ШТАММ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ PHYLLOBACTERIUM IFRIQIYENSE 6, АКТИВНЫЙ АЗОТФИКСАТОР И РОСТСТИМУЛЯТОР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РИСА Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, микробиологической промышленности и сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам оптимизации азотного питания растений путем предпосевной обработки семян эффективными диазотрофными бактериями и колонизации корней.

Повышение урожая сельскохозяйственных культур осуществляется путем внесения минеральных и органических удобрений. В современном сельском хозяйстве, ориентированном на биологизацию, одним из способов повышения урожайности сельскохозяйственных культур, в том числе риса, является применение микробных препаратов на основе активных штаммов различных микроорганизмов (Биопрепараты в сельском хозяйстве. Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве / Под ред. И.А. Тихоновича и Ю.В. Круглова. - М., 2005. - 154 с.).

В посевах зерновых культур применяют препарат ризоагрин на основе бактерии Agrobacterium radiobacter 204 с комплексом полезных для растений свойств. (Курсанова B.C., Бартая Н.Н. «Влияние препарата «Ризоагрин» на урожайность зеленой массы ячменя в одновидовом посеве и травосмесях с бобовыми культурами» / Вестник Алтайского государственного университета №12 (122), 2012, С. 5-9; Мельничук Т.Н. «Эффективность применения биологических препаратов в технологии возделывания зерновых культур» / Т.Н. Мельничук, Н.К. Шерстобоев, И.А Каменева, Л.А Чайковская, С.С. Ярошенко, В.В. Ключенко, Н.М. Донец // Производственная лаборатория, №1 (40). - 2012. - С. 11-16).

Известен штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083, используемый в качестве средства для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста. Штамм был выделен из корней риса, произрастающего в провинции Иенгнам Республики Южная Корея и депонирован под регистрационным номером «148 ВНИ-ИСХМ-Д» от 14.07.2005 г. (Патент РФ №2295562 C1, C12N 1/20, A01N 63/00, опубл. 20.03.2007, бюл. №8).

Недостаточная эффективность существующих микробных препаратов при выращивании риса объясняется тем, что в бессменных посевах риса современных сортов применяются интенсивные технологии (многократные подкормки азотными удобрениями, обработка химическими средствами защиты растений от фитопатогенов, фитофагов и сорной растительности). Такие условия формируют микробоценоз, не способствующий приживаемости штаммов их биоагентов и, соответственно, функционированию ассоциативной системы бактерий с растениями.

В основу изобретения поставлена задача выделить штамм бактерий с высокой степенью ассоциативности с растением, адаптированного к почвенно-климатическим условиям юга России и районированным сортам риса, способного связывать азот атмосферы, стимулировать рост и развитие растений, что обеспечит повышение урожайности культуры.

Поставленная задача решена путем выделения в 2011 году из апикальной части корней риса, выращиваемого в монокультуре, штамма ассоциативных бактерий Phyllobacterium ifriqiyense 6, активного азотфиксатора, рост-стимулятора, который повышает продуктивность риса и может быть рекомендован для приготовления бактериальных препаратов.

Штамм выделен по усовершенствованной методике, предложенной Шерстобоевым Н.К., Мельничук Т.Н. и др., в основе которой принцип элективности, сформулированный Виноградским, и метод изучения эпифитов по Худякову (Красильников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд-во АН СССР, 1958. - 181 с.). Выделен и идентифицирован по морфологическим и биохимическим свойствам в 2011 году по определителю Берги 1984 г. и методическим рекомендациям по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений (Возняковская, Ю.М., Попова Ж.П., 1985 г.). Генетическая идентификация была проведена в 2016 году в ФГБНУ ВНИИСХМ г. Санкт-Петербург (при поддержке гранта №16-34-50060. Идентификация и характеристика симбиотических свойств ростстимулирующих бактерий ризосферы риса).

Штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 был выделен из апикальной части корней риса сорта Хазар, который выращивали в модифицированных сосудах Леонарда на капустной среде №19. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма: колонии на агаризованной среде округлой формы, диаметром 5-7 мм, выпуклые, блестящие, грязно-белые (прозрачные), края ровные. Клетки подвижные, утолщенные палочки. Грамотрицательные, спор не образуют. Обильный рост отмечен на средах как с минеральным, так и с органическим азотом; утилизирует простые сахариды с подкислением среды (рост слабый); крахмал не гидролизует, не разжижает желатин; каталазоположительны; при 37°С рост отсутствует; факультативный аэроб. Штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 обильно растет на картофельном косяке, образуя слизь. При культивировании на лакмусовом молоке пептонизирует его. Температурный интервал роста штамма 22-30°С. Температурный оптимум - 25-28°С и рН 6,9-7,2.

На основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена нововыделенный штамм идентифицирован как Phyllobacterium ifriqiyense и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером RCAM 04327 от 21.10.2016 г. (копия справки о депонировании прилагается).

Штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 фиксирует азот атмосферы и продуцирует биологически активные вещества. Потенциальная азотфиксирующая активность культуры 430,2 С₂Н₄ нМоль/мл/час, которая определялась методом ацителен-редукции на газовом хроматографе "Chrom-5" с пламенно-ионизационным детектором. Количественный и качественный состав ауксинов, синтезируемых штаммом Phyllobacterium ifriqiyense 6, представлен в таблице 1.

Оптимальная температура для роста и размножения данного штамма 25-28°С, он стабильно хранится на капустной агаризованной среде при температуре +4°С. Периодичность пересева 1 раз в 6 месяцев.

Состав среды №19:

Капустный отвар 1 л

Кукурузный экстракт - 1,25 мл/л

сусло пивное - 25 мл/л

агар-агар - 20 г/л

рН - 7,0-7,2.

Штамм бактерий Phyllobacterium ifriqiyense 6 формирует активные ассоциации с растениями риса и приживается в ризосфере растений риса и через 25 суток их количество составляет 97 тыс. колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 грамме ризосферной почвы.

Штамм является перспективным для предпосевной обработки семян риса с целью повышения урожайности и качества полученной продукции, а также улучшения посевных качеств семян пшеницы.

В условиях вегетационного опыта 2014 года установлено, что штамм P. ifriqiyense 6 увеличивает длину побега на 34,8% относительно контроля и на 10,8% в варианте с применением референтного штамма A. radiobacter 204; длину корня на 90,6% и 5,2% и воздушно-сухую массу на 61,9% и 54,6% - соответственно (таблица 2).

В полевых опытах (2012-2013 г.) на лугово-каштановой почве Красноперекопского района Республики Крым, в условиях периодического затопления в ООО «Осавиахим» штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 увеличивал численность диазотрофов в ризосфере растений риса (таблица 3). В варианте с перспективным штаммом P. ifriqiyense 6 в фазы кущения, цветения и созревания численность азотфиксаторов увеличивалась на 38,4%, 28,2% и 21,6% относительно контроля по фазам вегетации соответственно.

Анализ биологической урожайности (2012-2015 гг.) показал стабильное повышение продуктивности риса при инокуляции семян перед посевом штаммом ассоциативных бактерий Phyllobacterium ifriqiyense 6. Прибавка урожая в среднем за три года составляла 6,2 т/га к контролю и 3,7 т/га к референтному штамму (таблица 4).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04327. Штамм Phyllobacterium ifriqiyense RCAM 04327 может быть использован в сельском хозяйстве для повышения продуктивности риса. 4 табл.

Штамм ассоциативных бактерий Phyllobacterium ifriqiyense 6, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM 04327, активный азотфиксатор и ростстимулятор для повышения продуктивности риса.