ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ГУАРА Bradyrhizobium retamae - СТИМУЛЯТОР АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ГУАРА Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/20 C05F11/08 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к технологии активации семян гуара с помощью бактериальных удобрений.

Гуар или циамопсис четырехкрыльниковый (Cyamopsis tetragonoloba) - однолетняя зернобобовая культура, представляющая собой травянистое растение семейства Бобовые (Fabaceae). Растения высотой от 70 см до 3 м и более. Мощная стержневая система корней дает возможность растению получать достаточное количество питательных веществ и влаги их глубоких слоев почвы.

Семена гуара состоят на 20-22% из оболочек, на 44-46% из зародыша и на 32-36% из эндосперма. В эндосперме семян гуара содержится ценное вещество - гуаровая камедь, в состав которой входит до 85% галактоманнана, 12% воды, 5% белка, 2% не растворимого в кислоте осадка или сырых волокон, 0,7% золы, 0,7% жир. (https://glavagronom.ru/articles/Guar-cennost-zernobobovoj-kultury-i-perspektivy-proizvodstva-v-Rossii).

В настоящее время гуаровая камедь нашла широкое применение в нефтегазовой, пищевой промышленности, а также в косметической, фармацевтической, легкой промышленности и других отраслях экономики, так как она является сильным и гелеобразующим агентом с регулируемой вязкостью, зависящей от температуры, времени и концентрации. В частности, камедь, благодаря способности в малых количествах образовывать гели с холодной водой, надежно

суспензирует бентонитовую глину в буровом растворе и ограничивает потери воды. Наличие ее в пищевых продуктах способствует уменьшению аппетита, снижению уровня насыщенных жиров и холестерина в организме. Так как она проявляет гипогликемические свойства и уменьшает всасывание глюкозы в крови, это позволяет использовать гуаровую камедь при лечении и профилактике диабета. Кроме того камедь гуарового дерева является активным компонентом многих биологически активных добавок (Локло, Энергетический коктейль Ти Эн Ти, Пастилки с солодкой, цинком и др.).

Гуар, в основном, выращивают в Индии, однако из-за высокого спроса на камедь это растение пытаются культивировать в других районах с подходящим климатом: в США, Судане, Афганистане, Кении, Пакистане, Австралии, а также на юге России. В РФ полевой опыт по возделыванию гуара был начат в 2013 г.: для этих целей была отведена экспериментальная делянка в 3 га в хозяйстве агрофирмы «Красный сад» Азовского района Ростовской области. Температурный режим Приазовья для новой культуры оказался вполне подходящим и уже в следующем году они получили первый урожай - пусть небольшой, но вполне достаточный для того, чтобы обеспечить себя посевным материалом.

Проведенные исследования показали, что гуар, как и другие бобовые культуры, вступает в симбиоз с азотфиксирующими бактериями, в результате чего за вегетационный период накапливает в почве около 60 кг азота на гектаре и улучшается структура почвы.

Вместе с тем известно, что продуктивность бобовых культур зависит не только от климатических условий, но и от эффективности симбиоза с ризобиями, которая в том числе определяется их комплементарностью к определенному сорту. Использование клубеньковых бактерий для инокуляции растений особенно важно при интродукции растений на новые места обитания,

поэтому для успешного выращивания гуара в России необходимы специфические штаммы-симбионты.

Выпускаемые в России инокулянты, содержащие штаммы клубеньковых бактерий ((https://ekosspb.ru/catalog/microbiologicheskie-preparaty/rizotorfin; http:fialka,tomsk/forum/viewtopic.php?t=35148.).). создаются на основе селекционных штаммов бактерий конкретной высеваемой культуры. Их применение для выращивания гуара в проанализированной научно-технической литературе не обнаружено..

Технический результат достигался использованием для данной цели штамма Bradyrhizobium retamae 716, который был депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения при ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург) 04.12.2019 с регистрационным номером RCAM 05275.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Наименование: клубеньковые бактерии гуара (Cyamopsis tetragonoloba) Bradyrhizobium retamae

Номер штамма: 716

Происхождение штамма: ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург, Пушкин). Выделен из клубенька растения гуара (Cyamopsis tetragonoloba), произрастающего в провинции Гоа, Индия. Белимов А.А., Сафронова В.И., 2019 г.

Методы идентификации: секвенирование гена 16S рРНК (ФГБНУ ВНИИСХМ, Сазанова А.Л., Кузнецова И.Г.

Морфолого-культуральные и биохимические признаки. Штрих на среде YMA умеренный, слизистый, блестящий. На МПА не растет, Молоко с лакмусом подщелачивает. Колонии на 3 сутки, беловатые, округлые, слизистые, с ровным краем, диаметр до 1 мм.

Результаты секвенирования гена 16S рРНК:

Патогенность. Непатогенный штамм.

Способ хранения. Штамм выращивают на маннитно-дрожжевом агаре (YMA) при 28°С. Температура хранения +4°С. Пересев один раз в 6 месяцев. Долгосрочное хранение - в криоконсервированном состоянии при -80°С на среде TY с 15% глицерином.

Характеристика штамма. Азотфиксирующий микросимбионт гуара (Cyamopsis tetragonoloba).

Штамм получали следующим образом. Семена гуара (Cyamopsis tetragonoloba), полученные в ФГБНУ ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова, скарифицировали и поверхностно стерилизовали в 98% H₂SO₄ в течение 10 мин, затем тщательно промывали стерильной водопроводной водой и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 25°С в темноте в течение 3 дней. Проростки переносили в пластиковые сосуды (10 сосудов, 4 проростка в сосуд), содержащие 100 г стерильного вермикулита. В каждый сосуд добавляли 5 мл водных вытяжек, полученных из образцов почв, собранных в 2018 году в провинции Гоа (Индия).

Растения культивировали в течение 46 дней в фитокомнате с относительной влажностью 60% и четырехуровневым режимом освещенности/температуры: ночь (темнота, 18°С, 8 часов), утро (200 мкмоль м^-2с^-1, 20°С, 2 часа), день (400 мкмоль м^-2с^-1, 23°С, 12 ч), вечер (200 мкмоль м^-2с^-1, 20°С, 2 ч). Для освещения использовались лампы L 36W/77 FLUORA (Osram, Германия). По окончании эксперимента корни растений вынимали из вермикулита и промывали водопроводной водой. Образовавшиеся клубеньки отделяли от корней, поверхностно стерилизовали 1 мин в 70% этаноле и гомогенизировали в стерильной водопроводной воде. Штаммы ризобий были выделены из гомогенатов

клубеньков путем посева на агаризованную модифицированную маннитно-дрожжевую среду с добавлением 0.5% янтарной кислоты. Штаммы выращивались при 28°С.

Для определения видовой принадлежности штаммов использовали метод секвенирования гена 16S рРНК (rrs), а также последовательности между генами 16S и 23S рРНК (ITS-региона). Для амплификации 16S рДНК (около 1500 п.н.) использовали праймеры fD1 и rD1 а для амплификации ITS региона (800 п.н.) праймеры FGPS1490-72 и FGPL-132

Полученные ПЦР-продукты выделяли из геля и очищали для последующего секвенирования на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl (AppliedBiosystems, США). Поиск гомологичных последовательностей выполняли с помощью базы данных NCBI GenBank и программы BLAST. Для конструирования филогенетического дерева применяли программу MEGA5 и метод Neighbor-Joining. Пары последовательностей сравнивали по числу различающихся нуклеотидов.

Эффективность и промышленную применимость штамма иллюстрировали следующим примером.

Пример 1. Для инокуляции семян гуара использовали водные суспензии (10 Е7 кл./мл) изолированных клубеньковых бактерий в количестве 10 мл в сосуд. Суспензии бактерий вносили на семена сразу после посева, что в дальнейшем позволяло корням прорастающих семян контактировать с бактериями. Д ля каждого варианта опыта использовали по 8 растений.

Растения культивировали в течение 46 дней в фитокомнате с относительной влажностью 60% и четырехуровневым режимом освещенности/температуры: ночь (темнота, 18°С, 8 часов), утро (200 мкмоль м^-2с^-1, 20°С, 2 часа), день (400 мкмоль м^-2с^-1, 23°С, 12 ч), вечер (200 мкмоль м^-2с^-1, 20°С, 2 ч). По окончании эксперимента растения вынимали из сосудов, корни промывали

водопроводной водой и подсчитывали количество образовавшихся клубеньков. Азотфиксирующую активность клубеньков определяли ацетиленовым методом. Для этого корни помещали в герметичные флаконы, добавляли ацетилен в концентрации 10% и инкубировали 1 сутки при 25°С. Реакцию останавливали добавлением 2,5% раствора формалина и определяли содержание этилена на газовом хроматографе GC-2014 (Shimadzu, Япония). Побеги растений высушивали и использовали для определения содержания в них общего азота с помощью автоматического анализатора Kjeltec 8200 («FOSSAnalytical», Дания). Полученные результаты приведены в таблице 1.

Полученные результаты показали, что заявляемый штамм обладает повышенной азотфиксирующей способностью по сравнению с контролем без инокуляции и описанными ранее аналогами - штаммами Bradyrhizobium elkanii 499 и 500. Он также достоверно повышает биомассу корней и побегов гуара и содержание азота в растениях.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium retamae, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения при ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 05275, обладает азотфиксирующей способностью. Изобретение обеспечивает повышение содержания азота в растениях гуара. 1 табл., 1 пр.

Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium retamae, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения при ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 05275, в качестве стимулятора роста и азотфиксирующей способности гуара.