ВЫСОКОСТАБИЛЬНЫЕ НЕВЕЗИКУЛЯРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ МИКРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2020 года по МПК A61K9/14 A61K31/202 A61K47/44 A61P31/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины. В частности, настоящее изобретение относится к высокостабильной невезикулярной наночастице и применению такой наночастицы при лечении микробных инфекций.

Область техники

Микроорганизм представляет собой собирательный термин для всех организмов малого размера, нелегко увидеть невооруженным глазом, в том числе для большой группы организмов, включающей бактерии, грибы, некоторые протесты малого размера, микроводоросли и вирусы. Они имеют малый размер и тесно связаны с человеком, включая в широкий диапазон полезных и вредоносных видов, и затрагивают широкий спектр таких областей техники, как пищевые продукты, медицина, промышленность и сельское хозяйство, и защита окружающей среды.

Одним из наиболее важных эффектов микроорганизмов на человека является распространение инфекционных заболеваний. В предотвращении и лечении заболеваний был достигнут значительный прогресс, однако постоянно появляются новые и повторно возникающие микробные инфекции. Патогенез некоторых микробных инфекций остается неясным, что приводит к отсутствию эффективных вариантов лечения. При этом злоупотребление значительным числом антибиотиков широкого спектра вызвало значительные трудности выбора, результатом которых стали мутации у многих штаммов, приводящие к возникновению лекарственной устойчивости и новых угроз для здоровья человека. Например, инфекция Tuberculosis, раньше находившаяся под контролем, снова широко распространилась в мире из-за появления устойчивой к лекарствам Mycobacterium tuberculosis.

Другой пример: стафилококки, в частности, Staphylococcus aureus, являются одной из основных причин смертельных внутрибольничных и внебольничных инфекций. За последние десятилетия в течение нескольких поколений S. aureus вырабатывал устойчивость к антибиотикам и в настоящее время устойчив ко всем бета-лактамным антибиотикам, в том числе пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемовым антибиотикам. Staphylococcus aureus, устойчивый к бета-лактамным антибиотикам, также известен как метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus (MRSA) или супербактерия. Растущая распространенность вызванных MRSA инфекций привела к широкому применению ванкомицина, одного из немногочисленных антибиотиков, остававшихся эффективными при MRSA. Однако ванкомицин способен только подавлять, но не устранять MRSA. Кроме того, экстенсивное применение ванкомицина привело к появлению устойчивого к ванкомицину Staphylococcus aureus в конце 1990-х гг. Все указанные факты подчеркивают важность и срочную необходимость разработки новых эффективных способов лечения MRSA.

Последние исследования в области новых лекарственных средств против MRSA включают синтез новых лекарственных средств на основе существующих антибиотиков, разработку иммуноглобулинов для целевого выведения токсинов MRSA и разработку естественных антибиотиков, таких как катионные противомикробные пептиды, липосомы и другие эндогенные вещества. Хотя указанные новые синтетические лекарственные средства давали хорошие результаты в клинических испытаниях, они обладают структурой и антибактериальными механизмами, аналогичными существующим антибиотикам, и в результате у MRSA может развиваться устойчивость к синтетическим лекарственным средствам вскоре после начала их широкого клинического применения. Пассивная нейтрализация бактериальных токсических факторов путем инъецирования противовирусных глобулинов и фрагментов антител может быть благоприятной для улучшения при острой инфекции, однако указанный способ не ингибирует и не устраняет собственно бактерии, и в конечном итоге все равно приводит к рецидивирующим инфекциям.

Некоторые микроорганизмы инфицируют специфические участки, что обуславливает недоступность или неэффективность лекарственных средств. Например, Helicobacter Pylori, обнаруживаемая в желудке, представляет собой наиболее распространенный бактериальный патоген в мире, которым инфицировано более половины населения мира. Инфекции Helicobacter pylori вызывают различные заболевания желудка, в том числе хронический гастрит, язву желудка и рак желудка.

В настоящее время универсальный план лечения инфекции Н. pylori в мире представляет собой тройную терапию, то есть два антибиотика (кларитромицин + амоксициллин или метронидазол) в комбинации с ингибитором протонной помпы. Однако из-за быстрого появления штаммов Н. pylori, устойчивых к существующим антибиотикам, уровни эрадикации для современных схем лечения быстро снижаются. Например, показатель выведения для тройной терапии Н. pylori упал до 60-75%. Основная причина заключается в устойчивости штаммов Н. pylori к указанным антибиотикам. В частности, устойчивость к ключевому компоненту тройной терапии, метронидазолу, наиболее очевидна. В развитых странах такая устойчивость составляет 40%, а в развивающихся странах - 90%. С учетом указанной возникающей устойчивости были разработаны разные типы антибиотиков, однако результаты не были удовлетворительными. Кроме того, вновь разработанные антибиотики и варианты их применения также ограничены неудовлетворительной комплаентностью пациентов, значительными побочными эффектами и высокой стоимостью лечения антибиотиками. Очевидна необходимость в разработке новых решений для лечения в клинике, отличающихся превосходным терапевтическим действием и менее выраженными побочными эффектами.

Другие микробные инфекции, хотя и не приводящие к тяжелым, например, смертельным последствиям, могут серьезно влиять на качество жизни людей. Например, инфекция акне (угревая) представляет собой распространенное состояние кожи, которым поражено или было поражено 80% людей. Основной причиной акне является избыточная секреция секрета кожных желез, приводящая к закупориванию волосяных фолликулов, обуславливающему формирование локализованной гипоксической или анаэробной среды, что стимулирует быстрое размножение Propionibacterium acnes. Propionibacterium acnes представляет собой грамположительную анаэробную бактерию, тесно связанную с инфекцией акне. Размножение P. acnes приводит к разрыву стенки волосяного фолликула, соответственно, иммунные клетки хозяина реагируют на вторжение бактерий, что приводит к воспалительному акне. Тяжелое воспаление очагов поражения акне может вызывать пигментацию и постоянные рубцы кожи, приводя к нарушению душевного равновесия, стрессу и чувству неполноценности, таким образом влияя на психическое здоровье и развитие.

Для лечения акне был разработан и одобрен ряд противомикробных агентов, в том числе адапален, тазаротен, эритромицин, клиндамицин, пероксид бензоила (ВРО) и другие антибиотики. Хотя указанные антибиотики демонстрируют значимые противоугревые эффекты, указанные лекарственные средства часто имеют серьезные побочные эффекты. Например, ВРО представляет собой одно из наиболее часто используемых средств для кожи при акне; однако он с высокой частотой вызывает эритему, шелушение, жжение кожи и обесцвечивание волос. Хотя пероральные антибиотики очень эффективны, их применение часто сопровождается риском повреждения микрофлоры ЖКТ и индукции устойчивой P. acnes. Например, изотретиноин представляет собой третиноин, происходящий из витамина А, для лечения тяжелого акне, и его применение строго регулируется. Использование указанного лекарственного средства у большинства пациентов с акне невозможно ввиду выраженных тератогенных эффектов. Соответственно, новые противоугревые лекарственные средства должны не только обеспечивать хорошие терапевтические эффекты, однако также давать очень незначительные токсические побочные эффекты и не индуцировать появление лекарственно-устойчивых штаммов.

Помимо бактерий, к представляющей серьезную угрозу для здоровья человека группе микроорганизмов также относятся грибы. В соответствии с участком организма человека, где происходит микотическая инвазия, микотические (вызванные грибами) инфекционные заболевания подразделяют на четыре категории: поверхностный микоз, дерматофития, микотическое заболевание подкожных тканей и системное микотическое заболевание; две первых категории известны как поверхностные микотические заболевания, а две последние категории известны как глубокие микотические заболевания (глубокий микоз).

В настоящее время, на фоне проведения трансплантаций костного мозга и органов, химиотерапии опухолей, длительного применения глюкокортикоидов и широкого применения антибиотиков широкого спектра, частота встречаемости инвазивных микотических инфекций год от года возрастает, постоянно появляются новые патогены, и положение усугубляется. Глубокий микоз является наиболее разрушительной из микотических инфекций, а также одной из внутрибольничных инфекций. Его клинические симптомы и признаки являются неспецифическими. Глубокий микоз характеризуется отсутствием эффективных диагностических инструментов, быстрым характером прогрессирования, неудовлетворительным прогнозом и более частым применением профилактических и эмпирических вариантов лечения. В настоящее время клинические антимикотические лекарственные средства могут быть подразделены на четыре категории: азолы, полиены, акриламины, флуцитозин и т.п., из которых наиболее широко применяются азолы. У существующих антимикотических лекарственных средств имеются ограничения, например, узкий спектр антибактериального действия и значительные побочные эффекты, ограничивающие их клиническое применение. В то же время ввиду экстенсивного применения антимикотических лекарственных средств уровень устойчивости грибов постоянно увеличивается, что влияет на терапевтические эффекты указанных лекарственных средств.

В последние десятилетия проводились интенсивные исследования применения нанотехнологий в фармакологии. Наночастицы могут быть нагружены лекарственным средством путем физического покрытия или химического связывания, со значимым увеличением таким образом кинетических и терапевтических индексов указанного лекарственного средства по сравнению с лекарственным средством в свободной форме. Преимущества указанных систем доставки лекарственных средств на основе наночастиц обычно заключаются в улучшении растворимости в сыворотке указанного лекарственного средства, продлении системной циркуляции указанного лекарственного средства и продолжительном контролируемом высвобождении указанного лекарственного средства. Поскольку большинство лекарственных средств в указанных наночастицах представлено традиционными антибиотиками, все равно развиваются устойчивые штаммы. Кроме того, процесс изготовления применяемых наночастиц является сложным, дорогостоящим и отличается ограниченной стабильностью, что серьезно влияет на практическую применимость таких лекарственных средств.

Соответственно, в данной области техники существует значительная потребность в высокоэффективных новых терапевтических агентах, направленных против микробной инфекции и не индуцирующих лекарственно-устойчивые штаммы.

Краткое описание изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении высокоэффективного нового терапевтического лекарственного средства, направленного против микробной инфекции и не индуцирующего лекарственно-устойчивые штаммы.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена невезикулярная наночастица, состоящая из жирной кислоты или ее производного, поверхностно-активного вещества и, необязательно, липида.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная жирная кислота представляет собой жирную кислоту С8-С28, предпочтительно, С12-С24, наиболее предпочтительно, С12-С18, насыщенную или ненасыщенную; а указанное производное жирной кислоты представляет собой моно-, ди- или триглицериды жирной кислоты С10-С14, предпочтительно, C11-С13.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная ненасыщенная жирная кислота содержит от 1 до 6, предпочтительно, от 1 до 4, например, 1, 2 или 3 ненасыщенных связи, предпочтительно, двойных связи.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанные жирные кислоты включают, не ограничиваясь перечисленными, пальмитиновую, стеариновую, олеиновую, линоленовую, линолевую, лауриновую, миристоленовую, арахидоновую, эйкозапентаеновую кислоту (здесь и далее в настоящем документе называемую ЭПК), докозагексановую кислоту (здесь и далее в настоящем документе называемую ДГК), каприловую кислоту, каприновую кислоту и нонановую кислоту.

Согласно конкретному варианту реализации указанная жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, лауриновую кислоту или миристолеиновую кислоту; а производное жирной кислоты представляет собой моноглицерид, диглицерид или триглицерид лауриновой кислоты, предпочтительно, моноглицерид лауриновой кислоты.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанное поверхностно-активное вещество включает, не ограничиваясь перечисленными, одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из стеарата натрия, 4-(5-додецил)бензенсульфоната, полиоксиэтиленгликоля, полисорбата 20, полисорбата 40, сложного эфира сорбита 60, полисорбата 80, полоксамера, октилфенилэфира полиэтиленгликоля и Тритон Х-100.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный липид представляет собой фосфолипид и/или холестерин.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанные фосфолипиды включают, не ограничиваясь перечисленными, один или более фосфолипидов, выбранных из группы, состоящей из: фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, димиристоилцерофосфолипида, дипальмитоилфосфатидилхолина, пальмитоилфосфатидилглицерина и диолеилфосфатидилэтаноламина.

Согласно предпочтительному варианту реализации отношение массы указанного липида к массе указанного поверхностно-активного вещества составляет 10~0:1, предпочтительно, 5~0:1, более предпочтительно, 2,5~0:1.

Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация указанной жирной кислоты или ее производного составляет от 0,001 до 5% (масса/объем), предпочтительно, от 0,1 до 5% (масса/объем), более предпочтительно, от 0,2 до 4% (масса/объем); и еще более предпочтительно, от 0,3 до 3% (масса/объем).

Согласно конкретному варианту реализации размер указанных наночастиц составляет 1-90 нм, предпочтительно, 2-80 нм, более предпочтительно, 5-50 нм, более предпочтительно, 5-20 нм, и наиболее предпочтительно, 5-15 нм.

Согласно предпочтительному варианту реализации размер полученных наночастиц может составлять 1-30 нм; 10-40 нм; 20-50 нм; 30-60 нм; 40-70 нм; 50-80 нм; 60-90 нм; или размер указанных наночастиц может составлять 5-25 нм; 15-35 нм; 25-15 нм; 35-55 нм; 45-65 нм; 55-75 нм; 65-85 нм; или размер указанных наночастиц может составлять 10-30 нм; 20-40 нм; 30-50 нм; 40-60 нм; 50-70 нм; 60-80 нм; 70-90 нм.

Согласно конкретному варианту реализации коэффициент полидисперсности указанных наночастиц составляет<0,3, предпочтительно, <0,2.

Согласно предпочтительному варианту реализации размер указанных наночастиц находится в более узком диапазоне, например, составляет приблизительно 5-10 нм, приблизительно 15-25 нм, приблизительно 20-30 нм, приблизительно 40-50 нм, приблизительно 65-75 нм, приблизительно 80-90 нм или приблизительно 100-110 нм.

Согласно конкретному варианту реализации стабильность указанной невезикулярной наночастицы определяется как:

после хранения при комнатной температуре и до 37°С в течение 3 месяцев изменение значений «минимальной ингибирующей концентрации» и «минимальной бактерицидной концентрации» для указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами; или,

после хранения при комнатной температуре в течение 1,5 месяцев, предпочтительно, 3 месяцев изменение размера указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 15%, более предпочтительно, меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами.

Согласно конкретному варианту реализации указанные наночастицы получают с применением способа, включающего:

1) суспендирование поверхностно-активного вещества и необязательного липида в воде;

2) перемешивание суспензии, полученной на этапе 1), до образования гомогенной суспензии;

3) нагревание гомогенной суспензии, полученной на этапе 2), до температуры выше температуры плавления содержащихся в ней поверхностно-активного вещества и необязательного липида;

4) добавление жирной кислоты или ее производного в горячую суспензию, полученную на этапе 3), и перемешивание;

5) охлаждение и отстаивание суспензии, полученной на этапе 4), с получением суспензии невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению.

Согласно конкретному варианту реализации наночастицы согласно настоящему изобретению применяют для получения направленного против микробной инфекции агента или для лечения микробной инфекции.

Указанные микроорганизмы включают: бактерии и грибы; указанные бактерии включают: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии; грамположительные бактерии включают: Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus; Propionibacterium, предпочтительно, Propionibacterium freudennreichii, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum, более предпочтительно, Propionibacterium acnes; и

Указанные грамотрицательные бактерии включают: Helicobacter Pylori, Pseudomonas aeruginosa, предпочтительно, Helicobacter pylori;

Указанные грибы включают, не ограничиваясь перечисленными, грибы рода Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, пигментированные грибы, Mycobacterium, Sporotrichosis, Trichophyton, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucor, Actinomyces bovis, Nocardia и т.п., предпочтительно, Trichophyton и Aspergillus, более предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Trichophyton schoenleinii; и, наиболее предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ получения невезикулярной наночастицы согласно первому аспекту настоящего изобретения, включающий следующие этапы:

1) суспендирование поверхностно-активного вещества и необязательного липида в воде;

2) перемешивание суспензии, полученной на этапе 1), до образования гомогенной суспензии;

3) нагревание гомогенной суспензии, полученной на этапе 2), до температуры выше температуры плавления содержащихся в ней поверхностно-активного вещества и необязательного липида;

4) добавление жирной кислоты или ее производного в горячую суспензию, полученную на этапе 3), и перемешивание;

5) охлаждение и отстаивание суспензии, полученной на этапе 4), с получением невезикулярной наночастицы по любому из пп. 1-5.

Согласно предпочтительному варианту реализации температура плавления в указанном способе составляет 20°С-80°С, например, 20°С, 30°С, 40°С, 50°С, 60°С, 70°С или 80°С.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный способ может дополнительно включать детекцию гидродинамического размера полученных наночастиц.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная жирная кислота представляет собой жирную кислоту С8-С28, предпочтительно, С12-С24, наиболее предпочтительно, С12-С18, насыщенную или ненасыщенную; и указанное производное жирной кислоты представляет собой моно-, ди-, или триглицериды жирной кислоты С10-С14, предпочтительно, жирной кислоты C11-С13.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная ненасыщенная жирная кислота представляет собой жирную кислоту, содержащую одну или более, предпочтительно, 1-4 двойных связи.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная жирная кислота включает, не ограничиваясь перечисленными, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линоленовую кислоту, линолевую кислоту, лауриновую кислоту, миристолеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, ЭПК, ДГК, каприловую кислоту, каприновую кислоту и нонановую кислоту.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанное поверхностно-активное вещество включает, не ограничиваясь перечисленными, одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из стеарата натрия, 4-(5-додецил)бензенсульфоната, полиоксиэтиленгликоля, полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 80, полоксамера, октилфенилэфира полиэтиленгликоля и Тритон Х-100.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный липид представляет собой фосфолипид и/или холестерин.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанные фосфолипиды включают, не ограничиваясь перечисленными, один или более фосфолипидов, выбранных из группы, состоящей из: фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, димиристоилцерофосфолипида, дипальмитоилфосфатидилхолина, пальмитоилфосфатидилглицерина и диолеилфосфатидилэтаноламина.

Согласно предпочтительному варианту реализации отношение массы указанного липида к массе указанного поверхностно-активного вещества составляет 10~0:1, предпочтительно, 5~0:1, более предпочтительно, 2,5~0:1.

Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация указанной жирной кислоты составляет 0,001-5% (масса/объем), предпочтительно, 0,1-5% (масса/объем), более предпочтительно, 0,2-4% (масса/объем), более предпочтительно, 0,3-3% (масса/объем).

Согласно предпочтительному варианту реализации размер полученных наночастиц составляет 1-90 нм, предпочтительно, 2-80 нм, более предпочтительно, 5-50 нм, более предпочтительно, 5-20 нм, и наиболее предпочтительно, 5-15 нм.

Согласно предпочтительному варианту реализации размер полученных наночастиц может составлять 1-30 нм; 10-40 нм; 20-50 нм; 30-60 нм; 40-70 нм; 50-80 нм; 60-90 нм; или размер указанной наночастицы может составлять 5-25 нм; 15-35 нм; 25-45 нм; 35-55 нм; 45-65 нм; 55-75 нм; 65-85 нм; или размер указанной наночастицы может составлять 10-30 нм; 20-40 нм; 30-50 нм; 40-60 нм; 50-70 нм; 60-80 нм; 70-90 нм.

Согласно предпочтительному варианту реализации коэффициент полидисперсности указанных наночастиц составляет <0,3, предпочтительно, <0,2.

Согласно предпочтительному варианту реализации размер указанных наночастиц находится в более узком диапазоне, например, составляет приблизительно 5-10 нм, приблизительно 15-25 нм, приблизительно 20-30 нм, приблизительно 40-50 нм, приблизительно 65-75 нм, приблизительно 80-90 нм или приблизительно 100-110 нм.

Согласно предпочтительному варианту реализации стабильность указанной невезикулярной наночастицы определяется как:

после хранения при комнатной температуре и до 37°С в течение 3 месяцев, изменение значений «минимальной ингибирующей концентрации» и «минимальной бактерицидной концентрации» для указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами; или,

после хранения при комнатной температуре в течение 1,5 месяцев, предпочтительно, 3 месяцев изменение размера указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 15%, более предпочтительно, меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая невезикулярную наночастицу согласно первому аспекту настоящего изобретения и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно предпочтительному варианту реализации лекарственная форма фармацевтической композиции включает, не ограничиваясь перечисленными, лекарственную форму, подходящую для системного введения, или лекарственную форму для местного введения;

Дополнительно указанная лекарственная форма включает, не ограничиваясь перечисленными, таблетку, раствор, суспензию, капсулу, гранулу, порошок, инъекцию, пластырь, спрей, мазь, масляную мазь, пасту, гель, крем, капли, спрей, лосьон; при этом предпочтительной является лекарственная форма для местного введения, включающая, не ограничиваясь перечисленными: пластырь, спрей, мазь, масляную мазь, пасту, гель, крем, капли, спрей, лосьон.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный фармацевтически приемлемый носитель включает, не ограничиваясь перечисленными, воду; солевой раствор; связывающий агент (например, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу); наполнитель (например, лактозу и другие сахариды, желатин или сульфат кальция), смазывающее вещество (например, крахмал, полиэтиленгликоль или ацетат натрия), разрыхлитель (например, крахмал или натрия крахмал гликолят) и смачивающий агент (например, лаурилсульфат натрия).

Согласно предпочтительному варианту реализации указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать улучшающий проникновение агент; указанный улучшающий проникновение агент включает, не ограничиваясь перечисленными, поверхностно-активное вещество (например, натрия лаурилсульфат, полиоксиэтилен-9-эфир и полиоксиэтилен-20-гексадецилэфир); желчную кислоту (например, холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту и дезоксихолевую кислоту); хелатирующий агент (например, динатрия этилендиаминтетраацетат, лимонную кислоту и салицилат); и нехелатирующий не являющийся поверхностно-активным веществом агент (например, ненасыщенную циклическую мочевину).

Согласно конкретному варианту реализации указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие антибиотики.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный антибиотик представляет собой антибиотик против инфекции, вызванной Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивым Staphylococcus aureus, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: ванкомицин, цефалоспорин, линезолид, тейкопланин, абамектин, хинуклидин, дальфопристин, квинупристин, клиндамицин, даптомицин, рифампин, телаванцин, тетрациклины, такие как тигециклин и т.п.; или указанный антибиотик представляет собой антибиотик для лечения инфекции, вызванной P. acnes, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, адапален, тазаротен, эритромицин, клиндамицин, азитромицин, миноциклин, рокситромицин, третиноин и пероксид бензоила (ВРО);

Как вариант, указанный антибиотик представляет собой антибиотик для лечения инфекции, вызванной Helicobacter Pylori, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: кларитромицин, амоксициллин, метронидазол, тинидазол, фуразолидон, тетрациклин и т.п.;

Как вариант, указанный антибиотик представляет собой антимикотический антибиотик, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, клотримазол, нистатин, флуконазол, кетоконазол, итраконазол, миконазол, тербинафин, аморолфин, амфотерицин В, гризеофульвин, циклопироксоламин, каспофунгин и т.п.;

Как вариант, указанные антибиотики могут представлять собой хинолоны, р-лактамы, макролиды, аминогликозиды, амидолы, нитроимидазолы и т.п.

Согласно конкретному варианту реализации указанная фармацевтическая композиция представляет собой водную фармацевтическую композицию.

Согласно четвертому аспекту в настоящем изобретении предложено применение указанной наночастицы согласно первому аспекту настоящего изобретения или фармацевтической композиции согласно третьему аспекту настоящего изобретения в получении противомикробного агента.

Согласно конкретному варианту реализации указанные микроорганизмы включают: бактерии, грибы.

Согласно конкретному варианту реализации указанные бактерии включают: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии.

Согласно конкретному варианту реализации указанные грамположительные бактерии включают: Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, Propionibacterium, предпочтительно, Propionibacterium freudennreichii, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum, более предпочтительно, Propionibacterium acnes; и

Указанные грамотрицательные бактерии включают: Helicobacter Pylori, Pseudomonas aeruginosa, предпочтительно, Helicobacter pylori.

Согласно конкретным вариантам реализации указанные грибы включают, не ограничиваясь перечисленными, грибы рода Coccidioides, грибы рода Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, пигментированные грибы, Mycobacterium, Sporotrichosis, Trichophyton, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucor, Actinomyces bovis, Nocardia и т.п., предпочтительно, Trichophyton и Aspergillus, более предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Trichophyton schoenleinii, и наиболее предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения, включающий введение наночастиц согласно первому аспекту настоящего изобретения субъекту для лечения микробной инфекции.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения, включающий введение субъекту наночастиц согласно первому аспекту настоящего изобретения в комбинации с другим антибиотиком для лечения микробной инфекции.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанный антибиотик представляет собой антибиотик против инфекции, вызванной Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивым Staphylococcus aureus, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: ванкомицин, цефалоспорин, линезолид, тейкопланин, абамектин, хинуклидин, дальфопристин, квинупристин, клиндамицин, даптомицин, рифампин, телаванцин, тетрациклины, такие как тигециклин и т.п.; или,

Указанный антибиотик представляет собой антибиотик для лечения инфекции, вызванной Р. acnes, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, адапален, тазаротен, эритромицин, клиндамицин, азитромицин, миноциклин, рокситромицин, третиноин и пероксид бензоила (ВРО); указанный антибиотик представляет собой антибиотик для лечения инфекции, вызванной Helicobacter Pylori, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: кларитромицин, амоксициллин, метронидазол, тинидазол, фуразолидон, тетрациклин и т.п.;

Указанный антибиотик представляет собой антибиотик для лечения инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, и включает, не ограничиваясь перечисленными, пиперациллин, азлоциллин, цефтриаксон, цефоперазон сульбактам, амикацин, гентамицин, полимиксин В и т.п.; указанный антибиотик представляет собой антимикотический антибиотик, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, клотримазол, нистатин, флуконазол, кетоконазол, итраконазол, миконазол, тербинафин, аморолфин, амфотерицин В, гризеофульвин, циклопироксоламин, каспофунгин и т.п.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанные наночастицы и другие антибиотики вводят в тот же момент времени или в разные моменты времени с применением одного и того же или разных способов введения.

Следует понимать, что технические признаки согласно настоящему изобретению, конкретным образом упоминаемые выше и ниже (например, в разделе примеров) могут быть скомбинированы друг с другом с получением таким образом нового или предпочтительного технического решения, которое не требует индивидуального описания.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены фотографии набора наночастиц согласно настоящему изобретению; при этом: на панели А представлены концентрации линоленовой кислоты в диапазоне от (а) 0,1% (масса/объем) до (h) 4% (масса/объем) (% (масса/объем) = масс. %); на панели В представлены концентрации лауриновой кислоты в диапазоне от (а) 0,1% (масса/объем) до (f) 5% (масса/объем); на панели С представлены концентрации миристолеиновой кислоты от (а) 0,1% (масса/объем) до (h) 4% (масса/объем); на панели D представлены концентрации моноглицерида лауриновой кислоты от 0,1% по массе до 0,8% по массе. Идеальные лекарственные формы с наночастицами могут быть определены на основании физических свойств, таких как степень агрегации и прозрачность указанных образцов.

На фиг. 2 представлены (А) гидродинамический размер (диаметр, нм) и (В) полидисперсность (PDI) наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих разные концентрации миристолеиновой кислоты, детектируемые с применением динамического рассеяния света.

На фиг. 3 представлена долгосрочная стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, определяемая путем детекции их гидродинамического диаметра в течение трех месяцев. В течение указанного периода указанные наночастицы хранили при 4°С, 25°С и 37°С, соответственно, наблюдая увеличение диаметра, составляющее менее 2 нм.

На фиг. 4 показан гидродинамический диаметр (нм) наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) лауриновой кислоты, при разных температурах в широком диапазоне температур (от -40°С до +100°С); размер наночастиц оставался стабильным.

На фиг. 5 показана стабильность при хранении наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) лауриновой кислоты, при 20°С; размер указанных наночастиц оставался стабильным в течение 5-месячного периода детекции.

На фиг. 6 показано что суспензии наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты, хранили в течение 3 месяцев при -20°С, 4°С, 25°С и 37°С, соответственно, наблюдая увеличение диаметра, составляющее менее 2 нм.

На фиг. 7 показана стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению (содержащих 0,4% (масса/объем) моноглицерида лауриновой кислоты); размер указанных наночастиц оставался стабильным в течение 6-недельного периода детекции.

На фиг. 8 приведена минимальная ингибирующая концентрация (MIC) in vitro наночастиц, предложенных в настоящем изобретении, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, для MRSA252. Наночастицы в разных концентраций инкубировали с MRSA252 (1*10⁶ КОЕ/мл) (КОЕ: колониеобразующая единица), и измеряли поглощающую способность бактерий при OD₆₀₀ через 5 часов и 24 часа, соответственно. Эти результаты показывают, что наночастицы согласно настоящему изобретению способны ингибировать рост бактерий в концентрации, превышающей 0,1% (масса/объем) или даже выше. На снимках смешанной суспензии бактерий и наночастиц согласно настоящему изобретению через 5 и 24 часов видно, что раствор, содержащий 0,1% (масса/объем) наночастиц, является чистым и прозрачным, что указывает на то, что 0,1% (масса/объем) представляет собой MIC наночастиц согласно настоящему изобретению.

На фиг. 9 приведена минимальная ингибирующая концентрация (MIC) in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,1% (масса/объем) лауриновой кислоты, против Р. acnes, при этом фиг.(b) представляет собой увеличенный вариант фиг.(а).

На фиг.10 приведены минимальные ингибирующие концентрации (MIC) in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты против Н. pylori (Sydney, штамм 1, HPSS1). Наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях инкубировали в течение 18 часов с HPSS1 (5*10⁶ КОЕ/мл) (КОЕ: колониеобразующая единица), и измеряли поглощающую способность бактерий при OD₆₀₀. Эти результаты показывают, что наночастицы согласно настоящему изобретению могут эффективно ингибировать рост бактерий в концентрации, равной 0,0015% (масса/объем) или превышающей ее, что указывает на то, что 0,0015% (масса/объем) представляет собой MIC наночастиц согласно настоящему изобретению.

На фиг. 11 приведена минимальная бактерицидная концентрация (MBC) in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, против MRSA252. Наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях инкубировали с MRSA252 (1*10⁶ КОЕ/мл) в течение 24 часов, а затем 5 мкл указанной суспензии инкубировали в течение ночи при 37°С и наблюдали на чашках с агаром TSB. Количественно определяли значение КОЕ MRSA252. (А) Изображения наблюдаемых КОЕ MRSA252 после инкубации наночастиц согласно настоящему изобретению в разных концентрациях с MRSA252 на чашках с агаром в течение 24 часов; (В) Эти результаты показывают, что 0,2% (масса/объем) наночастиц согласно настоящему изобретению обеспечивали гибель 99,9% MRSA252. Кроме того, бактерии погибали полностью при повышении концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению до 0,4% (масса/объем) или более.

На фиг. 12 представлен график, отражающий антибактериальную активность наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против P. acnes в разных концентрациях: (а) 1×10⁶ КОЕ/мл, (b) 1*10⁷ КОЕ/мл, (с) 1×10⁸ КОЕ/мл и (d) 1×10⁹ КОЕ/мл. Наночастицы согласно настоящему изобретению инкубировали с бактериальным образцом в каждой концентрации в течение 5 часов. После этого указанные образцы разводили ФСБ с коэффициентом разведения от 1:10 до 1:10⁶, и 10 мкл каждого образца высевали на чашки с агаром RCM. КОЕ P. acnes подсчитывали (Н/Д: недетектируемо) после культивирования при 37°С в течение 3 дней в анаэробных условиях.

На фиг. 13 представлен график зависимости от времени антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против 1×10⁷ КОЕ/мл P. acnes. P. acnes полностью погибали после инкубирования в течение 5 часов (Н/Д: недетектируемо).

На фиг. 14 представлен график зависимости от температуры антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против 1×10⁷ КОЕ/мл P. acnes после инкубирования в течение 5 часов. Эти результаты показали, что P. acnes полностью погибали (Н/Д: недетектируемо) при комнатной температуре (20°С) или более.

На фиг. 15 приведена минимальная бактерицидная концентрация (МВС) in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) лауриновой кислоты против Р. acnes, при этом фиг. (b) представляет собой увеличенный вариант фиг. (а).

На фиг. 16 приведены минимальные бактерицидные концентрации (МВС) in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты против HPSS1. TNAN-3 в разных концентрациях инкубировали с HPSS1 (5*10⁶ КОЕ/мл) в течение 18 часов, а затем 5 мкл указанной суспензии инкубировали в течение ночи при 37°С. Значения КОЕ HPSS1 могут быть количественно определены. (А) Изображения наблюдаемых КОЕ HPSS1 после инкубации с наночастицами согласно настоящему изобретению в разных концентрациях с HPSS1 на чашке с агаром в течение 18 часов. (В) Эти результаты показывают, что 0,0015% (масса/объем) наночастиц согласно настоящему изобретению обеспечивали гибель 99,9% HPSS1. Кроме того, бактерии полностью погибали при повышении концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению до 0,003% (масса/объем) или более.

На фиг. 17 показана морфология MRSA252 до (А) и после (В) обработки наночастицами согласно настоящему изобретению, содержащими 1% (масса/объем) линоленовой кислоты. На (В) приведены изображения бактерий после инкубации с наночастицами согласно настоящему изобретению в течение 24 часов. Во всех экспериментах начальная бактериальная концентрация составляла 1*10⁶ КОЕ/мл. Масштаб изображения: 1 мкм.

На фиг. 18 приведены изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM): (а) необработанной P. acnes, (b) P. acnes, обработанной наночастицами согласно настоящему изобретению, содержащими 1% (масса/объем) лауриновой кислоты. С помощью электронной микроскопии было показано, что обработка наночастицами согласно настоящему изобретению уничтожала бактериальную мембрану P. acnes.

На фиг. 19 показана морфология HPSS1 до (А) и после (В) обработки наночастицами, предложенными в настоящем изобретении, содержащими 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты. На (В) приведены изображения бактерий после инкубации с 0,003% (масса/объем) наночастиц согласно настоящему изобретению в течение 18 часов. Во всех экспериментах начальная бактериальная концентрация составляла 2,5*10⁶ КОЕ/мл. Масштаб изображения: 1 мкм.

На фиг. 20 показана долгосрочная антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты. После хранения при комнатной температуре в течение двух месяцев наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрировали значения MIC и МВС, близкие к значениям для свежеполученных наночастиц согласно настоящему изобретению. После хранения в течение 3 месяцев MIC указанного образца незначительно увеличивалась до 0,2% (масса/объем), тогда как МВС соответствовала прежнему значению.

На фиг. 21 показана антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против 1×10⁷ КОЕ/мл P. acnes после хранения при разных температурах в течение 5 месяцев. Propionibacterium acnes полностью погибали в условиях хранения при температуре 37°С (Н/Д: недетектируемо).

На фиг. 22 показана долгосрочная антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты. После хранения при комнатной температуре в течение 3 месяцев в форме суспензии указанные наночастицы демонстрировали значения MIC и МВС, близкие к значениям для свежеполученных наночастиц.

На фиг. 23 показана долгосрочная антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты. После хранения при -20°С в течение 3 месяцев в лиофилизированной форме указанные наночастицы демонстрировали значения MIC и МВС, близкие к значениям для свежеполученных наночастиц.

На фиг. 24 показана антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, против MRSA252 in vivo. Мышей инфицировали 1*10⁷ КОЕ MRSA252, и затем применяли гель, содержащий наночастицы согласно настоящему изобретению, один раз в сутки в течение 5 последовательных дней. Через 5 дней после инокуляции MRSA252 инфицированную кожу мышей извлекали, гомогенизировали и культивировали на чашках с агаром для регистрации бактериальных КОЕ. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение для шести отдельных экспериментов. * Значимость представлена р-значением (** р<0,01).

На фиг. 25 показана антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, in vivo у мышей, подкожно инфицированных MRSA 252. Во время эксперимента мышам подкожно инъецировали 1*10⁶ КОЕ MRSA252, а затем инъецировали наночастицы согласно настоящему изобретению в тот же участок через 20 минут. На снимке показано состояние поврежденных областей через 24, 48 и 72 часа после инъекции MRSA.

На фиг. 26 показано 7-дневное исследование токсичности in vivo гелевой лекарственной формы наночастиц согласно настоящему изобретению для местного применения, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты. С использованием оценочной шкалы Дрейза было показано, что применение лекарственной формы с наночастицами согласно настоящему изобретению не вызывало значимых отека или эритемы. Приведены изображения для 5 мышей из каждой группы.

На фиг. 27 представлена оценка методом Г/Э (левая панель) и TUNEL (правая панель) токсичности in vivo наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты. Холостой ФСБ гель применяли в качестве отрицательного контроля. Лекарственные формы с наночастицами согласно настоящему изобретению не вызывали воспаления и значимой гибели клеток. Приведены изображения для 5 мышей из каждой группы.

На фиг. 28 представлена оценка инфильтрации кожи макрофагами. Оценивали безопасность применения наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты. Получали замороженные срезы кожи, затем окрашивали ядра ДАПИ, а макрофаги кожи окрашивали конъюгированным с ФИТЦ антителом против f4/80 мыши. Непосредственно после окрашивания образцы кожи визуализировали с применением флуоресцентного микроскопа Nikon Delta Macroview. Приведены изображения для 5 мышей из каждой группы. Масштаб изображений: 400 мкм.

На фиг. 29 показана антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против P. acnes in vivo с применением модель на ушах мыши. В уши (левое и правое) мышам ICR внутрикожно инъецировали P. acnes (1×10⁷ КОЕ в 20 мкл ФСБ). Наночастицы согласно настоящему изобретению (1 масс. % лауриновая кислота) или ФСБ инъецировали в участок инъекции P. acnes, соответственно. Через 24 часа зараженный бактериями участок кожи извлекали для подсчета бактерий, (а) Повреждение ткани в участке инъекции через 24 часа после инъекции. (b) Микробиологическая нагрузка в участке инъекции через 24 часа после инъекции (Н/Д: недетектируемо).

На фиг. 30 показаны результаты тестирования токсичности наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) на коже спины мышей. Наночастицы согласно настоящему изобретению в форме геля наносили на выбритую кожу на спине мышей. Через 24 часа гель удаляли и проводили анализ кожи. Кожа, обработанная наночастицами согласно настоящему изобретению, сохраняла нормальную структуру; не наблюдалось эритемы или отека. Результаты окрашивания гематоксилином и эозином (Г/Э) показали, что кожа, обработанная наночастицами согласно настоящему изобретению, оставалась структурно интактной и содержала слой здоровых эпидермальных клеток на дерме. Наблюдаемые результаты лечения наночастицами согласно настоящему изобретению были идентичны результатам обработки ФСБ, указывая на то, что наночастицы согласно настоящему изобретению не приводят к детектируемой токсичности для кожи.

На фиг. 31 представлены результаты отзывов 98 волонтеров с акне о применении геля с наночастицами согласно настоящему изобретению. Результаты отзывов собирали на 3 день, 7 день и 21 день, соответственно.

На фиг. 32 приведены кривые распределения по размерам наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты.

На фиг. 33 приведена кривая распределения по размерам наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты).

На фиг. 34 приведена кривая распределения по размерам наночастиц согласно настоящему изобретению (0,4% (масса/объем) моноглицерида лауриновой кислоты).

На фиг. 35 приведена схематическая диаграмма структуры наночастиц согласно настоящему изобретению.

На фиг. 36 приведено сравнение минимальной бактерицидной концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, с указанной концентрацией для свободных жирных кислот в водной среде.

На фиг. 37 приведено сравнение минимальной бактерицидной концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты), с указанной концентрацией для свободных жирных кислот в водной среде.

На фиг. 38 показано, что свободная миристолеиновая кислота в буфере ФСБ не проявляет активности против Н. pylori, однако миристолеиновая кислота (0,3% (масса/объем)) в форме наночастиц согласно настоящему изобретению проявляет активность против Н. pylori.

Способ реализации изобретения

После проведения экстенсивных и интенсивных исследований авторы настоящего изобретения неожиданным образом обнаружили, что невезикулярные наночастицы (наночастица с мицеллярной структурой) придавали жирной кислоте или ее производному (например, глицериду жирной кислоты), поверхностно-активному веществу и, необязательно, липиду не только значимую антибактериальную активность, однако также превосходную стабильность; и что невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению может применяться в качестве превосходного антибактериального лекарственного средства, не индуцирующего лекарственно-устойчивые штаммы. Вышеуказанные открытия послужили основой для настоящего изобретения.

Жирная кислота

Термин «жирная кислота» в настоящем документе имеет значение, соответствующее общеизвестному специалистам; то есть жирная кислота представляет собой амфифильную молекулу, состоящую из гидрофобной углеводородной цепи и гидрофильной концевой группы карбоновой кислоты.

Специалисту известно, что определенные жирные кислоты обладают определенными противомикробными свойствами, однако ввиду специфической природы жирных кислот, например, нерастворимости в воде, жирные кислоты не могут быть прямо использованы в качестве медикамента, или для введения необходимы органические растворители. Например, лауриновая кислота, свободная жирная кислота, присутствующая в секрете сальных желез человека, обладает более мощной антибактериальной активностью, чем пероксид бензоила. Однако ввиду неудовлетворительной водорастворимости лауриновую кислоту необходимо растворять в таком растворителе, как диметилсульфоксид (ДМСО), для получения лекарственной формы для наружного применения, однако ДМСО проявляет раздражающие и токсические побочные эффекты. Соответственно, на существующем уровне техники существует множество ограничений для применения жирных кислот в качестве лекарственных средств.

В отличие от существующего уровня техники, согласно настоящему изобретению жирные кислоты для применения против микробных инфекций могут быть доставлены без применения органических растворителей, что позволяет преодолеть ограничения фармацевтического применения жирных кислот, а также использовать ряд жирных кислот, применение которых в качестве медикаментов согласно существующему уровню техники затруднительно. Жирные кислоты, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, представлены жирными кислотами С8-С28, предпочтительно, С12-С24, более предпочтительно, С12-С18, насыщенными или ненасыщенными. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная ненасыщенная жирная кислота содержит от 1 до 6, предпочтительно, от 1 до 4, например, 1, 2, 3 или 4 ненасыщенных связей, предпочтительно, двойных связей. Согласно конкретному варианту реализации, жирные кислоты, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, пальмитиновую, стеариновую, олеиновую, линоленовую, линолевую, линолевую, лауриновую, миристоленовую, арахидоновую, ЭПК, ДГК, каприловую кислоту, каприновую кислоту и нонановую кислоту. Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации жирные кислоты, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, линоленовую кислоту, лауриновую кислоту, миристолеиновую кислоту.

После ознакомления с принципами настоящего изобретения специалисту будет понятно, что «жирные кислоты», описанные в настоящем документе, включают их производные, т.е. «жирные кислоты» описанные в настоящем документе включают три формы (кислота, соль и сложный эфир) жирных кислот. Согласно конкретному варианту реализации производное жирной кислоты в невезикулярной наночастице согласно настоящему изобретению представляет собой моноглицерид, диглицерид или триглицерид жирной кислоты С10-С14, предпочтительно, жирной кислоты C11-С13. Согласно конкретному варианту реализации указанная жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту, предпочтительно, лауриновую кислоту. Согласно предпочтительному варианту реализации указанное производное жирной кислоты представляет собой моноглицерид лауриновой кислоты. Термин «моноглицерид лауриновой кислоты» в настоящем документе включает изомеры моноглицерида лауриновой кислоты, где гидроксил глицерина находится в разных R, S конфигурациях, 1-гидроксизамещенный моноглицерид лауриновой кислоты, 2-гидроксизамещенный моноглицерид лауриновой кислоты, а также любую смесь вышеперечисленного.

Невезикулярная наночастица

Термины «наночастица», «наночастица согласно настоящему изобретению», «невезикулярная наночастица» и «невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению» в настоящем документе имеют одинаковое значение и относятся к наночастицам, не имеющим везикулярной формы. В частности, невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению определена относительно других наночастиц с полостной структурой, то есть невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению представляет собой наночастицу, в которой отсутствуют полости. Кроме того, на основании описанного ниже способа получения наночастицы согласно настоящему изобретению специалист сможет понять, что наночастица согласно настоящему изобретению представляет собой систему наночастиц, то есть наночастицы в водной системе или водную систему, содержащую наночастиц. Другими словами, описанная в настоящем документе наночастица согласно настоящему изобретению представляет собой водную систему наночастиц, то есть систему наночастиц без органического растворителя.

Наночастицы согласно настоящему изобретению могут применяться для доставки естественных антибактериальных веществ, таких как жирные кислоты и их производные (такие как моноглицерид лауриновой кислоты) в участки, инфицированные микроорганизмами, такими как бактерии или грибы, позволяя избежать применения растворителей, таких как ДМСО. Предложенная согласно настоящему изобретению невезикулярная наночастица состоит из жирной кислоты или ее производного, поверхностно-активного вещества и, необязательно, липида. Молекулы указанных компонентов содержат гидрофильную часть и гидрофобную часть, состоящую из удлиненной углеводородной цепи. Например, жирная кислота представляет собой амфипатическую молекулу, состоящую из гидрофобной углеводородной цепи и гидрофильной концевой группы карбоновой кислоты. В другом примере глицерид жирной кислоты, такой как моноглицерид лауриновой кислоты, состоит из гидрофобной углеводородной цепи и гидрофильной концевой группой глицерина. В таких структурах жирные кислоты или сложные эфиры жирных кислот могут быть включены в наномицеллы - наночастицы, обеспечивающие амфипатическую среду. В присутствии воды гидрофильная часть и поверхностно-активное вещество располагаются таким образом, чтобы образовывать обращенную к воде поверхность, тогда как гидрофобные части располагаются таким образом, чтобы образовывать отделенное от воды ядро, с образованием таким образом наноструктуры мицеллы (как показано на фиг. 35).

Липиды, входящие в состав невезикулярной наночастицы согласно настоящему изобретению могут представлять собой фосфолипиды и/или холестерин. Согласно конкретному варианту реализации указанный липид представляет собой фосфолипид, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, один или более фосфолипидов, выбранных из: фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, димиристоилцерофосфолипида, дипальмитоилфосфатидилхолина, пальмитоилфосфатидилглицерина и диолеилфосфатидилэтаноламина.

Поверхностно-активные вещества, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, одно или более поверхностно-активных веществ, выбранных из: стеарата натрия, 4-(5-додецил)бензенсульфоната, полиоксиэтиленгликоля, полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 80, полоксамера, октилфенилэфира полиэтиленгликоля и Тритон Х-100.

Согласно конкретному варианту реализации вспомогательный материал для наночастицы согласно настоящему изобретению может включать фосфатидилхолин, холестерин, лецитин, полисорбат 20, полисорбат 80 и додецилсульфат натрия.

В невезикулярной наночастице согласно настоящему изобретению отношение липида к поверхностно-активному веществу может составлять 10-0:1, предпочтительно, 5-0:1; и более предпочтительно, 2,5-0:1.

Невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению содержит подходящее количество жирной кислоты или ее производного. Согласно конкретному варианту реализации указанная жирная кислота или ее производное присутствует в концентрации, составляющей от 0,001 до 5% (масса/объем), предпочтительно, от 0,1 до 5% (масса/объем), более предпочтительно, от 0,2 до 4% (масса/объем), более предпочтительно, от 0,3 до 3% (масса/объем). Согласно предпочтительному варианту реализации наночастица согласно настоящему изобретению может содержать 1,0% (масса/объем) линоленовой кислоты или лауриновой кислоты, или 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты, или 0,4% (масса/объем) моноглицерида лауриновой кислоты. Специалисту будет понятно, что концентрация жирной кислоты или ее производного, описанных в настоящем документе, относится к концентрации указанной жирной кислоты или ее производного в системе, содержащей наночастицы согласно настоящему изобретению, в частности, в водной системе, например, в водной суспензии.

Невезикулярная наночастица согласно настоящему изобретению обладает рядом физических и химических характеристик, таких как диаметр наночастиц и концентрация линоленовой кислоты или глицерида лауриновой кислоты (т.е. процент по массе линоленовой кислоты или глицерида лауриновой кислоты в суспензии наночастиц). Диаметр указанных наночастиц может быть измерен с применением динамического рассеяния света. Средний диаметр невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению составляет приблизительно от 1 до 90 нм, предпочтительно, от 2 до 80 нм, более предпочтительно, от 5 до 50 нм, более предпочтительно, от 5 до 20 нм; наиболее предпочтительно, от 5 до 15 нм.

Согласно другим вариантам реализации размер указанных наночастиц может составлять 1-30 нм; 10-10 нм; 20-50 нм; 30-60 нм; 40-70 нм; 50-80 нм; 60-90 нм; как вариант, размер указанных наночастиц может составлять 5-25 нм; 15-35 нм; 25-45 нм; 35-55 нм; 45-65 нм; 55-75 нм; 65-85 нм; Как вариант, размер указанных наночастиц может составлять 10-30 нм; 20-40 нм; 30-50 нм; 40-60 нм; 50-70 нм; 60-80 нм; 70-90 нм.

Наблюдается однородное распределение невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению по размерам, с коэффициентом полидисперсности, составляющим <0,3, предпочтительно, <0,2. Согласно предпочтительному варианту реализации размер указанных наночастиц находится в более узком диапазоне, например, составляет приблизительно 5-10 нм, приблизительно 15-25 нм, приблизительно 20-30 нм, приблизительно 40-50 нм, приблизительно 65-75 нм, приблизительно 80-90 нм или приблизительно 100-110 нм.

Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению проявляют превосходную стабильность. Согласно конкретному варианту реализации изменение значений «минимальной ингибирующей концентрации» и «минимальной бактерицидной концентрации» наночастиц согласно настоящему изобретению составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 10% по сравнению со значениями для свежеполученных наночастиц после хранения при различных температурах в течение 3 месяцев. Согласно другому варианту реализации изменение размера наночастиц согласно настоящему изобретению составляет меньше 20%, предпочтительно, меньше 15%, более предпочтительно, меньше 10%, после хранения при комнатной температуре в течение 1,5 месяцев, предпочтительно, 3 месяцев, по сравнению с размером свежеполученных наночастиц. Термин «комнатная температура» в настоящем документе имеет значение, соответствующее общеизвестному специалистам, и обычно относится к 25°С±5°С, или 25°С±3°С, или 25°С±1°С.

Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению проявляют превосходную противомикробную активность. Согласно конкретному варианту реализации наночастицы согласно настоящему изобретению способны ингибировать бактерии или грибы или обеспечивать их гибель.

Согласно конкретному варианту реализации указанные бактерии включают, не ограничиваясь перечисленными: грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии;

Указанные грамположительные бактерии включают, не ограничиваясь перечисленными: Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, Propionibacterium, предпочтительно, Propionibacterium freudennreichii, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum, более предпочтительно, Propionibacterium acnes;

Грамотрицательные бактерии включают, не ограничиваясь перечисленными: Helicobacter Pylori, Pseudomonas aeruginosa;

Согласно другому специфическому варианту реализации грибы включают, не ограничиваясь перечисленными: грибы рода Coccidioides, грибы рода Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, пигментированные грибы, Mycobacterium, Sporotrichosis, Trichophyton, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucor, Actinomyces bovis, Nocardia и т.п., предпочтительно, Trichophyton и Aspergillus, более предпочтительно, Candida albicans, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Trichophyton schoenleinii, и наиболее предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus.

Согласно конкретному варианту реализации наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрируют минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), составляющую 0,1% (масса/объем), и минимальную бактерицидную концентрацию (МВС), составляющую 0,2% (масса/объем), против 1×10⁶ КОЕ MRSA; согласно другому специфическому варианту реализации наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрируют минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), составляющую 0,0125% (масса/объем), и минимальную бактерицидную концентрацию (МВС), составляющую 0,02% (масса/объем), против P. acnes; согласно еще одному специфическому варианту реализации наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрируют минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), составляющую 0,0015% (масса/объем), и минимальную бактерицидную концентрацию (МВС), составляющую 0,0015% (масса/объем), против 5×10⁶ КОЕ Н. pylori. Согласно еще одному специфическому варианту реализации невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрируют MIC, составляющую 0,006% (масса/объем), против Trichophyton rubrum, и MIC, составляющую 0,1% (масса/объем), против Aspergillus fumigatus.

Способность наночастиц согласно настоящему изобретению к ингибированию микроорганизмов может быть определена следующим образом. Например, микроорганизм для тестирования инкубируют in vitro совместно с наночастицами согласно настоящему изобретению в среде, или совместно инкубируют в модели на животных. Затем подсчитывают число колоний микроорганизмов (охарактеризованное как КОЕ). В настоящем документе термин «ингибирование роста» относится к способности наночастиц согласно настоящему изобретению к ингибированию увеличения числа КОЕ при совместном культивировании с микроорганизмом. Соответственно, при приведении определенного микроорганизма в контакт с наночастицами согласно настоящему изобретению, число его КОЕ не изменяется или уменьшается.

В настоящем документе термин «минимальная ингибирующая концентрация» (MIC) относится к минимальной концентрации лекарственного средства, такого как наночастицы согласно настоящему изобретению, которая ингибирует рост микроорганизма, такого как бактерия (такая как Staphylococcus aureus) или гриб (такой как Trichophyton rubrum и Aspergillus fumigatus). Значение MIC может быть определена путем измерения оптической плотности микроорганизма после воздействия наночастицами согласно настоящему изобретению в различных концентрациях, в частности, по изменению значения OD₆₀₀ или OD₄₅₀. Если значения OD₆₀₀ или OD₄₅₀ по истечении периода времени не возрастают, следовательно, не происходит увеличения числа бактерий или грибов в культуральном бульоне.

В настоящем документе термин «минимальная бактерицидная концентрация» (МВС) относится к минимальной концентрации лекарственного средства, такого как наночастицы согласно настоящему изобретению, способной обеспечивать гибель клеток микроорганизмов. МВС может быть определена, например, посредством подсчета колоний, растущих на среде при совместном культивировании с наночастицами согласно настоящему изобретению в разных концентрациях, в определенных условиях, например, при 37°С.

В настоящем документе термин «приблизительно» относится к фактически указанному числу или значению, а также к значениям в пределах 10% выше или ниже от указанного числа или значения.

Способ получения невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению

Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением описанного ниже способа, включающего следующие этапы:

1) суспендирование поверхностно-активного вещества и необязательного липида в воде;

2) перемешивание суспензии, полученной на этапе 1), до образования гомогенной суспензии;

3) нагревание гомогенной суспензии, полученной на этапе 2), до температуры выше температуры плавления указанных содержащихся в ней поверхностно-активного вещества и необязательного липида;

4) добавление жирной кислоты или ее производного в горячую суспензию, полученную на этапе 3), и перемешивание;

5) охлаждение и отстаивание суспензии, полученной на этапе 4), с получением суспензии невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению.

Согласно конкретному варианту реализации температура плавления в указанном способе составляет 20°С - 80°С, например, 20°С, 30°С, 40°С, 50°С, 60°С, 70°С или 80°С.

Согласно дополнительному варианту реализации указанный способ может дополнительно включать детекцию гидродинамического размера полученных наночастиц.

В получении невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению необходимо учитывать такие показатели, как физико-химические свойства сырьевых материалов и материала для включения в наночастицы, природа среды, используемой для диспергирования наночастиц, эффективная концентрация нагруженного вещества и его потенциальная токсичность, процессы, вовлеченные в применение/доставку наночастиц, оптимальный размер, полидисперсность и срок хранения, воспроизводимость от партии к партии и возможность массового изготовления безопасного и эффективного продукта.

Наночастицы согласно настоящему изобретению не могут образовываться спонтанно, они образуются при обеспечении достаточной энергии для жирных кислот, таких как линоленовая кислота, и вспомогательного материала в воде (например, посредством обработки ультразвуком, гомогенизации, встряхивания или нагревания).

Наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть получены из различных ингредиентов с применением способов, предложенных в настоящем изобретении. Другие подходящие способы получения наночастиц согласно настоящему изобретению, включают способы с перемешиванием и способы с нагреванием, в том числе высокоскоростное перемешивание. Преимущества такой техники заключаются в простоте оборудования и легкости получения.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные наночастицы могут быть получены путем гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением широко применяется в различных областях промышленности и считается очень эффективным способом для промышленного применения. Указанная техника включает получение твердых липидных наночастиц при температуре выше или ниже комнатной; размер частиц может быть уменьшен путем кавитации и вихревого перемешивания. Липосомы и лекарственные средства могут быть разморожены с применением горячей гомогенизации под высоким давлением и скомбинированы с водным раствором поверхностно-активного вещества при той же температуре. Затем горячую предварительную эмульсию обрабатывают в гомогенизаторе высокого давления с контролируемой температурой, проводя, как правило, до 3 циклов при 500 бар. Полученная наноэмульсия рекристаллизуется после охлаждения до комнатной температуры с образованием твердых липосомных наночастиц. Холодная гомогенизация под высоким давлением может быть использована для обработки гидрофильных лекарственных средств.

Помимо описанных выше способов, для получения наночастиц согласно настоящему изобретению могут применяться любые другие способы получения твердых липосомных наночастиц. Такие способы включают микроэмульсионные способы, способы испарения растворителя в эмульсиях, диффузии растворителя в эмульсиях, нагнетания растворителя и обращенно-фазовые способы.

Наночастицы, полученные с применением способа согласно настоящему изобретению, проявляют превосходную стабильность структуры и биологической активности; способ получения согласно настоящему изобретению позволяет успешно использовать жирные кислоты или их производные.

Фармацевтическая композиция и способ ее применения

Наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть введены в состав фармацевтических композиций для применения у человека и других млекопитающих. При применении они могут быть смешаны с другими фармацевтическими носителями или разбавителями; дозировка и период введения определяют в соответствии с природой и тяжестью состояния млекопитающего. В целом, может быть обеспечена фармацевтически эффективная дозировка жирных кислот или их производных в наночастицах согласно настоящему изобретению; например, дозировка, эффективную для уменьшения числа микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus или грибов, инфицирующих млекопитающее, например, человека.

Составы и способы введения хорошо известны специалисту в данной области техники. Как правило, курс лечения продолжается от нескольких дней до нескольких месяцев до облегчения состояния, в зависимости от тяжести состояния, лечение которого проводят, и ответа на лекарственное средство. Оптимальные дозировка, способ введения и периодичность повторения также могут быть определены специалистом. Оптимальная величина дозы может быть скорректирована в соответствии с относительной терапевтической эффективностью наночастиц согласно настоящему изобретению, и количество для применения, как правило, может быть рассчитано на основании значений MIC и МВС in vitro и в моделях на животных in vivo. Частота дозирования может составлять один или более раз в сутки, дважды в неделю, один раз в неделю или реже. После успешного лечения необходимо проводить поддерживающую терапию для предотвращения рецидива инфекции.

В настоящем документе термины «фармацевтически приемлемый носитель» и «вспомогательное вещество» имеют одно и то же значение и оба относятся к фармацевтически приемлемому растворителю, суспендирующему агенту или любому другому фармацевтически инертному вспомогательному веществу, применяемому для доставки субъекту наночастиц согласно настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой жидкость или твердое вещество, и указанный носитель должен быть выбран в соответствии с предполагаемым способом введения, таким образом, чтобы обеспечивать достижение требуемой дозировки, однородности и других характеристик доставки лекарственных средств и химических свойств при использовании наночастиц согласно настоящему изобретению в комбинации с одним или более терапевтическими соединениями или другими фармацевтическими ингредиентами.

Фармацевтически приемлемые носители, не оказывающие нежелательного влияния на наночастицы согласно настоящему изобретению или не уничтожающие наноструктуры наночастиц согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными: воду; солевой раствор; связующие агенты (например, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу); наполнители (например, лактозу и другие сахара, желатин или сульфат кальция); смазывающие вещества (например, крахмал, полиэтиленгликоль или ацетат натрия); разрыхлители (например, крахмал или натрия крахмалгликолят); и смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия).

Наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть введены различными способами, однако обычно их вводят местно. Наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть смешаны с другими молекулами или использованы в комбинации со смесью других молекул, молекулярных структур или соединений, таких как полиэтиленгликоль, вазелин или другие составы для местного применения для облегчения поглощения, распределения и/или абсорбции указанного лекарственного средства. Лекарственные формы для местного введения могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, а также неводные растворы обычных растворителей, таких как этанол, или жидкие или твердые масляные растворы. Такие растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Фармацевтические лекарственные формы для местного введения включают трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи, жидкости и порошки; в частности, предпочтительными являются лосьоны, кремы и гели. Часто используют стандартные фармацевтические носители (водные, порошковые или масляные); могут также применяться и другие вещества, такие как загустители. В некоторых случаях наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть суспендированы в суспензии с водной матрицей, неводной матрицей или смешанной матрицей. Суспензия может также содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит и/или декстран. Суспензии могут также содержать стабилизаторы.

Согласно предпочтительному варианту реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также содержать улучшающий проникновение агент для усиления эффективности проникновения наночастиц согласно настоящему изобретению через кожу млекопитающих. Улучшающие проникновение агенты усиливают способность как липофильных, так и не липофильных лекарственных средств пересекать клеточную мембрану. Улучшающие проникновение агенты включают, не ограничиваясь перечисленными: поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-гексадециловый эфир; соли желчных кислот, таких как холевая кислота, дегидрохолевая кислота и дезоксихолевая кислота; хелатирующие агенты, такие как динатрия этилендиаминтетраацетат, лимонную кислота и салицилаты; и нехелатирующие не являющиеся поверхностно-активными вещества, такие как ненасыщенные циклические мочевины.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть доставлены путем ионтофореза, например, с применением заряженного трансдермального пластыря для «переноса» указанных наночастиц в дерму.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, как правило, может также содержать некоторые другие вспомогательные фармацевтические ингредиенты, в том числе совместимые фармацевтически активные материалы, такие как противозудные агенты, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные агенты, и другие материалы, применяемые для улучшения физических свойств лекарственной формы (например, красители, консерванты, антиоксиданты, замутнители и стабилизаторы, и т.п.). Могут также быть добавлены такие вспомогательные агенты, как смазывающие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, влияющие на осмотическое давление соли, буферы, красители и ароматические вещества. Разумеется, при добавлении указанных вспомогательных веществ они не должны взаимодействовать с активностью и эффектами наночастиц согласно настоящему изобретению. При необходимости, после получения составы нужно стерилизовать.

В свете описания настоящего изобретения и принципов, известных из существующего уровня техники, специалист в данной области техники сможет получить различные лекарственные формы с фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению. Согласно конкретному варианту реализации лекарственные формы фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, лекарственные формы, подходящие для системного введения, или лекарственные формы для наружного применения или местного введения. Кроме того, лекарственные формы могут включать, не ограничиваясь перечисленными: таблетки, растворы, суспензии, капсулы, гранулы, порошки, инъецируемые составы, пластыри, спреи, мази, масляные мази, пасты, гели, кремы, капли, спреи, лосьоны. Согласно конкретному варианту реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению представляют собой лекарственные формы для наружного применения или местного введения, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: пластыри, спреи, мази, масляные мази, пасты, гели, кремы, капли, спреи, лосьоны.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может применяться в качестве агента против микробной инфекции. Указанный микроорганизм включает бактерии или грибы. Например, указанные бактерии включают, не ограничиваясь перечисленными: грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии; указанные грамположительные бактерий включают, не ограничиваясь перечисленными: Staphylococcus, предпочтительно, Staphylococcus aureus, более предпочтительно, метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, или Propionibacterium, предпочтительно, Propionibacterium freudennreichii, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum, более предпочтительно, Propionibacterium acnes; указанные грамотрицательные бактерии включают, не ограничиваясь перечисленными: Helicobacter Pylori, Pseudomonas aeruginosa; в другом примере указанные грибы включают, не ограничиваясь перечисленными: грибы рода Coccidioides, грибы рода Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, пигментированные грибы, Mycobacterium, Sporotrichosis, Trichophyton, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucor, Actinomyces bovis, Nocardia и т.п., предпочтительно, Trichophyton и Aspergillus, более предпочтительно, Candida albicans, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Trichophyton schoenleinii, и наиболее предпочтительно, Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут обеспечивать лечение инфекции, вызванной указанными микроорганизмами, в частности, путем уменьшения количества микроорганизмов, таких как стафилококки, пропионобактерии, Helicobacter pylori или грибы, выживающие на поверхности или внутри организма млекопитающего (например, человека). Указанные способы включают нанесение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению или наночастиц согласно настоящему изобретению на участок повреждения у инфицированного млекопитающего, например, на кожу, для уменьшения числа инфекционных стафилококков или пропионобактерий, или грибных клеток. Фармацевтическая композиция или наночастицы согласно настоящему изобретению могут также смягчать симптомы инфекций, вызванных микроорганизмами, такими как Staphylococcus aureus или P. acnes, или микотических инфекций.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также содержать другие стандартные антибиотики, и, соответственно, применяться в комбинации с другими антибиотиками, при условии, что указанные другие стандартные антибиотики и наночастицы согласно настоящему изобретению не оказывают друг на друга нежелательного действия. По сравнению с применением стандартных антибиотиков по отдельности, использование их комбинации может позволять уменьшать дозировку стандартных антибиотики, снижать побочные эффекты и улучшать терапевтические эффекты. Указанный дополнительный антибиотик может представлять собой антибиотик для лечения той же микробной инфекции, лечение которой проводят с применением наночастиц согласно настоящему изобретению, и, соответственно, увеличивать терапевтические эффекты; он может также представлять собой антибиотик для лечения микробной инфекции, отличной от инфекции, лечение которой проводят с применением наночастицы согласно настоящему изобретению, и, соответственно, обеспечивать лечение другой микробной инфекции или осложненной микробной инфекции. Указанные другие стандартные антибиотики могут представлять собой хинолоны, р-лактамы, макролиды, аминогликозиды, амидолы, нитроимидазолы и т.п. Например, другие стандартные антибиотики включают, не ограничиваясь перечисленными: ванкомицин, цефалоспорин, линезолид, тейкопланин, арбекацин, хинуклидин, дальфопристин, квинупристин, клиндамицин, даптомицин, рифампицин, телаванцин, тетрациклины, такие как тигециклин и т.п.; или другие стандартные антибиотики включают, не ограничиваясь перечисленными, адапален, тазаротен, эритромицин, клиндамицин, азитромицин, миноциклин, рокситромицин, изотретиноин и пероксид бензоила (ВРО); или другие стандартные антибиотики включают, не ограничиваясь перечисленными, амоксициллин, метронидазол, тинидазол, фуразолидон, тетрациклин и т.п.; или другие стандартные антибиотики представляют собой антимикотические лекарственные средства, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, клотримазол, нистатин, флуконазол, кетоконазол, итраконазол, миконазол, тербинафин, нафтифин, аморолфин, амфотерицин В, гризеофульвин, циклопироксоламин, каспофунгин и т.п.

Кроме того, специалистам в данной области техники будет понятно, что другие антибиотики, описанные выше, могут вводиться в то же время и тем же способом введения, что и наночастицы согласно настоящему изобретению; могут вводиться в то же время другим способом; и, как вариант, могут вводиться в другое время тем же способом. Например, другие антибиотики, описанные выше, могут дискретно присутствовать в той же фармацевтической композиции, что и наночастицы согласно настоящему изобретению (например, в наборе) и, соответственно, могут быть введены тем же или другим путем введения, в то же самое время или в другое время.

Согласно предпочтительному варианту реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой водную фармацевтическую композицию, т.е. фармацевтическую композицию, не содержащую органических растворителей. Специалист сможет определить концентрацию указанной жирной кислоты или ее производного в фармацевтической композиции в соответствии с принципами настоящего изобретения и фактической необходимостью.

Преимущества настоящего изобретения:

1. Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению проявляют значимую антибактериальную активность;

2. Ингредиенты для невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению выбирают из природных источников, демонстрирующих высокую безопасность, отсутствие токсических побочных эффектов;

3. Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению проявляют превосходную стабильность;

4. В невезикулярных наночастицах согласно настоящему изобретению избегают использования органических растворителей, таких как ДМСО, для доставки лекарственного средства;

5. Способ получения невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению является простым, не предусматривает применения токсических и вредных органических растворителей, таких как хлороформ, обеспечивая таким образом уменьшение затрат на получение и являясь экологически благоприятным;

6. Размер невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению незначителен, таким образом, они легко попадают в ткань для оказания бактерицидного действия;

7. Невезикулярные наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрируют незначительную полидисперсность, хорошую гомогенность и стабильные бактерицидные эффекты.

Если не указано иное, все технические и научные термины согласно настоящему изобретению имеют значения, общеизвестные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя настоящее изобретение может быть реализовано с применением способов и материалов, аналогичных или эквивалентных представленным в настоящем документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упоминаемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки. В случае какого-либо конфликта между указанными публикациями, патентными заявками, патентами и другими источниками, и настоящей патентной заявкой, решающее значение будет иметь настоящее описание (в том числе определения). Кроме того, материалы, способы и примеры в настоящей патентной заявке предназначены исключительно для иллюстрации, а не для ограничения.

Настоящее изобретение дополнительно описано ниже в контексте конкретных вариантов реализации. Следует понимать, что указанные примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не предполагается, что они ограничивают объем настоящего изобретения. Экспериментальные процедуры в приведенных ниже примерах, если не описаны специфические условия, обычно проводят в соответствии со стандартными условиями, такими как описанные в источнике: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), или условиями, рекомендованными производителем. Если не указано иное, указаны массовые проценты и доли.

Примеры

Материалы и методы

Материал:

Лецитин яичного желтка (яичный фосфатидилхолин (ФХ)), холестерин, C6-NBD фитосфингозин (C6NBD) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-L-лизин-родамин В-ацил (DMPE-RhB) приобретали у Avanti Polar Lipids, Inc. (Алабастер, Алабама); линоленовую кислоту, триптический соевый бульон (TSB), забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ), трифторуксусную кислоту (ТФК), ацетонитрил и Сефадекс G-75 приобретали у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури); и агар приобретали у BD (Спаркс, Мэриленд).

Лауриновую кислоту приобретали у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). КНСО₃ приобретали у Fisher Scientific Division (Питтсбург, Пенсильвания). 3,4-дифторфенацилбромид приобретали у Maybridge (Кембридж, Англия). Среду Бринелла (кат. №211088), анаэробную систему (кат. №260683) и бактоагар (кат. №214010) приобретали у BD (Спаркс, Мэриленд). 1 литр среды Бринелла содержит 10,0 г расщепленного трипсином казеина, 10,0 г расщепленной пепсином животной ткани, 1,0 г глюкозы, 2,0 г дрожжевого экстракта, 5,0 г хлорида натрия и 0,1 г бисульфита натрия. Дефибринированную овечью кровь (серии №R54016 и №R54008) и растворы хлорида гематина с витамином K (кат. № R450951) приобретали у Remel Corporation (Ленекса, Канзас). Усиленную среду для клостридий (кат. № ОХСМ0149 В) приобретали у Oxoid Corporation (Хэмпшир, Великобритания).

Миристоленовую кислоту, триптический соевый бульон (TSB), забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ), трифторуксусную кислоту (ТФК), ацетонитрил и Сефадекс G-75 приобретали у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Агар приобретали у BD (Спаркс, Мэриленд).

Моноглицерид лауриновой кислоты приобретали у TCI (Tokyo Chemical Industry), штамм 216-3664 Trichophyton rubrum получали из лаборатории микологии больницы Хуашань, Aspergillus fumigatus 116-7490 получали из лаборатории микологии больницы Хуашань, дегидрированный порошок PDA приобретали у Merck (Германия); RPMI1640 приобретали у GIBCO (США). Культура бактерий:

Штамм MRSA252 (полученный из АТСС) восстанавливали из замороженного состояния и культивировали на чашках с триптическим соевым агаром при 37°С в течение ночи. Затем одиночную колонию инокулировали в триптическую соевую среду (TSB) и инкубировали при 37°С при встряхивании до достижения культурой OD₆₀₀, составляющей приблизительно 0,7 (фаза логарифмического роста). Затем бактерии извлекали посредством центрифугирования при 4000 * g в течение 3 минут и дважды промывали стерильным ФСБ. После удаления ФСБ путем центрифугирования полученные бактерии суспендировали в подходящем количестве свежей среды TSB для последующего использования.

Propionibacterium acnes (АТСС 6919) культивировали в среде Бринелла с добавлением 5% (по объему) дефибринированной овечьей крови, витамина К (5 мкг/мл) и хлорида гематина (50 мкг/мл), при 37°С, в анаэробных условиях, созданных с помощью анаэробной системы. Моноклональные колонии собирали, инокулировали в усиленную среду для клостридий и культивировали в анаэробных условиях при 37°С до достижения OD₆₀₀, составляющей приблизительно 1,0 (фаза логарифмического роста). После центрифугирования при 5000 g в течение 10 минут клетки собирали и промывали ФСБ, а затем повторно разбавляли подходящим количеством ФСБ для тестирования.

Helicobacter pylori Sydney, штамм 1 (HPSS1 из АТСС) восстанавливали из замороженного состояния и помещали на хранение при 37°С в микроаэробных условиях (10% CO₂, 85% N₂ и 5% О₂) в колумбийском агаре (содержащие 5% лизированной крови лошади (FBS)). В эксперименте свежие колонии, выращенные на чашках с агаром, инокулировали в среду с сердечно-мозговым экстрактом (BHI) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, а затем аккуратно встряхивали с возвратно-поступательным движением в течение ночи в микроаэробных условиях при 37°C с получением бульонной культуры Helicobacter pylori. Ночные бульонные культуры HPSS1 центрифугировали при 5000 * g в течение 10 минут для получения бактериального осадка. После удаления среду путем центрифугирования полученные бактерии суспендировали в подходящем количестве свежей среды BHI, содержащей 5% FBS, для использования.

Культура грибов:

Штаммы 216-3664 Trichophyton rubrum и 116-7490 Aspergillus fumigatus восстанавливали из замороженного состояния, инокулировали на чашки с PDA и культивировали в течение 48 ч при 37°С.

Получение и характеризация наночастиц согласно настоящему изобретению: смесь 200 мг поверхностно-активного вещества (полисорбат 20 или полисорбат 80) и липида (лецитин яичного желтка : холестерин = 9:1 по массе) суспендировали в 4 мл воды, при этом отношение поверхностно-активного вещества к липосомам составляло 10:0, 8:2, 5:5,3:7, 1:9 или 0:10, соответственно. Суспензию перемешивали до образования гомогенного раствора, который затем нагревали до температуры выше температуры плавления указанного поверхностно-активного вещества и липида (20°С, 30°С, 40°С, 50°С, 60°С, 70°С или 80°С, в зависимости от используемых поверхностно-активного вещества и липида, и их отношения). В указанную суспензию добавляли в соответствующих концентрациях жирные кислоты, такие как линоленовая кислота (от 0,1% (масса/объем) до 4% (масса/объем)), (от 0,1% (масса/объем) до 5% (масса/объем)), миристолеиновая кислота или моноглицерид лауриновой кислоты (от 0,1% (масса/объем) до 0,8% (масса/объем)), и перемешивали в течение 30 минут. Указанный раствор выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Гидродинамический размер наночастиц согласно настоящему изобретению измеряли с применением инструмента Malvern Zetasizer ZS (Malvern Instruments, Англия, Великобритания). Средний диаметр наночастиц согласно настоящему изобретению определяли с применением динамического рассеяния света (ДРС). Все измерения свойств повторяли 3-кратно при 25°С.

Стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению: изучали долгосрочную стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению при хранении растворов указанной наночастицы при разных температурах в течение определенного периода времени; размер частиц образца измеряли в каждой заранее заданной точке времени для определения стабильности наночастиц согласно настоящему изобретению при разных температурах.

Антибактериальную активность in vitro (значения MIC и МВС) наночастиц согласно настоящему изобретению: MIC и МВС in vitro наночастиц согласно настоящему изобретению в отношении разных бактерий тестировали с применением стандартных способов в данной области техники.

Морфология бактерий, обработанных наночастицами согласно настоящему изобретению: морфологию бактерий, обработанных или не обработанных наночастицами согласно настоящему изобретению, оценивали стандартным способом с применением сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Определение антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению in vivo против MRSA252:

Антибактериальную активность и терапевтические эффекты наночастиц согласно настоящему изобретению на инфекцию MRSA252 in vivo оценивали в следующих двух моделях: модели инфекции эпидермальных ран у мышей и модели подкожной инфекции у мышей.

Для получения модели эпидермальных ран мышам (от Charles River Laboratories) внутрибрюшинно инъецировали кетамин и ксилазин. После выполнения анестезии темную шерсть мышей сбривали и промывали кожу пропитанным этанолом диском. Получали деэпидермизированные кожные раны в эпидермисе спины мышей; с помощью игл размера 28G на заданную область площадью 1*1 см² наносили 6*6 перекрестных линий. Царапины наносили таким образом, чтобы затронуть только роговой слой и эпидермис, но не дерму. Через 5 минут в область с перекрестными царапинами высевали 50 мкл суспензии в ФСБ, содержащей 1×10⁷ КОЕ MRSA252, с применением микропипетки. Через 30 минут на область повреждения наносили ФСБ-гель с наночастицами согласно настоящему изобретению. Использованный гель представлял собой гидрогель, изготовленный из гидроксиэтилцеллюлозы, глицерина, полиэтиленгликоля в нужных пропорциях. Указанные лекарственные средства наносили ежедневно в течение 5 последовательных дней, также применяли холостой суспензионный гель в качестве контрольного эксперимента. На 6 день мышей умерщвляли, извлекали ткань кожи с применением дерматома размером 8 мм и подсчитывали число присутствующих бактерий.

Для получения модели подкожной инфекции темную шерсть мышей сбривали и промывали кожу пропитанным этанолом диском. После этого 20 мкл суспензии в ФСБ, содержащей 1×10⁶ КОЕ MRSA 252, подкожно инъецировали в выбритую область, а затем инъецировали в ту же область 200 мкл наночастиц согласно настоящему изобретению. Стерильный ФСБ инъецировали в качестве холостого контрольного эксперимента. Физиологические проявления и паттерны на участке инфекции подвергали тщательному наблюдению. Через три дня после инокуляции бактерий регистрировали результаты гистологического анализа ран.

Определение антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes in vivo: антибактериальную активность наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes в физиологических условиях изучали путем внутрикожной инъекции мышам ICR (от Charles River Laboratories). В частности, P. acnes (1×10⁷ КОЕ, растворенные в 20 мкл ФСБ) внутрикожно инъецировали в оба уха мышей ICR (как в левое, так и в правое), а затем в участок инъекции P. acnes инъецировали наночастицы согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) или ФСБ (используемый в качестве отрицательного контрольного теста), соответственно. Через 24 часа после инъекции из ушей мыши получали образцы размером 8 мм путем перфорационной биопсии, а затем гомогенизировали в 1 мл стерильного ФСБ (Mini-Beadbeater™). Гомогенаты разводили ФСБ с коэффициентом разведения от 1:10 до 1:10⁶. По 10 мкл каждого разведения высевали на чашки с агаром RCM. Чашки с агаром инкубировали при 37°С в течение 3 дней в отсутствие кислорода, а затем повторно подсчитывали КОЕ P. acnes. Использовали по шесть мышей на группу (n=6); эксперимент повторяли 3-кратно для верификации статистической значимости.

Исследование токсичности наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) линоленовой кислоты) in vivo: токсичность наночастиц согласно настоящему изобретению для кожи тестировали на коже спины мышей ICR. В частности, спины мышей выбривали за 24 часа до исследования. Затем на выбритую область наносили гель с наночастицами согласно настоящему изобретению один раз в сутки в течение 7 дней. В качестве контрольной группы использовали мышей, на кожу которым наносили ФСБ. Чтобы избежать высыхания геля, кожу мышей закрывали марлей. Через 24 часа после последнего местного введения мышей умерщвляли и извлекали поперечные фрагменты кожи размером 8 мм для гистологического исследования. Ткань кожи каждой мыши обрабатывали 10% забуференным формалином в течение 18 часов, а затем заливали в парафин. Указанные срезы ткани окрашивали Г/Э-методом. Апоптоз эпителиальных клеток оценивали с применением TUNEL-анализа. Затем срезы визуализировали с использованием Hamamatsu NanoZoomer 2.0 НТ (цифровой сканер для срезов). Изображения обрабатывали с применением программного обеспечения для обработки изображений NDP. Пять мышей на группу (n=5). Для оценки токсичности образцы ткани оценивали по шкале Дрейза. Система оценок представлена следующим образом: 0 - признаки раздражения отсутствуют; 1 - крайне незначительное, почти неощутимое раздражение; 2 - явная и видимая стимуляция в эпидермисе; 3 - серьезное раздражение в эпидермисе; 4 - серьезное раздражение в эпидермисе со стимуляцией дермы; 5 - серьезное раздражение в эпидермальном и дермальном слоях. Для анализа инфильтрации макрофагами получали фрагменты ткани кожи мышей размером 8 мм. Получали срезы указанных замороженных фрагментов кожи, макрофаги кожи окрашивали конъюгированным с ФИТЦ антителом против f4/80 мыши, а ядра окрашивали ДАПИ. После окрашивания образцы кожи непосредственно визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Delta Macroview.

Токсичность для кожи: токсичность для кожи наночастиц согласно настоящему изобретению тестировали на коже спины мышей ICR. В частности, за 24 часа до исследования спины мышей выбривали, а затем местно применяли целлюлозный гель с наночастицами согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) (гидрогель, изготовленный из гидроксиэтилцеллюлозы, глицерина, полиэтиленгликоля в подходящей пропорции). Холостой ФСБ-гель (без наночастицы согласно настоящему изобретению) применяли в качестве отрицательного контроля. Через 24 часа изучали и фотографировали морфологию кожи. Результаты исследования раздражения кожи оценивали по шкале Дрейза. Фрагменты кожи размером 8 мм получали путем перфорационной биопсии, окрашивали гематоксилином и эозином (Г/Э) и фотографировали под микроскопом для наблюдения за морфологией кожи. Использовали по шесть мышей на группу (n=6); эксперимент повторяли 3-кратно для верификации статистической значимости.

Определение антимикотической активности (MIC) невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению in vitro: Колонии штамма 216-3664 Trichophyton rubrum, культивированного на чашках с PDA, собирали, помещали в стерильную бидистиллированную воду и получали жидкий состав с мутностью, соответствующей 10⁶ КОЕ, а затем разводили 1000-кратно в жидкой RPMI 1640 до конечной бактериальной концентрации, составляющей 10³ КОЕ. Брали 96-луночный планшет с крышкой, в указанный 96-луночный планшет добавляли полученный методом двойных разведений раствор лекарственного средства в концентрации от высокой до низкой, соответственно, при этом в каждую лунку 1-10 добавляли по 100 мкл раствора лекарственного средства; 100 мкл жидкой среды RPMI 1640 (не содержащей раствора лекарственного средства) добавляли в лунку 11 в качестве положительного контроля; 200 мкл жидкой среды RPMI 1640 (не содержащей раствора лекарственного средства) добавляли в лунку 12 в качестве отрицательного контроля. По 100 мкл бактериальной суспензии добавляли в лунки 1-11, соответственно. Для каждого штамма получали ряд лунок, 1-кратно параллельно повторяя указанные действия. Подготовленный культуральный планшет помещали в инкубатор с увлажнением и температурой 35°С на 48 ч, и определяли значение MIC указанного лекарственного средства путем наблюдения самой низкой концентрации указанного раствора лекарственного средства, при которой рост штамма отсутствовал.

Аналогичную процедуру использовали для измерения значений MIC невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению против Aspergillus fumigatus 116-7490 in vitro. В частности, колонии Aspergillus fumigatus 116-7490, культивированного на чашке с PDA, собирали, помещали в стерильную бидистиллированную воду и получали жидкий состав с мутностью, соответствующей 10⁶ КОЕ. Использовали тот же способ определения MIC, что и для штамма 216-3664 Trichophyton rubrum.

Пример 1. Получение и описание характеристик наночастиц согласно настоящему изобретению

Наночастицы согласно настоящему изобретению получали согласно описанию в разделе «Материалы и методы».

Гидродинамический размер наночастиц согласно настоящему изобретению описывается двумя показателями: z - средний размер частиц, и коэффициент полидисперсности, оба из которых рассчитывают с применением кумулянтного метода анализа результатов измерений динамического рассеяния света.

Авторы настоящего изобретения получали ряд наночастиц с варьирующей концентрацией линоленовой кислоты и тестировали их для определения оптимальной лекарственной формы. Как показано на фиг. 1А, раствор выглядит чистым и прозрачным (d) при концентрации линоленовой кислоты, составляющей 1% (масса/объем), при этом средний диаметр наночастиц согласно настоящему изобретению составляет 10 нм, и коэффициент полидисперсности составляет 0,2. Соответственно, наночастицы, выбранные в последующих экспериментах (также называемые в настоящем документе TNAN-2), содержали 1% (масса/объем) линоленовой кислоты, с отношением массы липида к массе поверхностно-активного вещества, составляющим 2:1. Кроме того, авторы настоящего изобретения дополнительно исследовали поверхностный потенциал наночастиц согласно настоящему изобретению в воде и установили, что он составляет от -3 мВ до -6 мВ при концентрации входящей в состав линоленовой кислоты от 0,2% (масса/объем) до 0,9% (масса/объем).

Авторы настоящего изобретения получали ряд наночастиц с варьирующей концентрацией лауриновой кислоты, и идентифицировали лучший состав посредством повторных экспериментов. Как показано на фиг. 1В, раствор выглядит чистым и прозрачным (с) при концентрации лауриновой кислоты, составляющей 1% (масса/объем), среднем диаметре указанных наночастиц, составляющем 11,1 нм, и среднем коэффициенте полидисперсности, составляющем 0,09. Соответственно, состав, выбранный в последующих экспериментах, содержал 1% (масса/объем) лауриновой кислоты (отношение массы липида к массе поверхностно-активного вещества 2:1, также называется в настоящем документе TNAN-1). Кроме того, авторы настоящего изобретения также исследовали поверхностный потенциал наночастиц согласно настоящему изобретению в воде и установили, что он составляет от -5 мВ до -15 мВ.

Авторы настоящего изобретения также получили наночастицы согласно настоящему изобретению с различной нагрузкой миристолеиновой кислотой, от 0,1 до 4% (масса/объем), как показано на фиг. 1С, для выбора оптимального выхода наночастиц при поддержании приемлемого размера наночастицы (приблизительно 9 нм). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что по мере увеличения начальной нагрузочной концентрации миристолеиновой кислоты размер наночастиц также увеличивается (фиг. 2). Лучший состав, выбранный для последующих экспериментов, содержал 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты (отношение массы липида к массе поверхностно-активного вещества 2:1, также называется в настоящем документе TNAN-3) со средним размером частиц, составляющим приблизительно 8,6 нм и порогом менее 10 нм. Массу указанных наночастиц измеряли с применением динамического рассеяния света и характеризовали через показатель полидисперсности. PDI наночастиц, содержащих 0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты, составлял приблизительно 0,2, что указывает на относительно незначительный разброс распределения частиц по размерам.

Авторы настоящего изобретения также определяли включение миристолеиновой кислоты с составы с наночастицами согласно настоящему изобретению по поверхностному Z-потенциалу. Поверхностный Z-потенциал составов, нагруженных 0,1-0,5% (масса/объем) миристолеиновой кислоты в деионизированной воде варьировал от -3 до -13 мВ. Более высокая нагрузка миристолеиновой кислотой в составе приводила к увеличению отрицательного заряда на поверхности. Такое уменьшение поверхностного z-потенциала коррелирует с нагрузкой миристолеиновой кислоты благодаря включению миристолеиновой кислоты в наночастицы согласно настоящему изобретению, поскольку при близких физиологическому значению значениях рН (7,4) миристолеиновой кислоты происходит депротонирование карбоксильных кислотных групп с образованием СОО^-.

Авторы настоящего изобретения также получали ряд невезикулярных наночастиц, содержащих разные концентрации моноглицерида лауриновой кислоты (0,1-0,8% (масса/объем)), и тестировали их для определения оптимальной лекарственной формы. При концентрации моноглицерида лауриновой кислоты, составляющей 0,4 масс. %, раствор выглядит чистым и прозрачным (как показано на фиг. 1D), при этом средний диаметр указанных наночастиц составляет 7,5 нм, а средний коэффициент полидисперсности составляет 0,17 (как показано на фиг. 34).

Пример 2-1. Антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению in vitro - 1

Антибактериальную активность наночастиц (линоленовая кислота) согласно настоящему изобретению против MRSA252 in vitro оценивали путем изучения бактериостатических и бактерицидных эффектов наночастиц согласно настоящему изобретению в разных концентрациях при совместной инкубации с бактериями. В указанном исследовании сначала измеряли минимальную концентрацию наночастиц согласно настоящему изобретению, ингибирующую бактериальный рост (MIC). В частности, 1×10⁶ КОЕ MRSA252 культивировали совместно с наночастицами согласно настоящему изобретению в концентрации 0-0,6% (масса/объем). Жидкость с бактериями при совместном культивировании с наночастицами согласно настоящему изобретению в концентрации не меньше 0,1% (масса/объем) оставалась прозрачной, что свидетельствует о том, что при указанной концентрации бактериальный рост был значимо ингибирован (фиг. 8А). Напротив, при концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению, составляющей менее 0,1% (масса/объем), жидкость с бактериальной культурой становится мутной, демонстрируя значительный бактериальный рост. Для количественного определения бактериального роста после инкубации в течение 5 или 24 часов измеряли OD₆₀₀ жидкой смеси для определения числа бактерий (1 OD₆₀₀ соответствует 10⁸ КОЕ/мл).

Как показано на фиг. 8В и 8С, при концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению, составляющей более 0,1% (масса/объем), рост бактерий был подавлен. Подводя итог, 0,1% (масса/объем) представляет собой MIC наночастиц согласно настоящему изобретению против MRSA252.

Также проводили тесты для определения минимальной бактерицидной концентрации (МВС) предложенных в настоящем изобретении наночастиц против MRSA252. В частности, установленное значение МВС определяли как наиболее низкую антибактериальную концентрацию, способную обеспечивать гибель 99,9% целевых бактерий MRSA252. В одном эксперименте in vitro наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях инкубировали совместно с MRSA252 (1*10⁶ КОЕ) в течение 24 часов. Такая инкубация обеспечивает контакт наночастиц согласно настоящему изобретению с MRSA252 и вызванную ими гибель бактерий. После инкубации собирали 5 мкл бактериальной культуры и помещали на чашку с агаром, после чего инкубировали в течение ночи при 37°С, а затем подсчитывали КОЕ MRSA252. На фиг. 11А представлены репрезентативные фотографии образца объемом 5 мкл, культивированного на чашке с агаром, после инкубации наночастиц согласно настоящему изобретению в разных концентрациях с содержащей бактерии жидкостью в течение 24 часов. Очевидно, что на чашках с агаром наблюдалось тем меньше видимых колоний, чем выше была используемая концентрация лекарственного средства. Затем собирали по 5 мкл бактериальной культуры в каждой группе, разводили с коэффициентом от 1:10 до 1:10⁵, а затем помещали на чашку с агаром TSB для наблюдения и подсчета КОЕ. Как показано на фиг. 11В, 0,2% (масса/объем) наночастиц согласно настоящему изобретению обеспечивали гибель 99,9% MRSA252. При увеличении концентрации линоленовой кислоты до значений, превышающих 0,2% (масса/объем), все бактерии погибали. Соответственно, 0,2% (масса/объем) представляет собой значение МВС наночастиц согласно настоящему изобретению против MRSA252.

Описанные выше результаты показывают, что отношение МВС:MIC для наночастиц согласно настоящему изобретению против MRSA252 составляло приблизительно 2:1, что свидетельствует о том, что указанная наночастица является бактерицидом против указанной бактерии. В то же время, указанная наночастица снижала число бактерий на 3 единицы по логарифмической шкале за 24 часа, демонстрируя бактерицидный эффект указанной наночастицы в отношении MRSA. Указанное исследование может послужить основой для будущей оценки концентрации и продолжительности воздействия указанным лекарственным средством in vivo.

Для глубокого понимания механизма, за счет которого наночастицы согласно настоящему изобретению обеспечивают гибель MRSA252, авторы настоящего изобретения дополнительно изучили морфологические изменения бактерий MRSA252 до и после обработки наночастицами согласно настоящему изобретению. До обработки клетки MRSA252 имели гроздевидную форму с типичным диаметром, составляющим 0,6-1 мкм, в соответствии с изображениями SEM, агрегированную морфологи и интактную структуру клеточной стенки /мембраны (фиг. 17А). После обработки наночастицами согласно настоящему изобретению в течение 24 часов визуализация с помощью SEM показала значимые изменения бактериальной морфологии, в том числе значимое разрушение структуры клеток, неупорядоченную морфологию агрегатов и размытые границы клеток (фиг. 17В). Такие изменения морфологии означают, что наночастицы согласно настоящему изобретению оказывают выраженные разрушительные эффекты на бактериальные клетки, таким образом ингибируя бактериальный рост.

Пример 2-2. Антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению in vitro - 2

Наночастицы согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) инкубировали совместно с P. acnes в разных концентрациях (1×10⁶ КОЕ/мл, 1×10⁷ КОЕ/мл, 1×10⁸ КОЕ/мл и 1×10⁹ КОЕ/мл) при 37°С в течение 5 часов для тестирования антибактериальной активности in vitro. После совместной инкубации образцы разводили ФСБ с коэффициентом от 1:10 до 1:10⁶, а затем собирали по 10 мкл каждого образца и высевали на чашки с агаром RCM. Образцы инкубировали в течение 3 дней при 37°С в анаэробных условиях, а затем подсчитывали КОЕ P. acnes. Как показано на фиг. 12, наночастицы согласно настоящему изобретению могут обеспечивать полную гибель Р. acnes при бактериальной концентрации, составляющей менее 1×10⁷ КОЕ/мл. При увеличении бактериальной концентрации до 1×10⁹ КОЕ/мл наночастицы согласно настоящему изобретению могут обеспечивать снижение бактериальной нагрузки, составляющее до 5 порядков величины, до остаточной бактериальной концентрации, составляющей приблизительно 1×10⁴ КОЕ/мл, что означает, что при высоких концентрациях бактерий указанных наночастиц (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) недостаточно для элиминации всех бактерий, возможно, ввиду недостаточного количества наночастиц в растворе.

Результаты тестирования зависимой от времени антибактериальной активности экспериментальных наночастиц согласно настоящему изобретению показывают, что полная гибель указанной бактерии может быть обеспечена только при совместной инкубации наночастиц согласно настоящему изобретению с бактериями (1×10⁷ КОЕ/мл) в течение 5 часов. По мере уменьшения времени совместной инкубации уменьшались также антибактериальные свойства (фиг. 13).

Такая антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению также связана с температурным режимом. Результаты после совместной инкубации наночастиц (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) с бактериями (1×10⁷ КОЕ/мл) в течение 5 часов показали, что бактерии были полностью элиминированы при комнатной температуре (20°С) или более (фиг. 14).

Для определения MIC наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes in vitro наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях инкубировали с P. acnes (1*10⁶ КОЕ/мл) в течение 5 часов в анаэробных условиях, и тестировали поглощающую способность при 600 нм в образцах (оптическая плотность при 600 нм, OD₆₀₀). Все тесты проводили параллельно 3-кратно. Эти результаты показывают, что при концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению, составляющей 0,0125% (масса/объем) или более они ингибируют рост бактерий, как показано на фиг. 9.

Для определения МВС наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes in vitro наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях инкубировали с P. acnes (1*10⁶ КОЕ/мл) в течение 5 часов в анаэробных условиях при 37°С. После инкубации образцы разводили ФСБ с коэффициентом от 1:10 до 1:10⁶, и высевали 5 мкл разведения на чашку с агаром RCM. Чашку с агаром культивировали в анаэробных условиях при 37°С в течение 3 дней, после чего количественно определяли КОЕ (колониеобразующая единица) P. acnes. Эти результаты показывают, что 0,02% (масса/объем) наночастиц согласно настоящему изобретению обеспечивали гибель 99,9% P. acnes. Кроме того, наночастицы согласно настоящему изобретению в концентрации 0,05% (масса/объем) и выше обеспечивали гибель всех бактерий, как показано на фиг. 15.

Описанные выше результаты показывают, что отношение МВС : MIC для наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes составляло приблизительно 1,6:1, что свидетельствует о том, что указанная наночастица является бактерицидом для указанной бактерии.

После количественного анализа антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению против P. acnes in vitro наблюдали эффекты обработки с применением наночастиц на морфологию бактерий с применением сканирующей электронной микроскопии. Propionibacterium acnes инкубировали совместно с наночастицами в течение 5 часов, фиксировали 2% глутаральдегидом, а затем наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Как показано на фиг. 18, на полученной с помощью сканирующего электронного микроскопа микрофотографии необработанного образца (т.е. образца, совместно инкубированного с ФСБ-буфером) видно, что P. acnes обладает упорядоченной палочковидной структурой с гладкой поверхностью и фимбриями. Напротив, бактерии, обработанные наночастицами согласно настоящему изобретению, демонстрировали значимые аномалии; на бактериальной поверхности присутствуют неупорядоченные деформации и перетяжки, фимбрии отсутствуют (фиг. 18). Описанные выше результаты показывают, что наночастиц согласно настоящему изобретению могут разрушать структуру бактериальной мембраны, демонстрируя бактерицидную функцию.

Пример 2-3. Антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению in vitro - 3

Антибактериальную активность наночастиц согласно настоящему изобретению (миристолеиновая кислота) против Н. pylori (Sydney, штамм 1, HPSS1) in vitro определяли по значению MIC (определенному как наиболее низкая концентрация, которая ингибирует бактериальный рост) и МВС (определенному как наиболее низкая концентрация, обеспечивающая гибель 99,9% бактерий-мишений) против Н. pylori.

Для определения MIC Н. pylori с оптической плотностью 0,05 OD₆₀₀ (соответствующей 5×10⁶ КОЕ/мл) культивировали совместно с наночастицами согласно настоящему изобретению в разных концентрациях (0-0,012% (масса/объем)). Для количественной оценки бактериального роста значения OD₆₀₀ в бактериальных культурах определяли через 18 часов культивирования, и регистрировали изменение значения относительно начального. Указанное изменение отражает рост бактерий под влиянием наночастиц согласно настоящему изобретению. Как показано на фиг. 10, при концентрации наночастиц согласно настоящему изобретению, составляющей менее 0,0015% (масса/объем), значение COD₆₀₀ после совместного культивирования значимо отличалось (>5%) от начального значения, что указывает на очевидный рост бактерий наблюдается даже в присутствии TNAN-3 в указанной концентрации. Напротив, при концентрации миристолеиновой кислоты, превышающей 0,0015% (масса/объем), изменение OD₆₀₀ составляет меньше 5%, что указывает на эффективное ингибирование бактериального роста. Соответственно, 0,0015% (масса/объем) определяли как MIC наночастиц согласно настоящему изобретению.

Авторы настоящего изобретения также определяли бактерицидные эффекты наночастиц согласно настоящему изобретению на Н. pylori. Helicobacter pylori (5×10⁶ КОЕ) и наночастицы согласно настоящему изобретению в разных концентрациях культивировали совместно в течение 18 часов. Такой процесс культивирования обеспечивает взаимодействие наночастиц согласно настоящему изобретению с Н. pylori, таким образом обеспечивая их гибель. После инкубации 5 мкл бактериального бульона инокулировали на колумбийский агар, а затем инкубировали при 37°С в течение 4 дней для подсчета числа бактерий. На фиг. 16А представлены репрезентативные фотографии 5 мкл бактерий, культивированных на чашке с агаром, после обработки наночастицами согласно настоящему изобретению в разных концентрациях в течение 18 часов. Очевидно, что на чашках с агаром наблюдалось тем меньше видимых колоний, чем выше была используемая концентрация наночастиц согласно настоящему изобретению.

Как показано на фиг. 16В, 0,0015% (масса/объем) наночастицы согласно настоящему изобретению обеспечивали гибель 99,9% Н. pylori. При увеличении концентрации миристолеиновой кислоты до больше 0,0015% (масса/объем) погибали все бактерии. Соответственно, 0,0015% (масса/объем) представляет собой значение МВС наночастиц согласно настоящему изобретению против Н. pylori.

Результаты согласно настоящему изобретению показывают, что отношение МВС : MIC наночастиц согласно настоящему изобретению против HPSS1 составляет примерно 1:1, что свидетельствует о том, что указанный состав представляет собой бактерицид для указанного патогена. Вместе с тем, указанный состав снижал количество бактерий более чем на три порядка величины в пределах периода 18 часов, что указывает на бактерицидные эффекты указанного лекарственного средства в отношении HPSS1, соответственно, обеспечивая основу для дальнейшей оценки in vivo концентрации и продолжительности воздействия лекарственного средства.

Для глубокого понимания механизма, за счет которого состав с наночастицами согласно настоящему изобретению обеспечивает гибель Helicobacter pylori, авторы настоящего изобретения дополнительно изучали морфологические изменения клеток Helicobacter pylori до и после обработки наночастицами согласно настоящему изобретению. До обработки клетки Н. pylori демонстрировали нормальную изогнутую морфологию и полноценную клеточную мембрану в соответствии с изображениями SEM (фиг. 19А). Типичная клетка спиральной Helicobacter pylori имеет длину 2-4 мкм и ширину 0,5-0,8 мкм с видимыми жгутиками в оболочке. После обработки наночастицами согласно настоящему изобретению в течение 18 часов визуализация с помощью SEM показала значимые изменения бактериальной морфологии, в том числе полную утрату нормальной изогнутой морфологии, разрушение цилиндрического типа протопластов, лизис клеток, фрагментацию мембран бактериальных клеток и сильно выраженную агломерацию (фиг. 19В). Такое изменение морфологии указывает на выраженный разрушительный эффект состава с наночастицами согласно настоящему изобретению, за счет которого происходит ингибирование бактериального роста.

Примеры 2-4. Антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению in vitro - 4

Антибактериальную активность наночастиц согласно настоящему изобретению (ряд невезикулярных наночастиц с разными концентрациями моноглицерида лауриновой кислоты) против грибов in vitro оценивали путем изучения бактериостатического эффекта наночастиц согласно настоящему изобретению в разных концентрациях при совместной инкубации с грибами.

Сначала измеряли минимальную концентрацию наночастиц согласно настоящему изобретению (MIC), ингибирующую бактериальный рост. В частности, 1×10³ КОЕ Trichophyton rubrum 216-3664 инкубировали совместно с наночастицами согласно настоящему изобретению в концентрации, составляющей 0-0,4% (масса/объем). В соответствии с методом микроразведений NCCLS-M27-A3 после инкубации в течение 48 часов получали результаты, согласно которым рост бактерий соответствует наблюдаемому отсутствию ингибирования, а отсутствие роста бактерий отражает антибактериальные эффекты. Минимальная концентрация указанных наночастиц, соответствующая отсутствию роста бактерий, представляла собой MIC. По результатам наблюдений, значение MIC наночастиц согласно настоящему изобретению против Trichophyton rubrum 216-3664 составляло 0,006% (масса/объем).

Кроме того, 1×10³ КОЕ Aspergillus fumigatus 116-7490 инкубировали совместно с наночастицами согласно настоящему изобретению в концентрации, составляющей 0-0,4% (масса/объем). Применяли тот же способ, что и для Trichophyton rubrum 216-3664; MIC наночастиц согласно настоящему изобретению против Aspergillus fumigatus 116-7490 составляла 0,1% (масса/объем).

Пример 3. Стабильность при хранении наночастиц согласно настоящему изобретению

Авторы настоящего изобретения исследовали долгосрочную стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) линоленовой кислоты) в течение 3 месяцев при разных температурах. Изменения стабильности определяли путем измерения размера частиц. Как показано на фиг. 3, размер указанных наночастиц при хранении при 4°С, 25°С и 37°С увеличивался всего лишь от 11 нм до 13 нм с пренебрежимой вариабельностью, что указывает на продемонстрированную высокую стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению при всех условиях хранения.

При использовании в качестве медикамента ключевой особенностью наночастиц согласно настоящему изобретению является сохранение способности оказывать эффективные бактерицидные эффекты в течение длительного периода хранения, то есть помимо стабильной структуры также очень важна стабильная активность. Для оценки указанной способности авторы настоящего изобретения изучали значения MIC и МВС наночастиц согласно настоящему изобретению в течение 3-месячного периода хранения. Как показано на фиг. 20, наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрировали значения MIC и МВС, близкие к MIC и МВС свежеполученных образцов, после хранения при комнатной температуре в течение трех месяцев.

Исследования показали, что антибактериальная активность наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) также связана с температурой хранения. После хранения в течение 5 месяцев при 37°С наночастицы согласно настоящему изобретению обладали такой же антибактериальной активностью, что и свежие наночастицы, которые могут обеспечивать гибель 1×10⁷ КОЕ/мл P. acnes полностью. Однако при хранении при температуре, составляющей 20°С или 4°С, указанная антибактериальная активность уменьшалась, и может обеспечивать гибель только начального количества, составляющего 4,4 и 1,8 порядков величины P. acnes (1×10⁷ КОЕ/мл), соответственно (фиг. 21).

Исходя из этого, авторы настоящего изобретения дополнительно исследовали стабильность и эффективность наночастиц (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) в условиях чрезвычайно высокой температуры и чрезвычайно низкой температуры. В зависимости от размера частиц (фиг. 4) и результатов определения минимальной бактерицидной концентрации (МВС) (пример 2, фиг. 14), частицы были стабильны при 20-100°С, и их антибактериальная активность оставалась неизменной. Кроме того, P. acnes в концентрации, составляющей 1×10⁷ КОЕ/мл, может быть не полностью элиминирован частицами, сохраняемыми при пониженных температурах (от 4 до -80°С), a TNAN-1, замороженный при -80°С, был очень нестабилен.

Дополнительные тесты на долгосрочную стабильность позволили обнаружить, что указанные наночастицы сохраняли стабильность в течение 5 месяцев при 20°С. В ходе тестирования и объем частиц, и коэффициент полидисперсности оставались практически постоянными (фиг. 5).

Посредством мониторинга размера наночастицы авторы настоящего изобретения также изучали долгосрочную стабильность других выбранных составов (0,3% (масса/объем) миристолеиновой кислоты) при разной температуре хранения в течение 3-месячного периода времени. Как показано на фиг. 6, мицеллы наночастиц, сохраняемых в различных условиях, в том числе при -20°С (лиофилизированный состав), 4°С, 25°С и 37°С (в суспензии), демонстрировали изменение размеров от 8,2 до 9,7 нм, которым можно пренебречь, что предполагает высокую стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению в различных условиях хранения.

Сохранение способности оказывать эффективный бактерицидный эффект в течение продолжительных периодов хранения является критически важным для составов с наночастицами согласно настоящему изобретению. Для оценки такой способности авторы настоящего изобретения изучали значения MIC и МВС наночастиц согласно настоящему изобретению в течение 3-месячного периода хранения. Как показано на фиг. 22 и 23, наночастицы согласно настоящему изобретению демонстрировали значения MIC и МВС, эквивалентные MIC и МВС свежеполученного образца, независимо от того, хранились ли они в суспензии при комнатной температуре в течение 3 месяцев или в высушенной замораживанием форме при -20°С в течение 3 месяцев.

Наночастицы согласно настоящему изобретению, содержащие моноглицерид лауриновой кислоты, также демонстрируют превосходную стабильность при хранении. Авторы настоящего изобретения осуществляли хранение наночастиц согласно настоящему изобретению, содержащих 0,4% (масса/объем) моноглицерида лауриновой кислоты при комнатной температуре в течение 6 недель. Тестирование на изменения стабильности может быть проведено путем детекции размера частиц. Как показано на фиг. 7, размер наночастиц согласно настоящему изобретению при хранении при комнатной температуре в течение 6 недель оставался в пределах от 7,5 до 8,0 нм; изменение размера частиц может быть почти пренебрежимым, что указывает на высокую стабильность наночастиц согласно настоящему изобретению при таких условиях хранения.

Пример 4-1. Антибактериальная эффективность наночастиц согласно настоящему изобретению in vivo - 1

Антибактериальную активность и терапевтические эффекты наночастиц согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) линоленовой кислоты) против инфекции MRSA252 in vivo дополнительно оценивали с применением модели инфекции деэпидермизированной кожи на мышах ICR. Инфекцию (у мышей) вызывали с использованием MRSA252; гель с наночастицами согласно настоящему изобретению и холостой гель наносили ежедневно в течение 5 последовательных дней. Бактериальную нагрузку измеряли на 6 день после инфицирования MRSA252. Ткань кожи сначала гомогенизировали в ФСБ и инкубировали в течение ночи на чашках с MRSA-специфическим агаром (маннитовый агар). Чашки с маннитовым агаром специально выбирали для культивирования MRSA, поскольку при росте MRSA наблюдаются изменения цвета агара от розового к желтому. Как показано на фиг. 24А, чашки с агаром для MRSA после лечения наночастицами согласно настоящему изобретению, оставались розовыми, тогда как чашки в контрольной группе (с применением холостого геля) желтели. Указанное наблюдение означает, что наночастица согласно настоящему изобретению обладает выраженной бактерицидной активностью в отношении инфекции деэпидермизированной кожи. Помимо проведения визуального наблюдения, авторы настоящего изобретения также подсчитывали количество КОЕ в образце. Результаты показывают, что количество бактерий, остававшихся на коже мышей после лечения холостым гелем, приблизительно в 66 раз превышало количество на коже после лечения наночастицами согласно настоящему изобретению, при гипотетическом значении t-распределения, составляющем менее 0,01 (фиг. 24В).

Для лучшей оценки активности наночастиц согласно настоящему изобретению против MRSA указанные наночастиц также тестировали в модели подкожной инфекции на мышах ICR. В указанном исследовании через 24 часа после инфицирования у получавших лечение холостым гелем мышей наблюдался очаг гнойного поражения на участке инфекции. У мышей, получавших лечение гелем с наночастицами согласно настоящему изобретению, наблюдались высыпания возле участка инфекции, однако их тяжесть была значительно меньшей (фиг. 25). Через 72 часа очаги поражения у получавших лечение холостым гелем мышей становились более выраженными, что указывало на распространение инфекции у мышей. Напротив, у мышей, получавших лечение гелем с наночастицами согласно настоящему изобретению, наблюдались незначительные очаги поражения. Указанное сравнение демонстрирует превосходную эффективность наночастиц согласно настоящему изобретению против MRSA.

Пример 4-2. Антибактериальная эффективность in vivo наночастиц согласно настоящему изобретению -2

Для тестирования антибактериальной активности in vivo мышам ICR внутрикожно инъецировали наночастицы согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) против Р. acnes. В указанном примере ухо мыши было выбрано для внутрикожной инъекции, поскольку благодаря структуре уха инокулированные бактерии могут оставаться в области инъекции. Для тестирования антибактериальной активности наночастиц согласно настоящему изобретению против Р. acnes в физиологическом окружении, P. acnes (1×10⁷ КОЕ в 20 мкл ФСБ) внутрикожно инъецировали в оба уха (левое и правое) мышам ICR. В участок инъекции P. acnes затем инъецировали наночастицы согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) или ФСБ (используемого в качестве отрицательного контроля). Через 24 часа образцы из ушей мышей диаметром 8 мм собирали посредством перфорационной биопсии, затем гомогенизировали и культивировали для подсчета оставшихся P. acnes. Как показано на фиг. 29, P. acnes, инокулированная в уши мыши, может быть полностью элиминирована при применении наночастицы согласно настоящему изобретению. Напротив, для отрицательного контроля (лечение ФСБ-буфером) детектированное число бактерий составило 1,2×10⁴ КОЕ/мл. Описанные выше результаты демонстрируют, что наночастицы согласно настоящему изобретению эффективно обеспечивают гибель P. acnes в физиологической среде (например, в дерме).

Пример 5-1. Токсичность наночастиц согласно настоящему изобретению для нормальной ткани кожи -1

Токсичность наночастиц согласно настоящему изобретению тестировали путем местного нанесения гелевого состава с наночастицами согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) линоленовой кислоты) на эпидермис выбритой кожи мышей в пределах периода, составляющего 5 дней. Как показано на фиг. 26, не было обнаружено эритемы, отека или раздражения, вызванных наночастицами согласно настоящему изобретению.

Для дополнительной оценки раздражения и апоптоза проводили анализы с окрашиванием Г/Э и мечением терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL). Как показано на фиг. 27, поверхность кожи, обработанной наночастицами согласно настоящему изобретению, сохраняла неразрушенную структуру с ясно выраженным слоем здоровых эпидермальных клеток над дермой, идентичной структуре необработанного образца кожи. Окрашивание Г/Э также продемонстрировало, что обработка наночастицами согласно настоящему изобретению не вызывала какого-либо внутритканевого воспаления по сравнению с необработанной кожей. Кроме того, проводили анализ методом TUNEL для оценки серьезных повреждений ДНК в ткани кожи и количества некротических клеток. На фиг. 27 видно, что в ткани кожи, обработанной наночастицами согласно настоящему изобретению, не наблюдалось значимого увеличения апоптотического окрашивания по сравнению с необработанной кожей.

Для дополнительной верификации безопасности наночастиц согласно настоящему изобретению, в частности, оценки способности вызывать воспаление кожи, авторы измеряли уровень инфильтрующих кожу макрофагов. В указанном исследовании макрофаги дермы в отсутствие обработки и при обработке наночастицами согласно настоящему изобретению в ткани кожи окрашивали конъюгированным с ФИТЦ антителом против f4/80 мыши. Как показано на фиг. 28, макрофаги кожи можно наблюдать в нижней части эпидермиса над слоем дермы, и обработка наночастицами согласно настоящему изобретению не изменяла такого распределения в ткани. В образцах, обработанных наночастицами согласно настоящему изобретению, не наблюдалось значимого увеличения уровня инфильтрующих макрофагов по сравнению с необработанными образцами кожи, что указывает на отсутствие значимого воспаления.

Пример 5-2. Токсичность наночастицы согласно настоящему изобретению для нормальной ткани кожи - 2

После местного нанесения геля с наночастицами согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) на кожу на спине мышей ICR осуществляли детекцию возможной токсичности указанных наночастиц для нормальной ткани кожи путем изучения изменений морфологии кожи. В указанном примере кожу на спине мышей выбривали за 24 часа до дозирования, чтобы обеспечить достаточное время для восстановления рогового слоя от возможных царапин. Перед экспериментом кожу смачивали ФСБ. Затем образцы наночастиц согласно настоящему изобретению местно наносили на кожу; через 24 часа лекарственное средство удаляли, кожу промывали и смачивали ФСБ. Как показано на фиг. 30, кожа, обработанная наночастицами согласно настоящему изобретению, сохраняла нормальную структуру при отсутствии эритемы или отека. Структура обработанной наночастицами кожи была аналогична структуре отрицательного контроля, т.е. структуре обработанной холостым ФСБ гелем кожи. По шкале оценок раздражения кожи Дрейза эритема и отек кожи, обработанной наночастицами согласно настоящему изобретению, соответствовали оценке 0, что указывает на отсутствие очевидного раздражения кожи. Образцы биопсии кожи собирали, проводили гистологическое исследование и анализ с применением окрашивания гематоксилином и эозином (Г/Э). Результаты (фиг. 30, нижняя часть) показывают, что кожа, обработанная наночастицами согласно настоящему изобретению, была структурно интактной и содержала слой здоровых эпидермальных клеток на дерме, что идентично результатам при обработке ФСБ. Указанный результат дополнительно подтверждает безопасность применения наночастиц согласно настоящему изобретению.

Пример 6. Тестирование применения наночастиц согласно настоящему изобретению у человека

В тестирование применения геля с наночастицами согласно настоящему изобретению (1% (масса/объем) лауриновой кислоты) включали 98 волонтеров; у указанных волонтеров наблюдались разные стадии инфекции акне. Гель применяли дважды ежедневно в течение 3 недель. Отзывы пользователей собирали на 3, 7 и 21 дни. Статистические результаты показывают, что на 3, 7 и 21 дни 72,4%, 82,7% и 90,8% пользователей давали сходную положительную оценку эффектов геля с наночастицами согласно настоящему изобретению, соответственно (фиг. 31). Предоставленные волонтерами отзывы показали, что наночастицы согласно настоящему изобретению эффективны для уменьшения или элиминации инфекции акне, вызванной P. acnes.

Пример 7. Противомикробное действие жирных кислот в водной системе

Авторы настоящего изобретения также тестировали антибактериальную активность наночастиц согласно настоящему изобретению и свободных жирных кислот в водной системе.

Результаты показаны на фиг. 36-38. В водной системе (ФСБ) наночастицы согласно настоящему изобретению, содержащие линоленовую кислоту, могут обеспечивать значимую гибель MRSA, тогда как свободная линоленовая кислота почти не оказывала бактерицидного эффекта в водной системе;

Наночастицы согласно настоящему изобретению, содержащие лауриновую кислоту, могут обеспечивать значимую гибель Propionibacterium acnes, тогда как свободная лауриновая кислота почти не оказывает бактерицидного эффекта в водной системе;

Миристолеиновая кислота в форме наночастиц согласно настоящему изобретению демонстрировала бактерицидную активность против Н. pylori, тогда как свободная форма миристолеиновой кислоты в той же концентрации не демонстрировала бактерицидной активности против Н. pylori.

Это показывает, что жирные кислоты могут проявлять антибактериальные эффекты только тогда, когда свободные жирные кислоты представлены в форме наночастиц согласно настоящему изобретению.

Все упоминаемые в настоящей заявке источники включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый источник был индивидуально включен посредством ссылки. Кроме того, следует понимать, что после ознакомления с описанными выше принципами настоящего изобретения специалист сможет вводить различные модификации или изменения в настоящее изобретение, и такие эквивалентные формы также входят в объем прилагаемой формулы изобретения в настоящем документе.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к невезикулярной наночастице, способу получения такой частицы и применению при лечении микробных инфекций. Невезикулярная наночастица для лечения микробных инфекций содержит жирную кислоту или ее производное и поверхностно-активное вещество; причем размер указанных наночастиц составляет 5-50 нм; где жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, лауриновую кислоту или миристоленовую кислоту; а производное жирной кислоты представляет собой моноглицерид лауриновой кислоты; и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80. Группа изобретений обеспечивает значимую антибактериальную активность, превосходную стабильность, применение наночастиц в качестве превосходного антибактериального лекарственного средства, не индуцирующего лекарственно-устойчивые штаммы. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 пр., 38 ил.

1. Невезикулярная наночастица для лечения микробных инфекций, содержащая жирную кислоту или ее производное и поверхностно-активное вещество;

причем размер указанных наночастиц составляет 5-50 нм;

где жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, лауриновую кислоту или миристоленовую кислоту; а производное жирной кислоты представляет собой моноглицерид лауриновой кислоты; и

поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80.

2. Невезикулярная наночастица по п. 1, характеризующаяся тем, что указанная невизикуляная частица состоит из жирной кислоты или ее производного, поверхностно-активного вещества и липида.

3. Невезикулярная наночастица по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что размер указанных наночастиц составляет 5-20 нм и более предпочтительно 5-15 нм.

4. Невезикулярная наночастица по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что коэффициент полидисперсности указанных наночастиц составляет <0,3, предпочтительно <0,2.

5. Невезикулярная наночастица по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что стабильность указанной невезикулярной частицы определяется как:

после хранения при комнатной температуре и до 37°C в течение 3 месяцев, изменение значений «минимальной ингибирующей концентрации» и «минимальной бактерицидной концентрации» для указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами; или

после хранения при комнатной температуре в течение 1,5 месяцев изменение размера указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно меньше 15%, более предпочтительно меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами;

после хранения при комнатной температуре в течение 3 месяцев изменение размера указанных наночастиц составляет меньше 20%, предпочтительно меньше 15%, более предпочтительно меньше 10% по сравнению со свежеполученными наночастицами.

6. Невезикулярная наночастица по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что указанные наночастицы получают с применением способа, включающего:

1) суспендирование поверхностно-активного вещества и необязательно липида в воде;

2) перемешивание суспензии, полученной на этапе 1), до образования гомогенной суспензии;

3) нагревание гомогенной суспензии, полученной на этапе 2), до температуры выше температуры плавления содержащихся в ней поверхностно-активного вещества и необязательного липида;

4) добавление жирной кислоты или ее производного в горячую суспензию, полученную на этапе 3), и перемешивание;

5) охлаждение и отстаивание суспензии, полученной на этапе 4), с получением суспензии невезикулярных наночастиц согласно настоящему изобретению.

7. Способ получения невезикулярной наночастицы по любому из пп. 1-5, включающий следующие этапы:

1) суспендирование поверхностно-активного вещества в воде;

2) перемешивание суспензии, полученной на этапе 1), до образования гомогенной суспензии;

3) нагревание гомогенной суспензии, полученной на этапе 2), до температуры выше температуры плавления содержащихся в ней поверхностно-активного вещества и необязательного липида;

4) добавление жирной кислоты или ее производного в горячую суспензию, полученную на этапе 3), и перемешивание;

5) охлаждение и отстаивание суспензии, полученной на этапе 4), с получением невезикулярной наночастицы по любому из пп. 1-5.

8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что на этапе 1) в воде суспендируют поверхностно-активное вещество и липид.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая невезикулярную наночастицу по любому из пп. 1-6.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, характеризующаяся тем, что указанная фармацевтическая композиция содержит невезикулярную частицу по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9, характеризующаяся тем, что указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие антибиотики.

12. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 9-11, характеризующаяся тем, что указанная фармацевтическая композиция представляет собой водную фармацевтическую композицию.

13. Применение наночастицы по любому из пп. 1-6 или фармацевтической композиции по любому из пп. 9-12 в получении противомикробного агента.

14. Применение по п. 13, характеризующееся тем, что указанные микроорганизмы включают: бактерии, грибы.

15. Применение по п. 14, характеризующееся тем, что указанные бактерии включают: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии.

16. Применение по п. 15, характеризующееся тем, что указанные грамположительные бактерии включают: Staphylococcus, предпочтительно Staphylococcus aureus, более предпочтительно метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, Propionibacterium, предпочтительно Propionibacterium freudennreichii, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum, более предпочтительно Propionibacterium acnes; и

указанные грамотрицательные бактерии включают: Helicobacter Pylori, Pseudomonas aeruginosa, предпочтительно Helicobacter pylori.

17. Применение по п. 14, характеризующееся тем, что указанные грибы включают, не ограничиваясь перечисленными, грибы рода Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, пигментированные грибы, Mycobacterium, Sporotrichosis, Trichophyton, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucor, Actinomyces bovis, Nocardia и т.п., предпочтительно Trichophyton и Aspergillus, более предпочтительно Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Trichophyton schoenleinii и наиболее предпочтительно Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus.

18. Способ лечения, включающий введение наночастиц по любому из пп. 1-6 субъекту для лечения микробных инфекций.

19. Способ лечения, включающий введение наночастиц по любому из пп. 1-6 субъекту в комбинации с другим антибиотиком для лечения микробных инфекций.