Штамм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum - активный симбиотический азотфиксатор для гороха, чины, чечевицы, рекомендованный как основа микробного препарата Российский патент 2022 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, растениеводству и предназначено как основа микробного удобрительного препарата для симбиотрофного питания азотом воздуха и повышения продуктивности гороха, чины, чечевицы.

Зернобобовые культуры - важнейший источник растительного белка для кормления животных и питания людей. Они дают высокобелковые корма, необходимые для всех жизненных процессов у животных и формирования их высокой продуктивности. В структуре растительных белковых ресурсов однолетние зернобобовые культуры занимают важнейшее место. Распространенными из группы зернобобовых являются горох, чечевица, чина и др. Кроме белка, семена зернобобовых содержат до 50% углеводов, значительное количество масла, витамины группы А, В, С и минеральные вещества (кальций, фосфор, магний, сера, железо и др.).

Горох, чина, чечевица обладают уникальной способностью вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями вида Rhizobium leguminosarum и могут усвоить из воздуха до 70 кг/га азота воздуха ежегодно, на 50-60% удовлетворить свои потребности в этом элементе и оставить в почве с пожнивными остатками до 10-20% симбиотического азота для последующих культур (Бабич А.О., Петриченко В.Ф., Адамень Ф.Ф. Проблема фотосинтеза и биологической фиксации азота бобовыми культурами // Вестник сельскохозяйственной науки. - 1996. - №2 (514). - С. 34-39; Кокорина А.Л., Кожемяков А.П. Бобово-ризобиальный симбиоз и применение микробиологических препаратов комплексного действия - важный резерв повышения продуктивности пахотных земель. - С.-Петербург: С.-Пб. ГАУ, 2010. - 50 с). Это позволяет экономить до 20% азотных удобрений. Предпосевную обработку семян микробными препаратами на основе высокоэффективных штаммов ризобий применяют для эффективного процесса биологической азотфиксации и повышения продуктивности гороха, чины, чечевицы (Завалин А.А. Биопрепараты, удобрения и урожайность. -М.: Изд-во ВНИИА, 2005. - 302 с; Тихонович И.А., Борисов А.Ю. и др. Специфика микробиологических препаратов для бобовых культур и особенности их производства // Бобовые и злаки. - 2012. - №3. - С. 11-17; Турина Е.Л., Дидович С.В. и Кулинич Р.А. Применение полифункциональных биопрепаратов при выращивании бобовых культур // Сельское хозяйство. - 2015. - №2. - С. 31-33). В России среди применяемых микробных препаратов на основе клубеньковых бактерий, специфичных гороху, чине, чечевице, известны такие как: Нитрагин (ФГБНУ «ВНИИСХМ», Санкт-Петербург), РизоБаш (НВП БашИнком, Уфа), Ризоторфин-Б (ООО «Биофабрика», Кузнецк), Азофикс-Ж (Группа компаний «Биона», Белгород) и другие. Известно, что вирулентность и активность клубеньковых бактерий могут зависеть от особенностей штамма, вида и сортовой специфичности растений, почвенно-климатических условий и ряда других факторов (Сытников Д.М. Биотехнология микроорганизмов азотфиксаторов и перспективы применения препаратов на их основе // Биотехнология. - 2012. -Т. 5, №4. - С. 34-45), в связи с чем необходимо оценивать эффективность биоагентов микробных препаратов на определенных сортах бобовых культур. В доступной нам литературе отсутствуют сведения об эффективности применения данных препаратов в условиях Крыма.

Клубеньковые бактерии обладают строгой хозяйской специфичностью и способны вступать в симбиоз со строго определенным спектром сортов и видов бобовых растений, например бактерии Rhizobium leguminosarum (biovar viceae) являются симбионтами гороха, чины, вики, чечевицы (Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. - СПб.: Наука, 1998. - 194 с; Тихонович И.А., Борисов А.Ю. и др. Специфика микробиологических препаратов для бобовых культур и особенности их производства // Бобовые и злаки. - 2012. - №3. - С. 11-17).

В Институте сельского хозяйства Крыма микробные препараты на основе штаммов клубеньковых бактерий производятся уже более 30-ти лет. Институт является оригинатором Крымской коллекции микроорганизмов (ККМ, http://www.ckp-rf.ru/usu/507484/), в которой есть несколько десятков штаммов ризобий гороха, адаптированных к почвенно-климатическим условиям южной зоны России. Более 30 лет использовался высокоэффективный и конкурентоспособный штамм Rhizobium leguminosarum П как основа микробного препарата под горох (А.с.SU 1789523 А1; МПК C05F 11/08, C12N 1/20; опубл. 23.01.1993, бюл. №3). Однако данный штамм потерял вирулентность - способность в симбиозе с растениями гороха образовывать корневые азотфиксирующие клубеньки, в которых происходит процесс азотфиксации и симбиотрофное питание азотом воздуха растений.

В основу изобретения поставлена задача выявления вирулентного эффективного штамма клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum, обладающего азотфиксирующими свойствами, который в перспективе позволит расширить ассортимент биологических средств для оптимизации азотного питания растений.

Поставленная задача решена путем получения эффективного и технологичного штамма Rhizobium leguminosarum К-29, активного симбиотического азотфиксатора, который может быть использован как основа микробного препарата для предпосевной обработки семян гороха, чины, чечевицы.

Эффективный штамм Rhizobium leguminosarum К-29 получен методом аналитической селекции (Методы исследований клубеньковых бактерий // Методические рекомендации для курсов повышения квалификации научных сотрудников по сельскохозяйственной микробиологии. - Л., 1981. - 48 с.) из клубеньков чечевицы сорта Луганчанка в селекционных посевах Луганского ДСГДС.

Первичная идентификация проведена, основываясь на морфологических, культуральных и биохимических свойствах штамма по определителю Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х томах, 1997).

Культурально-морфологические особенности штамма: клетки штамма 3-суточной культуры имеют палочковидную форму размером 2,2-2,5×0,7-0,9 мкм, подвижные, перитрихи. Штамм граммотрицательный, аэроб. На гороховой агаризованной питательной среде на третьи сутки образует колонии до 3-5 мм в диаметре, сначало прозрачные, потом полупрозрачные, с гладким краем.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Штамм усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, ксилол, рамнозу, мальтозу, манит, сорбит, дульцит. Как источник азота использует аммонийный, нитратный, амидный азот. На питательной среде с органическим азотом (МПА) штамм не растет. Молоко с лакмусом подкисляет, вызывает осаждение казеина и формирование прозрачной зоны (1,0-1,5 см) в верхней части среды. Желатин не разжижает, не имеет протеолитического фермента желатиназы, не гидролизует крохмал, казеин, агар, не имеет амилазной и оксидазной активности, характеризуется способностью к денитрификации (восстанавливает нитраты до молекулярного азота), уреазной и каталазной активностью. Штамм имеет активную нитратредуктазу и восстанавливает нитраты. Флюоресцирующие и феназиновые пигменты не образует.

Температурный интервал роста штамма на плотных и жидких питательных средах составляет 18-37°С, а температурный оптимум - 25-28°С, штамм отнесен к мезофилам. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 4,5-8,5; оптимальной для развития клетки штамма является близкая к нейтральной реакция среды рН 6,5-7,5; штамм отнесен к нейтрофилам.

Признаки штамма устойчивые. Культуру хранят на маннитно-дрожжевом агаре или на бобовом агаре с сахарозой при температуре 4-5°С, пересевая один раз в 7 месяцев. Вместо сахарозы можно использовать смесь маннита и глюкозы.

Генетическая идентификация проведена методом ПЦР анализа в ФГБНУ ВНИИСХМ г. Санкт-Петербург. Для установления таксономической принадлежности штамма был амплифицирован фрагмент гена 16S РНК. На основании проведенного анализа штамм идентифицирован как Rhizobium leguminosarum и депонирован 17.10.2019 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05217.

Технологичные свойства штамма.

Штамм технологичен, растет в жидких питательных средах, рекомендуемых для культивирования быстрорастущих клубеньковых бактерий (Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий и способы получения препаратов на их основе. Методические рекомендации. - Л., 1991. - 60 с.) и в стерильном вермикулитном субстрате (таблица 1). В среде №1 (состав: гороховый отвар - 100 г/л, сахар пищевой - 20 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л, KH₂PO₄ - 0,5 г/л, K₂HPO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄ - 0,2 г/л, СаСО₃ - 1 г/л) получают посевной материал, который используется для инокуляции среды №2 (состав: кукурузный экстракт - 10 г/л, меласса - 20,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,5 г/л, K₂HPO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄ - 0,2 г/л, СаСО₃ - 0,5 г/л) в количестве 5% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют при 28°С в течение 3 суток. Полученный жидкий препарат используют для обработки семян гороха, чины, чечевицы или инокуляции вермикулитного субстрата при приготовлении сыпучего микробного препарата.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Симбиотическую эффективность штамма Rhizobium leguminosarum К-29 определяли в вегетационных опытах на черноземе южном на различных сортах гороха (Pisum sativum L)., чины (Lathyrus L.), чечевицы (Lens Mill.). В качестве прототипа использовали стандартный штамм Rhizobium leguminosarum 261б из коллекции Института микробиологии и вирусологии НАН Украины, который имеется в Крымской коллекции микроорганизмов НИИСХ Крыма.

Пример 1. Симбиотическая эффективность штаммов Rhizobium leguminosarum на горохе сортов Аксакайский усатый, Альянс, Софья, Спартак (вегетационный опыт на черноземе южном)

В вегетационном опыте на черноземе южном в варианте с поверхностно обработанными семенами штаммом Rhizobium leguminosarum 261б сортов гороха наблюдали образование азотфиксирующих клубеньков на сортах Аксакайский усатый, Альянс, Софья, Спартак в количестве от 4,3 до 12,7 ед/растение (фиг. 1). Бактеризация штаммом Rhizobium leguminosarum К-29 обеспечила формирование клубеньков на уровне обработки референтным штаммом и составила от 4,0 до 7,7 единиц на растение, кроме варианта с сортом Альянс, где уступала в 1,6 раза по данному показателю.

Установлено, что на трех сортах гороха: Альянс, Софья, Спартак фитомасса растений варианта с инокуляцией Rhizobium leguminosarum К-29 была на уровне обработки штаммом Rhizobium leguminosarum 261б, а по сорту Аксакайский усатый превышала на 1,7 г/растение (45%, в 1,8 раза) (фиг. 2).

Пример 2. Симбиотическая эффективность штамма Rhizobium leguminosarum К-29 на горохе сортов Донец, Батрак, Фокор, Атаман, Старт, Лавр.

В вегетационном опыте на черноземе южном во всех вариантах с поверхностно обработанными семенами штаммами Rhizobium leguminosarum сортов гороха Донец, Батрак, Фокор, Атаман, Старт, Лавр сформировались азотфиксирующие корневые клубеньки в количестве 6,2-9,8 единиц/растение. На пяти сортах гороха фитомасса растений варианта с обработкой Rhizobium leguminosarum К-29 была на уровне варианта с референтным штаммом Rhizobium leguminosarum 261б, а на сорте Старт существенно превышала данный показатель на 0,4 г/растение (25%, в 1,3 раза) (фиг. 3).

Пример 3. Симбиотическая эффективность штамма Rhizobium leguminosarum К-29 на горохе сортов Сотник, Премьер, Аргон, Визир, Родник, Девиз.

В вегетационном опыте на черноземе южном во всех вариантах с обработкой семян штаммами Rhizobium leguminosarum сортов гороха Сотник, Премьер, Аргон, Визир, Родник, Девиз наблюдали образование азотфиксирующих корневых клубеньков в количестве 5,8-11,4 единиц/растение. В варианте с Rhizobium leguminosarum К-29 фитомасса четырех сортов гороха была на уровне фитомассы растений, бактеризованных референтным штаммом Rhizobium leguminosarum 261б, а на сортах Сотник и Визир существенно превышала данный показатель соответственно на 0,2 г/растение (18%, в 1,2 раза) и 0,3 г/растение (20%, в 1,3 раза) (фиг. 4).

Пример 4. Симбиотическая эффективность штаммов Rhizobium leguminosarum на чине сорта Жемчужная.

В вегетационном опыте на черноземе южном в вариантах с поверхностно обработанными семенами чины штаммами Rhizobium leguminosarum наблюдали образование азотфиксирующих корневых клубеньков в количестве 11,0-16,2 единиц/растение. Установлено, что эффективность бактеризации референтным штаммом Rhizobium leguminosarum 261б и заявляемым штаммом Rhizobium leguminosarum К-29 существенно не различалась по показателям высоты и фитомассы растений, которые были соответственно на уровне 36,3-37,2 см и 2,23-2,33 г/растение (фиг. 5).

Пример 5. Симбиотическая эффективность штаммов Rhizobium leguminosarum на чечевице сорта Линза.

В вегетационном опыте на черноземе южном в вариантах с поверхностно обработанными семенами чечевицы (Lens Mill.) штаммами Rhizobium leguminosarum сформировались азотфиксирующие клубеньки на корнях растений в количестве 16,2,0-20,2 единиц/растение. Установлено, что эффективность бактеризации референтным штаммом Rhizobium leguminosarum 261б и перспективным штаммом Rhizobium leguminosarum К-29 существенно не различалась по показателям высоты и фитомассы растений, которые были соответственно на уровне 23,7-25,2 см и 2,10-2,23 г/растение (фиг. 6).

Таким образом, проведенные исследования подтверждают способность штамма Rhizobium leguminosarum К-29 образовывать азотфиксирующие клубеньки на корнях растений гороха, чины, чечевицы. Кроме того, на примерах показано, что результаты бактеризации семян штаммом Rhizobium leguminosarum К-29 по показателю фитомассы растений находятся на одном уровне либо превышают результаты бактеризации стандартным штаммом, что свидетельствует о высокой эффективности заявляемого штамма. Согласно технологичным свойствам данного штамма его можно использовать в качестве основы жидкого и сыпучего микробного препарата для симбиотрофного питания растений азотом воздуха и повышения продуктивности гороха, чины, чечевицы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается штамм Rhizobium leguminosarum К-29, полученный методом аналитической селекции из клубеньков чечевицы сорта Луганчанка в селекционных посевах Луганского ДСГДС и депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05217. Штамм является активным симбиотическим азотфиксатором и может быть использован как основа микробного препарата для предпосевной обработки семян гороха, чины, чечевицы. 6 ил., 1 табл., 5 пр.

Штамм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum К-29, активный симбиотический азотфиксатор, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05217.