СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОБНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ДЕГИДРОГЕНАЗЫ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/18 G01N21/78 

Изобретение относится к области геоэкологии и может быть использовано для идентификации микробного загрязнения водной среды, например, из навоза скота, на территориях пастбищного скотоводства посредством анализа активности фермента дегидрогеназы, продуцируемого различными микробами. При этом учитывается то, что в результате просачивания через навоз дождевых и/или талых вод и образования поверхностных и внутрипочвенных стоков, может происходить микробное загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, используемых местным населением для питьевых целей, что согласно санитарно-гигиеническим нормативам не допускается.

Заявляемый способ повышает оперативность, точность и качество оценки эпидемиологической ситуации, которая может быть вызвана патогенными микробами на территориях пастбищного скотоводства, первичным очагом которых, как правило, является навоз больных животных. Соответственно, способ позволяет обосновать принятие профилактических и/или ремедиационных мер для исключения инфицирования местного населения через загрязненные поверхностные и подземные водоисточники, используемые для питьевых целей.

Особую значимость заявляемый способ может приобрести для контроля ситуации, связанной с эпидемией сибирской язвы, возбудителем которой является спорообразующая бактерия Bacillus anthracis. Первичными очагами инфекции, как правило, является навоз больных оленей на пастбищах, а вторичные очаги данной бактерии создаются в результате просачивания через навоз дождевых и талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки. Пример - вспышка эпидемии сибирской язвы летом 2016 г. в Ямало-Ненецком автономном округе, на полуострове Ямал с развитым пастбищным оленеводством. В результате эпидемии заболело 2650 оленей и 36 человек с одним летальным исходом [см. журнал «Проблемы особо опасных инфекций». 2016. Вып. 4. С. 42-46; «Журнал инфектологии». 2016. Том 8. №3. С. 5-27.]. Одним из факторов передачи Bacillus anthracis человеку могло быть употребление сырой и/или недостаточно термически обработанной воды из озер - мест водопоев оленей, среди которых могли быть и больные животные.

Известен способ определения микробного загрязнения водной среды (Патент РФ на изобретение №2286565), включающий отбор проб воды, ее пропускание через бактерицидный фильтр, доведение рН пробы до значений 5-6 и определение микробного загрязнения водной среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом формулы R₄NI_n((n-1)/2)H₂O.

Существенными недостатками известного способа являются:

- использование устройства сложной конструкции для определения микробного загрязнения водной среды, включающего источник оптического излучения, кювету для исследуемой среды, фотоприемник, бактерицидный фильтр и реакционную камеру;

- отсутствие единообразия в определении микробного загрязнения водной среды, т.е. определение концентрации выделившегося из бактерицида йода, пропорциональной микробному заражению воды;

- использование недостаточно корректного, весового метода, требующего предварительного выделения и осаждения йода.

Известен способ определения микробного загрязнения водной среды (Патент РФ на изобретение №2476876), включающий измерение на анализаторе жидких проб - интенсивности люминолозависимой хемилюминесценции натуральной пробы (J₀) и фильтратов натуральной пробы после ее тонкой фильтрации (J₁) и ультрафильтрации (J₂) через прозрачные аналитические трековые мембраны, определение процентного содержания непосредственно участвующих в образовании светосуммы реакции основных компонентов водной среды в виде микропланктона с микровзвесями (А), бактерий (В) и растворов органических и неорганических соединений (С) исходя из замеренных значений световыхода люминесцентной реакции (J_A, J_B, J_C) по соответствующим формулам.

Существенными недостатками известного способа являются:

- использование сложного прибора в виде хемилюминесцентного анализатора (люминометра) жидких проб и вакуумной фильтрационной установки с прозрачными аналитическими трековыми мембранами и вакуумным насосом;

- необходимость фильтрационной подготовки анализируемых проб воды;

- сложность формирования аналитических данных для расчета результатов определения микробного загрязнения водной среды.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ определения микробного загрязнения воды (Патент РФ на изобретение №2576030), включающий использование проб с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий. При освещении проб ультрафиолетовым излучением определяют интенсивность флуоресценции I_фл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции I_флк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду при длине волны λ_фл=415±10 нм. Затем строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением I_фл-I_флк в каждой пробе, определяют флуоресценцию I_фла анализируемой пробы и значение I_фла-I_флк, и, наконец, по калибровочной кривой вычисляют соответствующую I_фла-I_флк концентрацию КОЕ_ап в анализируемой пробе. В случае превышения КОЕ_ап допустимого значения более чем на заданную величину микробную загрязненность оценивают, как опасную.

Существенными недостатками известного способа являются:

- обязательное использование проб с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерии кишечной палочки Escherichia coli, культивирование которой на питательной среде (агаре) занимает продолжительное время - несколько суток;

- сложность подготовки аналитических данных к расчетам микробного загрязнения воды;

- необходимость дополнительного сравнительного анализа тех же проб воды с использованием сложной технологии, представленной в другом способы (Патент РФ на изобретение №2078138).

Целью предлагаемого изобретения является решение технической задачи оперативной (в течение 1 суток) и доступной для региональных лабораторий идентификации на территории пастбищного скотоводства микробного загрязнения водной среды, например, из навоза скота, посредством анализа активности фермента дегидрогеназы в сухих пробах навоза и водных пробах из навоза, получаемых методом центрифугирования.

Данная техническая задача решается благодаря тому, что на территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба, М 1:200000 и крупнее, определяют место выпаса скота. Затем с места выпаса скота отбирают усредненный репрезентативный образец навоза, который высушивают (при комнатной температуре) и просеивают (через сито диаметром ячеек 3 мм) для получения сухого образца. Из этого образца берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, т.е. всего 30 проб. Первая партия представляет собой сухие пробы навоза и идет под номером №1 (соотношение навоз: вода в ней равно 1:0). Остальные 4 партии сухих проб навоза помещают в центрифужные пробирки на фильтровальную бумагу с размером пор 12-15 мкм (например, марки "Черная лента" по международной классификации). Затем в пробирки добавляют дистиллированную воду без перемешивания с пробой в соотношениях навоз: вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии. Таким образом имитируется низкообъемная влажность навоза, характерная в случае выпадения дождя (соотношение навоз: вода в пределах 1:1÷1:2), и высокообъемная влажность навоза, характерная в случае таяния снега (соотношение навоз: вода в пределах 1:3÷1:4). Центрифужные пробирки с пробами вставляют в ротор центрифуги и тут же центрифугируют не менее 5 минут для получения из них водных проб навоза соответственно под номерами №2, №3, №4 и №5. После этого каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера с добавлением необходимых реагентов и инкубируют их в термостате при +30°С в течение одних суток. По завершению инкубирования анализируют активность фермента дегидрогеназы в пробах №1, №2, №3, №4 и №5 спектрофотометрическим методом с необходимой математической обработкой полученных результатов для каждой партии проб.

На фиг. 1 приведена схема дюралюминиевой центрифужной пробирки (в разрезе) для получения водных проб из навоза и в ней использованы следующие обозначения:

1 - цилиндр;

2 - проба навоза;

3 - кружок фильтровальной бумаги;

4 - дюралюминиевое ситечко;

5 - внешняя резьба;

6 - внутренняя резьба;

7 - накопитель;

8 - водная проба навоза.

На фиг. 2 приведено оборудование и устройство для анализа активности фермента дегидрогеназы сухой пробы навоза и водных проб из навоза с использованием следующих обозначений:

9 - термостат;

10 - модифицированная колба Эрленмейера;

11 - реакционная смесь;

12 - коленчатый отросток колбы Эрленмейера с насыщенным щелочным раствором пирогаллола.

Способ идентификации микробного загрязнения водной среды посредством анализа активности фермента дегидрогеназы реализуют следующим образом.

На территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба М 1:200000 или крупнее, определяют место выпаса скота и намечают точки, в которых будут отобраны образцы навоза. Определение этих точек и их число производится с учетом того, чтобы в конечном итоге был получен усредненный репрезентативный образец навоза. Отобранные образцы навоза высушивают (при комнатной температуре), просеивают (через сито диаметром ячеек 3 мм) и тщательно перемешивают для получения сухого образца. Из этого, полученного таким образом образца, берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, т.е. всего 30 проб.

Первая партия представляет собой сухие пробы навоза и идет под номером №1 (соотношение навоз: вода в ней равно 1:0).

Для получения водных проб из навоза используют метод центрифугирования с применением, например, центрифуги марки К-24 с холодильным устройством. Для этого остальные 4 партии сухих проб навоза, т.е. всего 24 штуки проб, помещают в цилиндры (1) отдельных дюралюминиевых центрифужных пробирок на кружки фильтровальной бумаги (3) с размером пор 12-15 мкм (например, марки "Черная лента" по международной классификации). Эти кружки фильтровальной бумаги предварительно укладываются на дюралюминиевые ситечки (4), лежащие на выступах цилиндров, фиг. 1. Затем в пробы в центрифужных пробирках добавляют дистиллированную воду без перемешивания в соотношениях навоз: вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии. Таким образом имитируется низкообъемная влажность навоза, характерная в случае выпадения дождя (соотношение навоз: вода в пределах 1:1÷1:2), и высокообъемная влажность навоза, характерная в случае таяния снега (соотношение навоз: вода в пределах 1:3÷1:4). Центрифужные пробирки с пробами вставляют в ячейки ротора центрифуги, плотно завинчивают крышку ротора и тут же центрифугируют для получения из них водных проб навоза соответственно под номерами №2, №3, №4 и №5. Процедуру центрифугирования производят при 10000 оборотах в минуту не менее 5 минут при температуре около 12°С для получения водных проб навоза (8) в их накопителе (7), т.е. отвинчивающейся нижней части центрифужной пробирки. В накопителе (7), благодаря внешней (5) и внутренней (6) резьбе центрифужной пробирки происходит, без каких-либо потерь, сбор отдельных водных проб навоза.

Затем в сухой пробе навоза №1 и водных пробах из навоза №2, №3, №4 и №5 анализируют активность фермента дегидрогеназы спектрофотометрическим методом, фиг. 2. Для этого каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера (10). В эти колбы последовательно добавляют по 1 мл 1%-х водных растворов глюкозы (С₆Н₁₂О₆) и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (C₁₉H₁₅N₄Cl), и всю эту реакционную смесь (11) перемешивают. Далее в коленчатый отросток колбы Эрленмейера (12) с помощью шприца вводят насыщенный щелочной раствор пирогаллола (С₆Н₃(ОН)₃) в гидроксиде калия (КОН) для создания анаэробных условий. Колбы герметизируют стеклянными шлифованными пробками, дополнительно используя вакуумную смазку, и ставят на инкубирование в термостат (9) при +30°С на одни сутки.

После завершения инкубирования проб в течение 1 суток, производят экстракцию, образующегося в них 2,3,5-трифенилформазана (C₁₉H₁₆N₄) с помощью этанола (С₂Н₅ОН) - 5 раз по 4 мл. Экстракты каждой отдельной пробы объединяют, доводят этанолом до объема 25 мл и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре (при длине волны λ=490 им). Затем по заранее подготовленному калибровочному графику для различных количеств C₁₉H₁₆N₄ в этаноле (например, 1-30 мкг/л), рассчитывают количество образованного вещества, выражаемое в единицах мкг или мг C₁₉H₁₆N₄/(г⋅сут) для сухого навоза. Для водных проб навоза количество образованного вещества пересчитывают на 1 мл и выражают единицах мкг или мг C₁₉H₁₆N₄/(мл⋅сут), различающиеся в различных вариантах. По результатам анализа активности фермента дегидрогеназы идентифицируют микробное загрязнение водной среды из навоза скота, происходящее в результате просачивания через навоз дождевых и/или талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки.

Например, были проведены опыты с усредненным репрезентативным образцом навоза, отобранным с места выпаса крупного рогатого скота на территории пастбищного скотоводства в Московской области. Образец прошел операции последующего высушивания, просеивания с перемешиванием. Из него были получены сухие пробы навоза и водные пробы из навоза. После проведения описанных и дополнительных процедур лабораторных анализов было установлено статистически доказанное микробное загрязнение воды, которое определяется посредством анализа активности фермента дегидрогеназы, табл. 1.

При этом значения активности фермента дегидрогеназы были подтверждены, результатами анализа количества микробов, продуцирующих данный фермент в различных пробах, проведенного по общепринятой методике [см. Звягинцев Д.Г., Асеева И.В., Бабьева И.П., Мирчинк Т.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. С. 15-20, 34-38]. Из этих, сравнительных исследований и полученных аналитических данных, видно, что проба сухого навоза №1, как первичного очага микробов, характеризуется максимальными значениями активности фермента дегидрогеназы, 667 мкг C₁₉H₁₆N₄/(г⋅сут), и количеством микробов, 2,2⋅10⁹ клеток/г, продуцирующих данный фермент. В водных пробах навоза №2, №3, №4 и №5, как вторичного очага микробов, при расширении соотношения навоз: вода в ряду - 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4, активность фермента оказалась в прямо пропорциональной зависимости от количества микробов, т.е. чем ниже была активность дегидрогеназы, тем меньшее количество микробов идентифицировалось в водной пробе и наоборот. Следует отметить, что если результаты анализа показывают нулевое значение активности фермента дегидрогеназы, то означает полное отсутствие микробного загрязнения водной среды из навоза.

Способ позволяет оперативно (в течение 1 суток):

- идентифицировать микробное загрязнение водной среды из навоза скота, происходящее в результате просачивания через навоз дождевых и талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки;

- обеспечить высокую точность и качество оценки эпидемиологической ситуации, вызванной патогенными микробами на территориях пастбищного скотоводства, первичным очагом которых может быть навоз больных животных;

- обосновать принятие профилактических или ремедиационных мер, чтобы избежать инфицирования местного населения через загрязненные поверхностные и подземные водоисточники, используемые для питьевых целей.

Изобретение относится к области геоэкологии и может быть использовано для идентификации микробного загрязнения водной среды. С этой целью на территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба, М 1:200000 и крупнее, определяют место выпаса скота. Затем с места выпаса скота отбирают усредненный репрезентативный образец навоза, который высушивают (при комнатной температуре) и просеивают (через сито диаметром ячеек 3 мм) для получения сухого образца. Из этого образца берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, т.е. всего 30 проб. Первая партия представляет собой сухие пробы навоза и идет под номером №1 (соотношение навоз: вода в ней равно 1:0). Остальные 4 партии сухих проб навоза помещают в центрифужные пробирки на фильтровальную бумагу с размером пор 12-15 мкм (например, марки "Черная лента" по международной классификации). Затем в пробирки добавляют дистиллированную воду без перемешивания с пробой в соотношениях навоз: вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии. Таким образом, имитируется низкообъемная влажность навоза, характерная в случае выпадения дождя (соотношение навоз: вода в пределах 1:1÷1:2), и высокообъемная влажность навоза, характерная в случае таяния снега (соотношение навоз: вода в пределах 1:3÷1:4). Центрифужные пробирки с пробами вставляют в ротор центрифуги и тут же центрифугируют не менее 5 минут для получения из них водных проб навоза соответственно под номерами №2, №3, №4 и №5. После этого каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера с добавлением необходимых реагентов и инкубируют их в термостате при +30°С в течение одних суток. По завершению инкубирования анализируют активность фермента дегидрогеназы в пробах №1, №2, №3, №4 и №5 спектрофотометрическим методом с необходимой математической обработкой полученных результатов для каждой партии проб. Достигается повышение оперативности и упрощение идентификации. 2 ил., 1 табл.

Способ идентификации микробного загрязнения водной среды из навоза скота посредством анализа активности фермента дегидрогеназы, отличающийся тем, что на территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба М 1:200000 или крупнее, определяют место выпаса скота, затем с места выпаса скота отбирают усредненный репрезентативный образец навоза, который высушивают и просеивают для получения сухого образца, из которого берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, первую партию, под номером №1, оставляют сухой, а остальные пробы навоза помещают в центрифужные пробирки на фильтровальную бумагу с размером пор 12-15 мкм, после чего в пробирки добавляют дистиллированную воду без перемешивания с пробой в соотношениях навоз : вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии, после чего пробирки помещают в ротор центрифуги и тут же центрифугируют не менее пяти минут для получения из них водных проб из навоза соответственно под номерами партий №2, №3, №4 и №5, после чего каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера с добавлением необходимых реагентов и инкубируют их в термостате при +30°С в течение одних суток, после чего анализируют активность фермента дегидрогеназы спектрофотометрическим методом в каждой пробе, по которой судят о микробном загрязнении водной среды из навоза скота.