ПРИМЕНЕНИЕ СРЕДСТВА ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНЫМИ ГРЫЗУНАМИ Российский патент 2020 года по МПК A01N43/16 A01N49/00 A01P11/00 

Настоящее изобретение касается применения средства, содержащего по меньшей мере один гидроксикумарин и по меньшей мере один аналог витамина D, для борьбы с резистентными грызунами, у которых имеет место фактическая резистентность по крайней мере к антикоагулянту второго поколения. Кроме того, настоящее изобретение также касается способа борьбы с резистентными грызунами с помощью использования описанного средства согласно изобретению.

Антикоагулянты, в частности, гидроксикумарины, с 1950-х годов используются в качестве родентицидных действующих веществ в съедобных приманках и других средствах для борьбы с грызунами. Эти активные вещества, такие как, например, варфарин, ингибируют активность фермента витамин-К-эпоксидредуктазы, который превращает витамин К в его активную форму, витамин-К-гидрохинон. Нехватка активной формы витамина К является причиной недостаточного карбоксилирования многочисленных белков, среди прочего, фактора свертывания крови X. Таким образом нарушается превращение протромбина в тромбин, стадия в каскаде реакций свертывания крови, что может приводить к ослаблению и при необходимости к гибели животного после приема соответствующей дозы кумарина.

С 1950-х годов антикоагулянты используются для борьбы с причиняющими ущерб грызунами, такими как амбарные крысы {Rattus norvegicus), черные крысы (Rattus rattus) и домовые мыши (Mus musculus). По сравнению с тяжелыми ядами эти активные вещества обладают преимуществом замедленного действия, так что не возникает никакого страха перед приманкой. К тому же, при нечаянном отравлении, например, домашних животных, в распоряжении имеется эффективный антидот в виде витамина К1.

Уже через несколько лет после вывода на рынок первого антикоагулянтного родентицида, варфарина, сообщалось о невосприимчивости крыс по отношению к этому действующему веществу (например, Boyle 1960; Nature 188:517.; Lund 1964, Bull WHO 47: 611-618). По причине все увеличивающихся сообщений о резистентности в период с 1970-х по 1980-е годы дошло до разработки антикоагулянтных действующих веществ второго поколения, имеющих заметно более высокую острую токсичность. И все же, по отношению к некоторым из этих действующих веществ могут развиваться повышенная невосприимчивость или резистентность и возникать перекрестные резистентности. При этом, как правило, имеет место то, что резистентность к одному определенному действующему веществу, также включает резистентность ко всем менее сильнодействующим активным веществам. Если линия является устойчивой к действующему веществу второго поколения, то она, следовательно, также является устойчивой ко всем действующим веществам первого поколения и также при необходимости менее сильнодействующим веществам второго поколения. Особенным недостатком сильнодействующих активных веществ второго поколения является их высокая токсичность в соединении с длительным временем выведения из организма, особенно, из печени. Поэтому данные средства применяются лишь весьма ограниченно. Хотя они оцениваются как устойчивые и биотоксичные и, следовательно, неприемлемые в принципе, они пока официально разрешаются с определенными условиями, поскольку отсутствуют альтернативы.

Важной причиной резистентности у крыс и домовых мышей является изменение последовательности в гене субъединицы 1 витамин К-эпоксид-редуктазного комплекса (VKORC1). Точечные мутации (однонуклеотидный полиморфизм, англ. - Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) в этом гене приводят к замене определенных аминокислот VKORC1. В случае резистентных линий амбарных крыс заменяется только по одной аминокислоте. Определенные изменения в последовательности VKORC1 сопровождаются изменением свойств фермента, которое затрудняет блокирование целевого фермента антикоагулянтными действующими веществами. Результатом является повышенная невосприимчивость по отношению к антикоагулянтным действующим веществам, такая как встречается также у людей и может затруднять терапевтическое использование соответствующих медикаментов. В случае крыс и мышей невосприимчивость может быть настолько сильно выраженной, что соответствующие антикоагулянтные средства для уничтожения не обеспечивают достаточного успеха в уничтожении, несмотря на технически правильное применение. Тогда, при хорошем приеме грызунами пищевой приманки, говорят о фактической резистентности (Greaves, 1994, Buckle А.Р. and Smith R.H. eds. «Rodent Pests and their Control», CABI, Wallingford, Oxon, UK, страницы 197-217).

Изменения последовательностей в гене VKORC1 сказываются с различной силой, в зависимости от того, в какой части гена они встречаются. В частности, изменения последовательности в области между 120 и 140 позициями аминокислот в гене способствуют соответственно определенному уровню резистентности у крыс и домовых мышей. Распространенное, например, в Германии, замещение аминокислоты тирозин на цистеин в позиции 139 гена VKORC1 (Tyr139Cys, Y139C) делает амбарных крыс и домовых мышей почти полностью нечувствительными по отношению к варфарину, куматетралилу, бромадиолону, а в случае крыс также к дифенакуму. Особи с этим вариантом гена VKORC1 в состоянии, также при высокой дозировке варфарина и других действующих веществ, сохранять свою свертываемость крови.

В частности, в случае амбарных крыс очень хорошо исследованы линии, характеризующиеся различными точечными мутациями SNP, в отношении их частично очень отличающихся чувствительности или соответственно резистентности. Например, известно, что линия Y139S (известная из Уэльса), хотя является немного более невосприимчивым по отношению к варфарину, однако не имеет фактической резистентности в отношении антикоагулянта второго поколения бромадиолона (Buckle et al. 2007, Int. J. Pest Mgt. 53 (4), 291-297). Резистентность существенно сильнее выражена в линии Y139C, вероятно, самой широко распространенной устойчивой линии (Дания, Германия, Нидерланды, Великобритания, Франция, Бельгия). В экспериментах в лаборатории и в естественных условиях было обнаружено, что эта линия является резистентной ко всем действующим веществам первого поколения, но также и к действующим веществам второго поколения - бромадиолону и дифенакуму (смотрите, среди прочего, Buckle et al. 2012, Pest. Manag. Sci. 69: 233-239, Endepols et al. 2007, Pest Manag. Sci. 68: 348-354).

Другой группой действующих веществ, которая может применяться в качестве родентицида, являются две формы витамина D - эргокальциферол и холекальциферол (витамины D2 и D3). Эти действующие вещества едва ли обладают потенциалом образования остатков, и поэтому не представляют никакой опасности для хищников, которые питаются крысами или мышами. Передозировка этого витамина приводит к гиперкальциемии. Поэтому холекальциферол применяется в качестве родентицида. Правда, кальциферолы, в сравнении с антикоагулянтами, до сих пор не могли реализовываться на рынке, поскольку в применяемых концентрациях, в частности у крыс, они вызывают боязнь пищевой приманки, следовательно, избегание этой приманки, или соответственно снижают привлекательность этой приманки для крыс (Prescott et al. 1992, Proc. 15th Vertebrate Pest Conf., Univ. Calif., Davis, 218-223). Уже после одного дня кормления приманкой, имеющей содержание холекальциферола 0,075%, у крыс развивается боязнь приманки, то есть, они больше едят не из приманки, а только еще из других источников питания.

Однако также известно, что кальциферолы усиливают действие определенных антикоагулянтных родентицидов у определенных линий крыс, таким образом, могут действовать синергетически. Этот эффект был обнаружен у резистентных к варфарину крыс линий Y139S из Уэльса (Kerins et al. 2002, Comp. Clin. Path. 11, 59-64). В случае восприимчивых, следовательно, обладающих нормальной чувствительностью к антикоагулянтным родентицидам, животных в лучшем случае может быть обнаружен аддитивный эффект обоих действующих веществ (Greaves et al. 1974, J. Hyg. Camb. 73, 341-352).

До сих пор исходили из того, что этот усиливающий эффект встречается только в случае линий, которые являются резистентными к антикоагулянтам первого поколения, в частности, варфарину, а не линий, обладающих более сильной резистентностью, которые также являются резистентными к действующим веществам второго поколения, таким как бромадиолон.

Поэтому задачей настоящего изобретения было предоставить средства, которые могут использоваться против грызунов, которые обладают фактической резистентностью к антикоагулянтам второго поколения. Другой задачей было найти средства, которые не должны использовать ни остро токсичные вещества, ни особенно сильнодействующие и образующие остатки антикоагулянты второго поколения, однако несмотря на это являются эффективными против резистентных к антикоагулянтам грызунов. Кроме того, другой задачей настоящего изобретения было минимизировать значения остаточного количества антикоагулянтов в грызунах, чтобы по возможности предотвратить вторичное отравление хищников.

Эти задачи были решены с помощью применения средства для борьбы с грызунами, которые являются резистентными по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, содержащих по меньшей мере один гидроксикумарин и по меньшей мере один аналог витамина D. Предпочтительно, описанные средства согласно изобретению используются для борьбы с грызунами, которые дополнительно являются резистентными по меньшей мере к одному антикоагулянту первого поколения.

Антикоагулянтами в рамках изобретения являются вещества из группы производных индандиона или гидроксикумарина 1-го и 2-го поколения. Эти вещества во всем мире применяются для борьбы с грызунами (сравните, например, с немецким патентом DE 2506769; японским патентом JP 48023942; швейцарским патентом СН 481580; Paposci (1974): Beihefte Z. Angew. Zool. с. 155 и немецким патентом DE 2506769). В качестве примеров антикоагулирующих веществ первого поколения следует назвать производные 4-гидроксикумарина (1-фенил-2-ацетил)-3-этил-4-гидроксикумарин («варфарин»), 3-(α-ацетонил-4-хлорбензил)-4-гидроксикумарин («кумахлор»), 3-(1',2',3',4'-тетрагидро-1'-нафтил)-4-гидроксикумарин («кумаметралил») и производные индандиона, такие как 1,1-дифенил-2-ацетилиндан-1,3-дион («дифацинон») и (1'-n-хлорфенил-1'-фенил)-2-ацетилиндан-1,3-дион («хлордифацинон»). Из второго поколения следует упомянуть 3-[3-(4'-гидрокси-3'-кумаринил)-3-фенил-1-(4'-бром-4'-бифенил)пропан-1-ол («бромадиолон»), 3-(3'-парадифенилил-1',2',3',4'-тетрагидро-1'-нафтил)-4-гидроксикумарин («дифенакум»), 3-[3-4'-бромбифенил-4-ил)-1,2,3,4-тетрагидро-1-нафтил]-4-гидроксикумарин («бродифакум»), 4-гидрокси-3-[1,2,3,4-[4-(4-трифторметилбензилокси)фенил]-1-нафтил]кумарин («флокумафен») и гидрокси-4-бензотиопираноны, например, «дифетиалон».

В одном варианте выполнения изобретения применение описанного средства согласно изобретению относится к борьбе с грызунами, которые обладают фактической резистентностью по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, выбираемому из группы бромадиолона, дифенакума, флокумафена, бродифакума и дифетиалона (предпочтительно, этой группы, однако без дифетиалона). В одном более предпочтительном варианте выполнения изобретения применение описанного средства согласно изобретению относится к борьбе с грызунами, которые обладают фактической резистентностью по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, выбираемому из группы бромадиолона и дифенакума (предпочтительно, по крайней мере бромадиолона). Еще предпочтительнее, описанные средства согласно изобретению дополнительно также используются для борьбы с грызунами, которые обладают фактической резистентностью к антикоагулянтам первого поколения, выбираемым из группы варфарина, куматетралила, дифацинона и хлорофацинона (предпочтительно, этой группы, однако без дифацинона и хлорофацинона). Предпочтительно, имеет место фактическая резистентность одновременно к варфарину, куматетралилу и бромадиолону. Еще предпочтительнее, дополнительно имеет место также еще фактическая резистентность к дифенакуму.

Термин «резистентность/резистентности» в рамках изобретения относится к «фактической резистентности», которая отличается тем, что соответствующий родентицид, также при технически правильном применении и хорошем приеме пищевой приманки грызунами, больше не достигает достаточной биологической эффективности (смотрите также Greaves - 1994, Buckle А.Р. and Smith R.H. eds. «Rodent Pests and their Control», CABI, Wallingford, Oxon, UK, страницы 197-217). Специалист в соответствии с этим определением может ясно и однозначно оценить, присутствует или нет фактическая резистентность. Как правило, степень «резистентности» может описываться с помощью величины фактора резистентности. Фактор резистентности (RF) обычно рассчитывается на основании летальной дозы (LD₅₀) или эффективной дозы (ED₅₀). LD₅₀ является статистически определенной дозой, которую в случае 50% испытуемых животных следует ожидать как смертельную. ED₅₀ является статистически определенной дозой действующего вещества, которая в случае 50% животных вызывает определенную реакцию, согласно изобретению это критическое значение при свертывании крови. LD₅₀ и ED₅₀ в каждом случае определяются экспериментально на каждую линию. RF представляет собой соотношение из LD₅₀ или соответственно ED₅₀ для резистентной линии и восприимчивой линии, которая служит в качестве сравнения. До 1980-х годов RF определяли на основании LD₅₀. Этот метод позднее был заменен на тест свертываемости крови (англ. BCR Resistance Tests), с помощью которого более точно могут определяться ED₅₀ (Prescott et al. 2007: A standardised BCR-resistance test for all anticoagulant rodenticides. Int. J. Pest Mgt. 53 (4), 265-272). В соответствии с этим, согласно изобретению RF рассчитывается с помощью соотношения из ED₅₀ резистентной линии и восприимчивой линии, которая служит в качестве сравнения. ED₅₀ согласно изобретению предпочтительно определяется с помощью теста свертываемости крови BCR Resistance Test в соответствии с указанной ранее литературной ссылкой.

Один предпочтительный вариант выполнения изобретения касается применения описанного средства согласно изобретению для борьбы с грызунами (предпочтительно, крысами, и еще предпочтительнее, амбарными крысами), причем имеет место фактическая резистентность по отношению к бромадиолону, и указанная фактическая резистентность характеризуется фактором резистентности по отношению к бромадиолону (предпочтительно, определенным по тесту BCR Resistance Test, смотрите Prescottt et al. 2007) по меньшей мере 7, предпочтительно, по меньшей мере 10, еще предпочтительнее, по меньшей мере 12, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 15.

Другой предпочтительный вариант выполнения изобретения касается применения описанного средства согласно изобретению для борьбы с грызунами (предпочтительно, крысами, и еще предпочтительнее, амбарными крысами), причем имеет место фактическая резистентность по отношению к дифенакуму, и указанная фактическая резистентность характеризуется фактором резистентности по отношению к дифенакуму (предпочтительно, определенным по тесту BCR Resistance Test) по меньшей мере 2, предпочтительно, по меньшей мере 2,9, еще предпочтительнее, по меньшей мере 4,8, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 12.

Более сильно устойчивые линии отличаются, в частности, резистентностью к бромадиолону. В следующей таблице 1 перечисляются значения RF для бромадиолона у соответствующих резистентных линий амбарных крыс:

Таблица 1: Факторы резистентности для бромадиолона в известных резистентных линиях амбарных крыс (Rattus norvegicus). RF для Y139S определяли на основании LD₅₀ (данных для теста BCR Resistance Test для Y139S еще не имеется), значения RF других линий определяли с помощью теста BCR Resistance Test (источник: Y139S: Buckle et al. 2007, Int. J. Pest Mgt. 53 (4), 291-297); другие линии: таблица 2, стр. 15, регламенты RRAC Guidelines on Anticoagulant Rodenticide Resistance Management; www.rrac.info),

Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения касается применения описанного средства согласно изобретению для борьбы с амбарными крысами, причем имеет место фактическая резистентность по меньшей мере по отношению к бромадиолону, и указанная фактическая резистентность по отношению к бромадиолону характеризуется:

-в случае линии Y139C фактором резистентности по меньшей мере 15, предпочтительно, по меньшей мере 17, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 20,

-в случае линии Y139F фактором резистентности по меньшей мере 7, предпочтительно, по меньшей мере 9, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 12,

- в случае линии L120Q Hampshire фактором резистентности по меньшей мере 10, предпочтительно, по меньшей мере 14, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 17.

Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения касается применения описанного средства согласно изобретению для борьбы с амбарными крысами, причем имеет место фактическая резистентность по меньшей мере по отношению к дифенакуму, и указанная фактическая резистентность по отношению к дифенакуму характеризуется:

-в случае линии Y139C фактором резистентности по меньшей мере 1,6, предпочтительно, по меньшей мере 2, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 2,9,

- в случае линии L120Q Hampshire фактором резистентности по меньшей мере 4,8, предпочтительно, по меньшей мере 12, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 15.

Из экспериментов и испытаний в естественных условиях с различными антикоагулянтами можно сделать вывод, что 100-процентная борьба с помощью исключительно антикоагулянта более не возможна, если RF превышает диапазон от 3 до 6. В зависимости от линии и от использованного антикоагулянта могут встречаться трудности уже при RF выше диапазона от 1,5 до 3.

Средства согласно изобретению подходят для борьбы со всеми резистентными линиями грызунов-вредителей, среди прочего, представителей родов Microtus, Arvicola, Rattus и Mus. В ареале расселения людей особенно следует упомянуть домовую мышь (Mus musculus/domesticus), амбарную крысу (Rattus norvegicus), а также черных крыс (R. rattus). Предпочтительно, описанные средства согласно изобретению используются против резистентных крыс, таких как амбарная крыса (Rattus norvegicus) vim черные крысы (R. rattus). Особенно предпочтительно, описанные средства находят применение при борьбе с амбарными крысами (Rattus norvegicus). Возможно применение на открытой местности, а также в зданиях, также загонах для животных, складских и производственных помещениях, а также в канализации.

Существующий уровень знаний, касающихся чувствительности всех известных резистентных линий амбарных крыс, обобщается в следующей ниже таблице 2. Данные основываются на анализе всех доступных данных по резистентным рабочим группам в Великобритании и Германии (смотрите, среди прочего: http://www.bpca.org.uk/assets/RRAG_Resistance_Guideline.pdf, Esther et al. 2014, Bundesgesundheitsblatt. DOI 10.1007/s00103-013-1930-z). Только в случае линии Y139S (Уэльс) не имеет места фактическая резистентность по отношению к антикоагулянтам второго поколения, другие линии частично с различной степенью выраженности являются фактически резистентными к этим действующим веществам. То есть, эти линии являются более сильно резистентными, чем линия Y139S.

Таблица 2: Характеризующиеся полиморфизмом VKORC1 резистентные линии амбарных крыс (Rattus norvegicus), и их фактическая резистентность по отношению к антикоагулянтам первого поколения (варфарину, хлорофацинону, куматетралилу) и второго поколения (бромадиолону, дифенакуму, бродифакуму, флокумафену, дифетиалону). Оценка основывается на испытаниях в естественных условиях и экспериментальных значениях.

Линия Y139C играет первостепенную роль. С одной стороны, помимо L120Q Berkshire, она является наиболее резистентной линией. С другой стороны, и это отличает ее от L120Q, она является наиболее распространенной линией (таблица 3). Следовательно, подтверждение эффективности средства против этой линии рассматривается как общее подтверждение эффективности против резистентных крыс, единственно, линия L120Q Berkshire могла бы иметь сравнимую степень резистентности.

Резистентная линия крыс «Westfalen», характеризующаяся полиморфизмом Y139C гена VKORC1, является резистентной к антикоагулянтам второго поколения бромадиолону и дифенакуму, а также действующим веществам первого поколения. Съедобные приманки, которые содержат одно из этих веществ в разрешенных к применению концентрациях, являются неэффективными против животных этой линии. Так, например, при испытаниях на поедание в лабораторных условиях с бромадиолоном и куматетралилом не наблюдалось никакой смертности.

Другой вариант выполнения изобретения касается применения описанного средства согласно изобретению для борьбы с амбарными крысами, которые являются резистентными по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения (и предпочтительно, одновременно также по меньшей мере к одному антикоагулянту первого поколения), причем эти амбарные крысы имеют изменения последовательности в гене субъединицы 1 витамин К - эпоксид-редуктазного комплекса 1 (VKORC1). Предпочтительно, эти амбарные крысы имеют изменения последовательности в области гена VKORC1, которая кодирует положения со 120 по 140 аминокислот белка VKORC1. Еще предпочтительнее, описанные средства согласно изобретению применяются для борьбы с резистентными амбарными крысами линий L120Q Berkshire, L120Q Hampshire, L128Q, Y139C, Y139F. Еще более предпочтительным является использование для борьбы с линией Y139C.

В другом варианте выполнения изобретения средство, применяемое согласно изобретению, в качестве по меньшей мере одного гидроксикумарина содержит гидроксикумарин, выбираемый из группы варфарина, кумахлора, куматетралила, бромадиолона, дифенакума, бродифакума и флокумафена. Предпочтительно, используется только один гидроксикумарин. В свою очередь, согласно изобретению, предпочтительно, используется по крайней мере (и предпочтительно, в качестве единственного гидроксикумарина) куматетралил.

Аналогами витамина D в рамках изобретения являются эргокальциферол и холекальциферол. Они являются производными 3β-гидрокси-Δ5,7-17β-замещенного стероида. Кальциферолы образуются в результате облучения из эргостерола. Кроме того, подходящими являются другие аналоги и метаболиты витамина D, такие как, например, гидроксихолекальциферол, дигидроксихолекальциферол, гидроксиэргокальциферол, дигидроксиэргокальциферол. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения средство, применяемое согласно изобретению, в качестве по меньшей мере одного аналога витамина D содержит эргокальциферол и/или холекальциферол. Еще предпочтительнее, средство, применяемое согласно изобретению, в качестве аналога витамина D содержит только холекальциферол.

Неожиданным образом, согласно изобретению выявилось, что приманки с куматетралилом особенно эффективны против описанных выше резистентных крыс тогда, когда добавляется незначительное количество холекальциферола. Уже добавление холекальциферола в концентрации 50 мг/кг к обычной концентрации куматетралила способствует высоким показателям смертности в случае резистентных крыс. Уже с помощью концентрации холекальциферола, составляющей 100 мг/кг, могут достигаться показатели смертности вплоть до 100% (смотрите примеры). Один куматетралил согласно изобретению, как и следует ожидать, не вызывает смертности. Поскольку один холекальциферол при 100 мг/кг также не вызывает смертности, эффект может объясняться только усиленным действием куматетралила. Опубликованные до сих пор доказательства усиливающего эффекта холекальциферола относятся исключительно только к слабо резистентной линии из Уэльса Y139S, который является лишь слегка резистентным к действующим веществам первого поколения варфарину и куматетралилу и не имеет фактической резистентности по отношению к антикоагулянту второго поколения (смотрите также таблицу 2, с. 16, RRAC Guidelines on Anticoagulant Rodenticide Resistance Management; www.rrac.info).

Другой вариант выполнения касается использования описанного средства согласно изобретению, причем по меньшей мере один гидроксикумарин используется в концентрации от 5 мг/кг до 1000 мг/кг, предпочтительно, между 20 и 800 мг/кг (первое поколение гидроксикумаринов: варфарин, кумахлор, куматетралил) или соответственно 10 и 100 мг/кг (2-е поколение гидроксикумаринов: бромадиолон, дифенакум, бродифакум и флокумафен), и особенно предпочтительно, между 20 и 750 мг/кг (относительно 1-го поколения гидроксикумаринов) или соответственно 10 и 50 мг/кг (относительно 2-го поколения гидроксикумаринов), и наиболее предпочтительно, между 250 и 800 мг/кг (относительно 1-го поколения гидроксикумаринов) или соответственно 20 и 50 мг/кг (относительно 2-го поколения гидроксикумаринов). Если используется несколько гидроксикумаринов, общая концентрация этих гидроксикумаринов также находится внутри описанного выше диапазона.

Другой вариант выполнения касается использования описанного средства согласно изобретению, причем используется по меньшей мере один аналог витамина D в концентрации от 10 до 1000 мг/кг, предпочтительно, между 20 и 200 мг/кг, особенно предпочтительно, между 25 и 100 мг/кг, наиболее предпочтительно, между 50 и 100 мг/кг. Если используется несколько аналогов витамина D, общая концентрация этих аналогов витамина D также находится внутри описанного выше диапазона.

Чтобы доказать эффект добавления незначительных количеств холекальциферола к приманкам с антикоагулянтом первого поколения также в практических условиях, были проведены стандартные испытания в естественных условиях. Помимо успешных экспериментов с 100 мг/кг холекальциферола, также был проведен эксперимент с более низкой концентрацией, составляющей только 50 мг/кг, в комбинации с куматетралилом. Даже эти пониженные количества холекальциферола оказались вполне эффективными (смотрите пример 2). В этом случае почти полностью было ликвидировано заражение, включающее примерно 50% резистентных крыс линии Y139C, следовательно, резистентных к бромадиолону.

Линия крыс Y139C обладает фактической резистентностью по отношению к двум антикоагулянтным родентицидам второго поколения. За исключением обнаруженного только в Беркшире (Англия) варианта линии L120Q, никакая линия не обладает таким высоким уровнем резистентности. Усиливающий эффект незначительных количеств холекальциферола до сих пор был обнаружен только в случае линии Y139S, который является заметно менее невосприимчивым и не имеет фактической резистентности к действующим веществам второго поколения. Хотя, усиливающее влияние на подавляющее свертываемость крови воздействие антикоагулянта в этой линии могло обнаруживаться (Kerins et al. 2002, Comp. Clin. Path. 11, 59-64.), однако это влияние не было таким сильным, чтобы следовало ожидать достаточного эффекта в случае более сильно резистентных крыс.

С помощью добавления самого по себе не эффективного, незначительного количества холекальциферола к антикоагулянтному средству для борьбы с грызунами первого поколения могут получаться средства уничтожения, которые действуют против сильно резистентных линий крыс и которые обладают преимуществами антикоагулянтных действующих веществ (замедленное действие, антидот), однако обходятся без применения антикоагулянтов второго поколения. Тем самым заметно снижаются риски, связанные с окружающей средой, которые находятся в связи с применением этих устойчивых действующих веществ.

Другой объект изобретения касается способа борьбы с грызунами, которые обладают фактической резистентностью по отношению по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, отличающегося тем, что применяется средство, которое содержит по меньшей мере один гидроксикумарин и по меньшей мере один аналог витамина D. Точно так же, как и для описанного применения, все ограничительные признаки также справедливы для этого описанного способа борьбы с грызунами.

Применяемые согласно изобретению средства составляются в композиции в форме всех типов родентицидных пищевых приманок. Эти приманки достаточно известны из уровня техники. Рекомендовать можно такие, которые основаны на злаковых, такие как овсяные хлопья, пшеница, кукуруза и другие. Это могут быть сыпучие приманки из одного или нескольких злаковых компонентов, экструдированные приманки, такие как грануляты или таблетки, брикеты с воском, мягкие или пастообразные, основанные на растительных жирах и муке смеси, или гели, которые основаны на маслянистых или водных композициях. Особенно следует рекомендовать пастообразные приманки, которые состоят из злаковых или муки и растительных жиров. Хорошо подходящими являются, например, пастообразные приманки в порционных упаковках от 10 г до 200 г.

Другими формами для приема являются жидкие или желеобразные пропитки, а также так называемые контактные средства, такие как порошки и пены. Эти средства не являются пищевыми приманками, однако вносятся таким образом, что они прилипают на мех грызунов и принимаются ими через рот только при чистке меха.

Так, в других экспериментах (смотрите пример 3) с крысами неожиданным образом дополнительно выявилось, что уже во время третьего дня от поедания приманки, содержащей гидроксикумарин и холекальциферол в незначительной концентрации (предпочтительно, при концентрации от 50 до 100 мг/кг, и еще предпочтительнее, между 75 и 100 мг/кг), наступает полное прекращение поедания (англ. «Stop-Feeding Effekt»). Это можно наблюдать, в частности, тогда, когда дается пищевая приманка с гомогенным распределением гидроксикумарина и холекальциферола, которые растворены в жирах (предпочтительно, пастообразные приманки или восковые брикеты). Очевидно, доступность холекальциферола является очень хорошей в таких пищевых приманках, в которых он присутствует растворенным в жирах и гомогенно распределенным. Вещество быстро и практически полностью поглощается в пищеварительном тракте. Особенно неожиданным в случае таких экспериментов было то, что несмотря на эффект прекращения поедания («Stop-Feeding») по меньшей мере 90% крыс приняли смертельную дозу антикоагулянта и умерли от внутреннего кровотечения. Вопреки ожиданию, сокращение периода поедания в результате эффекта прекращения поедания («Stop-Feeding») не приводило к значительно пониженным показателям смертности.

В экспериментах с антикоагулянтом первого поколения (куматетралилом, смотрите пример 3), как правило, принимается только примерно от 50% до 60% от количества приманки, такой как приманка одинаковой рецептуры с антикоагулянтом, однако без холекальциферола. В случае этого снижения приема приманки или соответственно действующего вещества специалист мог бы ожидать того, что остаточные количества действующего вещества антикоагулянта, которые можно обнаружить в печени, снижаются в таком же соотношении. Однако полностью неожиданно было установлено, что эти остаточные количества в экспериментальных группах, которые получали антикоагулянт в комбинации с холекальциферолом, являются значительно более сниженными, чем можно было заключить из соотношения съеденных количеств.

Поэтому в другом варианте выполнения изобретения описанные средства согласно изобретению дополнительно используются, в частности, также для снижения значений остаточного количества применяемого или соответственно применяемых гидроксикумаринов в грызунах (и в частности, в печени грызуна). С помощью такого применения описанного средства согласно изобретению значительно снижаются риски для окружающей среды, которые связаны с использованием антикоагулянтов. К ним относится, например, опасность вторичного отравления хищников, таких как хищные птицы, совы или ласки, которые поедают грызунов, которые сами приняли родентицидную пищевую приманку. Другой объект изобретения касается способа, описанного согласно изобретению, причем этот способ, предпочтительно, используется также для снижения значений остаточного количества применяемого или соответственно применяемых гидроксикумаринов в грызунах.

Примеры

Пример 1:

Эксперимент с поеданием с амбарными крысами резистентной линии Y139C, приманка с куматетралилом 375 мг/кг и холекальциферолом 100 мг/кг.

6 амбарных крыс из линии Y139C (2 самца и 4 самки) получали описанную далее пищевую приманку на протяжении промежутка времени, составляющего 4 дня. После этого определяли поедание и смертность. Одну группу (6 крыс, группа 1) кормили пищевой приманкой, состоящей из куматетралила (375 мг/кг) и холекальциферола (100 мг/кг). Другую группу (группу 2) кормили только с куматетралилом (375 мг/кг). Все животные потребляли пищевую приманку, за исключением одного животного из группы 2. Поедание было наиболее высоким во время первых 24 часов. На третий и четвертый день поедалось еще меньше. Все 6 крыс в группе 1 умерли спустя от 5 до 7 дней после начала эксперимента. Два самца употребили в каждом случае примерно 47 мг/кг куматетралила и 12,5 мг/кг холекальциферола (в пересчете на массу тела). Самки употребили от 50 до 79 мг/кг куматетралила и от 13 до 21 мг/кг холекальциферола (соответственно в пересчете на массу тела). В группе 2 не наблюдалось смертности, несмотря на то, что животные употребили 94 мг/кг куматетралила (средняя величина в пересчете на массу тела). Комбинация куматетралила и холекальциферола была смертельной и показывает, что эта комбинация действует против резистентных амбарных крыс линии Y139C.

Пример 2:

Эксперимент в естественных условиях на сельскохозяйственном предприятии в области резистентности Мюнстерланд, Вестфаллен, Германия.

Главной областью распространения резистентной к бромадиолону линии Y139C является Мюнстерланд (Германия). Крыс этой резистентной линии можно обнаружить на многих животноводческих сельскохозяйственных предприятиях.

Они являются резистентными к куматетралилу и антикоагулянтам второго поколения бромадиолону и дифенакуму (Buckle et al. 2012, Pest Manag Sci 69: 233-239; Endepols et al. 2007, Int. J. Pest Mgt. 53 (4), 285-290, Endepols et al. 2012, Pest Manag. Sci. 68: 348-354). На таком предприятии проводились испытания в естественных условиях с приманкой, содержащей куматетралил 375 мг/кг и холекальциферол 50 мг/кг. Перед уничтожением с помощью родентицидной приманки определяли частоту и степень резистентности в хозяйстве. Для этого ловили крыс и подвергали испытаниям в тесте на свертываемость крови с куматетралилом. Результат: примерно 46% крыс в хозяйстве были резистентными к куматетралилу с фактором резистентности от 60 до 80. Затем применяли приманку стандартным способом в течение 35 дней. Итог по уничтожению после поедания 7,3 кг приманки составлял 94%. Результат на этом уровне, как правило, оценивается как весьма хороший итог и как доказательство эффективности, потому как при практических условиях он должен считаться с миграцией крыс из окрестностей. Для официального санкционирования продукта 90% результата по уничтожению оценивают в качестве доказательства эффективности нового средства. Поэтому результат этого испытания в естественных условиях оценивается как доказательство полной эффективности приманки с куматетралилом и холекальциферолом против резистентной к бромадиолону линии Y139C.

Пример 3: Экспериментальное доказательство эффекта прекращения поедания и снижения остаточных количеств

Метод:

В лабораторном эксперименте с амбарными крысами (Rattus norvegicus) дикой линии сравнивали съеденные количества двух приманок, которые, за исключением добавления холекальциферола, имели одинаковый состав. Обе приманки представляли собой пастообразные приманки на жировой основе, приманка А с антикоагулянтом куматетралилом 375 мг/кг и приманка В с куматетралилом 375 мг/кг и холекальциферолом 100 мг/кг. Обе приманки неограниченно, ad libitum, на протяжении 10 дней предлагались группам, в каждом случае по шесть мужских и женских особей взрослых крыс. Определяли индивидуальное ежедневное съеденное количество, и пересчитывали по отношению к массе тела. У всех умерших во время эксперимента крыс определяли остатки куматетралила в печени и в остальном теле.

Результат:

В группе А (только куматетралил) потреблялось приманки 222,1 г/кг. В группе В (куматетралил и холекальциферол) потреблялось 126,5 г/кг, следовательно, только 57% от съеденного в группе А количества. Эту разницу можно объяснить эффектом прекращения поедания («Stop-Feeding Effekt») в группе В, который на третий день останавливал поедание (таблица 4). Смертность в группе А составила 11/12, в группе В 12/12. Остатки куматетралила в печени животных различались сильнее, чем следовало ожидать на основании данных по поеданию: в группе В они составили только 31% от значений в группе А.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Применение средства, содержащего по меньшей мере один гидроксикумарин и по меньшей мере один аналог витамина D, в качестве средства для борьбы с амбарными крысами, имеющими изменения последовательности в гене субъединицы 1 витамин К - эпоксидредуктазного комплекса 1 (VKORC1) и являющимися амбарными крысами линии L120Q Berkshire, L120Q Hampshire, L128Q, Y139C или Y139F, и у которых имеет место фактическая резистентность по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, и указанная фактическая резистентность характеризуется фактором резистентности, составляющим по меньшей мере 7, по отношению к бромадиолону, причем указанный по меньшей мере один гидроксикумарин выбран из группы варфарина, кумахлора, куматетралила, бромадиолона, дифенакума, бродифакума и флокумафена и указанный по меньшей мере один аналог витамина D выбран из группы эргокальциферола и холекальциферола в концентрации между 50 и 100 мг/кг. Изобретение позволяет повысить эффективность борьбы с амбарными крысами. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 4 табл.

1. Применение средства, содержащего по меньшей мере один гидроксикумарин и по меньшей мере один аналог витамина D, в качестве средства для борьбы с амбарными крысами, имеющими изменения последовательности в гене субъединицы 1 витамин К - эпоксидредуктазного комплекса 1 (VKORC1) и являющимися амбарными крысами линии L120Q Berkshire, L120Q Hampshire, L128Q, Y139C или Y139F, и у которых имеет место фактическая резистентность по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, и указанная фактическая резистентность характеризуется фактором резистентности, составляющим по меньшей мере 7, по отношению к бромадиолону, причем указанный по меньшей мере один гидроксикумарин выбран из группы варфарина, кумахлора, куматетралила, бромадиолона, дифенакума, бродифакума и флокумафена и указанный по меньшей мере один аналог витамина D выбран из группы эргокальциферола и холекальциферола в концентрации между 50 и 100 мг/кг.

2. Применение средства по п. 1, отличающееся тем, что имеет место фактическая резистентность к дифенакуму, и указанная фактическая резистентность по отношению к дифенакуму характеризуется фактором резистентности, составляющим по меньшей мере 2.

3. Применение средства по п. 1, отличающееся тем, что имеет место фактическая резистентность по меньшей мере по отношению к бромадиолону, и указанная фактическая резистентность по отношению к бромадиолону характеризуется:

- в случае линии Y139C фактором резистентности по меньшей мере 15,

- в случае линии Y139F фактором резистентности по меньшей мере 7, и

- в случае линии L120Q Hampshire фактором резистентности по меньшей мере 10.

4. Применение средства по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере одним гидроксикумарином является куматетралил.

5. Применение средства по одному из пп. 1-4, отличающееся тем, что указанное средство дополнительно используется для снижения значений остаточного количества по меньшей мере одного используемого гидроксикумарина в амбарных крысах.

6. Способ борьбы с амбарными крысами, имеющими изменения последовательности в гене субъединицы 1 витамин К - эпоксидредуктазного комплекса 1 (VKORC1) и являющимися амбарными крысами линии L120Q Berkshire, L120Q Hampshire, L128Q, Y139C или Y139F, и для которых имеет место фактическая резистентность по меньшей мере к одному антикоагулянту второго поколения, и указанная фактическая резистентность характеризуется фактором резистентности, составляющим по меньшей мере 7, по отношению к бромадиолону, отличающийся тем, что применяют средство, которое содержит по меньшей мере один гидроксикумарин, выбранный из группы варфарина, кумахлора, куматетралила, бромадиолона, дифенакума, бродифакума и флокумафена, и по меньшей мере один аналог витамина D, выбранный из группы эргокальциферола и холекальциферола, в концентрации между 50 и 100 мг/кг.