ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США номер 61/933954, поданной 31 января 2014 года, и временной заявки на патент США номер 62/104122, поданной 16 января 2015, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылок.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к модифицированным средствам биологического контроля и популяциям, которые обладают улучшенными свойствами.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Болезни растений и сельскохозяйственные вредители необходимо контролировать, чтобы сохранять качество и количество продуктов питания, кормов и волокон, производимых фермерами по всему миру. Болезни растений вызываются, главным образом, грибами, бактериями, вирусами и нематодами. Вредители растений включают, среди прочих, жующих, сосущих и колющих насекомых из отрядов чешуекрылых (Lepidoptera), жесткокрылых (Coleoptera) и полужесткокрылых (Hemiptera). Химические пестициды широко используются в сельском хозяйстве для защиты сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней. Эти химические продукты борются с вредителями, болезнями сельскохозяйственных культур и сорной растительностью, приводя к повышению урожайности. Без защиты сельскохозяйственных культур и борьбы с их вредителями производство и качество производимых продуктов питанию будет снижаться. Однако применение химических пестицидов приводит к определенному риску, поскольку многие из них обладают свойствами, которые могут представлять опасность для здоровья людей и окружающей среды, если используется не должным образом.
Проблемой, связанной с постоянным применением пестицидов, гербицидов и других химических средств защиты сельскохозяйственных культур, является развитие резистентности к средству контроля. Резистентность к пестицидам - это пониженная восприимчивость популяции вредителя к средству контроля, применяемому в дозах, которые ранее поражали большинство особей этого вида. Таким образом, существует потребность в новых продуктах с различными механизмами действия для способствования противодействию развития резистентности.
Давно известно, что филогенетически различающиеся микроорганизмы могут выступать в качестве природных антагонистов различных возбудителей болезней растений и сельскохозяйственных вредителей. Взаимодействия между растениями-хозяевами и микроорганизмами, которые приводят к биоконтролю, могут включать в себя антибиоз, конкуренцию, индукцию резистентности хозяина и хищническое истребление. Скрининг и тестирование изолятов привели к получению ряда кандидатов для промышленного внедрения. Микробные биопестициды предоставляют важную альтернативу контроля болезней растений и вредителей. Существует потребность в биологических средствах контроля, способных конкурировать в полевых условиях, в частности в присутствии гербицидов и фунгицидов, которые обычно используются в коммерческом сельском хозяйстве, и способных обладать антибиотическим действием на микроорганизмы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к композициям и способам для улучшения способности популяции биологических средств или средств биоконтроля конкурировать и выживать в полевых условиях. При улучшении популяции биологических средств модифицированная популяция средств способна расти, конкурировать с другими микробными штаммами и грибами, а также обеспечить защиту растений от патогенов. Кроме того, модифицированные средства биологического контроля стимулируют рост растений и урожайность. В частности, методами селекции или генной инженерии получены модифицированные биологические средства и модифицированные популяции таких средств, которые являются устойчивыми или резистентными к биоцидам, устойчивыми или резистентными к гербицидам, устойчивыми или резистентными к фунгицидам, устойчивыми или резистентными к пестицидам либо устойчивыми или резистентными к химическим средствам защиты сельскохозяйственных культур. Таким образом, повышается защита сельскохозяйственных культур от возбудителей болезней или сельскохозяйственных вредителей усиливается.
Модифицированные биологические средства могут расти в присутствии по меньшей мере одного гербицида, фунгицида, пестицида или другого химического средства защиты сельскохозяйственных культур, которые используются в коммерческом сельском хозяйстве. Такие модифицированные биологические средства способны расти и размножаться в почвах, где применялись такие гербициды, фунгициды, пестициды или другие химические средства защиты сельскохозяйственных культур. Модифицированные биологические средства могут придавать почве способность подавлять болезнетворные патогены или вредители или придавать резистентность к болезнетворным патогенам или вредителям. Такие модифицированные популяции биологических средств могут добавляться в почву для предотвращения развития патогенных грибов и болезней, которые они вызывают, или для ингибирования поедания насекомыми-вредителями или нематодами, стимулирования роста растений и повышения их урожайности. Следовательно, настоящее изобретение может использоваться для повышения конкурентоспособности модифицированных биологических средств, особенно по сравнению с другими микробными средствами, которые не являются резистентными к гербицидам, фунгицидам, пестицидам или другим химическим средствам защиты сельскохозяйственных культур. Таким образом, композиции по настоящему изобретению включают полученные селекцией или инженерией биологические средства и модифицированные популяции средств биоконтроля. Эти модифицированные биологические средства могут использоваться в качестве посевного материала или в качестве покрытия растений и семян. Они также могут и опрыскиванием надземных частей растений и могут смешиваться с гербицидом или другим химическим соединением, под которые они были модифицированы для придания им устойчивости. Как отмечалось выше, присутствие модифицированных биологических средств в полевых условиях повышает устойчивость растений к патогенам и стимулирует рост растений. Такие модифицированные биологические средства по изобретению могут использоваться с другими средствами для стимулирования роста растений и повышения урожайности.
Примеры осуществления настоящего изобретения включают следующие варианты:
1. Способ улучшения средства биоконтроля, причем указанный способ включает модифицирование указанного средства биоконтроля для придания ему резистентности по меньшей мере к одному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур.
2. Способ по варианту осуществления 1, в котором указанное средство биоконтроля модифицировано выращиванием в присутствии гербицида, фунгицида, пестицида или других химических средств защиты сельскохозяйственных культур для селекции резистентного штамма.
3. Способ по варианту осуществления 1, в котором указанное средство биоконтроля модифицировано трансформацией указанного средства биоконтроля геном, который придает резистентность к указанному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур.
4. Способ по любому из вариантов осуществления 1-3, в котором указанное средство биоконтроля представляет собой бактериальное средство биоконтроля.
5. Способ по любому из вариантов осуществления 1-3, в котором указанное средство биоконтроля выбрано из группы, включающей роды Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Lysobacter, Trichoderma, Paecilomyces, Gliocladium, Ampelomyces, Pythium, Metschnikowia, Chromobacterium, Penicillium, Coniothyrium, Chaetomium, Myrothecium, Aureobasidium, Pantoea, Burkholderia, Streptomyces, Variovorax, Pasteuria, Lactobacillus, Paenibacillus, Xanthomonas.
6. Способ по варианту осуществления 5, в котором указанное бактериальное средство биоконтроля представляет собой бактерию Pseudomonas.
7. Способ по варианту осуществления 6, в котором указанная бактерия Pseudomonas представляет собой бактерию Pseudomonas fluorescens или Pseudomonas chlororaphis.
8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-7, в котором гербицид выбран из группы, включающей глифосат, глюфосинат (ингибитор глутаминсинтазы), гербициды на основе производных сульфонилмочевины и имидазолинона (ингибиторы синтеза аминокислот с разветвленной цепью).
9. Модифицированное средство биоконтроля, где указанное средство биоконтроля получено селекцией под гербицид, фунгицид, пестицид или другое средство защиты сельскохозяйственных культур и резистентно к указанному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур.
10. Модифицированное средство биоконтроля по варианту осуществления 9, в котором указанное модифицированное средство биоконтроля представляет собой бактериальное средство биоконтроля.
11. Модифицированное средство биоконтроля по варианту осуществления 9, в котором указанное средство биоконтроля выбрано из группы, включающей роды Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Lysobacter, Trichoderma, Paecilomyces, Gliocladium, Ampelomyces, Pythium, Metschnikowia, Chromobacterium, Penicillium, Coniothyrium, Chaetomium, Myrothecium, Aureobasidium, Pantoea, Burkholderia, Streptomyces, Variovorax, Pasteuria, Xanthomonas.
12. Модифицированное средство биоконтроля по варианту осуществления 10, в котором указанное бактериальное средство биоконтроля представляет собой бактерию Pseudomonas.
13. Модифицированное средство биоконтроля по варианту осуществления 12, в котором указанная бактерия Pseudomonas представляет собой бактерию Pseudomonas fluorescens или Pseudomonas chlororaphis.
14. Модифицированное средство биоконтроля по любому из вариантов осуществления 9-13, в котором гербицид выбран из группы, включающей глифосат, глюфосинат (ингибитор глутаминсинтазы), гербициды на основе производных сульфонилмочевины и имидазолинона (ингибиторы синтеза аминокислот с разветвленными цепями).
15. Рекомбинантное средство биоконтроля, где указанное средство биоконтроля трансформировано геном резистентности к гербициду, придающим средству биоконтроля резистентность к гербициду.
16. Рекомбинантное средство биоконтроля по варианту осуществления 15, в котором указанное модифицированное средство биоконтроля представляет собой бактериальное средство биоконтроля.
17. Рекомбинантное средство биоконтроля по варианту осуществления 16, в котором указанное бактериальное средство биоконтроля выбрано из группы, включающей роды Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Lysobacter, Gliocladium, Pythium, Chromobacterium, Penicillium, Pantoea, Burkholderia, Streptomyces, Variovorax, Pasteuria и Xanthomonas.
18. Рекомбинантное средство биоконтроля по варианту осуществления 17, в котором указанное бактериальное средство биоконтроля представляет собой бактерию Pseudomonas.
19. Рекомбинантное средство биоконтроля по варианту осуществления 18, в котором указанная бактерия Pseudomonas представляет собой бактерию Pseudomonas fluorescens или Pseudomonas chlororaphis.
20. Рекомбинантное средство биоконтроля по любому из вариантов осуществления 15-19, где гербицид выбран из группы, включающей глифосат, глюфосинат (ингибитор глютаминсинтазы), гербициды на основе производных сульфонилмочевины и имидазолинона (ингибиторы синтеза аминокислот с разветвленной цепью цепи).
21. Модифицированная популяция средств биоконтроля, где популяция по существу включает средство биоконтроля по любому из вариантов осуществления 1-20.
22. Состав для контроля растительного патогена, причем указанный состав включает модифицированную популяцию средств биоконтроля, где указанные средства биоконтроля являются резистентными к гербицидам, и подходящий носитель.
23. Состав по варианту осуществления 22, в котором указанная популяция включает модифицированные бактериальные средства биоконтроля.
24. Состав по варианту осуществления 22, в котором указанная популяция включает средства биоконтроля.
25. Состав по любому из вариантов осуществления 22-24, в котором указанное средство биоконтроля присутствует в эффективном количестве, достаточном для улучшения здоровья, роста или урожайности растения в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения биоцида.
26. Состав по варианту осуществления 25, в котором средство биоконтроля включает штамм, депонированный как NRRL № В-50897, и биоцид представляет собой глифосат.
27. Состав по варианту осуществления 25, в котором средство биоконтроля включает штамм AIP050999, депонированный как NRRL № В-50999, и биоцид представляет собой глюфосинат.
28. Способ улучшения способности средства биоконтроля конкурировать в полевых условиях, причем указанный способ включает модифицирование указанного биологического средства таким образом, что указанное модифицированное средство биоконтроля способно расти в присутствии гербицида.
29. Способ стимулирования роста растения, где указанный способ включает нанесение композиции, содержащей модифицированную популяцию средств биоконтроля, на почву, где растет указанное растение.
30. Способ по варианту осуществления 29, в котором указанные средства биоконтроля модифицированы для придания им резистентности к глифосату или глюфосинату.
31. Способ выращивания растения, включающий нанесение на сельскохозяйственную культуру, семена или посевные площади комбинации эффективного количества биоцида и эффективного количества модифицированного средства биоконтроля, где
(a) эффективное количество биоцида является таковым, что избирательно контролирует целевой организм без значительного повреждения сельскохозяйственной культуры; и
b) эффективное количество модифицированного средства биоконтроля является достаточным для статистически значимого стимулирования здоровья, повышения урожайности и/или роста растений по сравнению со здоровьем, урожайностью и/или ростом растения, которые имеют место, когда немодифицированное средство биоконтроля применяется в такой же концентрации в комбинации с эффективным количеством биоцида.
32. Способ по варианту осуществления 31, в котором модифицированное средство биоконтроля и биоцид применяются одновременно.
33. Способ по варианту осуществления 32, в котором модифицированное средство биоконтроля и биоцид применяются последовательно.
34. Способ по любому из вариантов осуществления 31-33, в котором указанное средство биоконтроля включает штамм, депонированный как NRRL № В-50897.
35. Способ по варианту осуществления 34, в котором биоцид представляет собой глифосат и эффективное количество глифосата является таковымтаковым, что селективно контролирует сорную растительность без значительного повреждения сельскохозяйственной культуры.
36. Способ по любому из вариантов осуществления 31-33, в котором указанное средство биоконтроля включает штамм AIP050999, депонированный как NRRL № В-50999, и биоцид представляет собой глюфосинат.
37. Способ по варианту осуществления 36, в котором биоцид представляет собой глюфосинат и эффективное количество глифосата является таковым, что селективно контролирует сорную растительность без значительного повреждения сельскохозяйственной культуры.
38. Культивированная популяция средства биоконтроля, где указанная культивированная популяция получена выращиванием популяции средств под гербицид, фунгицид, пестицид или другое средство защиты сельскохозяйственных культур для селекции очищенной культуры средств биоконтроля, которые резистентны к указанному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур.
39. Культивированная популяция средства биоконтроля по варианту осуществления 38, где указанное средство биоконтроля присутствует в эффективном количестве, достаточном для улучшения здоровья, роста или урожайности растения в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения биоцида.
40. Выделенная биологически чистая культура средства биоконтроля, где указанное средство биоконтроля резистентно к биоциду, выбранному из гербицида, фунгицида, пестицида или химического средства защиты сельскохозяйственных культур, где указанная культура получена выращиванием в присутствии указанного биоцида.
41. Выделенная биологически чистая культура средства биоконтроля по варианту осуществления 40, где указанное средство биоконтроля присутствует в эффективном количестве, достаточном для улучшения здоровья, роста или урожая растения в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения биоцида.
42. Способ по варианту осуществления 38, в котором указанная композиция включает подходящий носитель.
43. Бактериальная культура, выращенная из штамма, депонированного как NRRL № В-50897, где указанная бактериальная культура обладает фунгицидной активностью и способна расти в присутствии глифосата.
44. Бактериальная культура по п.43, где штамм, депонированный как NRRL № В-50897, присутствует в эффективном количестве, достаточном для улучшения здоровья, роста или урожайности растения в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения глифосата.
45. Бактериальная культура, выращенная из штамма AIP050999, депонированного как NRRL № В-50999, где указанная бактериальная культура обладает фунгицидной активностью и способна расти в присутствии глюфосината.
46. Бактериальная культура по п.45, в котором штамм AIP050999, депонированный как NRRL № В-50999, присутствует в эффективном количестве, достаточном для улучшения здоровья, роста или урожайности растения в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения глюфосината.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 представлена кривая роста различных штаммов в присутствии глифосата.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к композициям и способам для улучшения средств биологического контроля. Термин «биологическое средство» или «средство биоконтроля» в настоящем изобретении используется для описания микроорганизма, который используется для контроля болезнетворных растительных патогенов и вредителей растений. Средства биологического контроля по настоящему изобретению были модифицированы таким образом, что они способны расти в присутствии по меньшей мере одного биоцида. Биоцид представляет собой химическое соединение, которое способно оказывать контролирующее действие на организм химическими или биологическими средствами. Биоциды включают пестициды, такие как фунгициды, гербициды, инсектициды, другие средства защиты сельскохозяйственных культур и т.п. Композиции по изобретению включают одно или несколько выделенных средств биоконтроля, которые были получены селекцией для придания им резистентности к биоцидам, таким как гербицид, фунгицид, пестицид или другое химическое средство защиты сельскохозяйственных культур; рекомбинантное средство биоконтроля, которое было трансформировано для введения гена резистентности к гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур; модифицированную популяцию средств биоконтроля, где популяция резистентна по меньшей мере к одному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур; и композиции, включающие в себя эти модифицированные популяции средств биоконтроля. Модифицированная популяция может содержать микроорганизмы, которые были получены селекцией для придания им для резистентности к гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур или были трансформированы геном, который придает резистентность или устойчивость к такому гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур. Таким образом, изобретение включает по существу чистые культуры или биологически чистые культуры таких модифицированных средств биоконтроля или модифицированных биологических средств. Термин «биологически чистая бактериальная культура» относится к культуре бактерий, не содержащей других видов бактерий в количествах, которые выявляются обычными бактериологическими методами. Другими словами, это культура, в которой практически все присутствующие бактериальные клетки представляют собой клетки выбранного штамма. Модифицированное средство биоконтроля включает средства биоконтроля, которые приобрели признак благодаря давлению отбора, и рекомбинантные средства биоконтроля, которые были трансформированы геном, придающим резистентность или устойчивость по меньшей мере к одному гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур.
Кроме того, изобретение охватывает конкретное модифицированное средство биологического контроля. Такое средство включает AIP1620. AIP1620 представляет собой штамм Pseudomonas, который был получен селекцией для придания ему устойчивости к глифосату. Дополнительные средства включают AIP050999. AIP050999 представляет собой штамм Pseudomonas, который был получен селекцией для придания ему устойчивости к глюфосинату.
AIP1620 депонирован в Патентном Депозитарии Национального центра сельскохозяйственного применения научно-исследовательской службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A, 31 января 2014 года с присвоением ему идентификационного номера NRRL № B-50897. AIP050999 депонирован в Патентном Депозитарии Национального центра сельскохозяйственного применения научно-исследовательской Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A, 23 января 2015 года с присвоением ему идентификационного номера NRRL № B-50999. Каждый из этих депозитов будет храниться в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для процедуры выдачи патентов. Это депонирование сделано просто для удобства работы специалистов данной области техники и не является признанием того, что депонирование необходимо в соответствии с Разделом 35 Кодекса законов США 112.
Выражение «устойчивость к химическому гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур или резистентность к химическому гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур» означает способность организма (то есть растения, средства биоконтроля, бактериального средства биоконтроля и т.д.) выживать и размножаться после воздействия химического гербицида, фунгицида, пестицида или другого химического средства защиты сельскохозяйственных культур в дозе, которая обычно является летальной для организма дикого типа.
Биологические средства или средства биоконтроля по изобретению включают микроорганизмы и грибы, которые контролируют болезнетворные патогены растений и стимулируют здоровье, рост и урожайность растений. Любое из этих биологических средств или средств биоконтроля может быть модифицировано селекцией или трансформацией с получением модифицированного биологического средства или средства биоконтроля или рекомбинантного биологического средства или средства биоконтроля. Таким образом, изобретение включает выделенное модифицированное средство биоконтроля. Модифицированные средства биоконтроля можно выращивать для получения популяции средств биоконтроля. Термин «модифицированная популяция биологических средств или средств биоконтроля» означает популяцию средств, которая по существу включает культуру средства, полученного селекцией, или рекомбинантного средства, обладающего целевым признаком, таким как резистентность к гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур. По существу, термин «включает» подразумевает, что популяция была выращена и получена из модифицированного или рекомбинантного средства биоконтроля. То есть, модифицированные или рекомбинантные средства биоконтроля можно выращивать для получения биологически чистой культуры. Следует представлять, что такие биологически чистые культуры могут применяться совместно для улучшения здоровья, роста или урожайности растений.
Любое биологическое средство или средство биоконтроля может применяться в способах по настоящему изобретению. Конкретные микроорганизмы, представляющие интерес, включают штаммы бактерий Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Lysobacter, Gliocladium, Pythium, Chromobacterium, Penicillium, Pantoea, Lactobacillus, Paenibacillus, Burkholderia, Streptomyces, Variovorax, Pasteuria, Xanthomonas и т.д. Грибы, представляющие интерес, включают Aureobasidium, Ampelomyces, Beauveria, Metarhizium, Metschnikowia, Myrothecium, Lecanicillium, Chaetomium, Cordyceps, Coniothyrium, Dactylella, Gliocladium, Aspergillis, Paecilomyces, Trichoderma, Pisolithus, Glomus и т.д. См., например, Патенты США №№ 5348742, 5496547, 5756087, 5955348, 6060051, 6635425 и Публикацию Патента США 20130142759, которые включены в данное описание в качестве ссылок. В продаже предлагается множество средств биоконтроля, и любое из них может быть изменено в соответствии с настоящим изобретением. Такие средства включают: Agrobacterium radiobacter K84; Trichoderma atroviride; Bacillus subtilis GB03; Bacillus Firmus I-1582; Trichoderma asperellum (ICC 012); T. gamsii (ICC 080); Bacillus pumilus штамм QST 2808; Bacillus pumilus штамм QST 713; B. subtilis штамм MBI 600; Paecilomyces fumosoroseus; Gliocladium catenulatum; Trichoderma harzianum rifai штамм KRL-AG2; Trichoderma harzianum Т-22; Trichoderma harzianum Т-22; Trichoderma virens штамм G-41; Trichoderma harzianum Т-22; Bacillus subtilis QST 713; Bacillus amyloliquefaciens штамм D747; Trichoderma (Gliocladium) virens GL-21; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces fumosoroseus; Ampelomyces quisqualis; B. subtilis DSM 17231; B. licheniformis DSM 17236; Pythium oligandrum DV 74; Bacillus subtili GB03; Trichoderma asperellum; Т. gamsii; Pseudomonas syringae ESC-10; Metschnikowia fructicola; Trichoderma harzianum Т-22; Pseudomonas chlororaphis MA 342; B. amyloliquifaciens; Chromоbacterium subtsugae штамм PRAA4-1; B. subtilis amyloliquefaciens FZB24; Penicillium bilaii; Paecilomyces fumosoroseus FE 9901; Streptomyces lydicus WYEC 108; P. syringae A506; Coniothyrium minitans; Paecilomyces lilacinus штамм 251; Streptomyces lydicus WYEC-108; Bacillus amyloliquifaciens; Trichoderma virens; Trichoderma viride; Ampelomyces quisqualis; Chaetomium globosum; Pseudomonas fluorescens; Bacillus subtilis; Bacillus pumulis; Myrothecium verrucaria AARC-0255; Streptomyces actinobacterium штамм К61; Gliocladium catenulatum J1446; Aureobasidium pullulans штамм DSM 14940; и A. pullulans штамм DSM 14941. Дополнительные биологические средства контроля болезней можно найти в интернете на сайте: nevegetable.org/table-22-biological-disease-control-products.
Болезнетворные патогены включают грибы, бактерии, вирусы и нематоды. Средства биоконтроля по изобретению представляют собой средства, которые предназначены для поражения любого из растительных патогенов. Целевые патогенные организмы включают, но без ограничения, Alternaria, Botrytis, Fusarium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Cercospora, Colletotrichum, Cladosporium, -Erisyphae spp., Microsphaera syringae, Peronospora spp., Plasmopara spp., Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Diplocarpon, Venturia, Mycosphaerella, Phomopsis, Taphrina, Elsinoe, Sclerotinia, Verticillum, Gnomonia, Fusicladium, Nectria, Phyllosticta, Diplocarpon, Albugo, Guignardia, Botrytis, Exobasidium, Entomosporium, Exobasidium, Pestalotia, Phoma, Cristulariella, Phakopsora, Thelaviopsis, Puccinia, Peronospora, Bremia, Pantoea, Clavibacter.
Резистентность к гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур - это способность организма выживать и размножаться после воздействия химического гербицида, фунгицида, пестицида или другого химического средства защиты сельскохозяйственных культур в дозе, которая обычно является смертельной для организма дикого типа или приводит к существенному сокращению роста организма дикого типа. Резистентность может быть вызвана или установлена благодаря селекции или может быть индуцирована с помощью генной инженерии. Для определения и получения модифицированной популяции средств биоконтроля путем селекции средство биоконтроля выращивают в присутствии химического гербицида, фунгицида, пестицида или другого химического средства защиты сельскохозяйственных культур в качестве давления отбора. Чувствительные средства погибают, в то время как резистентные средства выживают для репродукции без конкуренции. По мере того, как средства биологического контроля растут в присутствии химического гербицида, фунгицида, пестицида или другого химического средства защиты сельскохозяйственных культур, резистентные средства биоконтроля успешно размножаются и становятся доминирующими в популяции, представляя собой модифицированную популяцию средства биоконтроля. Методы селекции резистентных штаммов известны и описаны в патентах США №№ 4306027 и 4094097, которые включены в данное изобретение в виде ссылок. Таким образом, изобретение включает биологически чистую культуру резистентного штамма биоконтроля. Резистентные штаммы по изобретению обладают такими же идентификационными характеристиками, как и исходный чувствительный штамм, за исключением того, что они являются значительно более устойчивыми к конкретному химическому гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур. Таким образом, их идентификация легко осуществима сравнением с характеристиками известного чувствительного штамма.
Гербициды включают глифосат, ингибиторы АККазы (арилоксифеноксипропионат (FOPS)); ингибиторы ALS (сульфонилмочевины (SU), имидазолиноны (IMI), пиримидины (PM)); ингибиторы белков, ассоциированных с микротрубочками (динитроанилин (DNA)); синтетические ауксины (фенокси (Р), бензойная кислота (BA), карбоновые кислоты (СА)); ингибитор фотосистемы II (триазин (TZ), триазинон (TN), нитрилы (НТ), бензотиадиазиноны (BZ), мочевины(US)); ингибитор EPSP синтазы (глицины (GC)); ингибиторы синтеза глютамина (фосфиновая кислота (PA)); ингибитор DOXP синтазы (изоксазолидинон (IA)); ингибитор HPPD (пиразол (PA), трикетон (ТЕ)); ингибиторы PPO (простые дифениловые эфиры (DE), N-фенилфталимид (NP) (арил-триазинон (АТ)); ингибиторы VLFA (хлорацетамид (СА)), оксиацетамид (ОА)); ингибитор фотосистемы I ингибитор (бипиридилии (BP)); и т.п.
Пестициды включают имидаклоприд клотианидин, производные арилпиразола (WO2007103076); фосфорорганические соединения, фенилпиразол, пиретоиды, карбамоилоксимы, пиразолы, амидины, галогенированные углеводороды, карбаматы и их производные, тербуфос, хлорпирифос, фипронил, хлоретоксифос, телбутрин (тербутрин), карбофуран, имидаклоприд, тебупиримифос (5849320).
Фунгициды включают алифатические азотсодержащие фунгициды (бутиламин, цимоксанил, додицин, додин, гуазатин, иминоктадин); амидные фунгициды (бензовиндифлупир, карпропамид, хлораниформетан, цифлуфенамид, диклоцимет, димоксистробин, фенаминстробин, феноксанил, флуметовер, фураметпир, изофетамид, изопиразам, мандестробин, мандипропамид, метоминостробин, оризастробин, пентиопирад, прохлораз, квиназамид, силтиофам, трифорин); фунгициды на основе аминокислот (беналаксил, беналаксил-М, фуралаксил, металаксил, металаксил-М, пефуразоат, валифеналат); анилидные фунгициды (беналаксил, беналаксил-М, биксафен, боскалид, карбоксин, фенгексамид, флуксапироксад, изотианил, металаксил, металаксил-М, метсульфовакс, офурас, оксадиксил, оксикарбоксин, пенфлуфен, пиракарболид, седаксан, тифлузамид, тиадинил, вангард); бензанилидные фунгициды (беноданил, флутоланил, мебенил, мепронил, салициланилид, теклофталам); фуранилидные фунгициды (фенфурам, фуралаксил, фуркарбанил, метфуроксам); сульфонанилидные фунгициды (флусульфамид); бензамидные фунгициды (бензогидроксамовая кислота, флуопиколид, флуопирам, тиоксимид, трихламид, зариламид, зоксамид); фурамидные фунгициды (циклафурамид, фурмециклокс); фенилсульфамидные фунгициды (дихлофлуанид, толилфлуанид); сульфонамидные фунгициды (амисулбром, циазофамид); валинамидные фунгициды (бентиаваликарб, ипроваликарб); антибиотические фунгициды (ауреофунгин, бластицидин-S, циклогексимид, гризеофульвин, касугамицин, мороксидин, натамицин, полиоксины, полиоксорим, стрептомицин, валидамицин); стробилуриновые фунгициды (флуоксастробин, мандестробин); метоксиакрилат-тробилуриновые фунгициды (азоксистробин, бифужинжи, кумоксистробин, эноксатробин, флуфеноксистробин, jiaxiangjunzhi, пикоксистробин, пираоксистробин); метоксикарбанилат-стробилуриновые фунгициды (пираклостробин, пираметостробин, триклопирикарб); метоксииминоацетамид-стробилуриновые фунгициды (димоксистробин, фенаминстробин, метоминостробин, орисастробин); метоксииминоацетат-стробилуриновые фунгициды (крезоксим-метил, трифлоксистробин); ароматические фунгициды (дифенил, хлординитронафталины, хлоронеб, хлороталонил, крезол, диклоран, fenjuntong, гексахлорбензол, пентахлорфенол, квинтозин, пентахлорфеноксид натрия, текназен, трихлортринитробензолы); фунгициды на основе соединений мышьяка (асомат, урбацид); арилфенилкетоновые фунгициды (метрафенон, пириофенон); фунгициды на основе производных бензимидазола (альбендазол, беномил, карбендазим, хлорфеназол, ципендазол, дебакарб, фуберидазол, мекарбинзид, рабензазол, тиабендазол); бензимидазольные предшественники фунгицидов (фурофанат, тиофанат, тиофанатметил); фунгициды на основе производных бензотиазола (бенталурон, бентиаваликарб, бентиазол, хлорбентиазон, пробеназол); ботанические фунгициды (аллицин, берберин, карвакрол, карвон, остол, сангвинарин, сантонин); мостиковые дифенильные фунгициды (битионол, дихлорофен, дифениламин, гексахлорофен, паринол); карбаматные фунгициды (бентиаваликарб, фурофанат, иодокарб, ипроваликарб, пикарбутразокс, пропамокарб, пирибенкарб, тиофанат, тиофанат-метил, толпрокарб); бензимидазолилкарбаматные фунгициды (альбендазол, беномил, карбендазим, ципендазол, дебакарб, мекарбинзид); карбанилатныe фунгициды (диэтофенкарб, пираклостробин, пираметостробин, триклопирикарб); каназольные фунгициды, коназольные фунгициды (имидазолы) (климбазол, клотримазол, имазалил, окспоконазол, прохлораз, трифлумизол); коназольные фунгициды (триазолы) (азаконазол, бромуконазол, ципроконазол, диклобутразол, дифеноконазол, диниконазол, диниконазол-М, эпоксиконазол, этаконазол, фенбуконазол, флуквинконазол, флусилазол, флутриафол, фурконазол, фурконазол-цис, гексаконазол, имибенконазол, ипконазол, метконазол, миклобутанил, пенконазол, пропиконазол, протиоконазол, квинконазол, симеконазол, тебуконазол, тетраконазол, триадимефон, триадименол, тритиконазол, униконазол, униконазол-П; медьсодержащие фунгициды (аципетакс-медь, бордосская жидкость, бургундская жидкость, жидкость Cheshunt, ацетат меди, карбонат меди, основной, гидроксид меди, нафтенат меди, меди олеат, оксихлорид меди, силикат меди, сульфат меди, сульфат меди основной, хромат меди-цинка, куфранеб, купробам, оксид меди, манкоппер, оксиновая медь, saisentong, тиадиазол-медь); цианакрилатные фунгициды (бензамакрил, фенамакрил); дикарбоксимидные фунгициды (фамоксадон, флуороимид); дихлорфенилдикарбоксимидные фунгициды (хлозолинат, дихлозолин, ипродион, изоваледион, миклозолин, процимидон, винклозолин); фталимидные фунгициды (каптафол, каптан, диталимфос, фолпет, тиохлорфенприм); динитрофенольные фунгициды (бинапакрил, динобутон, динокап, динокап-4, динокап-6, мептилдинокап, диноктон, динопентон, диносульфон, динотербон, ДНОК); дитиокарбаматными фунгициды (амобам, асомат, азитирам, карбаморф, суфранеб, купробам, дисульфирам, фербам, метам, набам, текорам, тирам, урбацид, цирам); циклические дитиокарбаматные фунгициды (дазомет, этем, мильнеб); полимерные дитиокарбаматные фунгициды (манкоппер, манкозеб, манеб, метирам, поликарбамат, пропинеб, цинеб); дитиолановые фунгициды (изопротиолан, saijunmao); фумигантные фунгициды (сероуглерод, цианоген, простой дитиоэфир, метилбромид, метилиодид, тетратиокарбонат натрия); гидразидные фунгициды (бенквинокс, saijunmao); имидазольные фунгициды (циазофамид, фенамидон, фенапанил, глиодин, ипродион, изоваледион, пефуразоат, триазоксид); коназольные фунгициды (имидазолы) (климазол, клотримазол, имазалил, окспоконазол, прохлораз, трифлумизол); неорганические фунгициды (азид калия, тиоцианат калия, азид натрия, сера, см. также медьсодержащие фунгициды, см. также неорганические фунгициды на основе соединений ртути); фунгициды на основе соединений ртути; фунгициды на основе неорганических соединений ртути (хлорид ртути(II), оксид ртути(II), хлорид ртути(I)); фунгициды на основе органических соединений ртути (бромид (3-этоксипропил)ртути, ацетат этилртути, бромид этилртути, хлорид этилртути, 2,3-дигидроксипропилмеркаптид этилртути, фосфат этилртути, N-(этилртуть)-п-толуолсульфонанилид, гидраргафен, хлорид 2-метоксиэтилртути, бензоат метилртути, дициандиамид метилртути, пентахлорфеноксид метилртути, 8-фенилртуть оксихинолин, фенилртутьмочевина, ацетат фенилртути, хлорид фенилртути, фенилртутное производное пирокатехина, нитрат фенилртути, салицилат фенилртути, тиомерсал, ацетат толилртути); морфолиновые фунгициды (альдиморф, бензаморф, карбаморф, диметоморф, додеморф, фенпропиморф, флуморф, тридеморф); фосфорорганические фунгициды (ампропилфос, диталимфос, EBP, эдифенфос, фосетил, гексилтиофос, инезин, ипробенфос, изопамфос, kejunlin, фосдифен, пиразофос, толклофосметил, триамифос); оловоорганические фунгициды (декафентин, фентин, оксид трибутилолова); оксатииновые фунгициды (карбоксин, оксикарбоксин); оксазольные фунгициды (хлозолинат, дихлозолин, дразоксолон, фамоксадон, гимексазол, метазоксолон, миклозолин, оксадиксил, оксатиапипролин, пиризоксазол, винклозолин); полисульфидные фунгициды (полисульфид бария, полисульфид кальция, полисульфид калия, полисульфид натрия); пиразольные фунгициды (бензовиндифлупир, биксафен, фенпиразамин, флуксапироксад, фураметпир, изопиразам, оксатиапипролин, пенфлуфен, пентиопирад, пираклостробин, пираметостробин, пираоксистробин, рабензазол, седаксан); пиридиновые фунгициды (боскалид, бутиобат, дипиритион, флуазинам, флуопиколид, флуопирам, паринол, пикарбутразокс, пирибенкарб, пиридинитрил, пирифенокс, пиризоксазол, пироксихлор, пироксифур, триклопирикарб); пиримидиновые фунгициды (бупиримат, дифлуметорим, диметиримол, этиримол, фенаримол, феримзон, нуаримол, триаримол); анилинопиримидиновые фунгициды (ципродинил, мепанипирим, пириметанил); пиррольные фунгициды (диметахлон, фенпиклонил, флудиоксонил, флуороимид); фунгициды четвертичного аммония (берберин, сангвинарин); хинолиновые фунгициды (этоксиквин, галакринат, сульфат 8-оксихинолина, квинацетол, квиноксифен, тебуфлоквин); хиноновые фунгициды (хлоранил, дихлон, дитианон); хиноксалиновые фунгициды (хинометионат, хлорквинокс, тиоквинокс); тиадиазольные фунгициды (этридиазол, saisentong, тиадиазол-медь, цинк-тиазол); тиазольные фунгициды (этабоксам, изотианил, метсульфовакс, октилинон, оксатиапипролин, тиабендазол, тифлузамид); тиазолидиновые фунгициды (флутианил, тиадифлуор); тиокарбаматные фунгициды (метасульфокарб, протиокарб); тиофеновые фунгициды (этабоксам, изофетамид, силтиофам); триазиновые фунгициды (анилазин); триазольные фунгициды (амисульфбром, битертанол, флуотримазол, триазбутил); коназольные фунгициды (триазолы) (азаконазол, бромуконазол, ципроконазол, диклобутразол, дифеноконазол, диниконазол, диниконазол-М, эпоксиконазол, этоконазол, фенбуконазол, флуквинконазол, флусилазол, флутриафол, фурконазол, фурконазол-цис, гексаконазол, huanjunzuo, имибенконазол, ипконазол, метконазол, миклобутанил, пенконазол, пропиконазол, протиоконазол, квинконазол, симеконазол, тебуконазол, тетраконазол, триадимефон, триадименол, тритиконазол, униконазол, униконазол-П); триазолопиримидиновые фунгициды (аметоктрадин); мочевиновые фунгициды (бенталурон, пенцикурон, кваназамид); фунгициды на основе соединений цинка (аципетакс-цинк, хромат меди-цинка, куфранею, манкоцеб, метирам, поликарбамат, полиоксoрим-цинк, пропинеб, нафтенат цинка, триазол цинка (zinc thiazole), трихлорфеноксид цинка, цинеб, цирам); неклассифицированные фунгициды (ацибензолар, аципетакс, аллиловый спирт, хлорид бензалкония, бетоксазин, бромоталонил, хитозан, хлорпикрин, DBCP, гидроуксусная кислота, дикломезин, диэтилпирокарбонат, этилицин, фенаминосульф, фенитропан, фенпропидин, формальдегид, фурфурол, гексахлорбутадиен, метилизотиоцианат, нитростирол, нитротал-изопропил, ОСН, пентахлорфениллаурат, 2-фенилфенол, фталид, пипералин, пропамидин, проксиназид, пироквилон, ортофенилфеноксид натрия, спироксамин, султропен, тиоциофен, трициклазол) или мефеноксам.
Как указывалось, рекомбинантные средства биоконтроля, обладающие резистентностью к гербициду, фунгициду, пестициду или другому химическому средству защиты сельскохозяйственных культур, могут быть получены с помощью методов генной инженерии, и такие генномодифицированные или рекомбинантные средства бионтроля, выращены для получения модифицированной популяции средств биоконтроля. Рекомбинантное средство биоконтроля получают введением полинуклеотидов в клетку-хозяин средства биоконтроля посредством трансформации. Методы трансформации микроорганизмов известны и доступны в данной области техники. См., например, Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol. Biol. 166, 557-77; Seidman, C.E. (1994) In: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. eds., John Wiley and Sons, NY; Choi et al. (2006) J. Microbiol. Methods 64:391-397; Wang et al. 2010. J. Chem. Technol. Biotechnol. 85:775-778. Трансформация может проводиться в лабораторных условиях путем естественного поглощения голой ДНК компетентных клеток из внешней среды. В качестве альтернативы, компетентные клетки могут быть получены посредством воздействия двухвалентных катионов в условиях охлаждения, с помощью электропорации, воздействием полиэтиленгликоля, обработкой волокнистыми наночастицами или другими способами, хорошо известными в данной области техники.
Гены резистентности к гербицидам для применения в трансформации рекомбинантного средства биоконтроля включают, но без ограничения, гены дезинтоксикации фумонизина (патент США № 5792931); ацетолактатсинтазные (ALS) мутанты, которые приводят к резистентности к гербицидам, в частности к гербицидам на основе производных сульфонилмочевин, такие как S4 и/или Hra мутации; ингибиторам глутаминсинтазы, таким как фосфинотрицин или баста (например, ген bar); резистентности к глифосату (EPSPS ген); и HPPD резистентности (WO 96/38576, Патенты США №№ 6758044, 7250561, 7935869 и 8124846), или другие такие гены, известные в данной области техники. Содержание указанных документов включено в данное описание в виде ссылок. Ген bar кодирует резистентность к гербициду баста, ген nptII кодирует резистентность к антибиотикам канамицину и генетицину, а мутанты ALS генов кодируют резистентность к гербицидам на основе сульфонилмочевин, включая хлорсульфурон, метсульфурон, сульфометурон, никосульфурона, римсульфурон, флазасульфурон, сульфосульфурон и триасульфурон, имидазолиноновым гербицидам, включая имазетапир, имазаквин, имазапир и имазаметабенз.
Модифицированные популяции средств биологического контроля по изобретению могут вводиться в составы смачиваемых порошков, дустов, гранул, жидких составов на водной или масляной основе и т.п. Такие составы будут содержать модифицированные средства биологического контроля с добавлением носителей и других добавок. Составы могут применяться в качестве полевых инокулятнов для биоконтроля, для покрытия семян и т.д. То есть модифицированные популяции средств биоконтроля могут применяться любым способом, известным в данной области, в том числе для покрытия семян эффективным количеством модифицированных средств, внесением модифицированных популяций биоконтроля в борозды непосредственно в почву, лиственным применением, введением смешиванием в горшечную смесь, а также для борьбы с болезнями после сбора урожая. Такие способы известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 5348742 и в Публикации Европейской заявки EP0472494 A2, содержание которых введено в данное описание в виде ссылок. Биоконтроль включает регулирование постоянных популяций и введение специфических организмов для снижения заболеваемости.
Средство биоконтроля, предоставленное в соответствии с изобретением, может смешиваться с фунгицидном, инсектицидом или гербицидом для повышения его активности или активности химического соединения, к которому оно было добавлено. В некоторых случаях комбинация средства биоконтроля и химического соединения может проявлять синергическую активность, когда смесь этих двух компонентов превышает их аддитивное действие.
Модифицированные средства биологического контроля по настоящему изобретению могут применяться для значительного облегчения болезни, стимулирования роста и урожайности растений, а также снижения зависимости от традиционных пестицидов. Модифицированные средства по настоящему изобретению могут применяться с другими пестицидами для эффективной комплексной программы борьбы с сельскохозяйственными вредителями. В одном варианте осуществления модифицированные популяции средств биоконтроля могут смешиваться в составе с известными пестицидами способом, описанным в WO 94/10845, содержание которого включено в данное описание в виде ссылки.
Модифицированные популяции средств биоконтроля применяются в эффективном количестве. Эффективное количество популяции модифицированного средства биоконтроля представляет собой количество, достаточное для контроля или ингибирования патогена. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество модифицированного средства биоконтроля представляет собой количество, достаточное для стимулирования или усиления здоровья, роста или повышения урожайности растений в присутствии сельскохозяйственной полевой дозы применения биоцида. Доза применения модифицированного средства биоконтроля и/или биоцида может изменяться в зависимости от целевого патогена, культуры, подлежащей защите, эффективности популяций модифицированных средств биоконтроля, тяжести заболевания, климатических условий и т.п. Обычно для полевой инокуляции доза применения модифицированного средства биоконтроля составляет 1012 до 1016 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар. (Это соответствует дозе применения в интервале примерно от 10 г до 10 кг активного ингредиента на гектар, если АИ составляет 100 миллиардов КОЕ на грамм). В других вариантах осуществления изобретения доза применения модифицированного средства биоконтроля для полевой инокуляции составляет от 3×1015 до 1×1017 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар. (Это соответствует дозе в интервале примерно от 30 кг до 1000 кг активного ингредиента на гектар, если АИ составляет 100 миллиардов КОЕ на грамм). В других вариантах осуществления изобретения доза применения модифицированного средства биоконтроля для полевой инокуляции составляет от 3×1015 до 1×1017 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар; от примерно 1×1012 до примерно 1×1013 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар, от примерно 1×1013 до примерно 1×1014 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар, от примерно 1×1014 до примерно 1×1015 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар, от примерно 1×1015 до примерно 1×1016 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар или от примерно 1×1016 до примерно 1×1017 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар. В других вариантах осуществления изобретения доза применения модифицированного средства биоконтроля для полевой инокуляции составляет по меньшей мере примерно 1×1013, примерно 1×1014, 1×1015, примерно 1×1016 или примерно 1×1017 колониеобразующих единиц (КОЕ) на гектар. В других вариантах осуществления изобретения доза применения модифицированного средства биоконтроля для полевой инокуляции составляет от 10 г до 50 кг, от 50 кг до 100 кг, от 100 кг до 200 кг, от 200 кг до 300 кг, от 300 кг до 400 кг, от 400кг до 500 кг, от 500 кг до 600 кг, от 600 кг до 700 кг, от 700 кг до 800 кг, от 800 кг до 900 кг, от 900 кг до 1000 кг активного ингредиента на гектар, если АИ содержит 100 миллиардов КОЕ на грамм. В других вариантах осуществления изобретения доза применения модифицированного средства биоконтроля составляет по меньшей мере 10 г, 50 кг, 100 кг, 200 кг, 300 кг, 400 кг, 500 кг, 600 кг, 700 кг, 800 кг, 900 кг, 1000 кг активного ингредиента на гектар, если АИ содержит 100 миллиардов КОЕ на грамм. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения применяемое модифицированное средство биоконтроля включает штамм, депонированный как NRRL № В-50897, и/или штамм AIP050999, депонированный как NRRL № В-50999.
Любая подходящая сельскохозяйственная доза применения биоцида может наноситься на культуру, например может применяться эффективное количество биоцида, которое контролирует заданный организм (т.е. целевой вредитель, такой как грибы, насекомые, сорная растительность, болезни и т.д.). Методы анализа для определения эффективного количества модифицированного средства биоконтроля включают, например, любое статистически значимое улучшение здоровья, увеличения урожайности и/или роста растений, которые имеют место при применении эффективного количества средства биоконтроля и полевой дозы применения биоцида по сравнению со здоровьем, урожайностью и/или ростом растений, которые имеют место, когда в такой же концентрации применяется немодифицированное средство биоконтроля в комбинации с эффективным количеством биоцида.
Таким образом, еще один вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет способ контроля или ингибирования роста растительного патогена применением популяции модифицированных средств биологического контроля по изобретению в среде, в которой может расти растительный патоген. Применение может осуществляться по растению, частям растения, семенам растений, которые подлежат защите, или на почву, на которой растение, подлежащее защите, растет или будет расти. Применение по растению или частям растения может осуществлять до или после сбора урожая. Применение по семенам будет осуществляться до высева семян.
В других вариантах осуществления изобретения сельскохозяйственная культура, площадь культивирования, семена и/или сорная растительность могут подвергаться обработке комбинацией эффективного количества модифицированного средства биоконтроля и эффективного количества биоцида. Термин «обработка комбинацией» или «применение комбинации» модифицированного средства биоконтроля и биоцида по сельскохозяйственной культуре, площади культивирования или полю означает, что одно или несколько конкретных полей, одна или несколько сельскохозяйственных культур, один или несколько видов семян и/или видов сорной растительности подвергаются обработке одним или несколькими модифицированными средствами биоконтроля и одним или несколькими биоцидами таким образом, что достигается желаемый эффект. Кроме того, применение одного модифицированного средства биоконтроля или модифицированного средства биоконтроля в сочетании с биоцидом может осуществляться до высева сельскохозяйственной культуры (например, в почву, на семена или растения). При этом применение модифицированного средства биоконтроля и биоцида может быть одновременным или в разное время (последовательно) при условии, что достигается желаемый эффект.
В одном неограничивающем варианте осуществления изобретения модифицированное средство биоконтроля резистентно к глифосату и дополнительно стимулирует здоровье, урожайность или рост растений при применении в эффективном количестве, а биоцид включает глифосат или его активное производное. В таких способах семена, растение или участок культивации обрабатывают комбинацией эффективного количества модифицированного средства биоконтроля, которое резистентно к глифосату, и эффективного количества глифосата, где эффективное количество глифосата таково, что селективно контролирует сорную растительность без значительного повреждения сельскохозяйственной культуры. В таких вариантах осуществления изобретения эффективное количество модифицированного средства биоконтроля является достаточным для получения статистически значимого улучшения здоровья, урожайности и/или роста растения по сравнению со здоровьем, урожайностью и/или ростом растения, которые имеют место при применении немодифицированного средства биоконтроля в такой же концентрации в комбинации с эффективным количеством глифосата или его активного производного. В еще одном варианте осуществления изобретения средство биоконтроля включает эффективное количество AIP1620.
В еще одном неограничивающем варианте осуществления изобретения модифицированное средство биоконтроля резистентно к глюфосинату и дополнительно стимулирует здоровье, урожайность или рост растений при применении в эффективном количестве, и биоцид включает глюфосинат или его активное производное. В таких способах семена, растение или площадь культивации обрабатывают комбинацией эффективного количества модифицированного средства биоконтроля, которое резистентно к глюфосинату, и эффективного количества глюфосината, где эффективное количество глюфосината таково, что селективно контролирует сорную растительность без значительного повреждения сельскохозяйственной культуры. В таких вариантах осуществления изобретения эффективное количество модифицированного средства биоконтроля является достаточным, чтобы привести к статистически значимому улучшению здоровья, повышению урожайности и/или роста растения по сравнению со здоровьем, урожайностью и/или ростом растения, которые имеют место при применении немодифицированного средства биоконтроля в такой же концентрации в комбинации с эффективным количеством глифосата или его активного производного. В еще одном варианте осуществления изобретения средство биоконтроля включает эффективное количество AIP050999.
Термин «растение», когда используется в данном описании, включает растительные клетки, протопласты растений, культуры ткани растительных клеток, из которых можно регенерировать растения, растительные calli, растительные сгустки и растительные клетки, которые не повреждены в растениях или частях растений, таких как эмбрионы, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветы, ветки, плоды, ядра, колосья, початки, шелуха, стебли, корни, кончики корней, пыльники и т.п. Термин «зерно» означает зрелые семена, производимые коммерческими производителями для целей, отличных от выращивания или воспроизвства видов. Потомство, варианты и мутанты регенерированных растений также включены в объем настоящего изобретения при условии, что эти части включают внедренные полинуклеотиды.
Модифицированное средство биоконтроля может применяться по любым видам растений, включая, но без ограничения, однодольные и двудольные растения. Примеры видов растений, представляющих интерес, включают, но без ограничения, кукурузу (Zea mays), Brassica sp. (например, B. napus, B. rapa, B. juncea), особенно виды Brassica, используемые в качестве источников растительного масла, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, просо жемчужное (Pennisetum glaucum), просо посевное (Panicum miliaceum), сетарию итальянская (Setaria italica), дагусса (Eleusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solanum tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), картофель сладкий (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофе (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao, чай (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), оливу (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), овес, ячмень, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.
Овощные культуры включают томаты (Lycopersicon esculentum), салат-латук (например, Lactuca sativa), фасоль обыкновенную (Phaseolus vulgaris), фасоль лимскую (Phaseolus limensis), горох (Lathyrus spp.), а также представителей рода Cucumis, такие как огурец (C. sativus), канталупа (С. cantalupensis) и дыня мускусная (C. melo). Декоративные растения включают азалию (Rhododendron spp.), гортензию (Macrophylla hydrangea), гибискус (Hibiscus rosasanensis), розы (Rosa spp.), тюльпаны (Tulipa spp.), нарциссы (Narcissus spp.), петунии (Petunia hybrida), гвоздику (Dianthus caryophyllus), пуансеттию (Euphorbia pulcherrima) и хризантему.
Хвойные, которые могут применяться в практике настоящего изобретения, включают, например, сосны, такие как сосна ладанная (Pinus taeda), сосна Эллиота (Pinus elliotii), сосна желтая (Pinus ponderosa), сосна скрученная (Pinus contorta) и сосна лучистая (Pinus radiata); ель Дугласа (Pseudotsuga menziesii); тсугу канадская (Tsuga canadensis); ель сизую (Picea glauca); красное дерево (Sequoia sempervirens); ели истинные, такие как пихты (Abies amabilis) и пихта бальзамическая (Abies balsamea); а также кедры, такие как Западный красный кедр (Thuja plicata) и кипарисовик нутканский (Chamaecyparis nootkatensis). В конкретных вариантах осуществления изобретения растения по настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные культуры (например, кукурузу, люцерну, подсолнечник, Brassica, сою, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеницу, просо, табак и т.д.). В других вариантах осуществления изобретения используются растения кукурузы или сои.
Приведенные далее примеры предоставлены в качестве иллюстрации изобретения, а не в качестве какого-либо его ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ПРИМЕР 1: Получение резистентных к глифосату мутантов AIP0069
Введение
Биологические средства в настоящее время используются в сельском хозяйстве для снижения риска и повышения урожайности. Одной из важных характеристик биологических средств является то, что они должны быть совместимы с химическими веществами, которые также могут применяться в коммерческой практике сельского хозяйства. Глифосат является химическим гербицидом, который составляет примерно 25% мирового рынка гербицидов и применяется в количестве примерно 200 миллионов фунтов в год. Этот гербицид ингибирует фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), который катализирует одну стадию в биосинтезе ароматических аминокислот в растениях и многих бактериях. Таким образом, глифосат снижает жизнеспособность организмов, включая любые средства биоконтроля, которые основываются на EPSPS, и, как сообщалось, изменяет растительное микробное сообществ. В этом же докладе описывается успешное внедрение устойчивости к глифосату в штамм Pseudomonas fluorescens, используемый в биологическом контроле ряда важных растительных патогенных грибов, включая Pythium и Rhizoctonia, возбудителей «выпревания», которое представляет собой комплексную болезнь, имеющую большое значение в сельском хозяйстве. Помимо улучшения химической совместимости этого средства биоконтроля, введение резистентности к глифосату обеспечивает дополнительные преимущества в промышленном производстве.
В дополнение к примеру резистентности к глифосату, предоставленному выше, другие агрохимикаты могут ингибировать рост желательного средства биологического контроля или бактерий, способствующих росту растений. Примеры включают гербициды глюфосинат (ингибитор глютаминсинтазы), гербициды на основе сульфонилмочевин и имидазолинона (ингибиторы синтеза аминокислот с разветвленной цепью) и антибиотики стрептомицин, окситетрациклин и касугамицин.
Материалы, методы и полученные результаты
Штамм средства биологического контроля Pseudomonas fluorescens AIP00699 высевают штрихом в планшеты с агаром, содержащим 0 или 5 мМ глифосата. Основная питательная среда состоит из 11,3 г Na2HPО4⋅7H2О, 3 г KH2PO4, 1 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 31 г патоки, 493 мг MgSО4⋅7H2О, 50 мг ZnSО4⋅7H2О, 5 мг FeSО4⋅7H2О и 0,3 г тиамина на литр деионизированной воды. В отсутствие глифосата многочисленные колонии бактерий видны после инкубации в течение ночи при 25°С. В присутствии 5 мМ глифосата после аналогичной инкубации колонии не видны, однако после дополнительной инкубации в течение нескольких дней замечено небольшое количество колоний. Эти колонии выделяют и выращивают в жидкой среде в присутствии глифосата, взятого в различных концентрациях. Один изолят, названный GlyphRl, в десять раз более устойчив к глифосату, чем исходный штамм AIP0069 (фигура 1). Ожидается, что этот улучшенный штамм является более конкурентоспособным и, таким образом, более эффективен в качестве биоконтроля, чем AIP0069 или подобные чувствительные к глифосату штаммы, в сельскохозяйственных системах, где глифосат присутствует в почве и культурах. Кроме того, глифосат может применяться в качестве селективного средства в процессе производства, получения и/или хранении этого штамма для предотвращения его загрязнения другими бактериями.
ПРИМЕР 2: Активность резистентных к глифосату мутантов в качестве средства биологического контроля
Бактерии инокулируют в 50 мл бульонной среды, состоящей из 11,3 г Na2HPO4⋅7H2O, 3 г KH2PO4, 1 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 30 г мелассы, 493 мг MgSO4⋅7H2O, 50 мг ZnSO4⋅7H2O и 5 мг FeSO4⋅7H2O на литр деионизированной воды. Культуры выращивают в колбах с отражающими ребрами (baffled flasks) объемом 250 мл в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С в течение 2 дней. Клетки собирают центрифугированием при 3500×g в течение 10 минут. Культуральные супернатанты утилизируют и клетки снова суспендируют в стерильной деионизованной воде до объемов исходных культур. AIP0323, мутант AIP0069, который не обладает противогрибковой активностью, включают в качестве отрицательного контроля.
Зерна риса, инфицированные Rhizoctonia solani, получают как описано ранее (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae as a biocontrol for Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease 78:193-199). Инфицированный рис измельчают в блендере и просеивают через сито #10 (с отверстиями диаметром 2 мм). Измельченное зерно смешивают со средой прорастания в дозе 2 г на литр.
Семена бальзамина (Impatiens) высевают в зараженную среду для проращивания в кассеты размером 402, каждую ячейку обрабатывают 0,3 мл повторно суспендированных бактерий и выращивают семена в стандартных тепличных условиях. Для каждой экспериментальной обработки выполняют 2 повтора с 20 лунками на повтор. Число здоровых проростков оценивают через две недели. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что резистентные к глифосату варианты AIP0404 и AIP1620 сохраняют полную фунгицидную активность, по сравнению со штаммом-предшественником AIP0069.
Таблица 1
Штамм средства биоконтроля может применяться для контроля красной фузариозной гнили колосьев, азиатской ржавчины сои, Rhizoctonia, Botrytis, Pythium, болезней газонных трав и т.п.
ПРИМЕР 3:
Гены, кодирующие EPSPS-ферменты устойчивости к глифосату, могут быть получены из различных бактерий (A. Schulz et al., 1985. Differential sensitivity of bacterial 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases to the herbicide glyphosate. FEMS Microbiology Letters, 28:297-301). В частности, гены EPSPS из Agrobacterium tumefaciens CP4 (G.F. Barry et al, 1992. Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. p. 139-145. In B.K. Singh et al. (e.) Biosynthesis and molecular regulation of amino acids in plants. Am. Soc. Plant Physiologists, Rockville, MD) и Arthrobacter globiformis (C.L. Peters et al, 2010, GRG23 and GRG51 genes conferring herbicide resistance. Патент США № 7674958), являются высокорезистентными.
Подходящий ген амплифицируют с помощью ПЦР или получают синтетически с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Открытую рамку считывания клонируют в плазмидный вектор рКК223-3 (Pharmacia) между tacI промотором и транскрипционным терминатором rrnB. Промотор tacI обеспечивает сильную конститутивную экспрессию генов в Pseudomonas. Геномные ДНК последовательности из штамма AIP0069 встраивают с каждой стороны кассеты промотор-ген-терминатор для направления гомологичной рекомбинации в хромосому AIP0069.
Полученную в результате плазмиду мобилизуют из E.coli в Pseudomonas fluorescens AIP0069 конъюгацией, способом, хорошо известным в данной области, и селекцией на определенной среде, содержащей 100 мМ глифосата. Плазмида содержит узкую область хозяина colE1 в результате репликации и, таким образом, не может копироваться в Pseudomonas. Резистентные к глифосату колонии получают встраиванием кассеты промотор-ген-терминатор в хромосому Pseudomonas посредством гомологичной рекомбинации. События единственного перекреста хромосом (где вся плазмида интегрирована в хромосому) отличают от событий двойного перекреста (где интегрирована только целевая кассета промотор-ген-терминатор) с помощью ПЦР, саузерн-блоттинга или других методов, хорошо известных в данной области техники. Для применения выбирают событие двойного кроссинговера.
ПРИМЕР 4
Стартовые культуры AIP1620 инокулируют с использованием колоний из чашек с агаром Лурия, выращивают в 0,1X NBY бульоне (0,8 г питательного бульона Дифко и 0,5 г порошка дрожжевого экстракт на литр деионизированной воды) в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С. Продуцирующие культуры выращивают в бульоне, содержащем на литр деионизированной воды 11,3 г Na2HPO4⋅7H2O, 3,0 г KH2PO4, 1,0 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 3,0 г мелассы, 0,49 г MgSO4⋅7H2O, 50 мг ZnSO4⋅7H2O, 5 мг FeSO4⋅7H2O и соляную кислоту в количестве, достаточном для доведения значения рН до примерно 6,2. Пятьдесят мл бульона с продуцирующими культурами помещают в колбу объемом 250 мл с отражающими ребрами, инокулируют 0,5 мл стартовой культуры и инкубируют в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об./мин., при 28°С. Продуцирующие культуры инокулируют в разное время и затем собирают одновременно с получением культур со временем инкубации 15, 24, 33 и 43 часов. Сорок мл каждой культуры собирают центрифугированием. Отработанный культуральный бульон утилизируют и клетки повторно суспендируют в автоклавированной деионизированной воде, доводя конечный объем до 40 мл.
Инокулят грибов получают с использованием способа с применением рисового зерна, описанного Холмсом и Бенсоном (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199.). Инфицированные зерна риса измельчают в блендере и просеивают через сито #10. Полученный инокулят смешивают со сверхтонкой смесью проращивания Фафарда в дозе 1,0 г на литр.
Инокулированную смесь проращивания помещают в 392 тепличные кассеты (Landmark Plastic Corporation, Akron, OH), и в каждую ячейку высевают по одному семени Impatiens. Клеточные суспензии AIP1620 наносят в дозе 0,3 мл на ячейку. Семена проращивают в стандартных тепличных условиях. Для каждой обработки выполняют 3 повтора с 20 лунками на повтор. Спустя от 10 до 14 дней подсчитывают количество здоровых проростков в каждой обработке. Результаты представлены в таблице 2 ниже.
ПРИМЕР 5
В течение 10 месяцев проводят несколько тепличных испытаний клеток AIP1620. Для каждого испытания культуры AIP1620 выращивают, собирают и повторно суспендируют в автоклавированной деионизированной воде, как описано в примере 4, с использованием времени культивирования примерно 24 часов. Проращивание в тепличных условиях проводят как описано в примере 4, но дозу инокулирования R. solani варьируют от 0,25 до 1,0 г измельченного зерна риса на литр смеси проращивания в зависимости от испытания. Результаты, полученные из 17 испытаний и представленные в таблице 3 ниже, показывают стабильную способность AIP1620 контролировать болезнь растений, относящуюся к группе «выпревание».
ПРИМЕР 6
Пятьдесят граммов клеточной пасты AIP1620 смешивают с 50 г аттапульгитовой глины Min-U-Gel 400 или Min-U-Gel 200 (Active Minerals International, LLC, Sparks, MD), сушат до активности воды менее 0,3. Одну часть каждой композиции хранят при 4°С, а другую при 22°С. Жизнеспособность композиций тестируют в разное время посевом методом разведения, полученные результаты представлены в таблице 4 ниже. После хранения в течение 21 дня образцы, которые хранились при 4°С, испытывают в теплице на всхожесть семян и обнаруживают, что они сохраняют фунгицидную активность в отношении Rhizoctonia solani.
ПРИМЕР 7
Сто граммов клеточной пасты AIP1620 смешивают с 20 г синтетического силиката кальция (MicroCel E, Imerys Filtration Minerals, Lompoc, CA) с помощью кухонного комбайна. Полученный материал содержит 2,7⋅1010 колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) AIP1620, как определено посевом методом разведения. Материал сушат при температуре 40°С до активности воды менее 0,30, когда он содержит 1,4×109КОЕ/г AIP1620. Состав высушенного порошка хранят в вакуумных лавсановых мешочках при 22°C. Через 85 дней порошок содержит 1,1×106 КОЕ/г AIP1620 и сохраняет фунгицидную активность в отношении Rhizoctonia solani, как определено анализом всхожести семян в теплице.
ПРИМЕР 8
Сто граммов клеточной пасты AIP1620 смешивают с 5 г глицерина и 20 г синтетического силиката кальция с помощью кухонного комбайна. Полученный материал содержит 5,7×1011 КОЕ/г AIP1620, как определено посевом методом разведения. Материал сушат при температуре 40°С до активности воды менее 0,30, когда он содержит 3,1×109 КОЕ/г AIP1620. Состав сухого порошка хранят в вакуумных лавсановых мешочках при 22°C. Спустя 61 день порошок содержит 6,2×108 КОЕ/г AIP1620 и сохраняет фунгицидную активность в отношении Rhizoctonia solani, как определено анализом всхожести семян в теплице.
ПРИМЕР 9
Сто граммов клеточной пасты AIP1620 смешивают с 5 г трегалозы и 20 г синтетического силиката кальция с помощью кухонного комбайна. Полученный материал содержит 5,7×1011 КОЕ/г AIP1620, как определено посевом методом разведения. Материал сушат при температуре 40°С до активности воды менее 0,30, когда он содержит 4,0×10 КОЕ/г AIP1620. Состав высушенного порошка хранят в вакуумных лавсановых мешочках при 22°C. Спустя 54 дня порошок содержит 2,7×107 КОЕ/г AIP1620.
ПРИМЕР 10
Четыре грамма ксантановой камеди диспергируют в 4 г соевого масла. Полученную смесь смешивают с 100 г клеточной пасты AIP1620 и дают ей возможность загустеть в течение примерно 5 минут при комнатной температуре. Сгущенную смесь смешивают с 20 г синтетического силиката кальция с помощью кухонного комбайна. Полученный материал, содержащий 9,4×1011 КОЕ/г AIP1620, делят на две части по 50 г. Одну часть сушат при температуре 40°С до активности воды <0,30, когда она содержит 7,0×108 КОЕ/г AIP1620.
Другую часть сушат над силикагелем при комнатной температуре до активности воды <0,10, когда она содержит 1,18×1010КОЕ/г AIP1620.
ПРИМЕР 11
Пять различных составов получают по существу как описано в примере 4 выше, используя наполнители и соотношения, приведенные в таблице 5 ниже. Полученный составы сушат при температуре 40°С до активности воды менее 0,30 и хранят при температуре 4°С.
Инокулят грибов получают с использованием способа с применением рисового зерна, описанного Холмсом и Бенсоном (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199.). Инфицированные зерна риса измельчают в блендере и просеивают через сито #10. Полученный инокулят смешивают со сверхтонкой смесью проращивания Фафарда в дозе 0,25 г на литр.
Инокулированную смесь разделяют и добавляют состав АIP1620 в дозе 5 г на литр. Семена бальзамина (Impatiens) высевают в инокулированные и обработанные смеси. Семена проращивают в стандартных тепличных условиях. Через 10 дней подсчитывают количества здоровых проростков в каждой обработке. Полученные результаты представлены в таблице 6 ниже.
ПРИМЕР 12
Несколько составов получают, как описано в примерах с 4 по 8 выше, но в разное время. Составы различных составов приведены в таблице 7 ниже. После сушки до активности воды 0,30 или ниже материалы составов помещают в вакуумные мешочки и хранят при температуре 22°С.
Инокулят грибов получают с использованием способа с применением рисового зерна, описанного Холмсом и Бенсоном (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199.). Инфицированные зерна риса измельчают в блендере и просеивают через сито #10. Полученный инокулят смешивают со сверхтонкой смесью проращивания Фафарда в дозе 0,25 г на литр.
Инокулированную смесь разделяют и добавляют состав АIP1620 в дозе 5 г на литр. В тот же день образцы каждого состава высевают методом разбавления для определения количества КОЕ/г AIP1620. Семена бальзамина (Impatiens) высевают в инокулированные и обработанные смеси. Семена проращивают в стандартных тепличных условиях. Через 10-14 дней подсчитывают количества здоровых проростков в каждой обработке. Полученные результаты представлены в таблице 8 ниже.
Представленные результаты показывают, что AIP1620 в составах сохраняет жизнеспособность и активность, то есть способность защитить проростки от болезни группы выпревания.
ПРИМЕР 13
Пятьдесят граммов клеточной пасты AIP1620 смешивают с 50 г аттапульгитовой глины Min-U-Gel 400 или Min-U-Gel 200 (Active Minerals International, LLC, Sparks, MD), сушат до активности воды менее 0,3 и хранят при 22°C. Жизнеспособность составов тестируют в разное время посевом методом разбавления, полученные результаты представлены в таблице 9 ниже. Спустя 21 день оба состава тестируют в опыте проращивания семян в тепличных условиях, и полученные результаты показывают, что составы сохраняют фунгицидную активность в отношении Rhizoctonia solani.
Таблица 9
ПРИМЕР 14
Для демонстрации эффективности AIP1620 в контроле Botrytis cinerea проводят тепличные испытания.
Стартовые культуры AIP1620 инокулируют с использованием колоний из чашек с агаром Лурия и выращивают в 0,1X NBY бульоне (0,8 г питательного бульона Дифко и 0,5 г порошка дрожжевого экстракта на литр деионизированной воды) в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С. Продуцирующие культуры выращивают в бульоне, содержащем на литр деионизированной воды 11,3 г Na2HPO4⋅7H2O, 3,0 г KH2PO4, 1,0 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 3,0 г мелассы, 0,49 г MgSO4⋅7H2O, 50 мг ZnSO4⋅7H2O, 5 мг FeSO4⋅7H2O и соляную кислоту в количестве, достаточном для доведения значения рН до примерно 6,2. Пятьдесят мл бульона с продуцирующими культурами помещают в колбу объемом 250 мл с отражающими ребрами, инокулируют 0,5 мл стартовой культуры и инкубируют в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С. Продуцирующие культуры инокулируют в разное время и затем собирают одновременно с получением культур со временем инкубации 15, 24, 33 и 43 часов. Сорок мл каждой культуры собирают центрифугированием. Отработанный культуральный бульон утилизируют и клетки повторно суспендируют в автоклавированной деионизированной воде, доводя конечный объем до 40 мл.
Botrytis cinerea выращивают на бульоне картофельной декстрозы в течение от 1 до 2 недель без встряхивания. Образующуюся мицелиальную пленку удаляют из бульона и гомогенизируют в автоклавированной деионизированной воде для получения жидкого посевного материала.
Клубнику, выращенную без добавления химических удобрений, закупают на местном рынке. Отбирают плоды без пятен и погружают в инокулят B. cinerea на 2-3 секунды, а затем дают высохнуть в течение 60 минут до обработки. Обработку AIP1620 проводят погружением инокулированных плодов в суспензии клеток на 2-3 секунды. После этого плоды помещают в герметичные пластиковые контейнеры с влажным бумажным полотенцем для поддерживания высокой влажности и хранят при комнатной температуре в течение от 72 до 84 часов. Для каждой обработки проводят 14 повторов (ягод). Каждую ягоду обследуют визуально и тяжесть порчи оценивают в соответствии со следующей шкалой: 0=нет повреждений, 1=25% повреждено, 2=50% повреждено, 3=75% повреждено и 4=100% повреждено (то есть полное покрытие ягоды грибом). Полученные результаты представлены в таблице 10 ниже.
ПРИМЕР 15
Для демонстрации эффективности AIP1620 в контроле болезни выпревания, вызванной растительным патогенном подкласса оомицетов Pythium aphanadermatum, проводят тепличные испытания.
Стартовые культуры AIP1620 инокулируют с использованием колоний из чашек с агаром Лурия и выращивают в 0,1X NBY бульоне (0,8 г питательного бульона Дифко и 0,5 г порошка дрожжевого экстракта на литр деионизированной воды) в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С. Продуцирующие культуры выращивают в бульоне, содержащем на литр деионизированной воды 11,3 г Na2HPO4⋅7H2O, 3,0 г KH2PO4, 1,0 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 3,0 г мелассы, 0,49 г MgSO4⋅7H2O, 50 мг ZnSO4⋅7H2O, 5 мг FeSO4⋅7H2O и соляную кислоту в количестве, достаточном для доведения значения рН до примерно 6,2. Пятьдесят мл бульона с продуцирующими культурами помещают в колбу объемом 250 мл с отражающими ребрами, инокулируют 0,5 мл стартовой культуры и инкубируют в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, при 28°С. Продуцирующие культуры инокулируют в разное время и затем собирают одновременно с получением культур со временем инкубации 15, 24, 33 и 43 часов. Сорок мл каждой культуры собирают центрифугированием. Отработанный культуральный бульон утилизируют и клетки повторно суспендируют в автоклавированной деионизированной воде, доводя конечный объем до 40 мл.
Инокулят P. aphanadermatum получают с использованием способа с применением рисового зерна, описанного Холмсом и Бенсоном (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199.). Инфицированные зерна риса измельчают в блендере и просеивают через сито #10. Полученный инокулят смешивают со сверхтонкой смесью проращивания Фафарда в дозе 6,0 г на литр (испытания 1-4) или 7,0 г на литр (испытание 5).
Инокулированную смесь проращивания помещают в 392 тепличные кассеты (Landmark Plastic Corporation, Akron, OH) и в каждую ячейку высевают по одному семени бальзамина (Impatiens). Клеточные суспензии AIP1620 наносят в дозе 0,3 мл на ячейку. Семена проращивают в стандартных тепличных условиях. Для каждой обработки выполняют 2 или 3 повтора с 20 лунками на повтор. Спустя от 7 до 17 дней подсчитывают количество здоровых проростков в каждой обработке. Полученные результаты представлены в таблице 11 ниже.
ПРИМЕР 16. Контроль азиатской соевой ржавчины с помощью AIP1620
Клетки AIP1620 получают как описано в предыдущих примерах. Phakopsora pachyrhizi выращивают на чувствительных растениях сои, и собирают урединиоспоры вакуумным отсосом с зараженных листьев, на поверхности которых проявляются пустулы (Twizeyimana, M., and Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humidities. Plant Disease 94:1453-1460).
Растения сои сорта Williams 82 выращивают в ростовых камерах для растений с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Когда растения достигают стадии развития V3, первый полностью распустившийся трелистник опрыскивают повторно суспендированными клетками AIP1620, стандартным химическим фунгицидом или деионизированной водой (инокулированный контроль). Спустя один день листья инокулируют суспензией урединиоспор P. pachyrhizi (1×105/мл). Инокулирование и смесь штамм/фунгицид наносят с помощью пульверизатора, соединенного с воздушным компрессором. Растения выдерживают в ростовой камере с относительной влажностью 95% и суточным циклом освещенности 12 часов света и 12 часов темноты при температурах 21 и 23°С, соответственно. Спустя две недели тяжесть заболевания оценивают подсчетом количества спорообразующих урединий в случайно выбранных кругах диаметром 1 см на инокулированных листьях. Для каждой обработки выполняют 3 повтора (растения) и для каждого повтора проводят 3 подсчета урединий. Результаты, представленные в таблице 12 ниже, показывают, что применение AIP1620 эффективно контролирует азиатскую ржавчину сои, вызванную возбудителем Phakopsora pachyrhizi.
Таблица 12
Пример 17. Совместимость AIP1620 с коммерческими фунгицидами
Жизнеспособность AIP1620 определяют после смешивания штамма с 3 коммерческими фунгициды, которые содержат различные активные ингредиенты (таблица 13). Концентрации фунгицидов подбирают для имитации концентраций в типичной баковой смеси для применения в полевых условиях.
AIP1620 выращивают в 3 мл среды Лурия-Бертани (LB-среда) в пробирке объемом 10 мл в течение 24 часов при 28°С в инкубаторе, качающемся со скоростью при 250 об/мин. Клеточные пеллеты собирают центрифугированием и суспендируют в 3 мл деионизированной Н2О. Девятьсот микролитров клеточной суспензии смешивают с 100 мкл 10Х исходного фунгицидного раствора и инкубируют при 28°С в течение 5 минут или 120 минут.
После инкубирования с фунгицидами клетки собирают центрифугированием, как описано выше, и повторно суспендируют в деионизированной воде. Аликвоты серийно разводят в деионизированной воде, высевают на LB-агар и инкубируют при 28°С в течение 2 дней с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Бактериальные колонии подсчитывают и вычисляют количество колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл) в исходных растворах. Данные, представленные в таблице 14 ниже, показывают, что на жизнеспособность AIP 1620 добавление указанных составов фургицидов не оказывает неблагоприятного влияния.
Пример 18. Оценка защитной активности смесей AIP1620 и фунгицидов в отношении азиатской ржавчины сои, вызванной возбудителем Phakopsora pachyrhizi
Бактерии высевают в 50 мл бульонной среды, содержащей 11,3 г Na2HPO4⋅7H2O, 3,0 г KH2PO4, 1,0 г NH4Cl, 10 г глутамата натрия, 3,0 г мелассы, 0,493 г MgSO4⋅7H2O, 50 мг ZnSO4⋅7H2O и 5 мг FeSO4⋅7H2O на литр деионизированной воды. Культуры выращивают колбах объемом 250 мл с отражающими ребрами в инкубаторе, качающемся со скоростью 250 об/мин, в течение 2 дней. Клетки собирают центрифугированием при 3500хg в течение 10 минут. Культуральные супернатанты удаляют и клетки повторно суспендируют в стерильной деионизированной воде до объема исходных культур. AIP0323, мутант AIP0069, который не обладает фунгицидной активностью, включен в качестве отрицательного контроля.
Урединиоспоры Phakopsora pachyrhizi собирают вакуумным отсосом с зараженных листьев, на поверхности которых появились пустулы. Споры снова суспендируют в воде при 105 клеток/мл и высевают на отдельные листьях сои в виде аэрозоля с помощью аэрографа и методов, известных в данной области (Twizeyimana, M., and Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humidities. Plant Disease 94:1453-1460).
Смеси клеток AIP1620, повторно суспендированных в воде, и фунгицидно активных ингредиентов приготавливают в различных соотношениях, содержащих 106, 107, 108, 109 или 1010 AIP1620 клеток/мл, в смеси с фунгицидно активным ингредиентом в 1/LOX, 1/3X, 1/2X или 1X нормальной дозе полевого применения, полученной пересчетом полевой дозы применения с этикетки в г/мл на основании предполагаемого объема распыления на гектар или акр.
Инокулированные листья сои обрабатывают средством биоконтроля в указанных выше титрах, фунгицидами в указанных выше доза, а также смесями средства биоконтроля и фунгицида в различных комбинациях с титрами и дозами, указанными выше. Кроме того, некоторые отделенные инокулированные листья оставляют необработанными или обрабатывают AIP0323 в качестве контроля. По меньшей мере 3 листа (или сегмента листа) используются для каждой обработки средством биоконтроля, химическим соединением или смесью. Отделенные листья инкубируют при высокой влажности в ростовой камере в условиях 12 часов света, 21°С/12 часов темноты, 23°С. Спустя 10-14 дней листья визуально обследуют и оценивают в соответствии с количество видимых урединий на см2.
Для определения фунгицидного действия, ожидаемого от смеси, используют уравнение Колби (см. публикацию Colby, S.R., Calculation of the synergistic and antagonistic response of herbicide combinations. Weeds 1967, 15, 20-22, содержание которое включено в данное описание во всей полноте).
Представленное далее уравнение используют для расчета ожидаемой активности смесей, содержащих два активных ингредиента, А и В:
Ожидаемая активность=А+B-(A×B/100)
А=наблюдаемая эффективность активного компонента А при применении в концентрации, которая используется в смеси;
В=наблюдаемая эффективность активного компонента В при применении в концентрации, которая используется в смеси.
Типичные синергетические взаимодействия, включая дозы, применяемые и приводящие к контролю болезни, наблюдаются и записываются следующим образом;
% DC=Процент контроля болезни
% DC набл.=Наблюдаемый процент контроля болезни
% DC ожид.=Ожидаемый процент контроля болезни
Коэффициент синергизма =% DC набл./DC% ожид.
Пример 19. Селекция популяции штамма биологического контроля Pseudomonas fluorescens AIP000069, который приобрел резистентность к гербициду глюфосинату
50 микролитров культуры AIP000069, выращенной в 0,5X LB-среде в течение 24 часов при 28°С, наносят на планшеты, содержащие среду M63 Plus с 0 или 100 мМ глюфосината. Среда M63 Plus состоит из 13,6 г KH2PO4, 9,92 г C6H12O6, 2 г (NH4)2SО4, 5,5 мг CaCl2, 0,278 мг FeSO4⋅7H2O и 10,16 мг MgCl2⋅6H2O на литр деионизированной воды. В отсутствие глюфосината после инкубирования планшетов в течение 2 дней при температуре 28°C наблюдаются многочисленные колонии бактерий (газон). В присутствии 100 мМ глюфосината после аналогичной инкубации колонии не видны, однако после продолжения инкубации в течение нескольких наблюдается одна выросшая колония. Эту колонию высевают штрихом для изоляции на агаровой пластине M63, содержащей 100 мМ глюфосината. Полученному изоляту дают название AIP050999. Рост AIP050999 сравнивают с родительским штаммом, AIP000069, и резистентной к глифосату версией штамма AIP001620. Результаты представлены в таблице 15 ниже.
Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в описании, указывают на уровень квалификации специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и заявки на патенты включены в данное описание в виде ссылок, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент конкретно отдельно указывалась для включения в качестве ссылки.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано в некоторых детализациях, используемых в качестве иллюстрации и примера для облегчения понимания, будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут осуществляться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЬЮ РАСТЕНИЯ | 2016 |
|
RU2746928C2 |
| ШТАММ PAENIBACILLUS POLYMYXA ET3, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР | 2023 |
|
RU2820273C1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ | 2015 |
|
RU2588473C1 |
| ШТАММ MICROBACTERIUM SP. ET2, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР | 2023 |
|
RU2820245C1 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ | 2014 |
|
RU2659000C2 |
| КОНКУРЕНТОСПОСОБНЫЕ И ЭФФЕКТИВНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ | 2012 |
|
RU2611199C2 |
| МИКРООРГАНИЗМЫ - СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА РАСТЕНИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 2012 |
|
RU2664863C2 |
| ШТАММ BRADYRHIZOBIUM ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ШТАММ, И СЕМЯ, ПОКРЫТОЕ КОМПОЗИЦИЕЙ | 2012 |
|
RU2588483C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ПОТЕРИ УРОЖАЙНОСТИ ПРИ ПОСАДКЕ КУКУРУЗЫ-ПОСЛЕ-КУКУРУЗЫ | 2016 |
|
RU2729124C2 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ | 2016 |
|
RU2646160C2 |
Группа изобретений относится к борьбе с одним или более патогенами растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб. Предложена композиция, включающая эффективное количество (а) средства биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis NRRL No. B-50897, где штамм является живым, и (b) пестицид, фунгицид, инсектицид или гербицид, при этом указанная композиция борется с одним или более патогенами растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб. Предложен также способ борьбы с одним или более патогенами растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб, включающий нанесение на сельскохозяйственную культуру, семя или площадь культивирования эффективного количества указанной композиции. Предложен также состав для борьбы с патогеном растений, включающий эффективное количество средства биологического контроля, представляющего собой живой штамм Pseudomonas chlororaphis NRRL No. B-50897, где патоген растений представляет собой гриб. Предложены также способ выращивания растения и способ борьбы с патогеном растений с использованием указанного средства биологического контроля. Композицию, состав и средство биологического контроля применяют для покрытия семени. Изобретение обеспечивает эффективную защиту растений от патогенов и стимулирование роста растений, повышает конкурентоспособность средства биоконтроля с другими микробными штаммами и грибами. 8 н. и 29 з.п. ф-лы, 15 табл., 19 пр., 1 ил.
1. Композиция, включающая эффективное количество (а) средства биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, и (b) пестицид, фунгицид, инсектицид или гербицид; где указанная композиция борется с одним или более патогенами растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб, где штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым.
2. Композиция по п. 2, в которой фунгицид включает протиоконазол, азоксистробин, флуопиколид, хлороталонил или фосетил.
3. Композиция по п. 1, в которой фунгицид включает фенгексамид, флутриафол, дифеноконазол, тебуконазол, тетраконазол, пираклостробин, трифлоксистробин, пропиконазол или флуоксастробин.
4. Композиция по п. 1, в которой фунгицид включает флутоланил, метконазол или метрафенон.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, в которой гриб является возбудителем азиатской ржавчины сои.
6. Применение композиции по любому из пп. 1-5 для покрытия семени.
7. Применение по п. 6, где указанное семя является семенем однодольных растений.
8. Применение по п. 6, где указанное семя является семенем двудольных растений.
9. Способ борьбы с одним или более патогенами растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб, включающий нанесение на сельскохозяйственную культуру, семя или площадь культивирования эффективного количества композиции, содержащей (а) средство биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, и (b) пестицид, фунгицид, инсектицид или гербицид, где указанная композиция борется с указанным патогеном растений, в котором штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым.
10. Способ по п. 9, в котором фунгицид включает протиоконазол, азоксистробин, флуопиколид, хлороталонил или фосетил.
11. Способ по п. 9, в котором фунгицид включает фенгексамид, флутриафол, дифеноконазол, тебуконазол, тетраконазол, пираклостробин, трифлоксистробин, пропиконазол или флуоксастробин.
12. Способ по п. 9, в котором фунгицид включает флутоланил, метконазол или метрафенон.
13. Способ по любому из пп. 9-12, в котором указанное растение представляет собой однодольное растение.
14. Способ по любому из пп. 9-12, в котором указанное растение представляет собой двудольное растение.
15. Способ по любому из пп. 9-12 или 14, в котором гриб является возбудителем азиатской ржавчины сои.
16. Состав для борьбы с патогеном растений, включающий эффективное количество средства биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, где патоген растений представляет собой гриб, в котором штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым.
17. Состав по п. 16, отличающийся тем, что указанный состав является высушенным составом.
18. Состав по п. 16 или 17, отличающийся тем, что состав высушен до активности воды 0,3 или менее.
19. Состав по любому из пп. 16-18, отличающийся тем, что указанный состав представлен в форме смачиваемого порошка.
20. Состав по п. 19, в котором указанный смачиваемый порошок дополнительно включает силикат кальция.
21. Состав по п. 19 или 20, в котором указанный смачиваемый порошок дополнительно включает глицерин.
22. Состав по любому из пп. 17, 18, 20 или 21, отличающийся тем, что указанный состав включает смачиваемые гранулы.
23. Состав по любому из пп. 17-22, отличающийся тем, что указанный состав дополнительно включает по меньшей мере один пестицид, фунгицид, инсектицид или гербицид.
24. Применение состава по любому из пп. 17-23 для покрытия семени.
25. Способ выращивания растения, включающий посадку в площади культивирования покрытого семени, включающего семя и покрытие семени, где покрытие содержит средство биологического контроля, представляющее собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL № B-50897, в котором штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым.
26. Способ по п. 25, в котором указанное покрытие включает по меньшей мере один пестицид, фунгицид, инсектицид, гербицид, питательное вещество или их комбинацию.
27. Способ по п. 25 или 26, в котором указанное покрытое семя является семенем однодольных растений.
28. Способ по п. 25 или 26, в котором указанное покрытое семя является семенем двудольных растений.
29. Способ борьбы с патогеном растений, где патоген растений представляет собой гриб, включающий нанесение на растение, площадь культивирования или семя эффективного количества средства биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL № B-50897, где указанное средство биологического контроля борется с одним или более патогенов растений, причем по меньшей мере один патоген растений представляет собой гриб, в котором штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым.
30. Способ по п. 29, в котором указанный гриб включает Pythium aphanadermatum, Phytophthora parasitica, Rhizoctonia solani или Botrytis cinerea.
31. Способ по п. 29 или 30, в котором указанное растение является однодольным.
32. Способ по п. 29 или 30, в котором указанное растение является двудольным.
33. Способ по любому из пп. 29-32, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает нанесение эффективного количества гербицида, фунгицида, инсектицида, пестицида или их комбинации на растение, площадь культивирования или семя.
34. Способ по п. 33, в котором средство биологического контроля и гербицид, фунгицид, инсектицид или пестицид наносят последовательно.
35. Применение средства биологического контроля, представляющего собой штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, в котором штамм Pseudomonas chlororaphis, депонированный как NRRL No. B-50897, является живым, для покрытия семени.
36. Применение по п. 35, в котором семя является семенем однодольного растения.
37. Применение по п. 35, в котором семя является семенем двудольного растения.
| WO 1999026479 A1, 03.06.1999 | |||
| US5955348 A, 21.09.1999 | |||
| WO2013150422 A1, 10.10.2013 | |||
| WO2007149817 A2, 27.12.2007 | |||
| CHIN-A-WOENG ET AL | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| sp | |||
| radicis-lycopersici | |||
| MPMI Vol | |||
| Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба | 1920 |
|
SU11A1 |
| Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба | 1920 |
|
SU11A1 |
| ИСКРОВОЙ ГЕНЕРАТОР КОРОТКИХ ВОЛН | 1924 |
|
SU1069A1 |
| ШТАММ PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЕГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ДАННЫЙ ШТАММ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ | 1995 |
|
RU2154943C2 |
