БИОПРЕПАРАТ ПОД БОБОВУЮ КУЛЬТУРУ ЖИДКОЙ ФОРМЫ НА ОСНОВЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C05F11/08 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для получения жидкой формы микробиологических препаратов на основе клубеньковых бактерий, повышающих урожайность бобовых культур.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) для производства бактериального удобрения под лядвинец рогатый» по авторскому свидетельству №1458359 с приоритетом от 27.02.1987 г., МКИ C05F 11/08, опубликовано 15.02.1989 г.

В материалах к этому авторскому свидетельству описана технология получения биопрепарата на основе торфа - Ризоторфина, которая включает в себя приготовление культуральной жидкости на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476, подготовку торфа (измельчение, фасовка, стерилизация) с последующим заражением культуральной жидкостью с ризо-бактериями и подращиванием бактерий в торфе.

Аналогичным способом получают биоудобрение на торфе для небобовых растений, описанное в изобретении «Штамм бактерий Azosphillum lipoferum для производства удобрения под райграс пастбищный и кострец безостый» по патенту №1806123 с приоритетом от 05.03.1991 г., МПК C05F 11/08, C12N 1/20, опубликовано 30.03.1993 г.

Срок годности препаратов на основе торфа составляет до 6 месяцев.

Недостатком данного способа является необходимость поиска и подбора вида торфа (различная кислотность, состав), подходящего для приготовления биопрепарата, так как для этого пригодны далеко не все виды торфа, причем в настоящее время критерии для оценки его пригодности не найдены. К тому же запасы торфа нужного качества в России практически исчерпаны.

Кроме того, одной из проблем производства и практического применения под бобовые культуры препаратов на основе клубеньковых бактерий является их невысокая жизнестойкость при хранении и использовании. Содержащиеся в твердофазном носителе - торфе вещества фенольной природы оказывают неблагоприятное воздействие на клубеньковые бактерии, в результате чего процесс азотофиксации оказывается недостаточно эффективным.

Наиболее технологичной и удобной по сравнению с формой на твердофазных носителях является жидкая форма препарата, представляющая питательную среду, инокулированную бактериями. Из уровня техники известны также биопрепараты для разных целей в жидкой форме.

Так, например, известно изобретение «Способ получения микробиологического препарата для защиты растений от вредных насекомых и клещей», заявка №2004139258 от 29.12.2004 г., МПК A01N 63/00; C12N 1/20, опубликовано 10.06.2006 г. Согласно изобретению препарат представляет жидкую смесь культур из эпифидных микроорганизмов бактерий и грибов, в которую вводят минеральные соли (мочевина, амоний фосфорнокислый двузамещенный), для усиления жизнеспособности при хранении и эффективности действия на целевые объекты вводят гумат натрия и лигносульфонат; для придания стабильности препарату при хранении, повышения срока действия на обрабатываемой поверхности, прилипаемости, растекаемости вводят карбоксиметилцеллюлозу 0,1-1,0%, поверхностно-активное вещество, глицерин 5-10%, гумат натрия.

Самым большим недостатком жидкой формы биопрепаратов является короткий срок хранения, который, как правило, составляет 10-15 суток. После этого титр бактерий в препарате начинает резко снижаться, а следовательно, падает и его эффективность. Между тем, современное сельскохозяйственное производство требует дешевых, эффективных и удобных в применении биопрепаратов, которые сохраняли бы свою эффективность в течение более длительного времени.

Известно также изобретение «Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов», по патенту №2428469, заявка №2010109723 с приоритетом от 15.03.2010 г., МПК C12N 1/20, C02F 3/34, С09К 3/32, В09С 1/10, опубликовано 10.09.2011 г.

Согласно изобретению биопрепарат содержит водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий, нормальные парафины C₁₂-C₁₈, щавелевокислый аммоний, хлористый калий, взятые в определенном соотношении. Причем увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения хлористого калия, который подавляет вредное воздействие на бактерии продуктов их жизнедеятельности.

Известно изобретение «Препарат «ЭКСТРАГРАН» для стимуляции роста и защиты растений от болезней», заявка №2005130793 от 05.10.2005 г., МПК A01N 63/00; C12N 1/20, C12R 1/065, C12R 1/07, опубликовано 10.04.2007 г.

Согласно изобретению биопрепарат представляет жидкую смесь культур из штаммов микроорганизмов рода Bacillus mycoides и Azotobacter vineladii, взятых в определенном соотношении, в которую введены добавки в виде гуматов с микроэлементами при следующем составе, мас.%:

культуральная жидкость со штаммами микроорганизмов 25-30 гуматы 8-12 микроэлементы 0,05-0,08 вода остальное

Недостатком заявленного препарата «ЭКСТРАГРАН» является наличие проблем при хранении и транспортировании и связанная с этим низкая стабильность препарата.

Известно также изобретение «Биопрепарат в виде водной суспензии для повышения почвенного плодородия» по патенту №2390518 с приоритетом от 27.11.2008 г., МПК C05F 11/08, опубликовано 27.05.2010 г. (прототип).

Биопрепарат содержит компоненты при следующем соотношении, мас.%:

культуральная жидкость на основе штамма Azotobacter vineladii 50-60 микроэлементы 0,2-0,3 поваренная соль 1,0-1,5 вода до 100%

Установлено положительное влияние биопрепарата на овощи (помидоры, огурцы), картофель, а также ячмень и пшеницу. Поваренная соль играет роль консерванта, что позволяет увеличить срок хранения препарата до 12 месяцев

Однако описанные выше препараты не годятся для бобовых культур, т.к. используемые в них бактерии не являются клубеньковыми.

Уникальной особенностью клубеньковых бактерий является способность проникать в корни бобовых растений и образовывать на них азотфиксирующие клубеньки, способные снабжать атмосферным азотом растения. Без наличия этих клубеньков атмосферный азот недоступен растениям для питания.

Таким образом, в существующем уровне техники не выявлен биопрепарат (или способ его получения) на основе штаммов клубеньковых бактерий под бобовые культуры жидкой формы с достаточно длительным сроком хранения.

Задачей изобретения является получение жидкой формы биопрепарата на основе штаммов клубеньковых бактерий, повышающего урожайность бобовых культур, с длительным сроком хранения.

Задача решается за счет того, что биопрепарат под бобовую культуру включает смешанные в соотношении от 1:1 до 1:2 культуральную жидкость, содержащую штамм азотфиксирующих клубеньковых бактерий с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл, и водный раствор, содержащий, мас.%:

натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы 2,0-5,0% сорбат калия 0,5-3,0% глицерин 1,0-5,0%

Применение биопрепаратов на основе штаммов азотфиксирующих клубеньковых бактерий с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл, как известно, повышает урожайность бобовых растений (например, Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе. / Методические рекомендации. Ленинград, 1991 г.).

При этом глицерин в препарате служит источником углеводного питания для бактерий и антистрессантом.

Сорбат калия (Potassium Sorbate, E202) - калиевая соль сорбиновой кислоты, является природным консервантом и широко применяется при консервировании пищевых продуктов, т.к. предотвращает образование плесени и протухание. Он применяется при изготовлении многих продуктов для увеличения их срока годности, в т.ч. сорбат калия широко используется для консервирования фруктов и овощей, яичных и кондитерских изделий, мясных и рыбных продуктов, плодово-ягодных соков и безалкогольных напитков. При этом в зависимости от продукта норма содержания сорбата калия изменяется в диапазоне от 0,02% до 0,2%, т.е. максимально допустимая дозировка в пищевых продуктах E202 составляет не более 0,2%. разрешен во всех странах мира. В большинстве стран мира сорбат калия E202 разрешен и широко используется.

Экпериментально было установлено, что при включении сорбата калия в биопрепарат он не только угнетает постороннюю микрофлору, но и не оказывает вредного влияния на клубеньковые бактерии в концентрациях >0,2%.

Известно, что карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) - это простой эфир целлюлозы общей формулы: [C₆H₇O₂(ОН)_3-х(ОСН₂СООН)_х]_n.

Основное свойство карбоксиметилцеллюлозы - это способность к формированию очень вязкого коллоидного раствора, который не утрачивает своих свойств в течение длительного времени. В химической, пищевой и медицинской промышленности наиболее часто используется натриевая соль - натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ).

Na-КМЦ применяется в качестве пластификатора, загустителя, ресорбента. Применяется в производстве клея (например, клея бустилат), для стабилизации глинистых суспензий, используемых при бурении нефтяных и газовых скважин; как добавку к моющим веществам, препятствующую ресорбции загрязнений из моечного раствора на ткани; для шлихтования нитей основы и как загуститель печатных красок; в качестве флотореагентов; для повышения пластичности керамической массы и прочности изделия "сырца".

Na-КМЦ обладает эмульгирующими, загущающими, пенообразующими, стабилизирующими, смягчающими, гелеобразующими, пленкообразующими свойствами. Может служить хорошим заменителем желатина, глицерина, крахмала. Широко используется в косметическом производстве в зубных пастах, кремах и косметических масках, шампунях, кремах для бритья, кондиционерах для волос, препаратах для ванн. Нетоксична.

Применяются также в пищевой промышленности (Е-466) как регулятор и стабилизатор консистенции, загуститель, средство для капсулирования, используется при производстве мороженого, майонезов, творожных изделий, кондитерских изделий (желе, мусс, мармелад, джемы, фруктово-ягодные начинки, крем, паста, выпечка, макаронные изделия), соусов и мясных продуктов, в оболочках для рыбы, мяса, входит в состав средств для капсулирования.

Экпериментально было установлено, что включенная в биопрепарат на основе штаммов клубеньковых бактерий натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ) в указанном выше количестве (2,0-5,0% в составе водного раствора) служит регулятором и стабилизатором консистенции препарата, не оказывая при этом отрицательного влияния на бактерии.

Таким образом, совместное использование в жидком биопрепарате на основе клубеньковых бактерий натрий-карбоксиметилцеллюлозы, сорбата калия и глицерина в указанных соотношениях приводит к увеличению срока хранения препарата до 6 месяцев. Все количественные значения и соотношения для получения наилучшего результата установлены экспериментально.

При этом экспериментально установлено, что наилучший результат для повышения урожайности бобовых культур достигается при использования бактериального препарата, в котором смешаны в соотношении от 1:1 до 1:2 культуральная жидкость с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл азотфиксирующих клубеньковых бактерий и водный раствор, содержащий 2-5% Na-КМЦ, 0,5-3% сорбата калия и 1-5% глицерина.

Причем при получении культуральной жидкости может быть использована любая известная питательная среда для выращивания клубеньковых бактерий, например традиционная бобовая среда следующего состава: горох - 70 г/л, сахароза - 2,5 г/л, глюкоза - 10 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л, KH₂PO₄ - 0,5 г/л, K₂HPO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л, СаСО₃ - 1 г/л, которую сначала инокулируют клубеньковыми бактериями, а затем культивируют в ферментере при определенной температуре (как правило, 27-29°С) в течение определенного времени (обычно 72-96 часов) до достижения заданного титра бактерий (см. указанные выше Методические рекомендации. Хотянович А.В., 1991 г.).

Пример 1.

Для получения биопрепарата жидкой формы использовали штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б из Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM), в ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, где он был депонирован 20.04.1979 г. в группе клубеньковых бактерий под №RCAM2490.

Бактерию Bradyrhizobium japonicum 634б выращивали в качалочной колбе в течение 72 часов при температуре 27°С на традиционной питательной бобовой среде. В конце процесса культивирования титр штамма бактерий 634б в культуральной жидкости составил 9·10⁹ КОЕ/мл. После этого 100 мл полученной культуральной жидкости смешали в соотношении 1:1, т.е. с 100 мл водного раствора, содержащего 5 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (5%), 3 г сорбата калия (3%) и 5 г глицерина (5%). Концентрация бактерий в готовом биопрепарате жидкой формы составила 4,5·10⁹ КОЕ в 1 мл препарата.

Пример 2.

Для получения биопрепарата жидкой формы использовали штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum 640б из Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM), в ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, где он был депонирован 24.06.1981 г. в группе клубеньковых бактерий под №RCAM24100.

Бактерию Bradyrhizobium japonicum 640б выращивали в качалочной колбе в течение 96 часов при температуре 29°С на традиционной питательной бобовой среде. В конце процесса культивирования титр штамма бактерий 640б в культуральной жидкости составил 9,6·10⁹ КОЕ/мл. После этого 100 мл полученной культуральной жидкости смешали в соотношении 1:2, т.е. с 200 мл водного раствора, содержащего 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (2%), 1 г сорбата калия (0,5%) и 2 г глицерина (1%). Концентрация бактерий в готовом биопрепарате жидкой формы составила 3,2·10⁹ КОЕ в 1 мл препарата.

Были проведены опыты по хранению биопрепаратов разной формы, полученных на основе одних и тех же указанных ранее штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б и Bradyrhizobium japonicum 640б. Испытанию были подвергнуты препараты на твердом носителе (торф, инокулированный культуральной жидкостью), в жидкой форме без добавок (культуральная жидкость, разведенная водой в отношении от 1:1 до 1:2) и в жидкой форме с добавками в виде Na-КМЦ, сорбата калия и глицерина в указанных выше соотношениях согласно изобретению, как описано в примерах 1 и 2.

Все биопрепараты, участвующие в опытах, хранились при комнатной температуре (20-22)°С. Через определенные промежутки времени в препаратах измеряли значения титра бактерий.

Результаты измерений приведены в таблице 1.

Таблица 1 Титры бактерий в различных формах препаратов при хранении Биопрепарат Титр бактерий в препарате, КОЕ в 1 мл Основа Форма исходный через 14 дн. через 1 мес. через 3 мес. через 6 мес.               Сухой на торфе 3,7·10⁹ 7,2·10⁹ 6,4·10⁹ 4,2·10⁹ 3,4·10⁹             Штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б Традиционная жидкая форма без добавок           4,5·10⁹ 3,4·10⁹ 1,2·10⁹ 0,003·10⁹ 0*             Жидкая форма с добавками по изобретению           4,5·10⁹ 4,2·10⁹ 3,8·10⁹ 2,9·10⁹ 2,8·10⁹                         Сухой на торфе 2,7·10⁹ 6,2·10⁹ 5,8·10⁹ 5,2·10⁹ 3,8·10⁹             Штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum 640б Традиционная жидкая форма без добавок           3,2·10⁹ 2,4·10⁹ 1,6·10⁹ 0,045·10⁹ 0*             Жидкая форма с добавками по изобретению           3,2·10⁹ 3,2·10⁹ 3,1·10⁹ 2,9·10⁹ 2,6·10⁹          

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что значения титров микроорганизмов в жидкой форме биопрепаратов с добавками согласно изобретению (Na-КМЦ, сорбат калия и глицерин, в указанных выше соотношениях) даже через 6 месяцев находятся на одном уровне с титрами этих бактерий в сухой торфяной форме, что говорит о высокой эффективности препаратов заявляемой жидкой формы с добавками.

Таким образом, введение в состав биопрепарата на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий и водного раствора с добавками в виде Na-КМЦ, сорбата калия и глицерина в указанных выше соотношениях позволяет повысить срок сохранности в этом препарате клубеньковых бактерий и, соответственно, увеличить срок хранения жидкой формы препарата до 6 месяцев.

Для оценки эффективности заявляемого состава биопрепарата на основе клубеньковых бактерий после длительного срока его хранения (5 месяцев) были проведены вегетационные опыты на растениях сои сорта «Дива».

Препараты были получены на основе указанных ранее штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б и Bradyrhizobium japonicum 640б, выращенных на традиционной питательной среде (бобовый отвар с солями). Испытанию были подвергнуты препараты:

- в жидкой форме без добавок (культуральная жидкость, разведенная водой), причем с момента получения препарата до момента его применения прошел 1 день, т.е. свежий биопрепарат;

- в жидкой форме с добавками согласно изобретению, как описано выше в примерах 1 и 2, причем препарат использовали после 5 месяцев его хранения при температуре (20-22)°С.

Титры бактерий во всех вариантах опыта составляли значения в пределах (1,5-2)·10⁹ КОЕ/мл препарата.

Во всех вариантах опыта сначала семена сои замачивали на 5-10 секунд в биопрепарате (инокулировали), в контроле - инокуляцию семян сои осуществляли стерильной водой. Затем производили высев семян в вегетационные сосуды с дерново-подзолистой почвой (рН=6,2-6,8; N_общ=0,26%; Р₂O₅=150 мг/кг; С=4,7%; гумус - 1,8%). Масса почвы в каждом сосуде - 5 кг, в каждый сосуд помещали по 5 инокулированных семян сои. Повторность 6-кратная.

Постановка опытов, учет и оценка полученных результатов проводилась согласно стандартным методикам.

Одну часть сои выращивали до фазы бутонизации, после чего растения извлекали из почвы с корнями и измеряли их биометрические параметры. Результаты измерений приведены в таблице 2.

Другую часть сои выращивали до фазы спелости в конце вегетационного периода, после чего собирали поспевшие бобы сои, а растения также извлекали из почвы с корнями и измеряли их биометрические параметры.

Результаты измерений приведены в таблице 3.

Таблица 2 Биометрические параметры растений сои в фазе бутонизации   Средняя масса корня, г Средняя высота растения, см Средняя масса растения, г Прибавка массы растения, % Количество клубеньков Вариант опыта (инокуляция семян препаратом)   Контроль(вода) 3,3 21,2 3,8 - -   Традиционная жидкая форма без добавок (1 день хранения)           4,2 32,4 7,1 85,75 32 Препарат на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б           Жидкая форма с добавками по изобретению (5 мес. хранения)           4,7 40,3 8,9 132,2 37               Традиционная жидкая форма без добавок (1 день хранения)           Препарат на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 640б 4,9 38,4 9,4 136,8 39           Жидкая форма с добавками по изобретению (5 мес. хранения)           3,4 39,7 8,4 121,1 43            

Таблица 3 Биометрические параметры растений сои в фазе спелости в конце вегетации Вариант опыта (инокуляция семян препаратом) Средняя масса корня, г Средняя высота растения, см Средняя масса растения, г Прибавка массы растения, % Средняя масса бобов на растении, г Контроль(вода) 3,9 24,3 8,3 - 5,2   Традиционная жидкая форма без добавок (1 день хранения)           8,1 39,8 19,9 139,9 6,45 Препарат на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б           Жидкая форма с добавками по изобретению (5 мес. хранения)             8,7 40,3 22,1 166,3 6,6             Традиционная жидкая форма без добавок (1 день хранения)           5,0 38,4 19,9 140,0 6,9 Препарат на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 640б           Жидкая форма с добавками по изобретению (5 мес. хранения)             7,3 39,7 21,2 155,7 7,1          

Из данных, приведенных в таблице 2 и 3, видно, что биопрепараты жидкой формы на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 634б и Bradyrhizobium japonicum 640б, включающие в свой состав согласно изобретению водный раствор с добавками Na-КМЦ, сорбата калия и глицерина в указанных выше соотношениях, даже после 5 месяцев хранения обладают такой же эффективностью в отношении биометрических параметров растений сои, как и свежие препараты без названных добавок, полученные по традиционной технологии, а по количеству образуемых на корнях клубеньков, влияющих на питание растений атмосферным азотом, а также по средней массе снятых с одного растения бобов, характеризующей урожайность сои, - превосходят их.

Таким образом, на примере двух азотфиксирующих клубеньковых бактерий опытным путем подтверждено, что биопрепараты жидкой формы на основе штаммов клубеньковых бактерий заявляемого состава, повышающие урожайность бобовых культур, являются препаратами, сохраняющими свою эффективность в течение длительного срока хранения - 6 месяцев.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения жидкой формы микробиологических препаратов для бобовых культур на основе клубеньковых бактерий. Биопрепарат содержит смешанные в соотношении от 1:1 до 1:2 культуральную жидкость, содержащую штамм азотфиксирующих клубеньковых бактерий с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл, и водный раствор, содержащий (мас.%): натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (2,0-5,0), сорбат калия (0,5-3,0) и глицерин (1,0-5,0). Изобретение позволяет повысить урожайность бобовых культур и повысить срок хранения получаемого препарата. 3 табл., 2 пр.

Биопрепарат под бобовую культуру жидкой формы на основе клубеньковых бактерий, состоящий из смешанных в соотношении от 1:1 до 1:2 культуральной жидкости, содержащей штамм азотфиксирующих клубеньковых бактерий с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл, и водного раствора, содержащего, мас.%:
натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы 2,0-5,0% сорбат калия 0,5-3,0% глицерин 1,0-5,0%