Штамм клубеньковых бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp. (АSтRаGаLUS) для производства бактериального удобрения под астрагал Советский патент 1991 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур, а именно астрагала.

Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobiurn sp. для производства бактериального удобрения под астрагал.

Штамм Kradyrhizobiunr sp. (Astragalus) выделен из клубеньков астрагала болотного дикой популяции.

Идентифицирован по определителю бактерий Берги.

Штамм Bradyrhizobium sp. (Astragalus) депонирован и хранится в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 0206.

Культурно-морфологические признаки .

Штамм 0206 растет на питательных средах следующего состава:

1.Гороховый агар, г/л: горох 100,0, сахароза 20,0; агар 2; рН среды 6,8-7,0.

2.Манчитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; KiHPO4 0,5; MgS04 x

х 7HZ0 0,2; NaCt 0,1; дрожжевой экстракт 0, iJ агар 15,0; рН среды 6,8-7,0.

3.Малгитно-дрожжевой агар с бром- тимол синчм, г/л: маннит 0,5; MgS04 x 7H20 0,2; NaCl 0,1, дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0, бромтимол синий 5 мл 0,5%-ногс спиртового раствора, рН средь: 6,8-7,0.

Бактерии штакма 0206 имеют форму коротких толстых пягючек, п/о 72 ч попчижны, конотрихи, грамотрицательс&

Р со

ее

СО

316

ные. Величина клеток 5-тисуточной культуры на маниитно-дрожжевом агаре 1,8-2,4x10,0-1,1 мкм. Бактероиды имеют ветвистую форму. Медленно растуща культура.

При культивировании штамма на гороховом агаре при 26-28 С рост обильный, колонии появляются на 7-е сутки, беловатые, слизистые, стекающие, круглые, вьщуклые, размером 5-6 мм.

На маннитно-дрожжевом агаре штрих обильный, бесцветный, слизистый, сильно стекающий, плоский. Колонии появляются на 7-е сутки, однотипные, беловатые, круглые, выпуклые, растекающиеся , 5-6 мм,

На маннитно-дрожжевом агаре с бромтимол синим признаки штамма 0206 аналогичны росту на маннитно-дрожжевом агаре, но культура окрашивается в желтоватый цвет, а среда - в зеленватый. Параметры температуры и рН5 как на гороховом агаре,

Фиэиолого-биохимические признаки,

Молоко с лакмусом не пептонизи- рует, на 3-е сутки интенсивно подщелачивает с образованием слизистой зоны (через 15 суток - 7 мм) на поверхности. Желатину не разжижает. Аэроб, оптимум температуры 26-28 С. Рост при 10-40°С, РН - 5,0-7,5. 1 Отношение к углеводам. i Растет на многих углеводах с под- кислением среды. Активно усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, маннит, сорбит, слабее - рамно- зу, мальтозу, лактозу, декстрин. Клетчатку и крахмал не усваивает.

Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином, на мясо-пептонном агаре не растет.

Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен.

Штамм 0206 хранится на гороховом агаре при 4° С, рН 6,8-7,0 и пересевается один раз в 6 месяцев.

Оценку симбиотических свойств штамма 0206 - вирулентности, азот- фиксирующей активности и эффективности симбиоза - проводят в условиях Кикровегетационного и вегетационного опытов.

I Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции астрагала

0

5

0

5

0

5

0

5

клубеньковыми бактериями. Аэотфикси- рующую активность штаммов определяют по величине активности нитрогеназы - ключевого фермента в процессе связывания молекулярного азота. В свою очередь, нитрогеназную активность измеряют ацетиленовым методом (по ре-1- дукции ацетилена) на интактных растениях. Эффективность симбиотической азотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями ча сосуд, а также по величине урожая зеленой массы астрагала и содержанию в ней азота, который определяют с помощью системы Кьельтек-ауто Те- катор.

Пример 1. Оценки симбиотических свойств штамма 0206.

Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 5 г стерильного вермукулита добавляют 11 мл среды Красильникова-Кореняко, стерили- зируют в автоклаве. Семена астрагала серпоплодного, видообразца из ВИРа скарифицируют, затем стерилизуют сулемой в течение 1 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через 3-е суток проростки в асептических условиях раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка) . Опыты ставят в 10-кратной пов- торности. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 5 суток при 28°С и суспендируют в растворе микроэлементов по прописи Федорова). Через двое суток после посева семян в каждую пробирку вносят 1 мл инокулята, имеющего концентрацию 10 клеток. Растения выращивают в фитотроне при 22-24°С. Через 63 дня пробирки герметично закрывают и вводят шприцем ацетилен до концентрации 10% по объему. Коли

результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через 24 ч на газовом хроматографа. Величину нитрогеназ- ной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штаммов, выражают в микромолях CgH. за 24 ч на сосуд. Результаты представлены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что бактерии предлагаемого штамма 0206

вирулентны на астрагале, они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки, бактерии штамма 282 - не вирулентны.

Штамм 0206 является активным азо фиксирующим симбионтом астрагала, нитрогеназная активность клубеньков образованных бактериями этого штамм на растении - хозяине, на 3 порядка выше, чем контрольных растений и ратений, инокулированных штаммом 282.

Результаты микровегетационного опыта по определению общего накопле

ния азота растениями астрагала, бакте ризованными вышеупомянутыми штаммами, представлены в табл. 2.

Как показывают данные табл. 2, в результате активной симбиотической фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 0206 общее накопление азота растениями, бактеризованными этим штаммом, было вдвое больше, чем при использовании штамма 282. При этом урожай зеленой массы растений, инокулированных предлагаемым штаммом 0206, повысился на 40%, а содержание в нем азота - на 0,92%.

В варианте, где применялся штамм 282. клубеньки на растениях отсутствовали, следовательно, симбиотически связанного азота из воздуха в растения не поступало, в результате продуктивность астрагала не повышалась.

Резз/льтаты исследований видо ;пеци- фичности клубеньковых бактерий по отношению к астрагалу приведены в табл. 3.

Как показывает табл. 3, ни один из испытанных штаммов, кроме штамма 0206, яе показал положительных результатов на астрагале, в том числе и штамм из группы Bradyrhizobium sp. - Bradyrh. sp. (Lotus) 476. Клубеньковые бактерии клевера штамма 348а образуют на астрагале неактивные клубеньки и симбкотическая азотфиксация в данном случае не наблюдалась.

Лишь на варианте с инокуляцией аст рагала бактериями штамма- Bradyrhizo- biura sp. (Astragalus) 0206 образовались активные к. беньки, где отмечена высокая азотфиксирующая активность в результате чего увеличивался урожай зеленой массы растений и повышалось содержание в ней бочка.

Приведенные материалы свидетельствуют о высокой избирательности аст

0

0

5

0

5

40

45

50

рагала кмикрогимбиоптам и лают основание сделать вывод о том, то активную симбиотическую азотфиксацию у астрагала можно получить лишь при инокуляции специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшие опыты штамм 282 не включен .

Пример 2. Использование штамма 0206 для получения препарата бактериального удобрения.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или пятилитровых бутылях в течение 3-х суток на среде следующего состава (мас.%): гороховый отвар - 10,0; сахар (пищевой) - 1,0; (Ш4)г504 0,5; - 0,05; КгНР04 ЗН20 - 0,05; MgS04 - - 0,02; СаСО - 0,1; вода водопроводная - до 100,0, рН после стерилизации (1,0 ати, 30 мин) - 6,8-7,0, Титр клеток 4-5 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-литровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава (мас. кукурузный экстракт - 1,0, меласса - 2,0, {NE)SO 1,0, КН2Р04 - 0,025, - 0,025, .0 0,02, СаС03- 0,1, года водопроводная - до 100,0, рН после стерилизации 6,8-7,0.

Буты.л и ферментеры засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%, Рутылч встряхивают на кэчалке в течение 6-72 ч. В ферментерах бактерии внрашнвают 36-48 ч при аэрации 0,7-1 5 об/мин под избыточным давлеи ем 0,3-0,5 ат и при 28-30°С. Титр 4-5 млрд/мл. После микробиопогического хо:-:трсля культу- ральную жидкость из оут1ит°й или фер- ментаторов - инокулюм - используют для смешивания с. торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный )Орф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилиз, 1 амма-облучением при дозе J,5 Мрзд, Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральнля жидкость + меласса (6%) из расчета исходного ;итрл бактерий в торфе 0,3-0,5 МЛРД/Г торфа и влажности 45-60%. пакеты загружают в специальные смесители, при врате ии которых перемешивается их содержимое. Культуру р торфе подращивают, вьщерживая пакеты 3-5 суток при 15-20°С. Ризоторфин хранят при 3-8 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта. Ризоторфин для астрагала на предлагаемом штамме представляет по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд. клубеньковых бактерий иа 1 часть торфа. Срок годности препрата - 6 месяцев со дня изготовления Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Пример 3. Применение бактериального удобрения под астрагал.

Вегетационный опыт проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой п|очвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но без азота. Повтор- Ность опыта 4-кратная. Используют семена астрагала серпоплодного.

Для инокуляции семян чистую куль- Туру бактерий выращивают на скогаен- Цом картофельном агаре. Культуру в Пробирках с титром 4-5 млрд. смывают Йодопроводной водой, затем суспензию Заносят на семена астрагала, разло- зйенные в лунки, сделанные в почве Каждого сосуда. В сосуд вносят Ю8 клеток.

Данные по влиянию инокуляции астрагала штаммом 0206 на его продуктивность представлены в табл. 4.

Из табл. 4 следует, что штамм 020 Является активным азотфиксирующим си

5

0

5

0

5

бионтом астрагала и благодаря этому свойству способен повышать урожай зеленой массы растения-хозяина на 82,4% и увеличивать содержание белка в растениях на 12,9%.

Пример 4. Полевой опыт. Штамм 0206 применяют в виде торфяного, препарата. Почва дерновоподзолис- тая, площадь делянки 5 м2, повторность 4-кратная, используют семена астрагала болотного дикого видообразца.

Способ внесения препарата: 200 г ризоторфина разводят в 1,0л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Результаты опыта приведены в табл. 5.

Прибавка урожая зеленой массы растений от инокуляции штаммом 0206 составляет1 10,8 ц/га (43,0%), содержание, белка в растениях увеличивается на 3,9%, как показывает табл. 1.

Таким образом, штамм 0206 существенно увеличивает азотфиксирующую активность астрагала, повышает его продуктивность, что указывает на то, что штамм 0206 является активным азот- сЬиксирующим симбионтом астрагала. Формула изобретения

Штамм клубеньковых бактерий Вга- dyrhizobium sp. (Astragalus) ВНИИСХМ- 0206 для производства бактериального удобрения под астрагал.

Таблица 1

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур (астрагала) . Цель изобретения - получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под астрагал. Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Astragalus) выделен из клубеньков астрагала болотного, депонирован во ВНИИСХМ иод № 0206. Штамм позволяет увеличить урожай зеленой млссы астра ала на 10,8 ц/га

Вирулентность и азотфиксирующая активность вггамма Bradyrhizobium sp. (Astragalus) 0206 и известного штамма 282

окуля

0206

282

нет

7

Средние, цилиндрические, розоватые, 2-3 мм, по всей корневой системе

X - статистическсП обработка;

Р - 4,0%, НСРрд- 0,54 мхмоль/оосуд.

0,002

6,650 0,003

Таблица

Эффективность симбиотичёской аэотфиксации штамма Bradyrhizobium sp. (Astragalus) 0206 и известного штамма 282

- статистическая обработка; Р - 4,6%, HCP0i5 - 2,3 нг/сосуд.

Специфичность взаимодействия астрагала с клубеньковыми бактериями

разных видов

Bradyrhizobium sp.

(Astragalus)

Bradyrhizobium sp.

(Lotus)

R. meliloti

R. meliloti

R. leauminosarum

bv. frifolii

Rhizobium sp. Uialega;

римечания. среднее количество клубеньков на одно растение,

штук; мкмоль С2Н4/сосуд/2& ч; статистиче-- кая обработка: р - 4,6%, 2,3 мг/сосуд.

Таблица 4 Эффективность симбиоза штамма 0206 с астрагалом

Таблица 3

7 нет

нет нет

14 нет

0,003

6,650 0,003

0,003 0,003

0,003 0,003

15,6 - -11,5

21,4 6,3 40,417,2

16,0 0,4 2,612,0

15,5-,0,t 0,610,5

15,3-0,3 -1,912,1

Таблиц 5

Эффективность штамма клубеньковых бактерий астрагала 0206

а полевом опыте

t - 4,OX, 5,1 ц/ra.j ,,

1699990