СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПАСНОСТИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ ВОДЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к гигиенической медицине и экологии и может найти применение при оценке санитарного состояния водоемов, их пригодности для использования в качестве источника водозабора, а также для мониторинга процесса очистки сточных вод.

Для характеристики санитарно-гигиенического состояния водоемов первостепенное значение имеет степень их микробиологического загрязнения, а также выявление в них патогенных микроорганизмов и возбудителей паразитарных заболеваний. Это обусловлено тем, что инфекционная диарея является ведущей причиной заболеваемости населения и детской смертности. В связи с этим выявление загрязнения водных объектов микроорганизмами играет важную роль в определении степени экологического неблагополучия региона. Причем такая оценка необходима, в первую очередь, для источников водозабора, а также для контроля процесса очистки сточных вод.

Вместе с тем нередко возникает необходимость в экспресс-оценке санитарно-гигиенического состояния водоема, главным образом, в случае чрезвычайных ситуаций и экологических бедствий. Это требует определения микробиологической загрязненности непосредственно на месте происшествия. Однако нам не известен метод, который позволял бы в полевых условиях в течение нескольких минут дать оценку санитарного состояния водоема.

В настоящее время для определения опасности микробиологической загрязненности воды считается достаточным показать, что исследуемый образец воды содержит определенное количество бактерий, известных как специфические обитатели кишечного тракта, даже если они не являются прямыми возбудителями заболеваний, при этом в очаге эпидемии важен контроль как общей микробиологической загрязненности воды, так и наличия жизнеспособных бактерий. Индикаторами таких загрязнений чаще всего являются бактерии Escherichia coli. Большая часть стандартных методов включает посев бактерий, инкубацию при 37° или 44°C и последующий подсчет числа выросших колоний через 24-72 ч. Основным недостатком этих методов является их длительность (1-3 суток) и непригодность для экспресс-оценки санитарно-гигиенического состояния водоема, что особенно важно в чрезвычайных ситуациях.

Известны методы, включающие использование флуоресцентной индикации для определения β-D-галактозидазы фермента E. coli, который гидролизует 4-метилумбеллиферил β-D-галактозид. Это позволяет сократить время обнаружения микроорганизмов до 1,5 ч, Zweifel U.L. et al. Total counts of marine bacteria include a large fraction of non-nucleoid-containing bacteria (Ghosts). - Appl. Environm. Microbiol., 1995, V. 61, p. 2180-2185. Однако этот метод непригоден для объективной экспресс-оценки загрязненности водоемов живыми патогенными бактериями, которые не имеют этого фермента (например, Vibro cholerae).

Известен способ определения микробиологической загрязненности воды, описанный в заявке CA 2264272 (A1), опубл. 26.03.1998. Согласно данному способу отбирается жидкая проба, содержащая микроорганизмы, в контейнер, где находится флуоресцентный сенсор, позволяющий определить по снижению интенсивности флуоресценции уровень дыхания исследуемых бактерий в жидкости. Сопоставление этого параметра для анализируемого образца и контрольного образца, не содержащего дышащих бактерий, позволяет рассчитать по специальной программе наличие живых микроорганизмов в среде. Однако этот способ требует применения сложного и достаточно дорогостоящего оборудования, а определение флуоресценции в среде связано с расходом дефицитного флуорохрома, причем весь процесс изменений дыхания бактерий может быть обусловлен вариациями парциального давления кислорода в атмосфере, что в итоге также отражается на показателях аэробного пути обеспечения энергии микроорганизмами и может привести к неадекватной трактовке полученных результатов.

Известен способ определения микробиологического загрязнения водных сред, заключающийся в отборе проб исследуемой среды, ее пропускании через бактерицид формулы R₄NI_n((n-1)/2)H₂O, доведении pH пробы до значений 5-6 и определении числа живых микробных тел среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом, RU 2286565 C2, опубл. 27.10.2006. Способ позволяет в пробе воды объемом 50 см³ количественно определить активное микробное загрязнение в течение 30 мин с точностью до 400 бактерий/см³. Однако этот способ, как и вышеупомянутый, может быть реализован только в стационарных условиях и требует наличия специального оборудования.

Известен способ определения микробиологической загрязненности воды путем обработки пробы воды неионным детергентом, инкубации ее с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (красителем) и последующего определения флуоресценции при ультрафиолетовом возбуждении. Согласно данному способу используют стандартные пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции каждой пробы, а также контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, строят калибровочную кривую зависимости между концентрацией КОЕ и разностью интенсивности флуоресценции в каждой стандартной пробе и контрольной пробе, определяют флуоресценцию анализируемой пробы и разность значения этой флуоресценции и флуоресценции контрольной пробы, по калибровочной кривой определяют соответствующую этой разности концентрацию КОЕ в анализируемой пробе и в случае превышения этой концентрацией допустимого значения более чем на 20% микробиологическую загрязненность оценивают как опасную. Детергентную обработку проводят в присутствии комплексона и при ионной силе, соответствующей концентрации NaCl выше 1 М, а определение интенсивности флуоресценции осуществляют при λ_фл=460±5 нм, для детергентной обработки используют раствор 0,05-ного тритона X-100, содержащего 0,1 моль Na₂ЭДТА и 2 моль NaCl при pH 7,8 8,2, RU 2079138 C1, опубл. 10.05.1997.

Недостаток данного способа, принятого за прототип настоящего изобретения, состоит в следующем. В способе-прототипе, осуществляемом при λ_фл=460±5 нм, происходит определение, главным образом, концентрации ДНК, величина которой пропорциональна общему количеству микроорганизмов. Данная λ_фл=460±5 нм соответствует максимальному свечению 4′,6-диамидино-2-фенилиндола для анализируемого количества ДНК. Вместе с тем при обработке сточных вод дезинфицирующими средствами жизнеспособность патогенных микроорганизмов и, соответственно, опасность инфицирования потребителей воды резко уменьшаются. Поэтому для более корректной оценки инфекционной опасности воды необходимо определять не общее число микроорганизмов, а количество жизнеспособных (колониеобразующих) бактерий. Однако способ-прототип позволяет определить только общее количество микроорганизмов по ДНК, среди которых только часть является жизнеспособной.

Жизнеспособность клеток обеспечивают окислительно-восстановительные реакции, в которых принимает участие никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Являясь коферментом энзимов, обеспечивающих эти реакции, он принимает водород и электроны от окисляемых веществ, а восстановленная форма - (НАД·Н) способна переносить их на другие вещества. Наличие НАД является свидетельством осуществления ферментативных реакций, характерной чертой живых бактерий. Однако известно, что при λ_фл=460±5 нм НАД удовлетворительно не определяется, поскольку наиболее интенсивное свечение исходит не от НАД, а от окрашенной флуорохромом ДНК. Недостатком способа-прототипа является необходимость использования лизирующей смеси, что усложняет процесс и увеличивает его продолжительность.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности оценки инфекционной опасности воды, упрощение и сокращение продолжительности процесса.

Согласно изобретению в способе определения опасности микробиологической загрязненности воды, при котором используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции I_фл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции I_флк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, при возбуждении ультрафиолетовым излучением, строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением I_фл-I_флк в каждой пробе, определяют флуоресценцию I_фла анализируемой пробы и значение I_фла-I_флк, по калибровочной кривой определяют соответствующую I_фла-I_флк концентрацию КОЕ_ап в анализируемой пробе и в случае превышения КОЕ_ап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную, определение I_фл, I_флк, I_фла, осуществляют при длине волны флуоресценции λ_фл=415±10 нм.

Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию патентоспособности «Новизна».

Реализация отличительных признаков заявленного изобретения обусловливает весьма важный технический результат. Если способ-прототип позволяет определить общее количество микроорганизмов, независимо от их жизнеспособности, то заявленный способ обеспечивает возможность преимущественного определения количества жизнеспособных и, следовательно, опасных микроорганизмов с учетом НАД, при этом установлено, что максимальное свечение НАД имеет место при λ_фл=415±10 нм; при больших отклонениях λ_фл от 415 нм свечение НАД существенно снижается, что значительно уменьшает точность определения концентрации КОЕ. Какой-либо краситель или иные вспомогательные вещества не требуются.

Заявителем не выявлены источники информации, в которых содержались бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат.

Указанные обстоятельства позволяют сделать вывод о соответствии заявленного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

На фиг. 1 приведена зависимость I_фл-I_флк (в относительных единицах) и концентрация КОЕ бактерий в пробах, используемых при построении калибровочной кривой; на фиг. 2 - фрагмент калибровочной кривой, иллюстрирующий ее использование при определении концентрации КОЕ бактерий в анализируемой пробе.

Заявленный способ реализуют следующим образом. Для построения калибровочной кривой использовали пробы объемом 2,0 мл, содержащие от 0 (контрольная проба) до 15×10³ кл/мл. Контрольная проба представляла собой дистиллированную воду, в качестве остальных проб использована суспензия бактерий Escherichia coli. Коли-индекс установлен путем высева бактерий на агар и подсчета титра КОЕ. Пробы воды облучают ультрафиолетовым излучением с длиной волны λ_возб=350±10 нм. Интенсивность флуоресценции проб в конкретных примерах определяли при длине волны флуоресценции λ_фл=415 нм на флуориметре MPF-850 (Hitachi, Япония), после чего строили калибровочную кривую (фиг. 1).

В примере 1 анализируемую пробу в объеме 2,0 мл брали с поверхности воды в районе пляжа яхт-клуба на озере Разлив (г. Сестрорецк) и подвергали ультрафиолетовому облучению аналогично описанным выше пробам, использованным при построении калибровочной кривой. Затем с помощью флуориметра при длине волны λ_фл=415 нм определили интенсивность флуоресценции I_фл анализируемой пробы и I_фла-I_флк.

По калибровочной кривой установили, что данному значению I_фла-I_флк соответствует концентрация КОЕ=1,14×10³ кл/мл, что значительно превышает опасный уровень.

Затем для сравнения данную пробу анализировали с использованием способа-прототипа. В результате установили, что в данной пробе концентрация бактерий (общее микробное число - ОМЧ) составляет 2,8×10³ кл/мл. Таким образом, заявленный способ позволяет определять, главным образом, количество жизнеспособных клеток (КОЕ), значительно меньшее общего микробного числа, в котором преобладает количество нежизнеспособных бактерий.

В примере 2 анализируемая проба была взята из реки Олонка, респ. Карелия. Аналогичным образом установлено, что концентрация КОЕ в анализируемой пробе составляет 0,25×10³ кл/мл, что несколько превышает опасный уровень. В примере 2 при анализе пробы воды с использованием способа-прототипа было установлено, что ОМЧ составляет 7,6×10³ кл/мл. Долю жизнеспособных бактерий в ОМЧ с помощью способа-прототипа оценить невозможно, поэтому его результаты более чем в 30 раз завышают оценку опасности микробиологической загрязненности воды р. Олонка, осуществленную с помощью заявленного способа.

Таким образом, заявленный способ позволяет быстро, просто и надежно с достаточной точностью оценить опасность микробиологической загрязненности воды с учетом жизнеспособных бактерий, представляющих биологическую опасность. Калибровочная кривая строится для определенного флуориметра и используется при работе с ним многократно, время анализа пробы занимает не более 3 минут.

Изобретение относится к гигиенической медицине и экологии и может найти применение при оценке санитарного состояния водоемов. Для этого определяют микробиологическую загрязненность воды. Согласно предложенному способу используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий. При возбуждении ультрафиолетовым излучением определяют интенсивность флуоресценции I_фл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции I_флк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду при длине волны λ_фл=415±10 нм. Затем строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением I_фл-I_флк в каждой пробе, определяют флуоресценцию I_фла анализируемой пробы и значение I_фла-I_флк, по калибровочной кривой определяют соответствующую I_фла-I_флк концентрацию КОЕ_ап в анализируемой пробе. В случае превышения КОЕ_ап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную. Изобретение обеспечивает точность оценки инфекционной опасности воды, упрощает и сокращает время определения и может быть использовано для мониторинга процесса очистки сточных вод. 2 ил., 2 пр.

Способ определения опасности микробиологической загрязненности воды, при котором используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции I_фл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции I_флк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, при возбуждении ультрафиолетовым излучением, строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением I_фл-I_флк в каждой пробе, определяют флуоресценцию I_фла анализируемой пробы и значение I_фла-I_флк, по калибровочной кривой определяют соответствующую I_фла-I_флк концентрацию КОЕ_ап в анализируемой пробе и в случае превышения КОЕ_ап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную, отличающийся тем, что определение I_фл, I_флк, I_фла осуществляют при длине волны флуоресценции λ_фл=415±10 нм.