ID NO:9 (BC128562.1) и 10 (AAI28563.1), соответственно (регистрационный номер RefSeq указан в скобках).

FcγRIIа имеет два аллотипа, в одном из которых аминокислотой в положении 131 является гистидин (Н-типа), а в другом эта аминокислота заменена аргинином (R-типа)(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990).

В настоящем изобретении термин «Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)» или аналогичный термин означает Fc-область до введения в нее аминокислотной(ых) модификации(й) согласно изобретению. В настоящем изобретении этот термин может означать, например, Fc-область нативного IgG или Fc-область IgG, полученную путем введения в нативный IgG модификации, не являющейся аминокислотной(ыми) модификацией(ями) согласно изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении термин «вариант Fc-области» означает Fc-область, в которой по меньшей мере одна аминокислота была заменена другой аминокислотой согласно изобретению без введения аминокислотной(ых) модификации(й) согласно изобретению. В настоящем изобретении Fc-область, в которой «по меньшей мере одна аминокислота была заменена другой аминокислотой», включает Fc-область, в которую была введена указанная аминокислотная модификация, и Fc-область, состоящую из той же самой аминокислотной последовательности.

Термин «природные IgG» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает нативный человеческий IgG1, нативный человеческий IgG2, нативный человеческий IgG3, нативный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG.

Термин «Fc-область нативного IgG» означает Fc-область, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, происходящей от природного IgG. Константная область тяжелой цепи нативного IgG представлена на фиг. 21 (SEQ ID NO:11-14), и на этой фиг. 21, например, показаны Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG1, Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG2, Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG3, и Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG4. Fc-областями нативных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцированные из этих IgG.

В соответствии с настоящим изобретением, активность связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области или вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγR каждого типа, независимо от того является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена, например, путем мониторинга снижения или увеличения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсограммы, где различные FcγR, используемые в качестве аналита, подвергают взаимодействию с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п. с применением оборудования BIACORE, которое представляет собой анализатор взаимодействия, работающий на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР), как описано в примерах. Альтернативно, такая активность может быть определена путем мониторинга увеличения или уменьшения величины, полученной путем деления величины изменения резонансной единицы (RU) на сенсограмме до и после взаимодействия FcγR различных типов, используемых в качестве аналита, с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п., на величину изменения резонансных единиц (RU) до и после иммобилизации или захвата антител на сенсорном чипе. Кроме того, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсограммы, где оцениваемый образец, такой как антитело, используемое в качестве аналита, подвергают взаимодействию на сенсорном чипе, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки. Альтернативно, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величин на сенсограмме до и после взаимодействия оцениваемого образца, такого как антитело, используемое в качестве аналита, с сенсорным чипом, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки.

В частности, активность связывания варианта Fc-области с Fcγ-рецептором может быть определена путем скрининга, проводимого посредством проксимального гомогенного анализа на активацию люминесценции (ALPHA), с применением метода BIACORE на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) или т.п., а также с помощью ELISA или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

ALPHA-скрининг осуществляют с применением ALPHA-технологии, в которой используются две сферы, «донор» и «акцептор», и которая основана на нижеследующих принципах. Люминесцентные сигналы детектируются только в том случае, когда молекулы, связанные с донорными сферами, физически взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными сферами, и эти две сферы расположены в непосредственной близости друг к другу. Фотосенсибилизатор с лазерным излучением, присутствующий в донорных сферах, превращает кислород окружающей среды в синглетный кислород в возбужденном состоянии. Синглетный кислород диспергируется вокруг донорных сфер, и когда он достигает соседних акцепторных сфер, в этих сферах индуцируется хемилюминесцентная реакция, приводящая, в конечном счете, к излучению света. Если молекулы, связанные с донорными сферами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными сферами, то хемилюминесцентной реакции не происходит, поскольку синглетный кислород, продуцируемый донорными сферами, не достигает акцепторных сфер.

Так, например, биотинилированный полипептидный комплекс связывается с донорными сферами, а Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST), связывается с акцепторными сферами. В отсутствии конкурирующего полипептидного комплекса, содержащего вариант Fc-области, полипептидный комплекс, содержащий Fc-область дикого типа, взаимодействует с Fcγ-рецептором и продуцирует сигналы на длине волны 520-620 нм. Полипептидный комплекс, содержащий немеченую мутантную Fc-область, конкурирует с полипептидным комплексом, содержащим Fc-область дикого типа, за связывание с Fcγ-рецептором. Относительная активность связывания может быть определена путем количественной оценки снижения интенсивности флуоресценции, наблюдаемого после такого конкурентного связывания. Биотинилирование полипептидных комплексов, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п. хорошо известно специалистам. Экспрессию Fcγ-рецептора и GST в клетке, несущей слитый ген, продуцируемый путем присоединения полинуклеотида, кодирующего Fcγ-рецептор, с сохранением рамки считывания, к полинуклеотиду, кодирующему GST в экспрессионном векторе, и проведение очистки на колонке с глутатионом осуществляют методом мечения Fcγ-рецептора ферментом GST. Полученные сигналы, предпочтительно, анализируют, например, путем приведения их в соответствие с односайтовой моделью конкуренции посредством нелинейного регрессионного анализа с помощью компьютерной программы, такой как GRAPHPAD PRISM (GraphPad Inc., San Diego).

При наблюдении взаимодействия, одно из веществ (лиганд) иммобилизуют на тонкой золотой пленке на сенсорном чипе, после чего, при облучении светом с обратной стороны сенсорного чипа так, чтобы на границе между тонкой золотой пленкой и стеклом наблюдалось полное отражение, в части отраженного света образуется участок с пониженной интенсивностью отражения (ППР-сигнал). При наблюдении взаимодействия, в случае, если другое вещество (аналит) наносят на поверхность сенсорного чипа, и если лиганд связывается с аналитом, то масса иммобилизованной лигандной молекулы повышается, что приводит к изменению показателя преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа. В результате такого изменения показателя преломления происходит сдвиг положения ППР-сигнала (с другой стороны, при диссоциации такого связывания, сигнал возвращается в свое первоначальное положение). Система Biacore регистрирует величину вышеупомянутого изменения или, более конкретно, изменение массы в зависимости от времени путем построения кривой изменения массы на поверхности сенсорного чипа, отложенной на ординате по данным измерения (сенсограммы). По этой сенсограмме определяют количество аналита, связанного с лигандом, захваченным на поверхности сенсорного чипа. Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации (ka) и константы скорости диссоциации (kd), определяют на кривых сенсограммы, а константы диссоциации (KD) определяют как отношение этих констант. В анализе BIACORE, предпочтительно, применяется метод оценки ингибирования. Пример такого метода оценки ингибирования описан в Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010.

Fc-область с пониженной активностью связывания с FcγR или полипептид, содержащий такую Fc-область, означают вариант Fc-области или полипептид, содержащий такой вариант Fc-области, который связывается с FcγR со значительно более низкой активностью связывания, чем полипептид, содержащий родительскую Fc-область; при этом анализы на такое снижение активности связывания осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и) (где указанный полипептид также называется полипептидом, содержащим родительские Fc-области, или родительским полипептидом), и полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в Fc-области (где указанный полипептид также называется полипептидом, содержащим вариант Fc-области, или модифицированным полипептидом).

Кроме того, Fc-область с повышенной активностью связывания с FcγR или полипептид, содержащий такую Fc-область, означают вариант Fc-области или полипептид, содержащий такой вариант Fc-области, который связывается с FcγR со значительно более высокой активностью связывания, чем полипептид, содержащий родительскую Fc-область; при этом анализы на такое повышение активности связывания осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего родительскую Fc-область, и полипептида, содержащего вариант Fc-области.

Полипептид с постоянной активностью связывания с FcγR означает полипептид, который связывается с FcγR с активностью связывания, эквивалентной активности связывания родительского полипептида или по существу не отличающейся от активности связывания родительского полипептида; при этом анализы на такую постоянную активность осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего родительскую Fc-область, и полипептида, содержащего вариант Fc-области.

В настоящем изобретении повышенная активность связывания с FcγRIIb, предпочтительно, означает, например, активность, при которой отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего родительскую Fc-область, с FcγRIIb]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], измеренное с применением вышеупомянутого метода оценки, предпочтительно имеет значение, равное 15,0 или выше; 20,0 или выше; 25,0 или выше; 30,0 или выше; 35,0 или выше; 40,0 или выше; 45,0 или выше; 50,0 или выше; 55,0 или выше; 60,0 или выше; 65,0 или выше; 70,0 или выше; 75,0 или выше; 80,0 или выше; 85,0 или выше; 90,0 или выше; 95,0 или выше; или 100,0 или выше.

Кроме того, выражение «вариант Fc-области согласно изобретению обладает повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа» означает, что:

(i) активность связывания с FcγRIIb является повышенной, и активность связывания с FcγRIIа является постоянной или пониженной;

(ii) активность связывания с FcγRIIb является повышенной, и активность связывания с FcγRIIа также является повышенной, однако, степень повышения активности связывания с FcγRIIа ниже степени повышения активности связывания с FcγRIIb; или

(iii) активность связывания с FcγRIIb является пониженной, но степень снижения такой активности связывания ниже, чем степень снижения активности связывания с FcγRIIа. Независимо от того, имеет или не имеет вариант Fc-области согласно изобретению повышенную селективность связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIа, такая селективность связывания может быть определена, например, путем сравнения отношения величины KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIа к величине KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIb (величина KD для FcγRIIа/величина KD для FcγRIIb), где такое отношение величины KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIа к величине KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIb (величина KD для FcγRIIа/величина KD для FcγRIIb), определяют как описано в вышеупомянутых примерах. В частности, если величина отношения KD для полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, превышает величину отношения KD для полипептида, содержащего родительскую Fc-область, то полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, может быть определен как полипептид, обладающий повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область. В частности, поскольку активность связывания с FcγRIIа (R-типа), вероятно, коррелирует с активностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с FcγRIIа (Н-типа), то выбор аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) может (могут) способствовать повышению селективности связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIа (R-типа), будет играть важную роль в повышении селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с селективностью связывания с другими FcγR, не являющимися FcγRIIb.

Селективность связывания FcγRIIа (R-типа) и FcγRIIb выражают, например, как отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIа (R-типа)]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], составляющее предпочтительно 10,0 или более, а более предпочтительно 20,0 или более, где указанную величину KD измеряют методом, описанном выше.

Селективность связывания FcγRIIа (Н-типа) и FcγRIIb выражают, например, как отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIа (Н-типа)]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], составляющее предпочтительно 100 или более, 200 или более, 300 или более, 400 или более, 500 или более, а более предпочтительно 600 или более, 700 или более, 800 или более или 900 или более, где указанную величину KD измеряют методом, описанным выше.

Кроме того, активность связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, независимо от того, является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена по увеличению или снижению активности связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, как описано выше в примерах. В настоящем изобретении активность связывания полипептидов с различными FcγR означает величину, полученную путем определения разности относительных величин (RU) на сенсограммах до и после взаимодействия различных FcγR, используемых в качестве аналита, с каждым полипептидом, и деления этой разности на разность величин RU на сенсограммах до и после захвата полипептидов на сенсорных чипах.

Неограничивающие варианты Fc-области согласно изобретению имеют величину KD (моль/л) для FcγRIIb, составляющую, например, 9×10^-7или менее, предпочтительно 5×10^-7или менее, более предпочтительно 3×10^-7или менее, еще более предпочтительно 1×10^-7или менее, а наиболее предпочтительно 5×10^-8или менее.

Термин «Fc-область» означает фрагмент, состоящий из шарнирной области или ее части, СН2-домена и СН3-домена, присутствующих в молекуле антитела. В соответствии с Европейской нумерацией (также называемой здесь EU-индексом) (см. фиг. 21), например, Fc-область класса IgG, означает, например, область, которая простирается от цистеина в положении 226 до С-конца или от пролина в положении 230 до С-конца, но не ограничивается этими областями.

Fc-область может быть получена, предпочтительно, путем повторного элюирования фракции, адсорбированной на колонке с белком А, после частичного гидролиза моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п. с использованием протеазы, такой как пепсин. Такой протеазой может быть любая протеаза, при условии, что она может гидролизовать полноразмерное антитело так, чтобы фрагменты Fab и F(ab')₂ продуцировались посредством рестрикционного гидролиза в ферментативной реакции, осуществляемой при соответствующем рН, и посредством соответствующих ферментов, и примерами таких ферментов являются пепсин и папаин.

Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, имеющим комбинацию модификаций, которые включают замену аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) другой аминокислотой и замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 234, 235, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 (в соответствии с Европейской нумерацией), другой аминокислотой в Fc-области человеческого IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Путем объединения замены аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) с заменой по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 (в соответствии с Европейской нумерацией), другой аминокислотой в Fc-области человеческого IgG, можно получить полипептид, содержащий вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и). Другими аминокислотными модификациями, которые могут быть объединены с аминокислотной модификацией в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительно являются модификации в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296, 327, 330, 332, 333 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией), а в частности, модификации в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией). В частности, для повышения активности связывания с FcγRIIb или повышения селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа, предпочтительной комбинацией аминокислотных модификаций является комбинация модификаций в положениях аминокислот 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) с модификацией по меньшей мере одной аминокислоты в положениях, выбранных из положений 233, 237, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией).

Модифицированные аминокислоты не имеют конкретных ограничений, при условии, что эти аминокислоты будут способствовать повышению активности связывания с FcγRIIb или повышению селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIа, по сравнению с активностью до их модификации, при этом предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 234 является Tyr, аминокислотой в положении 235 является Phe, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 265 является Glu, аминокислотой в положении 266 является Phe, Leu или Met, аминокислотой в положении 267 является Ala, Glu, Gly или Gln, аминокислотой в положении 268 является Asp, Gln или Glu, аминокислотой в положении 269 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro или Gln, аминокислотой в положении 274 является Gln, аминокислотой в положении 296 является Asp или Phe, аминокислотой в положении 326 является Ala или Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Lys, Arg или Ser, аминокислотой в положении 331 является Ser, аминокислотой в положении 332 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 333 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 334 является Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 355 является Ala или Gln, аминокислотой в положении 356 является Glu, аминокислотой в положении 358 является Met, аминокислотой в положении 396 является Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, аминокислотой в положении 409 является Arg, а аминокислотой в положении 419 является Glu в соответствии с Европейской нумерацией. В частности, при объединении модификаций аминокислот в положениях 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) с модификациями по меньшей мере одной аминокислоты в положениях, выбранных из положений 233, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp или Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, аминокислотой в положении 332 является Thr, а аминокислотой в положении 396 является Leu или Met в соответствии с Европейской нумерацией.

В соответствии с настоящим изобретением, помимо этих модификаций, в Fc-область может быть добавлена по меньшей мере одна другая модификация. Такая добавленная модификация не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет приводить к повышению активности связывания с FcγRIIb и/или селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIа. Кроме того, модификации могут быть осуществлены путем введения совокупности модификаций, где часть Fc-области заменена соответствующей частью Fc-области другого изотипа. Так, например, активность связывания с FcγRIIb и/или селективность связывания с FcγRIIb может быть повышена путем объединения вышеупомянутых аминокислотных модификаций с заменой аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области, происходящей от IgG1, аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области, происходящей от IgG4. Конкретный пример включает комбинацию аминокислотных модификаций, вводимых в IL6R-BP230, и модификации, такой как замена аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в G1d, аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией) в G4d, как описано в примере 7 для IL6R-BP478/IL6R-L.

Из этих модификаций предпочтительными являются модификации, которые приводят к значительному повышению активности связывания с FcγRIIb или к значительному повышению селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIа (R-типа). Примерами таких предпочтительных комбинаций аминокислотных модификаций являются нижеследующие модификации (a)-(x):