ЭНАНТИОМЕР ЗАМЕЩЕННОЙ ФЕНИЛПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ЕГО КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК C07D209/82 A61K31/403 A61P3/04 A61P3/06 A61P3/10 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет Китайской заявки на патент No. 201610856914.7, поданной 27 сентября 2016 года, и озаглавленной ʺ(-)-2-[(2-(4-FLUOROBENZOYL)PHENYL)AMINO]-3-[(4-(2-CARBAZOLE-ETHOXY)PHENYL)]ПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА, MANUFACTURING METHOD, COMPOSITION AND APPLICATION OF SAMEʺ, и раскрытия которых включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии, конкретно к (-)-энантиомеру 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты и ее фармацевтически приемлемой соли, способу его получения, композиции, включающей его, и его применению.

Уровень техники

PPARγ является членом суперсемейства ядерных рецепторов, который в основном экспрессируется в жировой ткани. PPARα, другой член этого семейства, экспрессируется главным образом в тканях печени и может активироваться классом лигандов, называемых фибратами, и снижать уровни триглицеридов и холестерина. PPARα может стимулировать пролиферацию пероксидазы и ускоряет окисление жирных кислот, тем самым снижая содержание жирных кислот в крови (Keller and Wahli: Trends Endocrin Metab 1993, 4:291-296). Недавно стало известно, что PPARδ действует как регулятор липидного обмена с существенными эффектами «сжигания жира». В экспериментах in vitro активация PPARδ в клетках жировой и скелетной мышц способствует окислению и утилизации жирных кислот. В жировой ткани животных с низкой экспрессией PPARα активация PPARδ может специфически индуцировать экспрессию генов, участвующих в окислении жирных кислот и расходе энергии, тем самым улучшая содержание липидов и снижая вес. Что особенно важно, эти животные с активированным PPARδ были полностью устойчивы к рациону с высоким содержанием жиров, а также генетическим факторам (Lepr (db/db))-индуцированному ожирению. Краткосрочное лечение Lepr (db/db) мышей активатором PPARδ может разрушать накопленный жир, тогда как лечение мышей с дефицитом PPARδ диетой с высоким содержанием жира может вызвать ожирение (Wang YX et al., Cell 2003 Apr, 18; 113 (2): 159-70).

PPARα, PPARγ и PPARδ могут образовывать гетеродимеры с X-рецептором ретиноевой кислоты. Следовательно, гетеродимеры RXR/PPAR также играют важную роль в регулировании баланса клеточной дифференцировки сахара и липидов и адипоцитов. Сообщалось, что некоторые новые соединения, включая активаторы PPARγ и двойные активаторы PPARα/PPARγ, имеют хороший эффект в профилактике и лечении метаболического синдрома у людей и животных (WO 00/08002, WO01/57001 A1, US6054453, EP088317 B1, WO97/25042, WO02/26729 A2 и US6353018 B1). Поэтому скрининг на новые соединения со свойствами активатора PPARα, PPARγ и PPARδ имеет большое значение для комплексного лечения нарушений обмена веществ. Эти метаболические нарушения включают метаболические синдромы, такие как диабет, гипертензия, ожирение, инсулинорезистентность, гипертриглицеридемия, гипергликемия, повышенный уровень холестерина в крови, артериосклероз, ишемическая болезнь сердца и другие сердечно-сосудистые заболевания.

Заявитель раскрывает класс аралкиламинокислотных активаторов PPARα,γ и δ в Китайском патенте CN1257893C, которые обладают превосходной гипогликемической и гиполипидемической активностью, где в примере 15 конкретно раскрыта 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота и способ ее получения и примеры 21-28 раскрывают фармакологическую активность соединения. 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота является рацематом, тогда как Китайский патент CN1257893 не раскрывает ни его (+) или (-) энантиомер, ни способа получения, ни его фармакологическую активность.

Как правило, соединение будет иметь несколько пар энантиомеров, которые являются зеркальным отображением друг друга на основе различия в хиральном положении. За исключением оптической активности, два энантиомера, отраженные друг от друга, обычно имеют одинаковые физические свойства. В частности, два энантиомера, как правило, полностью или почти идентичны по температуре плавления, температуре кипения, растворимости, плотности и скорости преломления, но полностью противоположны с точки зрения оптического вращения. Поскольку два энантиомера вращали плоскость поляризованного света в одинаковой степени, но в противоположных направлениях, никакого оптического вращения не будет наблюдаться, когда они смешиваются. Другими словами, оптическое вращение рацемата теоретически равно нулю и практически близко к нулю. Из-за различий в оптической активности рацематы и отдельные энантиомеры могут различаться по своей физиологической активности и токсичности. Однако это различие в физиологической активности и токсичности обычно непредсказуемо, поэтому невозможно заранее предсказать разницу в оптическом вращении. В целом, в большинстве случаев физиологические активности (включая фармакодинамические эффекты) двух изомеров и физико-химические свойства, отличные от оптической активности, идентичны. В редких случаях возникают определенные фармакодинамические различия. С точки зрения различий в фармакодинамике, существуют в основном следующие типы состояний. 1) Энантиомеры имеют сходные фармацевтические свойства, но интенсивность активности различна. Например, антибактериальная активность S-изомера офлоксацина в 8-135 раз выше, чем у R-изомера (Mitscher LA et al., J Med Chem, 1987, 30(12): 2283-6). 2) Энантиомеры являются противоположными по фармацевтическим свойствам и взаимно антагонистичными. Например, (+)-изомер пикенадола является агонистом опиоидных рецепторов, а (-)-изомер является антагонистом опиоидных рецепторов (Carter RB et al., J Pharmacol Exp Ther, 1985, 234 (2): 299-306). 3) Энантиомеры дополняют друг друга по фармацевтическому свойству. Например, R-изомер мочегонного индакринона обладает мочегонным эффектом, а также побочным эффектом увеличения мочевой кислоты в крови, в то время как S-изомер способствует выведению мочевой кислоты и может эффективно уменьшить побочный эффект R-изомера. Поэтому выгодно использовать их в комбинации. Дальнейшие исследования показали, что терапевтический эффект является наилучшим, когда отношение S к R изомеру составляет 1:4 или 1:8 (Tobert J. A. et al., Clin Pharmacol Ther, 1981, 29(3): 344-50). 4) Различные энантиомеры обладают различной фармакологической активностью. Например, антигипертензивное лекарственное средство лабеталол имеет два хиральных центра, где (R,R)-изомер представляет собой неселективный антагонист β-адренорецептора, (S,R)-изомер представляет собой антагонист α1-адренорецептора, (S,S)-изомер имеет слабую блокаду α1-адренорецептора, тогда как (R,S)-изомер неактивен (Pieter A. et al., Drugs, 1993, 45(4): 509-517). 5) Один из энантиомеров имеет сильные токсические побочные эффекты. Например, талидомид использовался в качестве седативного средства для лечения реакций на беременность, но вызвал тысячи случаев тератогенности после приема беременными женщинами, поскольку S-изомер не только обладает седативным эффектом, но также обладает сильной эмбриотоксичностью и тератогенными эффектами (Blaschke G. et al., Arzneim-Forsch, 1979, 29(10), 1640-2). Следовательно, необходимо выделить чистые энантиомеры из рацемической смеси и изучить их свойства, поскольку физиологические различия между энантиомерами и рацемической смесью непредсказуемы.

Авторы изобретения получили (-)-энантиомер (левоизомер) 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты и изучили его фармакологическую активность.

Краткое изложение

Авторы настоящей заявки попытались получить и получили каждый из энантиомеров 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты и изучили их фармакологические активности. Неожиданно было обнаружено, что два изомера имеют значительно различающиеся фармакологические эффекты, где левоизомер ((-)-энантиомер в конкретном хиральном положении (см. положение, обозначенное «*» в формуле I) значительно превосходит (+)-энантиомер (т.е. декстроизомер) с точки зрения активации экспрессии RXR/PPAR-, RXR/PPAR- и RXR/PPAR-гетеродимеров и гипогликемического эффекта, продемонстрированного на мышиной модели db/db.

Основываясь на обнаружении, в первом аспекте настоящее изобретение предоставляет 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, которые могут селективно активировать PPAR-α, PPAR-γ и PPAR-δ.

Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с метаболическим синдромом, такого как диабет.

Химическая структура соединения (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты по настоящему изобретению показана в формуле (I):

положение, обозначенное * хиральное положение

Энантиомер 1: (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота;

Энантиомер 2: (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота

«Фармацевтически приемлемая соль», как используется в настоящем описании, означает соль, которая является фармацевтически приемлемой. Основания, используемые при получении солей, включают, но не ограничиваются ими, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия, калия), гидроксиды щелочноземельных металлов (например, кальция, магния), водный раствор аммиака и органические амины (NR¹R²R³, где R¹, R² и R³ могут быть одинаковыми или разными и предпочтительно представляют собой атом водорода или C1-C4 алкильную группу).

«Фармацевтически приемлемый», как используется в настоящем описании, понимается как подходящий для использования человеком и животными в обоснованных медицинских пределах без чрезмерных побочных эффектов, включая токсичность, аллергические реакции, раздражение и осложнения, и другие вредные эффекты.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, фармацевтический адъювант, включающий фармацевтически приемлемый эксципиент и/или носитель. (-)-2-[(2-(4-Фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими активными фармацевтическими ингредиентами, которые могут находиться в любой фармацевтически приемлемой комбинации.

Термин «фармацевтически приемлемый эксципиент и/или носитель», как используется в настоящем документе, означает нетоксичный, инертный, твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное средство для состава любого типа. Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995, раскрывает различные носители для формулирования фармацевтических композиций и известные способы получения этих фармацевтических композиций. Некоторые примеры материалов, которые можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но не ограничиваются ими, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; диолы, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; детергенты, такие как TWEEN^TM 80; буферы, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт; и фосфатный буферный раствор и другие нетоксичные совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния; и красители, покрывающие агенты, подсластители, отдушки и ароматизаторы; консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композициях, судя по составителю. Если фильтрация или другие терминальные процессы стерилизации невозможны, препарат может быть получен в стерильных условиях.

(-)-2-[(2-(4-Фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль, как описано в настоящем изобретении, может быть приготовлена в различных лекарственных формах с обычными фармацевтическими эксципиентами, таких как, но без ограничения, препараты для перорального приема (таблетки, капсулы, порошки, гранулы, сиропы, пилюли и т.п.), препараты для инъекций и препараты для местного применения и т.п. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обычно может содержать от 0,5 до 70% масс. активного ингредиента, предпочтительно 1-20% масс.

Полезные эффекты настоящего изобретения

В настоящем изобретении, (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота выделяется из энантиомеров 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты в рацемат, который активирует экспрессию RXR/PPAR-, RXR/PPAR- и RXR/PPAR- гетеродимеров и проявляет значительно лучший гипогликемический эффект в мышиной модель db/db, дополнительно улучшая терапевтический эффект соединений [(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты на заболевания, связанные с RXR или PPAR ядерными рецепторами, включая диабет 2 типа, нарушения липидного обмена, синдром X, сердечно-сосудистые заболевания, ишемическую болезнь сердца, гиперхолестеринемию и ожирение.

краткое описание чертежей

На фиг.1 показана активационная активность энантиомеров 1 и 2 по настоящему изобретению в отношении PPARα в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro;

На фиг.2 показана активационная активность энантиомеров 1 и 2 по настоящему изобретению в отношении PPARγ в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro;

На фиг.3 показана активационная активность энантиомеров 1 и 2 по настоящему изобретению в отношении PPAR-δ в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro.

Подробное описание

Содержание настоящего раскрытия дополнительно описано ниже со ссылкой на примеры, но объем защиты настоящего раскрытия не ограничивается этими примерами. Все проценты, указанные в настоящем раскрытии, являются массовыми процентами, если не указано иное. Диапазон значений, таких как единицы измерения или проценты, описанные в спецификации, предназначены для обеспечения однозначной письменной ссылки. Специалист в данной области все равно сможет получить желаемые результаты на основе идей и принципов настоящего раскрытия, используя температуры, концентрации, количества и т.п., выходящие за пределы этого диапазона или отличающиеся от одного значения.

Пример 1: Получение энантиомера 1 и 2 [(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты

20 г смеси энантиомеров растворяли в 2070 мл метанола и наносили на колонку для сверхкритической хроматографии Chiralpak (AY 20*250 мм). Колонку сначала промывали смесью метанол/диоксид углерода (объемное соотношение 4:1) при скорости потока 80 мл/мин в течение 120 минут, и затем элюировали смесью метанол/диоксид углерода/водный аммиак (объемное соотношение 6:4:0,005) при скорости потока 80 мл/мин в течение 30 минут. Примерно через 6 минут получали пик элюирования целевого энантиомера 1; примерно через 11 минут получали пик энантиомера 2. После выпаривания растворителя получали энантиомер 1 (15 г) и энантиомер 2 (2 г), соответственно.

(-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1):

содержание=100%

э.и.%=100%

[α]²⁴_D=-111,5 (c=0,01, DMSO)

Инфракрасный спектр (KBr, см^-1): 3323, 3047, 2983, 2938, 2870, 2730, 2492, 1922, 1893, 1622, 1598, 1508, 1456, 1387, 1249, 927, 850, 751;

¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ 2,88 (дд, 1H, J=13,8, 6,1 Гц, один из CH₂), 3,06 (дд, 1H, J=13,8, 5 Гц, один из CH₂), 4,01-4,04 (м, H, CH), 4,25 (т, J=5,3 Гц, 2H, CH₂), 4,72 (т, J=5,3 Гц, 2H, CH₂), 6,44 (т, 1H, J=7,5 Гц, Ar-H), 6,60 (д, J=8,7 Гц, 2H, Ar-H), 6,70 (д, J=8,6 Гц, 1H, Ar-H), 7,00 (д, J=8,6 Гц, 2H, Ar-H), 7,19 (т, 2H, J=7,5 Гц, Ar-H), 7,24 (дд, 1H, J=8,1, 1,5 Гц, Ar-H), 7,26-7,32 (м, 3H, Ar-H), 7,43 (тд, 2H, J=7,7, 1 Гц, Ar-H), 7,55-7,58 (м, 2H, Ar-H), 7,63 (д, J=8,3 Гц, 2H, Ar-H), 8,13 (д, J=7,8 Гц, 2H, Ar-H), 8,64 (д, J=7,0 Гц, 1H, NH);

HRMS (C₃₆H₂₉FN₂O₄) рассч. (%): 572,2111; найдено (%): 572,2108.

(+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 2):

содержание=100%

э.и.%=99,5%

[α]²⁴_D=98,5 (c=0,01, DMSO)

Инфракрасный спектр (KBr, см^-1): 3318, 3048, 2927, 2869, 2495, 1921, 1892, 1621, 1598, 1509, 1457, 1250, 1154, 927, 849, 751;

¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ 2,91 (дд, 1H, J=13,8, 6,2 Гц, один из CH₂), 3,06 (дд, 1H, J=13,8, 5 Гц, один из CH₂), 4,14-4,17 (м, 1H, CH), 4,24 (т, J=5,3 Гц, 2H, CH₂), 4,72 (т, J=5,3 Гц, 2H, CH₂), 6,47 (т, 1H, J=7,4 Гц, Ar-H), 6,61 (д, J=8,6 Гц, 2H, Ar-H), 6,73 (д, J=8,6 Гц, 1H, Ar-H), 7,01 (д, J=8,6 Гц, 2H, Ar-H), 7,18 (т, 2H, J=7,4 Гц, Ar-H), 7,26 (дд, 1H, J=8,0, 1,4 Гц, Ar-H), 7,29-7,32 (м, 3H, Ar-H), 7,42 (тд, 2H, J=7,7, 0,9 Гц, Ar-H), 7,56-7,59 (м, 2H, Ar-H), 7,63 (д, J=8,3 Гц, 2H, Ar-H), 8,12 (д, J=7,7 Гц, 2H, Ar-H), 8,63 (д, J=7,1 Гц, 1H, NH);

HRMS (C₃₆H₂₉FN₂O₄) рассч. (%): 572,2111; найдено (%): 572,2109

Пример 2: Получение натрий (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата (натриевая соль энантиомера 1)

Добавляли 30 мл тетрагидрофурана в 50 мл круглодонную колбу, и (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту (1000 мг, 1,75 ммоль) добавляли при перемешивании до полного растворения. Гидроксид натрия (71 мг, 1,77 ммоль) растворяли в 2 мл метанола. Затем метанольный раствор гидроксида натрия добавляли по каплям в (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту в тетрагидрофуране при перемешивании и реакцию продолжали при перемешивании в течение 30 минут. Смесь перегоняли при пониженном давлении и остаток от перегонки растворяли в 2 мл дихлорметана. 30 мл изопропилового эфира добавляли в 50 мл круглодонную колбу и указанный выше раствор дихлорметана добавляли по каплям при перемешивании. После завершения капельного добавления смесь перемешивали в течение 2 минут и отфильтровывали с отсасыванием. Осадок на фильтре промывали 5 мл изопропилового эфира, сушили в вакууме при комнатной температуре в течение 4 часов и сушили в вакууме при 60°C до потери при сушке менее 0,5% по массе с получением желтого твердого натрий (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата (1 г, 1,68 ммоль, 96,3% выход).

содержание=98,7%

э.и.%=96,1%

[α]²⁴_D== -119,5 (c=0,01, DMSO)

Инфракрасный спектр (KBr, см^-1): 3352, 3051, 2969, 2930, 2871, 1921, 1891, 1617, 1598, 1509, 1457, 1400, 1242, 928, 850, 750;

Рентгеновская порошковая дифрактометрия: аморфный

Измеренные данные и результаты анализа ЯМР (Bruker AVANCE III HD 500, DMSO-d₆), включая 1-H ЯМР, 13-C ЯМР, COSY, HMQC и HMBC, показаны в Таблице 1:

Таблица 1 Данные и анализ ЯМР спектров натрий (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата

атомное число химический сдвиг химический сдвиг COSY HSQC HMBC δH (ppm) δC (ppm) 1H-1H Гомо 13C-1H гетеро 13C-1H 1(8) 7,63 (д, 2H, J=8,3 Гц) 109,56 7,63 (7,41-7,45) 109,56 (7,63) 109,56 (7,41-7,45, 7,17-7,19, 8,13) 7,63 (7,17-7,19) 2(7) 7,41-7,45 (м, 2H) 125,6 7,41-7,45 (7,17-7,19) 125,60 (7,41-7,45) 125,60 (8,13, 7,17-7,19) 7,41-7,45 (7,63) 7,41-7,45 (8,13) 3(6) 7,17-7,19 (м, 2H) 118,83 7,17-7,19 (7,41-7,45) 118,83 (7,17-7,19) 118,83 (7,63) 7,17-7,19 (8,13) 7,17-7,19 (7,63) 4(5) 8,13 (д, 2H, J=7,7 Гц) 120,09 8,13 (7,17-7,19) 120,09 (8,13) 120,09 (7,41-7,45) 8,13 (7,41-7,45) 10(13) 140,21 140,21 (4,73, 7,41-7,45, 8,13) 11(12) 122,1 122,10 (7,17-7,19, 7,63, 8,13) 14 4,73 (т, 2H, J=5,3 Гц) 42,08 4,73 (4,24) 42,08 (4,73) 42,08 (4,24) 15 4,24 (т, 2H, J=5,4 Гц) 66,17 4,24 (4,73) 66,17 (4,24) 66,17 (4,73) 16 156,23 156,23 (7,01, 6,59, 4,23) 17(17') 6,59 (д, 2H, J=8,7 Гц) 113,64 6,59 (7,01) 113,64 (6,59) 113,64 (7,01) 18(18') 7,01 (д, 2H, J=8,6 Гц) 130,35 7,01 (6,59) 130,35 (7,01) 130,35 (2,88, 3,06, 6,59) 19 131,51 131,51 (2,88,3,06, 3,90-3,93, 6,59) 20 2,88 (дд, 1H, J=13,7, 5,9 Гц) 37,13 2,88 (3,90-3,93) 37,13 (2,88, 3,06) 37,13 (3,90-3,93, 7,01) 3,06 (дд, 1H, J=13,7, 5,1 Гц) 3,06 (3,90-3,93) 21 3,90-3,93 (м, 1H) 59 3,90-3,93 (2,88) 59 (3,90-3,93) 59,00 (2,88, 3,06, 8,74) 3,90-3,93 (3,06) 3,90-3,93 (8,74) 22 8,74 (д, 1H, J=6,7 Гц) 8,74 (3,90-3,93) 23 150,31 150,31 (7,20-7,26, 3,90-3,93) 24 116,5 116,50 (6,39, 6,66, 8,74) 25 7,20-7,26 (м, 1H) 134,22 7,20-7,26 (6,39) 134,22 (7,20-2,26) 134,22 (7,20-7,26) 26 6,39 (т, 1H, J=7,3 Гц) 112,48 6,39 (7,20-7,26) 112,48 (6,39) 112,48 (6,66) 6,39 (7,20-7,26) 27 7,20-7,26 (м, 1H) 134,48 7,20-7,26 (6,39) 134,48 (7,20-7,26) 134,48 (7,20-7,26, 6,39) 7,20-7,26 (6,66) 28 6,66 (д, 1H, J=8,6 Гц) 112,63 6,66 (7,20-7,26) 112,63 (6,66) 112,63 (6,39, 8,74) 29 195,72 195,72 (7,55-7,58, 7,20-7,26) 30 136,8 136,80 (7,28-7,32) 31(31') 7,55-7,58 (м, 2H) 131,25 7,55-7,58 (7,28-7,32) 131,25 (7,55-7,58) 3JF-C=8,8 32(32') 7,28-7,32 (м, 2H) 115,1 7,28-7,32 (7,55-7,58) 115,10 (7,28-7,32) 115,10 (7,55-7,58) 2JF-C=22,5 33 163,4 163,40 (7,55-7,58, 7,28-7,32) 1JF-C=248 34 173,67 173,67 (2,88, 3,06, 3,90-3,93, 8,74)

FAB-MS (m/z): 595(M+1)

Пример 3: Получение натрий (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата (натриевая соль энантиомера 2)

Добавляли 30 мл тетрагидрофурана в 50 мл круглодонную колбу, и (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту (1000 мг, 1,75 ммоль) добавляли при перемешивании до полного растворения. Гидроксид натрия (71 мг, 1,77 ммоль) растворяли в 2 мл метанола. Затем метанольный раствор гидроксида натрия добавляли по каплям в (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту в тетрагидрофуране при перемешивании и реакцию продолжали при перемешивании в течение 30 минут. Смесь перегоняли при пониженном давлении и остаток от перегонки растворяли в 2 мл дихлорметана. 30 мл изопропилового эфира добавляли в 50 мл круглодонную колбу и указанный выше раствор дихлорметана добавляли по каплям при перемешивании. После завершения капельного добавления смесь перемешивали в течение 2 минут и отфильтровывали с отсасыванием. Осадок на фильтре промывали 5 мл изопропилового эфира, сушили в вакууме при комнатной температуре в течение 4 часов и сушили в вакууме при 60°C до потери при сушке менее 0,5% по массе с получением желтого твердого натрий (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата (980 мг, 1,65 ммоль, 94,1% выход).

содержание=97,3%

э.и.%=98,4%

[α]²⁴_D== 128,8 (c=0,01, DMSO)

Инфракрасный спектр (KBr, см^-1): 3354, 3051, 2969, 2929, 2871, 1922, 1891, 1617, 1598, 1509, 1401, 1243, 928, 850, 750;

Рентгеновская порошковая дифрактометрия: аморфный

Измеренные данные и результаты анализа ЯМР (Bruker AVANCE III HD 500, DMSO-d₆), включая 1-H ЯМР, 13-C ЯМР, COSY, HMQC и HMBC, показаны в Таблице 2:

Таблица 2 Данные и анализ ЯМР спектров натрий (+)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионата

атомное число химический сдвиг химический сдвиг COSY HSQC HMBC δH (ppm) δC (ppm) 1H-1H Гомо 13C-1H Гетеро 13C-1H 1(8) 7,63 (д, 2H, J=8,3 Гц) 109,55 7,63 (7,41-7,45) 109,55 (7,63) 109,55 (7,41-7,45, 7,17-7,19, 8,13) 7,63 (7,17-7,19) 2(7) 7,41-7,45 (м, 2H) 125,59 7,41-7,45 (7,17-7,19) 125,59 (7,41-7,45) 125,59 (8,13, 7,17-7,19) 7,41-7,45 (7,63) 7,41-7,45 (8,13) 3(6) 7,17-7,19 (м, 2H) 118,83 7,17-7,19 (7,41-7,45) 118,83 (7,17-7,19) 118,83 (7,63) 7,17-7,19 (8,13) 7,17-7,19 (7,63) 4(5) 8,13 (д, 2H, J=7,7 Гц) 120,09 8,13 (7,17-7,19) 120,09 (8,13) 120,09 (7,41-7,45) 8,13 (7,41-7,45) 10(13) 140,21 140,21 (4,73, 7,41-7,45, 8,13) 11(12) 122,1 122,10 (7,17-7,19, 7,63, 8,13) 14 4,73 (т, 2H, J=5,3 Гц) 42,07 4,73 (4,24) 42,07 (4,73) 42,07 (4,24) 15 4,24 (т, 2H, J=5,4 Гц) 66,17 4,24 (4,73) 66,17 (4,24) 66,17 (4,73) 16 156,23 156,23 (7,01, 6,59, 4,24) 17(17') 6,59 (д, 2H, J=8,7 Гц) 113,64 6,59 (7,01) 113,64 (6,59) 113,64 (7,01) 18(18') 7,01 (д, 2H, J=8,7 Гц) 130,35 7,01 (6,59) 130,35 (7,01) 130,35 (2,88, 3,06, 6,59) 19 131,5 131,50 (2,88,3,06, 3,90-3,93, 6,59) 20 2,88 (дд, 1H, J=13,7, 5,9 Гц) 37,13 2,88 (3,90-3,93) 37,13 (2,88, 3,06) 37,13 (3,90-3,93, 7,01) 3,07 (дд, 1H, J=13,7, 5,1 Гц) 3,06 (3,90-3,93) 21 3,90-3,93 (м, 1H) 58,99 3,90-3,93 (2,88) 58,99 (3,90-3,93) 58,99 (2,88, 3,06, 8,74) 3,90-3,93 (3,06) 3,90-3,93 (8,74) 22 8,74 (д, 1H, J=6,8 Гц) 8,74 (3,90-3,93) 23 150,3 150,30 (7,20-7,26, 3,90-3,93) 24 116,5 116,50 (6,39, 6,66, 8,74) 25 7,20-7,26 (м, 1H) 134,22 7,20-7,26 (6,39) 134,22 (7,20-2,26) 134,22 (7,20-7,26) 26 6,39 (т, 1H, J=7,5 Гц) 112,48 6,39 (7,20-7,26) 112,48 (6,39) 112,48 (6,66) 6,39 (7,20-7,26) 27 7,20-7,26 (м, 1H) 134,48 7,20-7,26 (6,39) 134,48 (7,20-7,26) 134,48 (7,20-7,26, 6,39) 7,20-7,26 (6,66) 28 6,66 (д, 1H, J=8,6 Гц) 112,63 6,66 (7,20-7,26) 112,63 (6,66) 112,63 (6,39, 8,74) 29 195,73 195,73 (7,55-7,58, 7,20-7,26) 30 136,8 136,80 (7,28-7,32) 31(31') 7,55-7,58 (м, 2H) 131,25 7,55-7,58 (7,28-7,32) 131,25 (7,55-7,58) 3JF-C=8,8 32(32') 7,28-7,32 (м, 2H) 115,1 7,28-7,32 (7,55-7,58) 115,10 (7,28-7,32) 115,10 (7,55-7,58) 2JF-C=21,3 33 163,4 163,40 (7,55-7,58, 7,28-7,32) 1JF-C=248 34 173,71 173,71 (2,88, 3,06, 3,90-3,93, 8,74)

FAB-MS (m/z):595(M+1)

Пример 4 (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1) проявляла активность активатора PPARα в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro

Система обнаружения репортерного гена PPARα включает плазмиду для экспрессии люциферазы pCDNA3.1 (PPRE энхансерный элемент, встроенный против хода транскрипции промотора), плазмиду для экспрессии зеленого флуоресцентного белка GFP и плазмиду для экспрессии человеческого PPARα.

Вышеуказанные плазмиды котрансфицировали (реагент для трансфекции Fugene 6.0) в клеточную линию гепатомы человека L-02. Через 48 часов после трансфекции добавляли различные концентрации тестируемых соединений. Через 24 часа после введения клетки обрабатывали набором для анализа люциферазы (Promega E1910), и интенсивность флуоресценции GFP (длина волны 485-527 нм) и субстрата люциферазы (длина волны 562 нм) определяли с использованием флуоресцентного детектора (Fluoroskan Ascent FL), соответственно. Сигнал GFP использовали в качестве внутреннего эталона для коррекции обнаруженного сигнала субстрата люциферазы, и относительная интенсивность активации репортера была получена путем сравнения вышеуказанного скорректированного сигнала с холостым контролем (без обработки соединениями). Полу-активирующую активность (ЕС50) тестируемого соединения рассчитывали по данным градиента концентрации.

По сравнению с энантиомером 2 энантиомер 1 оказывает более существенное влияние на активацию PPARα, с EC₅₀ 1,135 мкМ и 5,385 мкМ, соответственно (см. Фиг.1).

Пример 5 (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1) проявляла активность активатора гетеродимера RXR/PPARγ в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro

Система обнаружения репортерного гена PPARγ включает плазмиду флуоресцентного репортерного гена pACOX (промотор содержит последовательность PPRE), плазмиду экспрессии PPARγ, плазмиду экспрессии RXR, и плазмиду для экспрессии зеленого флуоресцентного белка GFP.

Вышеуказанные плазмиды котрансфицировали (реагент для трансфекции Fugene 6.0) в клеточную линию гепатомы человека L-02. Через 48 часов после трансфекции добавляли различные концентрации тестируемых соединений. Через 24 часа после введения клетки обрабатывали набором для анализа люциферазы (Promega E1910), и интенсивность флуоресценции GFP (длина волны 485-527 нм) и субстрата люциферазы (длина волны 562 нм) определяли с использованием флуоресцентного детектора (Fluoroskan Ascent FL), соответственно. Сигнал GFP использовали в качестве внутреннего эталона для коррекции обнаруженного сигнала субстрата люциферазы, и относительная интенсивность активации репортера была получена путем сравнения вышеуказанного скорректированного сигнала с холостым контролем (без обработки соединениями). Полу-активирующую активность (ЕС50) тестируемого соединения рассчитывали по данным градиента концентрации.

По сравнению с энантиомером 2 энантиомер 1 оказывает более существенное влияние на активацию PPARγ, с EC₅₀ 0,076 мкM и 2,709 мкM, соответственно (см. Фиг. 2).

Пример 6 (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1) проявляла активность активатора гетеродимера RXR/PPAR-δ в экспериментальной модели анализа по гену-репортеру in vitro

Система обнаружения репортерного гена PPARδ включает плазмиду флуоресцентного репортерного гена pGL3-PPRE (PPRE энхансерный элемент встроенный против хода транскрипции промотора), плазмиду экспрессии PPARδ, плазмиду экспрессии RXR и плазмиду для экспрессии зеленого флуоресцентного белка GFP.

Вышеуказанные плазмиды котрансфицировали (реагент для трансфекции Fugene 6.0) в клеточную линию гепатомы человека L-02. Через 48 часов после трансфекции добавляли различные концентрации тестируемых соединений. Через 24 часа после введения клетки обрабатывали набором для анализа люциферазы (Promega E1910), и интенсивность флуоресценции GFP (длина волны 485-527 нм) и субстрата люциферазы (длина волны 562 нм) определяли с использованием флуоресцентного детектора (Fluoroskan Ascent FL), соответственно. Сигнал GFP использовали в качестве внутреннего эталона для коррекции обнаруженного сигнала субстрата люциферазы, и относительная интенсивность активации репортера была получена путем сравнения вышеуказанного скорректированного сигнала с холостым контролем (без обработки соединениями). Полу-активирующую активность (ЕС50) тестируемого соединения рассчитывали по данным градиента концентрации.

По сравнению с энантиомером 2 энантиомер 1 оказывает более существенное влияние на активацию PPAR-δ, с EC₅₀ 1,93 мкM и >10 мкM (при самой высокой концентрации не обнаружено заметной активности), соответственно (см. Фиг.3).

Пример 7 (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1) была эффективна в снижении концентрации глюкозы в крови у мышей db/db.

Эксперимент состоял из 4 групп: эталонная группа, две группы введения (которым вводили энантиомеры 1 и 2, соответственно) и группа положительного контроля (росиглитазон), по 10 мышей на группу. Способ введения был пероральным, доза составляла 20 мг/кг в группе введения и 5 мг/кг в контрольной группе, частота введения составляла один раз в день, и период введения составлял 14 дней. Животным групп 1-4 вводили перорально носитель, энантиомер 1, энантиомер 2 и положительный препарат росиглитазон, соответственно. В дни 0, 3, 6, 9, 12 и 14 после голодания в течение 6 часов после введения забирали кровь из хвостовой вены и уровни глюкозы в крови натощак измеряли с помощью глюкометра и регистрировали. Результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3 эффект (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты на концентрацию глюкозы в крови у мышей

Группа День 0 День 3 День 6 День 9 День 12 День 14 G1: эталонная группа (n=10) Среднее значение 18,98 25,5 23,69 26,49 29,23 18,52 SEM 1,47 1,12 1,17 0,97 0,99 1,28 G2:Энантиомер 1(n=10) Среднее значение 18,43 18,2 14,7 18,14 16,18 10,98 SEM 1,35 1,87 1,33 1,42 1,48 0,83 G3: Энантиомер 2 (n=10) Среднее значение 18,86 23,99 20,03 26,01 26,44 17,18 SEM 1,28 1,38 1,5 1,45 1,17 1,09 G4: росиглитазон Среднее значение 19,09 13,58 13,8 15,05 14,44 11,29 (n=10) SEM 1,36 1 0,82 0,86 0,46 1,09

Пример 8 (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота (энантиомер 1) увеличила толерантность к глюкозе в тесте на толерантность к глюкозе (OTGG)

После 14 дней введения животные голодали в течение ночи (<10 часов) и перорально получали 2 г/кг глюкозы на следующий день. Кровь забирали из хвостовой вены при 0 (до введения или уровень глюкозы в крови натощак), через 15, 30, 60 и 120 минут после введения, соответственно, и затем измеряли уровни глюкозы в крови с помощью глюкометра и регистрировали. Результаты показаны в таблице 4.

Таблица 4 эффект (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты на толерантность к глюкозе

Группа 0 мин 15 мин 30 мин 60 мин 120 мин AUC G1: эталонная группа (n=10) Среднее значение 18,52 32,3 33,3 32,28 27,77 60,97 SEM 1,28 0,72 0 0,58 1,96 1,54 G2: Энантиомер 1(n=10) Среднее значение 10,98 28,02 32,26 26,6 14,69 47,77 SEM 0,83 1,34 0,78 2,15 1,13 2,33 G3: Энантиомер 2 (n=10) Среднее значение 17,18 31,87 33,3 30,94 25,75 59,16 SEM 1,09 1,43 0 1,3 1,8 1,59 G4: росиглитазон Среднее значение 11,29 28,11 31,22 25,08 13,61 45,76 (n=10) SEM 1,09 2,03 1,11 1,33 1,48 2,01

Хотя изобретение было описано в связи с различными вариантами осуществления, это не означает, что изобретение ограничено этими вариантами осуществления. Специалистам в данной области будет понятно, что изобретение может охватывать различные альтернативы, модификации и эквиваленты. Считается, что эти альтернативы, варианты и эквиваленты находятся в пределах объема изобретения, как описано в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение раскрывает энантиомерное соединение, представляющее (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амин]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту формулы (I) или его фармацевтическую соль, и способ получения соединения и его применение. Энантиомерное соединение демонстрирует относительно лучшую активацию экспрессии RXR/PPAR-, RXR/PPAR- и RXR/PPAR-гетеродимеров и снижение содержания сахара в мышиной модели db/db по сравнению с (+)-энантиомером. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 8 пр.

(I)

1. (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль.

2. (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где соль представляет собой соль щелочного металла, соль щелочноземельного металла, соль аммония или соль четвертичного аммония.

3. (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль по п. 2, где соль щелочного металла представляет собой соль натрия или калия и/или соль щелочноземельного металла представляет собой соль кальция или магния.

4. Метод сверхкритической хроматографии для получения (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты по п. 1, включающий стадии:

растворения 2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты в растворителе, загрузки раствора в колонку для хиральной хроматографии, элюирования последовательно смесью растворителей органический растворитель/диоксид углерода и смесью растворителей органический растворитель/диоксид углерода/водный аммиак и разделения с получением (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты.

5. Применение (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства как активатора ядерных рецепторов PPAR.

6. Применение (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и предупреждения заболевания, связанного с регуляцией RXR/PPAR.

7. Применение по п. 6, где заболевание выбрано из группы, состоящей из диабета 2 типа, нарушений липидного обмена, синдрома X, сердечно-сосудистого заболевания, ишемической болезни сердца, гиперхолестеринемии и ожирения.

8. Фармацевтическая композиция, включающая (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый эксципиент и/или носитель.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, где содержание (-)-2-[(2-(4-фторбензоил)фенил)амино]-3-[(4-(2-карбазол-этокси)фенил)]пропионовой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли составляет 0,5-70% масс.

10. Фармацевтическая композиция по п. 8 или 9, где указанная фармацевтическая композиция имеет форму для перорального применения, препарата для инъекций или препарата для местного применения.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где композиция представляет собой таблетку, капсулу, порошок, гранулу, сироп или пилюлю.