АНТИТЕЛА К АЛЬФА-РЕЦЕПТОРУ СОБАЧЬЕГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 Российский патент 2020 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P11/06 A61P29/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. 119(e) предварительных заявок с серийными номерами 62/142108, поданной 2 апреля 2015 года; 62/269486, поданной 18 декабря 2015 года, и 62/310250, поданной 18 марта 2016 года, содержание которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам к альфа-рецептору собачьего IL-4, которые имеют специфические последовательности, высокую аффинность связывания для альфа-рецептора собачьего IL-4, включая некоторые, которые могут блокировать связывание собачьего IL-4 с альфа-рецептором собачьего IL-4. Настоящее изобретение также относится к уникальным эпитопам, которые связываются с антителами к альфа-рецептору собачьего IL-4. Настоящее изобретение также относится к применению антител и эпитопов по настоящему изобретению в лечении атопического дерматита у собак.

Уровень техники

Иммунная система включает сеть резидентных и рециркулирующих специализированных клеток, которые совместно функционируют для защиты хозяина от инфекционных заболеваний и рака. Способность иммунной системы выполнять эту функцию в значительной степени зависит от биологической активности группы белков, секретируемых лейкоцитами и в совокупности называемых интерлейкинами. Среди хорошо изученных интерлейкинов имеются две важные молекулы, идентифицированные как интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13). IL-4 и IL-13 представляют собой два тесно связанных белка, которые могут секретироваться многими типами клеток, включая CD4⁺ Th2-клетки, природные киллерные Т-клетки (NKT), макрофаги, тучные клетки и базофилы. IL-4 и IL-13 проявляют много перекрывающихся функций и имеют решающее значение для развития зависимых от Т-клеток гуморальных иммунных реакций. Несмотря на их сходство в общей структуре, клеточных источниках и биологических функциях, каждый из этих цитокинов опосредует некоторые специализированные функции, что стимулировало проведение обширных исследований, направленных на идентификацию рецепторов и даунстрим сигнальных путей через которые эти интерлейкины опосредуют как их общую, так и уникальную биологическую активность.

В настоящее время известно, что IL-4 связывается с высокой аффинностью с двумя рецепторами, то есть рецепторами IL-4 типа I и типа II. Рецептор IL-4 типа I состоит из α-цепи рецептора IL-4 и общей γ-цепи C, которая также является частью рецептора нескольких других интерлейкинов, включая IL-2, IL-7, IL-9 и IL- 15. Рецептор IL-4 типа II состоит из α-цепи рецептора IL-4 и α1-цепи рецептора IL-13. С другой стороны, IL-13 связывается с рецептором IL-4 типа II и с уникальным рецептором, обозначенным как α2-рецептор IL-13. Связывание IL-13 с α2-рецептором IL-13 не приводит к трансдукции сигналов, и этот рецептор также секретируется в растворимой форме. Следовательно, α2-рецептор IL-13 часто упоминается как рецептор-приманка.

Гены, кодирующие белок IL-4, от различных видов, клонировали и экспрессировали в клетках бактерий и млекопитающих. Например, кДНК, кодирующая человеческий IL-4, показывает, что зрелый человеческий IL-4 представляет собой секретируемый полипептид из 129 аминокислот с гипотетической молекулярной массой 15 кДа [Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (16): 5894-5898 (1986)]. Также была идентифицирована кДНК, кодирующая белок собачьего IL-4, и было показано, что она кодирует полипептид из 132 аминокислот, который обладает 40% идентичностью последовательности с человеческим IL-4 [van der Kaaij et al., Immunogenetics, 49: 142-143 (1999)]. Ген, кодирующий человеческий IL-13, клонировали и экспрессировали в различных системах-хозяевах [Minty et al., Nature, 362: 248-50 (1993)]. кДНК, кодирующая человеческий IL-13, показывает, что зрелый IL-13 представляет собой секретируемый полипептид с молекулярной массой 12,4 кДа. Также была идентифицирована кДНК, кодирующая собачий IL-13 [Yang et al., J. Interferon and Cytokine Research, 20: 779-785 (2000)]. Прогнозированный зрелый полипептид собачьего IL-13 состоит из 111 аминокислот и обладает 61,8% идентичностью последовательности с человеческим IL 13.

Гены, кодирующие α-цепи рецептора IL-4 человека и мыши, были клонированы и экспрессированы в различных системах-хозяевах. Например, кДНК, кодирующая α-цепь рецептора человеческого IL-4, была описана Galizzi et al. [International Immunology, 2(7): 669-675 (1990)], и кДНК, кодирующая α-цепь рецептора мышиного IL-4 была описана Mosley et al., [Cell, 59 (2): 335-348 (1989)]. кДНК для α-цепи рецептора IL-4 человека кодирует 825 аминокислотных остатков, включая сигнальную последовательность из 24 аминокислотных остатков. Несмотря на то, что мышиный белок, состоящий из 15 аминокислотных остатков, короче человеческого рецептора, оба белка тесно связаны общей 50% идентичностью последовательностей на уровне аминокислот.

Также были описаны гены, кодирующие α-цепи лошадиного, собачьего и кошачьего рецептора IL-4 [см. заявку на патент США 7208579B2]. Кроме того, кДНК, прогнозированную как соответствующую одной изоформе рецептора собачьего IL-4, можно найти в базе данных GenBank (SEQ ID NO: 1). Следовательно, настоящее изобретение было предпринято для определения кДНК α-цепи рецептора IL-4 и точного определения ее кодированной полипептидной последовательности.

Несмотря на то, что IL-4 и IL-13 являются критическими цитокинами для развития Th2-иммунных ответов, которые необходимы для защиты организма от внеклеточных патогенов (например, паразитов, проникающих ткани или полости), оба цитокина вовлечены в патогенез различных аллергических заболеваний у людей и животных, включая астму и атопический дерматит. Астма является распространенным респираторным заболеванием у людей. Болезнь характеризуется воспалением легких, гиперчувствительностью бронхов дыхательных путей к внешним раздражителям и структурными изменениями тканей бронхиальной стенки. Имеется обзор по патофизиологии аллергической астмы у Vatrella et al. [Journal of Asthma and Allergy, 7: 123-130 (2014)]. Астма поддерживается CD4+ Th2-клетками, которые продуцируют большое количество IL-4 и IL-13 и формируют иммунный воспалительный ответ в дыхательных путях при аллергии. Недавний прогресс в понимании астматического ответа подчеркивает важную роль, которую играют как IL-4, так и IL-13 в патогенезе болезни. Например, оба цитокина стимулируют переключение в В-клетках изотипа иммуноглобулина от IgM к IgE, и данный аллерген-специфический IgE способствует дегрануляции тучных клеток и высвобождению медиаторов воспаления в дыхательных путях. Кроме того, как IL-4, так и IL-13 усиливают сокращение гладких мышц бронхов и стимулируют рекрутинг эозинофилов в дыхательных путях, которые также могут дегранулировать в ответ на сшивание связанного с аллергеном IgE с его рецептором на эозинофилах. Кроме того, IL-13 также стимулирует секрецию слизи и способствует ремоделированию дыхательных путей, стимулируя гиперплазию кубических клеток, отложение коллагена и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей. Таким образом, в настоящее время ясно, что IL-4 и IL-13 тесно связаны с патологическими изменениями, которые приводят к проявлению астматических эпизодов, включая сужение бронхов и повышенную гиперактивность дыхательных путей.

Атопический дерматит (АД) является рецидивирующим, вызывающим зуд воспалительным заболеванием кожи, которое характеризуется нарушением функции иммунной системы и аномалиями эпидермального барьера. Патологические и иммунологические признаки АД были предметом обширных исследований [см. обзор Rahman et al. Inflammation & Allergy-drug target 10:486-496 (2011) и Harskamp et al., Seminar in Cutaneous Medicine and Surgery 32:132-139 (2013)] 32: 132-139 (2013)]. АД является наиболее распространенным заболеванием кожи у человека, поражающим 2-10% взрослого населения в Соединенных Штатах и около 25% детей во всем мире. У человека очаги поражения кожи при АД характеризуются инфильтрацией Th2-клеток, эозинофилов, тучных клеток и дендритных клеток. В острой фазе АД такие очаги поражения демонстрируют преобладающую экспрессию цитокинов Th2-типа, включая IL-4 и IL-13. АД также характеризуется повышенными уровнями циркулирующего IgE и положительно коррелирует с экспрессией IL-4 и IL 13 в CD4+ Th2-клетках в коже. Несмотря на то, что АД классифицируется как болезнь, связанная с Th2-клетками, другие субпопуляции T-клеток, такие как Th1, Th22 и Th17, также могут вносить свой вклад в патогенез болезни. Несмотря на растущую распространенность АД во всем мире, варианты лечения, доступные пациентам с симптомами, которые не поддаются адекватному контролю агентами для местного применения, ограничены оральными кортикостероидами, оральным циклоспорином и UVB фототерапией. Данные методы лечения не всегда эффективны, и их применение связано с различными проблемами в отношении безопасности. Недавно были разработаны моноклональные антитела, специфичные к человеческому IL-4 R_α, и некоторые из этих антител были интенсивно исследованы в отношение их терапевтического применения у человека для лечения атопического дерматита [см., например, заявку на патент США 20150017176 A1].

АД также является распространенным заболеванием у домашних животных, особенно собак, среди которых распространенность оценивается примерно на уровне 10-15% в популяции собак. Патогенез АД у собак и кошек [обзор представлен Nuttall et al., Nuttall et al., Veterinary Records 172(8):201-207 (2013)] имеет значительное сходство с АД у человека, включая инфильтрацию кожи различными иммунными клетками и CD4⁺ Th2 поляризованную среду с цитокинами, включая преобладание цитокинов IL-4 и IL-13. Как и у людей, современные методы лечения атопического дерматита у собак и кошек основаны на паллиативной терапии, такой как шампуни и увлажнители, или симптоматической терапии с использованием оральных или системных кортикостероидов и орального циклоспорина. Как и в случае с человеческим АД, эти методы лечения не затрагивают основополагающий механизм заболевания и имеют существенные проблемы в отношение безопасности и эффективности. Таким образом, существует нерешенная медицинская потребность в безопасном и эффективном варианте лечения АД у животных-компаньонов. Такое лечение должно предпочтительно интерферировать с основным механизмом заболевания.

Цитирование любой ссылки здесь не должно толковаться как признание того, что такая ссылка доступна как «предшествующий уровень техники» для данной заявки.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам к альфа-рецептору собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), которые имеют высокую аффинность связывания для собачьего IL-4R_α. В более конкретных вариантах осуществления антитела к альфа-рецептору интерлейкина-4 (IL-4R_α) также обладают способностью блокировать связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I или типа II, и затем ингибировать передачу сигналов от IL-4 и IL-13 собаки. В конкретных вариантах осуществления такие антитела к собачьему IL-4R_α представляют собой мышиные антитела к собачьему IL-4R_α. В более конкретных вариантах осуществления антитела к собачьему IL-4R_α обладают высокой аффинностью связывания с собачьим IL-4R_α, а также обладают способностью блокировать связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и типа II.

Кроме того, настоящее изобретение относится к определяющим комплементарность областям (CDR), содержащихся в этих антителах, и комбинации данных CDR (например, полученных из мышиных антител против собачьего IL-4R_α), вставленных в каркасные области собаки с получением канинизированных антител к собачьему IL-4R_α. Настоящее изобретение также относится к применению таких антител в лечении состояний, таких как атопический дерматит и/или другие патологические состояния, за счет даунстрим эффектов передачи сигналов в результате связывания собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает уникальные наборы CDR из четырнадцати (14) примерных мышиных антител к собачьему IL-4R_α. 14 примерных мышиных антител к собачьему IL-4R_α имеют уникальные наборы CDR, т. е. три CDR легкой цепи: CDR1 легкой цепи (CDRL1), CDR2 легкой цепи (CDRL2) и CDR3 легкой цепи 3 (CDRL3) и три CDR тяжелой цепи: CDR1 тяжелой цепи (CDRH1), CDR2 тяжелой цепи (CDRH2) и CDR3 тяжелой цепи (CDRH3). Как подробно описано ниже, в каждой группе CDR имеется высокая гомология последовательностей и даже некоторая избыточность, например, набор CDRL1 ниже. Следовательно, настоящее изобретение не только обеспечивает аминокислотные последовательности шести CDR из 14 примерных мышиных антител к собачьему IL-4R_α, но дополнительно обеспечивает консервативно модифицированные варианты этих CDR, а также варианты, которые включают (например, разделяют) такую же каноническую структуру и/или связываются с одним или несколькими (например, 1-4 или более) аминокислотными остатками собачьего IL-4R_α, которые составляют эпитоп собачьего IL-4R_α.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые со специфичностью связываются с IL-4R_α, включающие определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (VL CDR1), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или SEQ ID NO: 131, и/или определяющую комплементарность область легкой цепи 2 (VL CDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 или SEQ ID NO: 134, и/или определяющую комплементарность область легкой цепи 3 (VL CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 139, и/или определяющую комплементарность область тяжелой цепи 1 (VH CDR1), где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143, и/или определяющую комплементарность область тяжелой цепи 2 (VH CDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148, и/или определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (VH CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 153. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело млекопитающего. В более конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой канинизированное антитело.

Следовательно, «канинизированное» антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат одно или более из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (VH CDR1) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143. В другом варианте осуществления определяющая комплементарность область тяжелой цепи 2 (VH CDR2) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148. В еще одном варианте осуществления определяющая комплементарность область тяжелой цепи 3 (VH CDR3) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, S EQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 153. В конкретном варианте осуществления данного типа канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143, и VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148. В еще одном таком варианте осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143, и VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 или SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 153. В еще одном таком варианте осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148, и VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 или SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 153. В еще одном таком варианте осуществления, канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143, и VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148, и VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 или SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 153.

В конкретных вариантах осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент также включают определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (VL CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или SEQ ID NO: 131. В близких вариантах осуществления определяющая комплементарность область легкой цепи 2 (VL CDR2) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 или SEQ ID NO: 134. В еще одном варианте определяющая комплементарность область легкой цепи 3 (VL CDR3) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 139. В конкретном варианте осуществления данного типа канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или SEQ ID NO: 131, и VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 или SEQ ID NO: 134.

В еще одних таких вариантах осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или SEQ ID NO: 131, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 139. В еще одном таком варианте осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 или SEQ ID NO: 134, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 139.

В еще одних таких вариантах осуществления канинизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или SEQ ID NO: 131, VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 или SEQ ID NO: 134, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 139.

В конкретных вариантах осуществления канинизированное антитело против собачьего IL-4R_α содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-3A и H3-12 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, т. е. CDR1 тяжелой цепи имеет каноническую структуру класса 1, CDR2 тяжелой цепи имеет каноническую структуру класса 3A, и CDR3 тяжелой цепи имеет каноническую структуру класса 12. В еще более конкретных вариантах осуществления CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-1, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2A и H3-7 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-2A, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2B и H3-15 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-4, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-1 и H3-15 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-3, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2B и H3-6 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-2A, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи.

В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2B и H3-4 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-6, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-1 и H3-13 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-1, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2A и H3-6 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-2A, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи.

В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-3A и H3-15 или, альтернативно, H3-13, соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-6, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-2A и H3-10 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-6, L2-1 и L3-1 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело к собачьему IL-4R_α дополнительно содержит определяющие комплементарность области (CDR), где CDR имеют канонические структуры: H1-1, H2-3A и H3-9 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. В еще более конкретных вариантах осуществления данного типа CDR для соответствующих легких цепей имеют канонические структуры: L1-3, L2-1 и L3-3 соответственно для CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи.

Настоящее изобретение также относится к выделенному канинизированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с IL-4R_α, содержащим тяжелую цепь собачьего IgG и собачью легкую цепь каппа или лямбда. В конкретных вариантах осуществления данного типа собачья легкая цепь каппа или лямбда, которая содержит три определяющие комплементарность области легкой цепи (CDR): CDR1 легкой цепи (CDRL1), CDR2 легкой цепи (CDRL2) и CDR3 легкой цепи (CDRL3); и тяжелая цепь собачьего IgG, содержащая три CDR тяжелой цепи: CDR1 тяжелой цепи (CDRH1), CDR2 тяжелой цепи (CDRH2) и CDR3 тяжелой цепи (CDRH3), получены из мышиных антител против собачьего IL-4R_α. Конкретные варианты осуществления канинизированных антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению связываются с собачьим IL-4R_α и/или блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим IL-4.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу млекопитающего или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются со специфичностью с собачьим альфа-рецептором интерлейкина-4 (IL-4R_α), содержащим три определяющие комплементарность области легкой цепи (CDR): CDR1 легкой цепи (CDRL1), CDR2 легкой цепи (CDRL2) и CDR3 легкой цепи (CDRL3); и три CDR тяжелой цепи: CDR1 тяжелой цепи (CDRH1), CDR2 тяжелой цепи 2 (CDRH2) и CDR3 тяжелой цепи (CDRH3). В некоторых вариантах осуществления CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, вариант SEQ ID NO: 47, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 47, вариант SEQ ID NO: 47, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 48, вариант SEQ ID NO: 48, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 48, вариант SEQ ID NO: 48, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 49, вариант SEQ ID NO: 49, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 49, вариант SEQ ID NO: 49, который содержит каноническую структуру класса 4, SEQ ID NO: 50, вариант SEQ ID NO: ID NO: 50, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 50, вариант SEQ ID NO: 50, который содержит каноническую структуру класса 3, SEQ ID NO: 51, вариант SEQ ID NO: 51, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 51, вариант SEQ ID NO: 51, который содержит каноническую структуру класса 3, SEQ ID NO: 52, вариант SEQ ID NO: 52, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 52, вариант SEQ ID NO: 52, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 53, вариант SEQ ID NO: 53, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 53, вариант SEQ ID NO: 53, который содержит каноническую структуру класса 6, SEQ ID NO: 54, вариант SEQ ID NO: 54, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 54, вариант SEQ ID NO: 54 NO: 54, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 55, вариант SEQ ID NO: 55, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 55, вариант SEQ ID NO: 55, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 129, вариант SEQ ID NO: 129, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 129, вариант SEQ ID NO: 129, который содержит каноническую структуру класса 6, SEQ ID NO: 130, вариант SEQ ID NO: 130, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 130, вариант SEQ ID NO: 130, который содержит каноническую структуру 6, SEQ ID NO: 131, вариант SEQ ID NO: 131, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 131 или вариант SEQ ID NO: 131, который содержит каноническую структуру класса 3.

Соответствующая CDRL2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, вариант SEQ ID NO: 56, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 56, вариант SEQ ID NO: 56, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 57, вариант SEQ ID NO: 57, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 57, вариант SEQ ID NO: 57, который содержит канонической структуры класса 1, SEQ ID NO: 58, вариант SEQ ID NO: 58, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 58, вариант SEQ ID NO: 58, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 59, вариант SEQ ID NO: 59, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 59, вариант SEQ ID NO: 59, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 60, вариант SEQ ID NO: 60, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 60, вариант SEQ ID NO: 60, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 61, вариант SEQ ID NO: 61, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 61, вариант SEQ ID NO: 61, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 62, вариант SEQ ID NO: 62, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 62, вариант SEQ ID NO: 62, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 63, вариант SEQ ID NO: 63, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 63, вариант SEQ ID NO: 63, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 64, вариант SEQ ID NO: 64, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 64 или вариант SEQ ID NO: 64, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 132, вариант SEQ ID NO: 132, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 132, вариант SEQ ID NO: 132, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 133, вариант SEQ ID NO: 133, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 133, вариант SEQ ID NO: 133, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 134, вариант SEQ ID NO: 134, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 134 или вариант SEQ ID NO: 134, который содержит каноническую структуру класса 1.

Соответствующая CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, вариант SEQ ID NO: 65, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 65, вариант SEQ ID NO: 65, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 66, вариант SEQ ID NO: 66, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 66, вариант SEQ ID NO: 66, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 67, вариант SEQ ID NO: 67, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 67, вариант SEQ ID NO: 67, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 68, вариант SEQ ID NO: 68, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 68, вариант SEQ ID NO: 68, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 69, вариант SEQ ID NO: 69, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 69, вариант SEQ ID NO: 69, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 70, вариант SEQ ID NO: 70, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 70, вариант SEQ ID NO: 70, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 71, вариант SEQ ID NO: 71, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 71, вариант SEQ ID NO: 71, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 72, вариант SEQ ID NO: 72, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 72, вариант SEQ ID NO: 72, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 73, вариант SEQ ID NO: 73, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 73, вариант SEQ ID NO: 73, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 135, вариант SEQ ID NO: 135, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 135, вариант SEQ ID NO: 135, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 136, вариант SEQ ID NO: 136, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 136, вариант SEQ ID NO: 136, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 137, вариант SEQ ID NO: 137, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 137, вариант SEQ ID NO: 137, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 138, вариант SEQ ID NO: 138, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 138, вариант SEQ ID NO: 138, который содержит каноническую структуру класса 3, SEQ ID NO: 139, вариант SEQ ID NO: 139, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 139 или вариант SEQ ID NO: 139, который содержит каноническую структуру класса 1.

Соответствующая CDRH1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, вариант SEQ ID NO: 74, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 74, вариант SEQ ID NO: 74, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 75, вариант SEQ ID NO: 75, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 75, вариант SEQ ID NO: 75, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 76, вариант SEQ ID NO: 76, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 76 или вариант SEQ ID NO: 76, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 77, вариант SEQ ID NO: 77, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 77 или вариант SEQ ID NO: 77, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 78, вариант SEQ ID NO: 78, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 78, вариант SEQ ID NO: 78, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 79, вариант SEQ ID NO: 79, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 79, вариант SEQ ID NO: 79, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 80, вариант SEQ ID NO: 80, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 80, вариант SEQ ID NO: 80, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 81, вариант SEQ ID NO: 81, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 81, вариант SEQ ID NO: 81, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 82, вариант SEQ ID NO: 82, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 82 или вариант SEQ ID NO: 82, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 140, вариант SEQ ID NO: 140, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 140, вариант SEQ ID NO: 140, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 141, вариант SEQ ID NO: 141, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 141, вариант SEQ ID NO: 141, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 142, вариант SEQ ID NO: 142, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 142, вариант SEQ ID NO: 142, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 143, вариант SEQ ID NO: 143, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 143 или вариант SEQ ID NO: 143, который содержит каноническую структуру класса 1.

Соответствующая CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, вариант SEQ ID NO: 83, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 83, вариант SEQ ID NO: 83, который содержит каноническую структуру класса 3A, SEQ ID NO: 84, вариант SEQ ID NO: 84, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 84, вариант SEQ ID NO: 84, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 85, вариант SEQ ID NO: 85, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 85 или вариант SEQ ID NO: 85, который содержит каноническую структуру класса 2B, SEQ ID NO: 86, вариант SEQ ID NO: 86, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, вариант SEQ ID NO: 87, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 87, вариант SEQ ID NO: 87, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 88, вариант SEQ ID NO: 88, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 88, вариант SEQ ID NO: 88, который содержит каноническую структуру класса 2B, SEQ ID NO: 89, вариант SEQ ID NO: 89, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 89, вариант SEQ ID NO: 89, который содержит каноническую структуру класса 2B, SEQ ID NO: 90, вариант SEQ ID NO: 90, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 90, вариант SEQ ID NO: 90, который содержит каноническую структуру класса 1, SEQ ID NO: 91, вариант SEQ ID NO: 91, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 91, вариант SEQ ID NO: 91, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 144, вариант SEQ ID NO: 144, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 144, вариант SEQ ID NO: 144, который содержит каноническую структуру класса 3A, SEQ ID NO: 145, вариант SEQ ID NO: 145, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 145, вариант SEQ ID NO: 145, который содержит каноническую структуру класса 2A, SEQ ID NO: 146, вариант SEQ ID NO: 146, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 146, вариант SEQ ID NO: 146, который содержит каноническую структуру класса 3A, SEQ ID NO: 147, вариант SEQ ID NO: 147, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 147, вариант SEQ ID NO: 147 NO: 147, который содержит каноническую структуру класса 3A, SEQ ID NO: 148, вариант SEQ ID NO: 148, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 148 или вариант SEQ ID NO: 148, который содержит каноническую структуру класса 3A.

Соответствующая CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, вариант SEQ ID NO: 92, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 92, вариант SEQ ID NO: 92, который содержит каноническую структуру класса 12, SEQ ID NO: 93, вариант SEQ ID NO: 93, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 93, вариант SEQ ID NO: 93, который содержит каноническую структуру класса 7, SEQ ID NO: 94, вариант SEQ ID NO: 94, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 94 или вариант SEQ ID NO: 94, который содержит каноническую структуру класса 15, SEQ ID NO: 95, вариант SEQ ID NO: NO: 95, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 95 или вариант SEQ ID NO: 95, который содержит каноническую структуру класса 11, SEQ ID NO: 96, вариант SEQ ID NO: 96, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 96, вариант SEQ ID NO: 96, который содержит каноническую структуру класса 15, SEQ ID NO: 97, вариант SEQ ID NO: 97, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 97, вариант SEQ ID NO: 97, который содержит каноническую структуру класса 6, SEQ ID NO: 98, вариант SEQ ID NO: 98, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 98, вариант SEQ ID NO: 98, который содержит каноническую структуру класса 4, SEQ ID NO: 99, вариант SEQ ID NO: 99, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 99, вариант SEQ ID NO: 99, который содержит каноническую структуру класса 13, SEQ ID NO: 100, вариант SEQ ID NO: 100, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 100 или вариант SEQ ID NO: 100, который содержит каноническую структуру класса 6, SEQ ID NO: 149, вариант SEQ ID NO: 149, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 149, вариант SEQ ID NO: 149, который содержит каноническую структуру класса 15, SEQ ID NO: 150, вариант SEQ ID NO: 150, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 150, вариант SEQ ID NO: 150, который содержит каноническую структуру класса 10, SEQ ID NO: 151, вариант SEQ ID NO: 151, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 151, вариант SEQ ID NO: 151, который содержит каноническую структуру класса 15, SEQ ID NO: 152, вариант SEQ ID NO: 152, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 152, вариант SEQ ID NO: 152, который содержит каноническую структуру класса 9, SEQ ID NO: 153, вариант SEQ ID NO: 153, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 153 или вариант SEQ ID NO: 153, который содержит каноническую структуру класса 13.

В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих (включая химерные антитела млекопитающих) и/или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с альфа-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α) и/или блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим IL-4 и/или собачьим IL-13. В близких вариантах осуществления антитела млекопитающих и/или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению блокируют связывание собачьего IL-4 и/или собачьего IL-13 с рецептором IL-4 типа I и/или рецептором IL-4 типа II. В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих (независимо от того, выделены они или нет) являются канинизированными антителами.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, вариант SEQ ID NO: 47, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 47, или вариант SEQ ID NO: 47, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, вариант SEQ ID NO: 56, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 56 или вариант SEQ ID NO: 56, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, вариант SEQ ID NO: 65, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 65 или вариант SEQ ID NO: 65, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, вариант SEQ ID NO: 74, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 74 или вариант SEQ ID NO: 74, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, вариант SEQ ID NO: 83, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 83 и вариант SEQ ID NO: 83, который содержит каноническую структуру класса 3А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, вариант SEQ ID NO: 92, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 92 или вариант SEQ ID NO: 92, который содержит каноническую структуру класса 12.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, вариант SEQ ID NO: 48, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 48 или вариант SEQ ID NO: 48, который содержит каноническую структуру класса 2A; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, вариант SEQ ID NO: 57, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 57 или вариант SEQ ID NO: 57, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, вариант SEQ ID NO: 66, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 66 или вариант SEQ ID NO: 66, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, вариант SEQ ID NO: 75, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 75 или вариант SEQ ID NO: 75, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84, вариант SEQ ID NO: 84, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 84 и вариант SEQ ID NO: 84, который содержит каноническую структуру класса 2А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93, вариант SEQ ID NO: 93, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 93 или вариант SEQ ID NO: 93, который содержит каноническую структуру класса 7.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, вариант SEQ ID NO: 49, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 49 или вариант SEQ ID NO: 49, который содержит каноническую структуру класса 4; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, вариант SEQ ID NO: 58, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 58 или вариант SEQ ID NO: 58, который содержит каноническую структуру класса 4; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, вариант SEQ ID NO: 67, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 67 или вариант SEQ ID NO: 67, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, вариант SEQ ID NO: 76, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 76 или вариант SEQ ID NO: 76, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, вариант SEQ ID NO: 85, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 85 и вариант SEQ ID NO: 85, который содержит каноническую структуру класса 2B, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94, вариант SEQ ID NO: 94, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 94 или вариант SEQ ID NO: 94, который содержит каноническую структуру класса 15.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, вариант SEQ ID NO: 51, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 51 или вариант SEQ ID NO: 51, который содержит каноническую структуру класса 3; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, вариант SEQ ID NO: 60, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 60 или вариант SEQ ID NO: 60, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, вариант SEQ ID NO: 69, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 69 или вариант SEQ ID NO: 69, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78, вариант SEQ ID NO: 78, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 78 или вариант SEQ ID NO: 78, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87, вариант SEQ ID NO: 87, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 87 и вариант SEQ ID NO: 87, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96, вариант SEQ ID NO: 96, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 96 или вариант SEQ ID NO: 96, который содержит каноническую структуру класса 15.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, вариант SEQ ID NO: 52, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 52 или вариант SEQ ID NO: 52, который содержит каноническую структуру класса 2A; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, вариант SEQ ID NO: 61, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 61 или вариант SEQ ID NO: 61, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, вариант SEQ ID NO: 70, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 70 или вариант SEQ ID NO: 70, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, вариант SEQ ID NO: 79, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 79 или вариант SEQ ID NO: 79, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88, вариант SEQ ID NO: 88, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 88 и вариант SEQ ID NO: 88, который содержит каноническую структуру класса 2B, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, вариант SEQ ID NO: 97, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 97 или вариант SEQ ID NO: 97, который содержит каноническую структуру класса 6.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, вариант SEQ ID NO: 53, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 53 или вариант SEQ ID NO: 53, который содержит каноническую структуру класса 6; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, вариант SEQ ID NO: 62, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 62 или вариант SEQ ID NO: 62, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, вариант SEQ ID NO: 71, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 71 или вариант SEQ ID NO: 71, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80, вариант SEQ ID NO: 80, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 80 или вариант SEQ ID NO: 80, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89, вариант SEQ ID NO: 89, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 89 и вариант SEQ ID NO: 89, который содержит каноническую структуру класса 2B, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, вариант SEQ ID NO: 98, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 98 или вариант SEQ ID NO: 98, который содержит каноническую структуру класса 4.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, вариант SEQ ID NO: 54, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 54 или вариант SEQ ID NO: 54, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, вариант SEQ ID NO: 63, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 63 или вариант SEQ ID NO: 63, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, вариант SEQ ID NO: 72, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 72 или вариант SEQ ID NO: 72, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81, вариант SEQ ID NO: 81, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 81 или вариант SEQ ID NO: 81, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, вариант SEQ ID NO: 90, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 90 и вариант SEQ ID NO: 90, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, вариант SEQ ID NO: 99, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 99 или вариант SEQ ID NO: 99, который содержит каноническую структуру класса 13. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно двумя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 157 или SEQ ID NO: 158, или в обеих последовательностях SEQ ID NO: 157 и SEQ ID NO: 158.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, вариант SEQ ID NO: 55, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 55 или вариант SEQ ID NO: 55, который содержит каноническую структуру класса 2A; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, вариант SEQ ID NO: 64, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 64 или вариант SEQ ID NO: 64, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, вариант SEQ ID NO: 73, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 73 или вариант SEQ ID NO: 73, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, вариант SEQ ID NO: 82, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 82 или вариант SEQ ID NO: 82, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, вариант SEQ ID NO: 91, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 91 и вариант SEQ ID NO: 91, который содержит каноническую структуру класса 2А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, вариант SEQ ID NO: 100, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 100 или вариант SEQ ID NO: 100, который содержит каноническую структуру класса 6.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129, вариант SEQ ID NO: 129, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 129 или вариант SEQ ID NO: 129, который содержит каноническую структуру класса 6; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, вариант SEQ ID NO: 132, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 132 или вариант SEQ ID NO: 132, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, вариант SEQ ID NO: 135, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 135 или вариант SEQ ID NO: 135, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140, вариант SEQ ID NO: 140, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 140 или вариант SEQ ID NO: 140, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, вариант SEQ ID NO: 144, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 144 и вариант SEQ ID NO: 144, который содержит каноническую структуру класса 3А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149, вариант SEQ ID NO: 149, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 149 или вариант SEQ ID NO: 149, который содержит каноническую структуру класса 15. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно двумя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127 или SEQ ID NO: 128, или в обеих последовательностях SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 128.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130, вариант SEQ ID NO: 130, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 130 или вариант SEQ ID NO: 130, который содержит каноническую структуру класса 6; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133, вариант SEQ ID NO: 133, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 133 или вариант SEQ ID NO: 133, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, вариант SEQ ID NO: 136, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 136 или вариант SEQ ID NO: 136, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141, вариант SEQ ID NO: 141, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 141 или вариант SEQ ID NO: 141, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145, вариант SEQ ID NO: 145, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 145 и вариант SEQ ID NO: 145, который содержит каноническую структуру класса 2А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 150, вариант SEQ ID NO: 150, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 150 или вариант SEQ ID NO: 150, который содержит каноническую структуру класса 10. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно двумя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 158 или SEQ ID NO: 162, или в обеих последовательностях SEQ ID NO: 158 и SEQ ID NO: 162.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129, вариант SEQ ID NO: 129, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 129 или вариант SEQ ID NO: 129, который содержит каноническую структуру класса 6; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134, вариант SEQ ID NO: 134, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 134 или вариант SEQ ID NO: 134, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, вариант SEQ ID NO: 137, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 137 или вариант SEQ ID NO: 137, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140, вариант SEQ ID NO: 140, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 140 или вариант SEQ ID NO: 140, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146, вариант SEQ ID NO: 146, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 146 и вариант SEQ ID NO: 146, который содержит каноническую структуру класса 3А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 151, вариант SEQ ID NO: 151, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 151 или вариант SEQ ID NO: 151, который содержит каноническую структуру класса 15. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно двумя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или в обеих последовательностях SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131, вариант SEQ ID NO: 131, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 131 или вариант SEQ ID NO: 131, который содержит каноническую структуру класса 3; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, вариант SEQ ID NO: 60, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 60 или вариант SEQ ID NO: 60, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138, вариант SEQ ID NO: 138, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 1385 или вариант SEQ ID NO: 138, который содержит каноническую структуру класса 3, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, вариант SEQ ID NO: 142, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 142 или вариант SEQ ID NO: 142, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147, вариант SEQ ID NO: 147, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 147 и вариант SEQ ID NO: 147, который содержит каноническую структуру класса 3А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, вариант SEQ ID NO: 152, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 152 или вариант SEQ ID NO: 152, который содержит каноническую структуру класса 9. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно двумя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 154 или SEQ ID NO: 155, или в SEQ ID NO: 156, или любой их комбинации.

В еще одних вариантах осуществления антител млекопитающих (включая канинизированные антитела) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129, вариант SEQ ID NO: 129, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 129 или вариант SEQ ID NO: 129, который содержит каноническую структуру класса 6; CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, вариант SEQ ID NO: 132, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 132 или вариант SEQ ID NO: 132, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, вариант SEQ ID NO: 139, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 139 или вариант SEQ ID NO: 139, который содержит каноническую структуру класса 1, CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143, вариант SEQ ID NO: 143, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 143 или вариант SEQ ID NO: 143, который содержит каноническую структуру класса 1; CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148, вариант SEQ ID NO: 148, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 148 и вариант SEQ ID NO: 148, который содержит каноническую структуру класса 3А, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153, вариант SEQ ID NO: 153, консервативно модифицированный вариант SEQ ID NO: 153 или вариант SEQ ID NO: 153, который содержит каноническую структуру класса 13. В конкретных вариантах осуществления данного типа, когда антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно дувмя-пятью аминокислотными остатками, и/или более предпочтительно тремя-восемью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 159 или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или любой их комбинации.

Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются со специфичностью с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α). В конкретных вариантах осуществления данного типа антитела и их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α и блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим IL-4 и/или IL-13. Как указано выше, выделенные антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты могут представлять канинизированые антитела или канинизированные антигенсвязывающие фрагменты. В еще одних вариантах осуществления выделенные антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты могут представлять собой мышиные антитела или их мышиные антигенсвязывающие фрагменты.

Канинизированные антитела или канинизированные антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать шарнирную область. В конкретном варианте осуществления данного типа шарнирная область содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101. В другом варианте осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102. В еще одном варианте осуществления шарнирная область содержит аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103. В еще одном варианте осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.

В некоторых вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164. В конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 163. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166. В конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 165. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168. В конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 167. В конкретных вариантах осуществления данных типов, когда канинизированное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно с двумя-пятью аминокислотными остатками и/или более предпочтительно тремя-восьмью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 154 или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или любой их комбинации.

В близких вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170. В конкретных вариантах данного типа легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 169. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В конкретных вариантах осуществления данного типа легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 171. В еще одних вариантах осуществления канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174. В конкретных вариантах осуществления данного типа легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 173. В конкретных вариантах осуществления данных типов, когда канинизированное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно с двумя-пятью аминокислотными остатками и/или более предпочтительно тремя-восьмью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 154 или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или любой их комбинации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, содержащим комбинацию таких тяжелых цепей и легких цепей. В конкретных вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170. В более конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 163, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 169. В еще одних вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В более конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 165, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 171. В еще одних вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174. В более конкретных вариантах осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 167, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 173.

В близких вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В еще одних вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174. В еще одних вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170. В еще одних вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174. В еще одних вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170. В еще одних вариантах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172.

В конкретных вариантах осуществления данных типов, когда канинизированное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно с двумя-пятью аминокислотными остатками и/или более предпочтительно тремя-восьмью аминокислотными остатками или более в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 154 или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или любой их комбинации.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к выделенным антителам млекопитающих или их антигенсвязывающим фрагментам (включая канинизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты), которые связываются со специфичностью с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), и, когда связывается с собачьим IL-4R_α, то антитело связывается, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком, предпочтительно с двумя-пятью аминокислотными остатками и/или более предпочтительно тремя-восьмью аминокислотными остатками или более в SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162, или любой их комбинации. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с собачьим IL-4R_α и блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим интерлейкином-4.

В настоящем изобретении дополнительно обеспечиваются антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с собачьим IL-4R_α с константой диссоциации (Kd), которая ниже (например, 1×10^-13 М или ниже), чем 1×10^-12 М. В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α с константой диссоциации от 1×10^-5 М до 1×10^-12 М. В более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α с константой диссоциации от 1×10^-7 М до 1×10^-11 М. В еще более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α с константой диссоциации от 1×10^-8 М до 1×10^-11 М. В еще более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α с константой диссоциации от 1×10^-8 М до 1×10^-10 М.

Настоящее изобретение также относится к антителам млекопитающих или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью ассоциации (k_on), которая превышает 1×10⁷ M^-1с^-1. В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью ассоциации от 1×10² M^-1с^-1 до 1×10⁷ M^-1с^-1. В более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью ассоциации от 1×10³ M^-1с^-1 до 1×10⁶ M^-1с^-1. В еще более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью ассоциации от 1×10³ M^-1с^-1 до 1×10⁵ M^-1с^-1. В еще более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью ассоциации от 1×10⁴ M^-1с^-1 до 1×10⁵ M^-1с^-1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам млекопитающих или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью диссоциации (k_off) ниже, чем 1×10^-7 с^-1. В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью диссоциации от 1×10^-3 с^-1 до 1×10^-8 с^-1. В более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью диссоциации от 1×10^-4 с^-1 до 1×10^-7 с^-1. В еще более конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с собачьим IL-4R_α со скоростью диссоциации от 1×10^-5 с^-1 до 1×10^-7 с^-1.

В конкретных вариантах осуществления антитело млекопитающего по настоящему изобретению (включая химерные антитела) блокирует связывание собачьего IL-4 с IL-4R_α. В более конкретных вариантах осуществления антитело блокирует связывание собачьего IL-4 с IL-4R_α с минимальным значением EC₅₀ от 1×10^-8 M до 1×10^-9 M или даже в более низкой концентрации. В еще более конкретных вариантах осуществления ЕС₅₀ составляет от 5×10^-9 M до 1×10^-13 M. В еще более конкретных вариантах осуществления ЕС₅₀ составляет от 5×10^-9 M и 5×10^-11 M.

В близких вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты воздействуют отрицательно с ослаблением, например, ингибируют, клеточный путь(и) передачи сигналов, опосредуемый связыванием IL-4 и/или IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II. В конкретных вариантах осуществления антитела млекопитающих или их антигенсвязывающие фрагменты подавляют воспалительное заболевание кожи, вызывающее зуд, например, атопический дерматит, у субъекта-животного. В более конкретных вариантах осуществления субъектом-животным является собака. В близком варианте осуществления субъектом-животным является кошка.

Следовательно, любое из антител по настоящему изобретению может обладать одним, двумя, тремя, четырьмя или всеми данными свойствами, то есть вышеуказанными константами диссоциации с собачьим IL-4R_α, вышеуказанными скоростями связывания с собачьим IL-4R_α, вышеуказанными скоростями диссоциации из комплекса связывания антитело-собачий IL-4R_α, ингибированием клеточного пути(ей) передачи сигналов, опосредуемого связыванием IL-4 и/или IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II, или подавлением воспалительного заболевания кожи, вызывающего зуд, например, атопического дерматита, у субъекта-животного.

Как указано выше, антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты) по настоящему изобретению, включая вышеуказанные антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), могут представлять моноклональные антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), антитела млекопитающих (и их антигенсвязывающие фрагменты), например, мышиные (мыши) антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), канинизированные антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), включая канинизированные мышиные антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), и в некоторых вариантах осуществления антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты) являются выделенными.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам (включая выделенные нуклеиновые кислоты), которые кодируют любую из легких цепей канинизированного антитела по настоящему изобретению. Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые кодируют любую из тяжелых цепей канинизированного антитела по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к экспрессионным векторам, которые содержат одну или несколько нуклеиновых кислот (включая выделенные нуклеиновые кислоты) по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые содержат один или несколько экспрессионных векторов по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В близких вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены гибким линкером с образованием одноцепочечного антитела.

В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют Fab-фрагмент. В еще одних вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab'-фрагмент. В еще одних вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет (Fab')₂-фрагмент. В еще одних вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой диатело. В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент являются доменным антителом. В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет однодоменное антитело.

В конкретных вариантах осуществления канинизированное мышиное антитело против собачьего IL-4R_α или антигенсвязывающий фрагмент оказывают отрицательное воздействием с ослаблением на путь(и) передачи сигналов, опосредуемый связыванием IL-4 и/или IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II у субъекта-животного (например, собаки), которое подвергается лечению. В более конкретных вариантах осуществления введение канинизированного мышиного антитела против собачьего IL-4R_α или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению служат для ослабления одного или нескольких симптомов атопического дерматита у субъекта-животного (например, собаки).

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые кодируют канинизированные мышиные антитела против собачьего IL-4R_α или их фрагменты. В близких вариантах осуществления такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть использованы для получения лекарственного средства для лечения атопического дерматита у собаки. Альтернативно или в сочетании, настоящее изобретение обеспечивает применение любого из антител или фрагментов антител по настоящему изобретению для диагностического применения. В еще одних дополнительных вариантах осуществления обеспечивается набор, содержащий любое из канинизированных антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных здесь.

В еще одних дополнительных вариантах осуществления обеспечивается экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из канинизированных мышиных антител против собачьего IL-4R_α или антигенсвязывающих фрагментов по изобретению. Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей любой из экспрессионных векторов, описанных здесь. В конкретных вариантах осуществления данные нуклеиновые кислоты, экспрессионные векторы или полипептиды по изобретению пригодны в способах получения антитела. Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам (включая выделенные антигенные пептиды), которые состоят из 80 или менее аминокислотных остатков, которые составляют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162. В близких вариантах осуществления пептиды (включая выделенные антигенные пептиды) состоят из 60 или менее аминокислотных остатков, которые составляют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162. В близких вариантах осуществления пептиды (включая выделенные антигенные пептиды) состоят из 10 до 45 аминокислотных остатков, которые составляют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162. В еще одних вариантах осуществления пептиды (включая выделенные антигенные пептиды) состоят из 5 до 25 аминокислотных остатков или которые составляют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенным пептидам (включая выделенные пептиды), которые состоят из 80 или менее аминокислотных остатков, которые составляют аминокислотную последовательность, которая на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162, и связываются с выделенным антителом млекопитающего или антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению. В близких вариантах осуществления антигенные пептиды (включая выделенные антигенные пептиды) состоят из 60 или менее аминокислотных остатков, которые составляют аминокислотную последовательность, которая на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162, и связываются с выделенным антителом млекопитающего или его антигенсвязывающим фрагментом. В еще одних вариантах осуществления пептиды состоят из 5-25 аминокислотных остатков или которые составляют аминокислотную последовательность, которая на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или SEQ ID NO: 127, или SEQ ID NO: 128, или SEQ ID NO: 154, или SEQ ID NO: 155, или SEQ ID NO: 156, или SEQ ID NO: 157, или SEQ ID NO: 158, или SEQ ID NO: 159, или SEQ ID NO: 160, или SEQ ID NO: 161, или SEQ ID NO: 162, и связываются с выделенным антителом млекопитающего или его антигенсвязывающим фрагментом. В конкретных вариантах осуществления антитело млекопитающих содержит CDR 4D8. В еще одних вариантах осуществления антитело млекопитающих содержит CDR 11H2. В еще одних вариантах осуществления антитело млекопитающих содержит CDR 4H3. В еще одних вариантах осуществления антитело млекопитающего содержит CDR 11B6. В еще одних вариантах осуществления антитело млекопитающих содержит CDR 2E2. В еще одних вариантах осуществления антитело млекопитающих содержит CDR 6C12.

Кроме того, настоящее изобретение относится к слитым белкам, которые включают любой из вышеуказанных пептидов. В конкретном варианте осуществления слитый белок содержит такой антигенный пептид и Fc-область IgG антитела млекопитающего, отличного от собаки. В более конкретном варианте осуществления слитый белок содержит Fc-область IgG антитела млекопитающего, отличного от собаки. В некоторых вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет собой мышиный IgG. В альтернативных вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет собой IgG человека. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет собой IgG лошади. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет собой IgG свиньи. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, является бычьим IgG.

В конкретных вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет IgG1. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет IgG2a. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет IgG3. В еще одних вариантах осуществления IgG антитело млекопитающего, отличного от собаки, представляет IgG4. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и мальтозосвязывающий белок. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и бета-галактозидазу. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и глутатион-S-трансферазу. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и тиоредоксин. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и Gro EL. В еще одних вариантах осуществления слитый белок включает любой из вышеуказанных антигенных пептидов и NusA.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам (включая выделенные нуклеиновые кислоты), которые кодируют антигенные пептиды и соответствующие слитые белки по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к экспрессионным векторам, которые содержат эти нуклеиновые кислоты, и клеткам-хозяевам, которые содержат один или несколько экспрессионных векторов по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие антитела к собачьему IL-4R_α или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, антигенные пептиды (включая выделенные антигенные пептиды), происходящие из собачьего IL-4R_α, слитые белки, содержащие антигенные пептиды, происходящие из собачьего IL-4R_α по настоящему изобретению, нуклеиновые кислоты (включая выделенные нуклеиновые кислоты), кодирующие антигенные фрагменты и/или слитые белки по настоящему изобретению, экспрессионные векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, или любую их комбинацию, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам отрицательного воздействия с ослаблением активности IL-4 и/или IL-13, включающим введение субъекту-животному, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества таких фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления способ используется для лечения атопического дерматита у собаки.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут лучше пояснены со ссылкой на следующее краткое описание фигур и подробное описание.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана реактивность очищенных мышиных моноклональных антител к собачьему IL-4R_α (mAbs) против внеклеточного домена собачьего IL-4R_α. Различные мышиные mAb тестировали на их связывание с внеклеточным доменом собачьего IL-4R_α с помощью ELISA. Тестированные mAb обозначены следующим образом: 1A3 (•), 1A9 (), 1B12 (), 10C12 (), 10F2 (♦), 10E10 (•), 10 G8 (), 11B6 (), 11D3 () и контрольное антитело (♦). На оси абсцисс показано log значение концентрации mAB (нМ), на оси ординат представлена оптическая плотность, определенная с помощью ELISA.

На фигуре 2А показана кривая зависимости доза-эффект для связывания собачьего IL-4 с собачьим IL-4R_α, экспрессированным на поверхности клеток CHO, с использованием клеточного анализа связывания в системе CHO-cIL-4Rα. На оси абсцисс показано log значение добавленной концентрации IL-4, на оси ординат представлена средняя интенсивность флуоресценции (MFI), измеренная с использованием FACS.

На фигуре 2В показаны кривые зависимости доза-эффект для CHO-cIL-4Rα с использованием мышиных моноклональных антител к IL-4R_α (mAb): 11B6 (•), 4D8 (), 4H3 (), 2E2 (), 11H2 (♦) и 6C12 (). На оси абсцисс показано log значение добавленной концентрации IL-4, на оси ординат представлена средняя интенсивность флуоресценции (MFI), измеренная с использованием FACS. Половинные максимальные эффективные концентрации (EC50) для каждого из антител представлены в таблице 2 ниже.

На фиг. 3А и 3В показаны результаты добавления последовательно разведенных отдельных мышиных моноклональных антител к собачьему IL-4R_α (mAbs) на связывание IL-4 с использованием клеточного анализа связывания в системе CHO-cIL-4Rα. На фиг. 3А показана зависимость от концентрации способности моноклональных антител 11B6 (♦), 4D8 (), 4H3 (), 2E2 () и 11H2 (♦) индивидуально блокировать связывание IL-4 с использованием клеточного анализа связывания в системе CHO-cIL-4Rα. На фиг.3В показана зависимость от концентрации способности моноклональных антител 11H2 (♦) и 6C12 () индивидуально блокировать связывание IL-4 с использованием клеточного анализа связывания в системе CHO-cIL-4Rα. На оси абсцисс показано log значение добавленной концентрации IL-4, на оси ординат представлена средняя интенсивность флуоресценции (MFI), измеренная с использованием FACS.

На фиг. 4 показано связывание химерных и канинизированных моноклональных антител с собачьим IL-4R_α, которое оценивали с помощью ELISA. Дозозависимая реактивность канинизированных моноклональных антител к альфа-цепи собачьего рецептора IL-4 показана следующим образом: 4H3 M-C (•); 2G9 M-C (÷); c4H3 H1-L1 (); c4H3 H2-L2 (); c4H3 H3-L3 (О).

Подробное описание

В настоящее время различные подходы к лечению АД человека исследуются во многих клинических испытаниях [см. Malajian et al., New pathogenic and therapeutic paradigms in atopic dermatitis, Cytokine, (2014)]. Некоторые из этих подходов направлены на то, чтобы интерферировать с одной или несколькими сигнальными молекулами/событиями, ведущими к развитию и активации Th2-клеток. Одно из направлений исследований в данной области включает подходы к блокированию действия ключевых интерлейкинов-регуляторов Th2-пути. Основываясь на наблюдениях о том, что АД в значительной степени является заболеванием с преобладанием популяции Th2-клеток и накоплением данных, поддерживающих ключевую роль комбинированных эффектов IL-4 и IL-13 в качестве основных факторов развития Th2-клеток, и на основе данных, указывающих, что α-цепь рецептора IL-4 является необходимым рецептором для передачи сигналов от обоих цитокинов, настоящее изобретение описывает получение и характеристику моноклональных антител, которые блокируют связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и типа II и затем ингибируют передачу сигналов от обоих собачьих IL-4 и IL-3. Данные антитела имеют применимость при лечении атопического дерматита и других заболеваний у домашних животных, как здесь описано.

Сокращенные обозначения

По тексту подробного описания и в примерах изобретения будут использоваться следующие сокращенные обозначения:

ADCC Антителозависимая цитотоксичность CDC Комплементзависимая цитотоксичность CDR Определяющая комлементарность область в вариабельной области иммуноглобулина, определяемая с использованием системы нумерации Кабат CHO Яичники китайского хомячка EC50 Концентрация, приводящая к 50% эффективности или связыванию ELISA Иммуноферментный анализ FR Каркасная область антитела: вариабельные области иммуноглобулина, исключая участки CDR HRP Пероксидаза хрена IFN Интерферон IC50 Концентрация, приводящая к 50% ингибированию IgG Иммуноглобулин G Kabat Система выравнивания и нумерации иммуноглобулинов, впервые разработанная Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] mAb Моноклональное антитело (также Mab или MAb) MES 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота MOA Механизм действия NHS Нормальная человеческая сыворотка ПЦР Полимеразная цепная реакция ФК Фармакокинетика SEB Энтеротоксин В стафилоккоков TT Столбнячный токсоид V область Сегмент IgG цепей, который варьирует по последовательности среди антител. Он простирается до остатка 109 по Кабат в легкой цепи и 113 в тяжелой цепи VH Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина VL Вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина VK Вариабельная область легкой цепи каппа иммуноглобуоина

Определения

Для того, чтобы изобретение было более понятным, определенные технические и научные термины конкретно определены ниже. Если специально не указано иное в другом месте данного документа, то все другие технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение.

Как здесь используется, включая прилагаемую формулу изобретения, единственные формы слов, такие как «a», «an» и «the», включают их соответствующие множественные формы, если контекст явно не диктует иное.

Термин «активация», по отношению к клеткам или к рецепторам, относится к активации или обработке клетки или рецептора лигандом, если не указано иное по контексту или определенно. Термин «лиганд» охватывает природные и синтетические лиганды, например, цитокины, варианты цитокинов, аналоги, мутеины и связывающие соединения, полученные из антител. Термин «лиганд» также охватывает небольшие молекулы, например, пептидные миметики цитокинов и пептидные миметики антител. Термин «активация» может относиться к активации клеток, регулируемой внутренними механизмами, а также внешними или экологическими факторами.

Термин «активность» молекулы может описывать или относиться к связыванию молекулы с лигандом или рецептором, к каталитической активности; к способности стимулировать экспрессию генов или клеточную сигнализацию, дифференцировку или созревание; к антигенной активности, к модуляции активности других молекул и тому подобное. Термин «активность» молекулы также может относиться к активности в модуляции или поддержании взаимодействия между клетками, например, адгезии, или к активности в поддержании структуры клетки, например, клеточных мембран или цитоскелета. Термин «активность» также может означать специфическую активность, например [каталитическую активность]/[мг белка] или [иммунологическую активность]/[мг белка], концентрацию в биологическом компартменте или тому подобное. Термин «активность» может относиться к модуляции компонентов врожденной или адаптивной иммунной системы.

Термины «введение» и «обработка», по отношению к животному, например, экспериментальному субъекту-собаке, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к контактированию экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического агента или композиции с животным, например, субъектом-собакой, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Обработка клетки включает контактактирование реагента с клеткой, а также контактированию реагента с жидкостью, где жидкость контактирует с клеткой. Термины «введение» и «обработка» также означают обработку in vitro и ex vivo, например, клетки, реагентом, диагностическим, связывающим соединением или другой клеткой. Термин «субъект» включает любой организм, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее (например, собаку, кошку или человека) и наиболее предпочтительно собаку.

Как здесь используется, термин «замещение аминокислотного остатка» другим аминокислотным остатком в аминокислотной последовательности антитела, например, эквивалентен «замене аминокислотного остатка» другим аминокислотным остатком и означает, что определенный аминокислотный остаток в определенном положении в аминокислотной последовательности был заменен (или замещен) другим аминокислотным остатком. Такие замещения могут быть спланированы специально, то есть, целенаправленно заменяя аланин на серин в определенном положении в аминокислотной последовательности, например, с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Альтернативно, конкретный аминокислотный остаток или последовательность аминокислотных остатков антитела могут быть заменены одним или несколькими аминокислотными остатками в большей степени в результате естественных процессов отбора, например, основываясь на способности антитела, продуцируемого клеткой, связываться с определенной областью на данном антигене, например, областью, содержащей эпитоп или его фрагмент, и/или для того, чтобы антитело содержало определенную CDR, которая сохраняет ту же каноническую структуру, что и CDR, которую она заменяет. Такие замещения/замены могут привести к получению «вариантных» CDR и/или вариантных антител.

Термины «лечить» или «лечение» означает введение терапевтического агента, такого как композиция, содержащая любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, внутрь или наружно у субъекта-собаки или пациента-собаки, имеющего один или несколько симптомов заболевания, или с подозрением на наличие заболевания, при котором агент обладает терапевтической активностью.

Как правило, агент вводят в количестве, эффективном для ослабления и/или подавления одного или более симптомов заболевания у подвергшегося лечению субъекта или популяции субъектов, путем индукции регрессии или ингибирования прогрессирования такого симптома (симптомов) в любой клинически оцениваемой степени. Количество терапевтического агента, которое является эффективным для ослабления любого конкретного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьироваться в зависимости от таких факторов, как статус болезни, возраст и масса пациента (например, собака), и способность фармацевтической композиции вызывать требуемый ответ у субъекта. Насколько симптом заболевания был ослаблен или подавлен, можно оценить любым клиническим анализом, обычно используемым ветеринарными врачами или другими медицинскими специалистами для оценки степени тяжести или прогрессирования этого симптома. Несмотря на то, что вариант осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или предмет получения) может быть неэффективным в ослаблении симптома(ов) целевого заболевания у всех субъектов, он должен ослабить симптом(ы) целевого заболевания у статистически значимого количества субъектов, что определяется любым статистическим тестом, известным в данной области, таким как t-тест Стьюдента, тест chi2, U-тест Манна и Уитни, тест Крускала-Уоллиса (H-тест), тест Джонкхиера-Терпстра и тест Уилкоксона.

Термин «лечение», по отношению к человеку, ветеринарному субъекту (например, собаке) или испытуемому субъекту, относится к терапевтическому лечению, а также к исследовательским и диагностическим применениям. Термин «лечение», по отношению к человеку, ветеринарному субъекту (например, собаке) или испытуемому субъекту, клетке, ткани или органу, охватывает контактирование антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с собакой или другим субъектом-животным, клеткой, тканью, физиологическим компартментом или физиологической жидкостью.

Как здесь используется, термин «собака» включает всех домашних собак Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если не указано иное.

Как здесь используется, термин «кошка» относится к любому члену семейства кошачьих (Felidae). Членами этого семейства являются дикие, зоопарковые и домашние кошки, такие как любой член подсемейств Felinae, например, кошки, львы, тигры, пумы, ягуары, леопарды, снежные барсы, пантеры, североамериканские горные львы, гепарды, рысь, рыжая рысь, каракалы или любые помеси. Кошки также включают домашних кошек, чистокровных и/или домашних кошек-полукровок, выставочных кошек, лабораторных кошек, клонированных кошек и диких или одичавших кошек.

Как здесь используется термин «собачья каркасная область» относится к аминокислотной последовательности тяжелой цепи и легкой цепи собачьего антитела, отличной от остатков гипервариабельного участка, определенных здесь как остатки CDR. В отношение канинизированного антитела, то в большинстве вариантов осуществления аминокислотные последовательности нативных собачьих CDR замещены соответствующими чужеродными CDR (например, CDR из мышиного антитела) в обеих цепях. Необязательно тяжелые и/или легкие цепи собачьего антитела могут содержать некоторые чужеродные остатки, отличные от CDR, например, для сохранения конформации чужеродных CDR внутри собачьего антитела и/или модификации функции Fc, как показано ниже.

Было установлено, что собачий IL-4R_α содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 [SEQ ID NO: 4, без сигнальной последовательности]. В конкретном варианте осуществления собачий IL-4R_α кодируется нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 [SEQ ID NO: 3 без сигнальной последовательности]. Последовательности собачьего IL-4R_α могут различаться наличием, например, консервативных вариаций в неконсервативных областях, но собачий IL-4R_α будет иметь по существу ту же биологическую функцию, что и собачий IL-4R_α, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 [SEQ ID NO: 4, без сигнальной последовательности].

Цитокины IL-4 и IL-13 участвуют в патогенезе различных аллергических заболеваний у людей и животных, включая астму и атопический дерматит. Поскольку α-цепь рецептора IL-4 является необходимой рецепторной субъединицей для передачи сигналов от любого из этих цитокинов, то настоящее изобретение описывает получение и характеристику моноклональных антител, которые блокируют связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с IL-4R_α и тем самым ингибируют передачу сигналов от обоих собачьего IL-4 и IL-13. Следовательно, данные антитела пригодны в лечении атопического дерматита и других заболеваний у домашних животных, как здесь описано. Кроме того, для проявления биологической функции собачьего IL-4R_α требуется наличие, например, эпитопа во внеклеточном домене, который специфически связывается с антителом по настоящему раскрытию.

Отдельная аминокислотная последовательность собачьего IL-4R_α обычно будет, по меньшей мере, на 90% идентична собачьему IL-4R_α, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых случаях собачий IL-4R_α может быть, по меньшей мере, на 95% или даже, по меньшей мере, на 96%, 97%, 98% или 99% идентичен собачьему IL-4R_α, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность собачьего IL-4R_α должна различаться не более чем на 10 аминокислот с собачьим IL-4R_α, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность собачьего IL-4R_α может различаться не более чем на 5 или даже не более чем на 4, 3, 2 или 1 аминокислоту с собачим IL-4R_α, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Процент идентичности можно определить, как описано ниже.

Термин «иммунный ответ» относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцированных вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к избирательному повреждению, деструкции или удалению из организма млекопитающего (например, организма собаки) раковых клеток, клеток или тканей, инфицированных патогенами, или инвазирующих патогенов.

Антитела к IL-4R_α

Настоящее изобретение относится к выделенным антителам (в частности, мышиным антителам против собачьего IL-4R_α и их канинизированным антителам) или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с собачьим IL-4R_α, и к применениям таких антител или их фрагментов. В конкретных вариантах осуществления изобретения обеспечиваются мышиные антитела к CDR IL-4R_α из мышиных антител против собачьего IL-4R_α, которые, как было показано, связываются с собачьим IL-4R_α и блокируют связывание собачьего IL-4R_α с одним или более его лигандами, собачьим IL-4 или IL-13. Данные CDR могут быть вставлены в модифицированную собачью каркасную область собачьего антитела с получением канинизированного мышиного антитела к собачьему IL-4R_α.

Как здесь используется, термин «антитело к собачьему IL-4R_α» относится к антителу, которое продуцировано против собачьего IL-4R_α (например, у млекопитающего, такого как мышь или кролик) и которое специфически связывается с собачьим IL-4R_α. Антитело, которое «специфически связывается с собачьим IL-4R_α» и, в частности, собачьим IL-4R_α, или антитело, которое «специфически связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность собачьего IL-4R_α», представляет собой антитело, которое проявляет предпочтительное связывание с собачьим IL-4R_α по сравнению с другими антигенами, но для данной специфичности не требуется абсолютная специфичность связывания. Антитело к собачьему IL-4R_α считается «специфическим» для собачьего IL-4R_α, если его связывание является определяющим для присутствия собачьего IL-4R_α в образце, или если оно способно изменять активность собачьего IL-4R_α, не оказывая значительного отрицательного влияния на активность других молекул в образце собаки, например, без получения нежелательных результатов, таких как ложноположительные реакции при диагностическом применении или побочные эффекты при терапевтическом применении. Степень специфичности, необходимая для антитела к собачьему IL-4R_α, может зависеть от предполагаемого применения антитела и, во всяком случае, определяется его пригодностью для применения по назначению. Антитело или связывающее соединение, полученное из антигенсвязывающего участка антитела рассматриваемым способом, связывается с его антигеном или его вариантом, или его мутеином с аффинностью, которая, по меньшей мере, в 2 раза выше, предпочтительно, по меньшей мере, в 10 раз выше, более предпочтительно, по меньшей мере, в 20 раз выше, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз больше, чем аффинность для любого другого антигена.

Как здесь используется, антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим определенную антигенную последовательность (в данном случае фрагмент аминокислотной последовательности собачьего IL-4R_α), если оно связывается с полипептидами, содержащими фрагмент аминокислотной последовательности собачьего IL-4R_α, но не связывается с другими собачьими белками, в которых отсутствует фрагмент последовательности собачьего IL-4R_α. Например, антитело, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим собачий IL-4R_α, может связываться с FLAG^®-меченной формой собачьего IL-4R_α, но не будет связываться с другими FLAG^®-меченными собачьими белками. Антитело или связывающее соединение, полученное из антигенсвязывающего участка антитела, связывается «со специфичностью» с его собачьим антигеном или его вариантом, или мутеином, когда оно обладает аффинностью к этому собачьему антигену или его варианту, или мутеину, которая, по меньшей мере, в 10 раз выше, более предпочтительно, по меньшей мере, в 20 раз выше и еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз выше его аффинности для любого другого тестируемого собачьего антигена.

Как здесь используется, термин «антитело» относится к любой форме антитела, которая проявляет требуемую биологическую активность. Таким образом, он используется в самом широком смысле и конкретно охватывает, но не ограничивается, моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), канонизированные антитела, полностью собачьи антитела, химерные антитела и камелизированные однодоменные антитела. «Родительские антитела» представляют собой антитела, полученные воздействием иммунной системы на антиген до модификации антител для предназначенного применения, такой как канинизация антитела для применения в качестве собачьего терапевтического антитела.

Как здесь используется, если не указано иначе, то «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» относится к антигенсвязывающим фрагментам антител, то есть к фрагментам антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, с которым связываются полноразмерные антитела, например, фрагменты, которые сохраняют один или более участков CDR. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, не ограничиваясь этим, Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител, например, sc-Fv; нанотела и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.

«Fab-фрагмент» состоит из одной легкой цепи и C_H1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. «Fab-фрагмент» может быть продуктом расщепления антитела папаином.

Термин «кристаллизуемый фрагмент» («Fc») содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащих домены C_H3 и C_H2 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов C_H3.

«Fab'»-фрагмент содержит одну легкую цепь и часть или фрагмент одной тяжелой цепи, который содержит область V_H и домен C_H1, и также область между доменами C_H1 и C_H2, так что между ними может образовываться межцепочечная дисульфидная связь между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов с образованием молекулы F(ab')₂.

«F(ab')₂»-фрагмент содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами C_H1 и C_H2, так что между двумя тяжелыми цепями образуется межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом, «F(ab')₂»-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, которые удерживаются вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями. «F(ab')₂»-фрагмент может быть продуктом расщепления антитела пепсином.

«Fv-область» содержит вариабельные области из обеих тяжелой и легкой цепей, но не имеет константных областей.

Термин «одноцепочечное Fv» или «scFv» антитело относится к фрагментам антитела, содержащим области V_H и V_L антитела, где эти области находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между областями V_H и V_L, который позволяет scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена [см., Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); международная заявка WO 88/01649; и патенты США № 4946778 и № 5260203].

Как здесь используется, термин «каноническая структура» относится к локальной конформации, которую может принимать каждый из гипервариабельных участков тяжелой и легкой цепи антитела внутри каркасной области, в которой они находятся. Для каждого гипервариабельного участка существует небольшое число канонических структур (обычно обозначаемых простыми целыми числами, такими как 1 или 2 и т. д.), которые можно прогнозировать с большой точностью по аминокислотным последовательностям соответствующего гипервариабельного участка [особенно в контексте аминокислотной последовательности его каркасной области, как показано ниже для соответствующих вариабельных областей к собачьему IL-4R_α (см. таблицу 3 ниже)]. Данные канонические структуры могут быть определяющими в отношении того, приведет ли модификация аминокислотной последовательности определенной CDR к сохранению или потере способности связываться с ее антигенсвязывающим партнером [см. Chothia and Lesk, Canonical Structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothia et al., Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions, Nature, 34:877-883(1989); и Al-Lazikani et al., Standard Conformations for the canonical structures of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 273:927-948 (1997)].

«Доменное антитело» представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях две или более области V_H ковалентно связываются с пептидным линкером с получением бивалентного доменного антитела. Две области V_H бивалентного доменного антитела могут быть нацелены на одни и те же или разные антигены.

«Бивалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих участка. В некоторых случаях два антигенсвязывающих участка имеют одинаковую антигенную специфичность. Однако бивалентные антитела могут быть биспецифическими (см. ниже).

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела в настоящем изобретении также включают камелизированные однодоменные антитела [см., например, Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci. 26: 230 (2001); Reichmann et al., J. Immunol. Методы 231: 25 (1999); международные заявки WO 94/04678; WO 94/25591; патент США № 6005079]. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к однодоменным антителам, содержащим две области V_H с такими модификациями, что образуются однодоменные антитела.

Как здесь используется, термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, где эти фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанную с вариабельной областью легкой цепи (V_L), в той же полипептидной цепи (V_H-V_L или V_L-V_H). При использовании линкера, который является слишком коротким для того, чтобы произошло спаривание между двумя областями в одной и той же цепи, области вынужденно спариваются с комплементарными областями другой цепи и создают два антигенсвязывающих центра. [См., EP 0404097B1; WO 93/11161; и Holliger et al., Proc. Natl. Акад. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]. Имеется обзор по генно-инженерным вариантам антител [в общем, см. Holliger and Hudson, Nat. Biotechnol., 23: 1126-1136 (2005)].

Как правило, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению сохраняют, по меньшей мере, 10% от их связывающей активности для собачьего IL-4R_α (по сравнению с родительским антителом), когда эта активность выражается на молярной основе. Предпочтительно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению сохраняют, по меньшей мере, 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или более от аффинности связывания родительского антитела с собачьим IL-4R_α. Предполагается также, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут включать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены (относящиеся к «консервативным вариантам» или «функционально-консервативным вариантам» антитела), которые существенно не изменяют их биологическую активность.

«Выделенное антитело» относится к состоянию очистки и в таком контексте означает, что молекула по существу не содержит других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другой материал, такой как клеточный дебрис и ростовая среда. Как правило, термин «выделенный» не предназначен для обозначения полного отсутствия такого материала или отсутствия воды, буферов или солей, если они не присутствуют в количествах, которые существенно мешают экспериментальному или терапевтическому применению связывающего соединения, описанного здесь.

Как здесь используется, термин «химерное антитело» представляет собой антитело, имеющее вариабельную область из первого антитела и константную область из второго антитела, где первое и второе антитела происходят из разных видов [патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Акад. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]. Обычно вариабельные области получают из антитела от экспериментального животного («родительское антитело»), такого как грызуны, и последовательности константных областей получают из антител субъекта-животного, например, человека или собаки, в результате полученное химерное антитело с меньшей вероятностью будет вызывать неблагоприятный иммунный ответ у собаки или человека, соответственно, чем родительское антитело (например, антитело грызуна).

Как здесь используется, термин «канинизированное антитело» относится к формам антител, которые содержат последовательности «собачьих» и «несобачьих» (например, мышиных) антител. В общем, канинизированное антитело будет содержать по существу все, по меньшей мере, одну или более, или обычно две вариабельных области, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым в «несобачьем» иммуноглобулине (например, содержащем 6 мышиных CDR антитела к собачьему IL-4R_α, как показано ниже), и все или по существу все каркасные области (FR) (и обычно весь или по существу весь остальной каркас) представляют последовательность собачьего иммуноглобулина. Как здесь показано в качестве примера, канинизированное антитело содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи из мышиного антитела против собачьего IL-4R_α вместе с собачьим каркасом или модифицированным собачьим каркасом. Модифицированный собачий каркас содержит одну или более изменений аминокислот, как здесь показано, что дополнительно оптимизирует эффективность канинизированного антитела, например, с повышением его связывания с собачьим IL-4R_α и/или его способности блокировать связывание собачьего IL-4 и/или собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II.

Термин «полностью собачье антитело» относится к антителу, которое содержит только белковые последовательности собачьего иммуноглобулина. Полностью собачье антитело может содержать мышиные углеводные цепи, если оно продуцируется в организме мыши, в мышиной клетке или в гибридоме, полученной из мышиной клетки. Аналогично, «мышиное антитело» относится к антителу, которое содержит только мышиные иммуноглобулиновые последовательности. Альтернативно, полностью собачье антитело может содержать углеводные цепи крысы, если оно продуцируется в организме крысы, в клетке крысы или в гибридоме, полученной из клетки крысы. Аналогично, «крысиное антитело» относится к антителу, которое содержит только крысиные иммуноглобулиновые последовательности.

Существует четыре известных субтипа IgG тяжелой цепи собачьего IgG, и они относятся к IgG-A, IgG-B, IgG-C и IgG-D. Два известных субтипа легкой цепи называются лямбдой и каппа.

Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающий сайт. Таким образом, в целом, интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два связующих сайта, как правило, одинаковы.

Как правило, вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат три гипервариабельных участка, также называемых определяющими комплементарность областями (CDR), расположенными внутри относительно консервативных каркасных областей (FR). CDR обычно выравнены каркасными областями, что способствует их связыванию с определенным эпитопом. Как правило, в направлении от N-конца к С-концу вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот к каждой области проводится в соответствии со следующими определениями «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Kabat et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978); Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) или Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)].

Как здесь используется, термин «гипервариабельный участок» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (то есть, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в вариабельной области легкой цепи и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в вариабельной области тяжелой цепи) [см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), согласно данной системе области CDR антитела определяются по последовательности; см. также Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), согласно данной системе области CDR антитела определяются по структуре]. Как здесь используется, термин остатки «каркасной области» или «FR» относится к остаткам вариабельной области, отличным от остатков гипервариабельного участка, определенных здесь как остатки CDR.

Помимо связывания и активации иммунных клеток собаки, собачье или канинизированное антитело к IL-4R_α оптимально обладает двумя свойствами:

1. у него отсутствуют эффекторные функции, такие как антителозависимая цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC); и

2. оно легко выделяется в больших масштабах с использованием промышленных стандартных технологий, таких как хроматография с протеином А.

Ни один из встречающихся в природе изотипов собачьего IgG не удовлетворяет обоим критериям. Например, IgG-B может быть очищен с использованием протеина A, но он имеет высокий уровень активности ADCC. С другой стороны, IgG-A слабо связывается протеином А, но проявляет нежелательную активность ADCC. Более того, ни IgG-C, ни IgG-D не могут быть очищены на колонках с протеином А, хотя IgG-D не проявляет активности ADCC (IgG-C имеет высокую активность ADCC). Одним способом, с помощью которого настоящее изобретение преодолевает эту проблему, является обеспечение мутантных собачьих IgG-B антител, специфичных к IL-4R_α; такие антитела не обладают эффекторными функциями, такими как ADCC, и могут быть легко очищены с использованием стандартной хроматографии с протеином A.

«Гомология» относится к сходству между двумя полинуклеотидными последовательностями или двумя полипептидными последовательностями, когда они оптимально выровнены. Когда положение в обеих двух сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или аминокислотной мономерной субъединицей, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то молекулы гомологичны по данному положению. Процент гомологии представляет количество гомологичных положений, разделяемых двумя последовательностями, деленное на общее количество сравниваемых положений × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или гомологичны, когда последовательности оптимально выровнены, то две последовательности являются гомологичными на 60%. Как правило, сравнение выполняется, когда две последовательности выровнены, чтобы обеспечить максимальную процентную гомологию.

«Выделенная молекула нуклеиновой кислоты» означает геномную ДНК или РНК, мРНК, кДНК или молекулы синтетического происхождения, или их комбинации, которая не связана со всем или фрагментом полинуклеотида, в которой выделенный полинуклеотид обнаружен в природе, или связана с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе. Для целей настоящего раскрытия следует понимать, что «молекула нуклеиновой кислоты, содержащая» конкретную нуклеотидную последовательность, не охватывает интактные хромосомы. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, «содержащие» указанные последовательности нуклеиновых кислот, могут включать в дополнение к указанным последовательностям, кодирующие последовательности для до десяти или даже до двадцати или более других белков или их частей или фрагментов, или могут включать операбельно связанные регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию кодирующей области указанных последовательностей нуклеиновой кислоты, и/или могут включать векторные последовательности.

Выражение «контрольные последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии операбельно связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Контрольные последовательности, которые подходят для прокариотов, например, включают промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота «операбельно связана», когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера операбельно связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер операбельно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы операбельно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, «операбельно связанный» означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и в случае секреторного лидера - смежными в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, то используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с обычной практикой.

Как здесь используется, выражения «клетка», «клеточная линия» и «культура клеток» используются взаимозаменяемо, и все такие термины включают потомство. Таким образом, выражения «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную клетку и культуры, полученные из нее, без учета количества трансфекций. Также понятно, что не все потомство будет иметь точно идентичное содержание ДНК в результате преднамеренных или непреднамеренных мутаций. Также включается мутантное потомство, которое обладает той же функцией или биологической активностью, которые установлены в первоначально трансформированной клетке. Там, где имеются разные обозначения, это будет ясно из контекста.

Как здесь используется, термин «последовательность зародышевой линии» относится к последовательностям ДНК иммуноглобулина, не подвергшихся реарранжировке. Может быть использован любой подходящий источник нереаранжированных последовательностей иммуноглобулина. Последовательности зародышевой линии человека могут быть получены, например, из базы данных JOINSOLVER^® germline на веб-сайте Национального института артрита и костно-мышечных и кожных заболеваний Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов. Мышиные последовательности зародышевой линии могут быть получены, например, как описано в Giudicelli et al. [Nucleic Acids Res. 33: D256-D261 (2005)].

Свойства мышиного антитела к собачьему IL-4R_α и канинизированного мышиного антитела к собачьему IL-4R_α

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные мышиные антитела против собачьего IL-4R_α и их канинизированные антитела, способы применения антител или их антигенсвязывающих фрагментов в лечении заболевания, например, в лечении атопического дерматита у собак. У собаки имеется четыре тяжелые цепи IgG, обозначаемые как A, B, C и D. Эти тяжелые цепи представляют собой четыре разных подкласса IgG собаки, которые относятся к IgGA, IgGB, IgGC и IgGD. Каждая из двух тяжелых цепей состоит из одной вариабельной области (VH) и трех константных областей, называемых CH-1, CH-2 и CH-3. Домен CH-1 связан с доменом CH-2 аминокислотной последовательностью, называемой «шарниром», или, альтернативно «шарнирной областью».

ДНК и аминокислотные последовательности этих четырех тяжелых цепей были впервые установлены Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)]. Аминокислотные последовательности и последовательности ДНК этих тяжелых цепей также доступны в базе данных GenBank. Например, аминокислотная последовательность тяжелой цепи IgGA имеет инвентарный номер AAL35301.1, IgGB имеет инвентарный номер AAL35302.1, IgGC имеет инвентарный номер AAL35303.1, и IgGD имеет инвентарный номер (AAL35304.1). Собачьи антитела также содержат два типа легких цепей, каппа и лямбда. Последовательности ДНК и аминокислотная последовательность этих легких цепей могут быть получены из базы данных GenBank. Например, аминокислотная последовательность легкой цепи каппа имеет инвентарный номер ABY 57289.1, и легкая цепь лямбда имеет инвентарный номер ABY 55569.1.

В настоящем изобретении аминокислотная последовательность для каждого из четырех Fc-фрагментов собачьего IgG основана на установленной границе доменов CH1 и CH2, что определено Tang et al., выше. Канинизированные мышиные антитела против собачьего IL-R_α, которые связываются с собачьим IL-R_α, включают, не ограничиваясь этим: антитела, которые содержат собачьи тяжелые цепи IgG-A, IgG-B и IgG-D, и/или собачьи легкие цепи каппа вместе с мышиными CDR к IL-R_α. Следовательно, настоящее изобретение относится к выделенным мышиным антителам против собачьего IL-R_α и/или канинизированным мышиным антителам против собачьего IL-R_α или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с собачьим IL-R_α и блокируют связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I или типа II.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полноразмерным тяжелым цепям, которые могут быть сопоставлены с соответствующими легкими цепями с получением канинизированного антитела. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает канинизированные антитела к собачьему антигену (включая выделенные канинизированные мышиные антитела к собачьему IL-R_α) и способы применения антител или их антигенсвязывающих фрагментов в лечении заболевания, например, в лечении атопического дерматита у собак.

Настоящее изобретение также относится к канинизированным мышиным антителам к собачьему IL-R_α, которые содержат собачью область кристаллизуемого фрагмента (сFc-область), где сFc-область генетически модифицирована для усиления, снижения или элиминации одной или нескольких эффекторных функций. В одном аспекте настоящего изобретения генетически модифицированная cFc-область снижает или элиминирует одну или более эффекторных функций. В еще одном аспекте изобретения генетически модифицированная cFc-область усиливает одну или более эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная область cFc-область представляет собой генетически модифицированную Fc-область собачьего IgGB. В еще одном таком варианте осуществления генетически модифицированная область cFc-область представляет собой генетически модифицированную Fc-область IgGС. В конкретном варианте осуществления эффекторная функция представляет антителозависимую цитотоксичность (ADCC), которая усилена, снижена или элиминирована. В еще одном варианте осуществления эффекторная функция представляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC), которая усилена, усилена, снижена или элиминирована. В еще одном варианте осуществления cFc-область была генетически модифицирована для усиления, снижения или элиминации ADCC и CDC.

Для получения вариантов собачьего IgG, которые не обладают эффекторными функциями, был создан ряд мутантных собачьих тяжелых цепей IgGB. Данные варианты могут включать одну или несколько следующих единичных или комбинированных замещений в Fc-фрагменте аминокислотной последовательности тяжелой цепи: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G и P95A. Вариантные тяжелые цепи (то есть содержащие такие аминокислотные замены) клонировали в экспрессионные плазмиды и трансфектировали в клетки HEK 293 вместе с плазмидой, содержащей ген, кодирующий легкую цепь. Интактные антитела, экспрессированные и выделенные из клеток HEK 293, оценивали на связывание с Fc_γRI и C1q для определение их потенциальной способности опосредовать иммунные эффекторные функции [см. предварительную патентную заявку на патент США 62/030812, поданную 30 июля 2014 г., и предварительную заявку на патент США 62/922496, поданную 16 декабря 2014 г., содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте].

Настоящее изобретение также относится к модифицированным собачьим IgGD, которые вместо своей природной шарнирной области IgGD содержат шарнирную область из:

Альтернативно, шарнирная область IgGD может быть генетически модифицирована замещением остатка серина остатком пролина, то есть PKESTCKCIPPCPVPES, SEQ ID NO: 104 (остаток пролина (P), подчеркнут и выделен жирным шрифтом, он замещает встречающийся в природе остаток серина). Такие модификации могут привести к получению собачьего IgGD, где будет отсутствовать обмен Fab-фрагментами. Модифицированные собачьи IgGD могут быть сконструированы с использованием стандартных методов технологии рекомбинантной ДНК (например, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]. Для конструирования данных вариантов, нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность собачьего IgGD, могут быть модифицированы таким образом, чтобы они кодировали модифицированные IgGD. Затем модифицированные последовательности нуклеиновой кислоты клонируют в экспрессионные плазмиды для экспрессии белка.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с собачьим IL-R_α, могут содержать одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) мышиного антисобачьего антитела, как здесь описано. Одна, два, три, четыре, пять или шесть CDR могут быть независимо выбраны из последовательностей CDR, приведенных ниже. В дополнительном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с собачьим IL-R_α, включают легкую цепь каппа собачьего антитела, содержащую CDR-1 CD-1, CDR-2 и/или CDR-3 мышиной легкой цепи, и тяжелую цепь собачьего IgG антитела, содержащую CDR-1, CDR-2 и/или CDR-3 мышиной тяжелой цепи.

В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с IL-R_α, и включают легкие цепи каппа собачьего антитела, содержащие от одной до шести различных CDR, имеющих, по меньшей мере, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 и/или 73, и тяжелую цепь собачьего IgG антитела, содержащего от одной до шести различных CDR, имеющих, по меньшей мере, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и/или 100, сохраняя при этом требуемые связывающие и функциональные свойства. В еще одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают собачий каркас, содержащий комбинацию последовательности тяжелой цепи IgG с легкой цепью каппа, имеющей одну или несколько из вышеуказанных аминокислотных последовательностей CDR с 0, 1, 2, 3, 4 или 5 консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами, сохраняя при этом требуемые связывающие и функциональные свойства.

Идентичность последовательностей относится к степени, до которой аминокислоты двух полипептидов являются одинаковыми в эквивалентных положениях, когда две последовательности оптимально выровнены. Как здесь используется, одна аминокислотная последовательность на 100% идентична второй аминокислотной последовательности, когда аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Соответственно, аминокислотная последовательность на 50% идентична второй аминокислотной последовательности, когда 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей идентичны. Сравнение последовательностей выполняется по непрерывному блоку аминокислотных остатков, содержащихся в данном белке, например, белке или части сравниваемого полипептида. В конкретном варианте осуществления учитываются выбранные делеции или вставки, которые могли бы иным образом изменить соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.

Сходство последовательностей включает идентичные остатки и неидентичные биохимически связанные аминокислоты. Обсуждаются биохимически связанные аминокислоты, которые обладают сходными свойствами и могут быть взаимозаменяемыми.

«Консервативно модифицированные варианты» или «консервативная замена» относятся к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими сходные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость и т. д.), так что часто изменения могут быть сделаны без изменения биологической активности белка. Специалисты в данной области техники признают, что, как правило, единичные аминокислотные замены в несущественных областях полипептида по существу не нарушают биологическую активность (см., например, Watson et al., Molecular Biology of Gene, Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4-е Ed., 1987)]. Кроме того, замещения структурно или функционально сходных аминокислот с меньшей вероятностью будут нарушать биологическую активность. Примерные консервативные замены приведены в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Примерные консервативные аминокислотные замены Исходный остаток Консервативная замена Asp (N) Gln; His Arg (R) Lys; His Asn (N) Gln; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gln (Q) Asn Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; Ile; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala; Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu

Функционально-консервативные варианты антител по изобретению также рассматриваются в настоящем изобретении. Как здесь используется, термин «функционально-консервативные варианты относятся к антителам или фрагментам, в которых один или несколько аминокислотных остатков были изменены без изменения требуемого свойства, такого как аффинность и/или специфичность к антигену. Такие варианты включают, не ограничиваясь этим, замену аминокислоты на аминокислоту, обладающую сходными свойствами, такую как консервативные аминокислотные замены, приведенные в таблице 1 выше.

Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение дополнительно включает нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуноглобулиновые цепи мышиных антител к собачьему IL-R_α, и/или канинизированные мышиные антитела к собачьему IL-R_α и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные здесь (см. примеры ниже).

Настоящее изобретение также включает нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды иммуноглобулина, содержащие аминокислотные последовательности, которые, по меньшей мере, на 70% идентичны, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 80% идентичны, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90% идентичны и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95% идентичны (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) аминокислотным последовательностям CDR и антителам, обеспеченным здесь, когда сравнение выполняется с использованием алгоритма BLAST, где параметры алгоритма выбраны для обеспечения наибольшего соответствия между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей. Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют полипептиды иммуноглобулина, содержащие аминокислотные последовательности, которые, по меньшей мере, на 70% идентичны, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 80% идентичны, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90% идентичны и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95% идентичны (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) эталонным аминокислотным последовательностям, когда сравнение выполняется с использованием алгоритма BLAST, где параметры алгоритма выбраны для обеспечения наибольшего соответствия между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей, также включены в настоящее изобретение.

Как здесь используется, процентная идентичность нуклеотидной и аминокислотной последовательности может быть определена с использованием программы C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и алгоритма Clustal W с параметрами выравнивания по умолчанию и параметрами по умолчанию для идентификации. Эти коммерчески доступные программы также могут использоваться для определения сходства последовательностей с использованием тех же или аналогичных параметров по умолчанию. В качестве альтернативы, может использоваться поиск Advanced Blast в условиях фильтров по умолчанию, например, с использованием pileup программы GCG (Genetics Computer Group, Programme for GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) с использованием параметров по умолчанию.

Следующие ссылки относятся к алгоритмам BLAST, часто используемым для анализа последовательностей: BLAST ALGORITHMS: Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Gish W. et al., Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141(1996); Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997); Zhang J. et al., Genome Res. 7:649-656 (1997); Wootton J.C. et al., Comput. Chem., 17:149-163 (1993); Hancock J.M. et al., Comput. Appl. Biosci., 10:67-70 (1994); ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff M.O. et al., "A model of evolutionary change in proteins" in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3." (1978), M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul S.F., J. Mol. Biol. 219:555-565 (1991); States D.J. et al., Methods 3:66-70(1991); Henikoff S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992); Altschul S.F. et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993); ALIGNMENT STATISTICS: Karlin S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268 (1990); Karlin S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993); Dembo A. et al., Ann. Prob., 22:2022-2039 (1994); и Altschul S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments" in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), pp. 1-14, Plenum, New York (1997).

Настоящее изобретение также относится к экспрессионным векторам, содержащим выделенные нуклеиновые кислоты по изобретению, где нуклеиновая кислота операбельно связана с контрольными последовательностями, которые распознаются клеткой-хозяином, когда клетка-хозяин трансфицируется вектором. Также обеспечиваются клетки-хозяева, содержащие экспрессионный вектор по настоящему изобретению, и способы для получения описанного здесь антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включающие культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, в культуральной среде, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина или культуральной среды.

Связывание эпитопа и аффинность связывания

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с аминокислотными остатками того же эпитопа собачьего IL-R_α, что и мышиные антитела к собачьему IL-R_α, описанные здесь. В конкретных вариантах осуществления мышиные антитела к собачьему IL-R_α или их антигенсвязывающие фрагменты также способны ингибировать/блокировать связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и/или типа II.

Канинизированное мышиное антитело к IL-R_α может быть получено рекомбинантными способами, которые известны в данной области. Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии описанных здесь антител или фрагментов, хорошо известны в данной области и включают целый ряд иммортализованных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС). К ним относятся, среди прочего, клетки яичника китайского хомячка (CHO), NSO, клетки SP2, клетки HeLa, клетки почки новорожденного сирийского хомячка (BHK), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки A549, клетки 3Т3, клетки НЕК-293 и ряд других клеточных линий. Клетки-хозяева млекопитающих включают клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, быков, лошадей и хомяков. Клеточные линии особого предпочтения выбираются при определении того, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как клетки Sf9, клетки амфибий, бактериальные клетки, растительные клетки и грибковые клетки. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающий участок, или фрагмент, легкую цепь и/или ее антигенсвязывающий участок, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой растут клетки-хозяева.

Антитела можно выделить из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белков. Кроме того, экспрессия антител по изобретению (или других фрагментов из них) в линиях продуцирующих клеток может быть усилена с использованием ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутаминсинтетазы (система GS) является общим подходом для усиления экспрессии в определенных условиях. Система GS обсуждается полностью или частично в Европейских патентах 0216846, 0256055 и 0323997 и заявке на Европейский патент 89303964.4.

В общем, гликопротеины, продуцированные в определенной клеточной линии или трансгенным животным, будут иметь паттерн гликозилирования, который характерен для гликопротеинов, продуцируемых в клеточной линии или трансгенным животным. Следовательно, конкретный паттерн гликозилирования антитела будет зависеть от конкретной клеточной линии или трансгенного животного, используемых для получения антитела. Однако все антитела, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, приведенные здесь, или содержащие аминокислотные последовательности, обеспеченные здесь, входят в настоящее изобретение, независимо от паттерна гликозилирования, который могут иметь антитела. Аналогично, в конкретных вариантах осуществления антитела с паттерном гликозилирования, содержащие только нефукозилированные N-гликаны, могут быть преимущественными, поскольку, как было показано, эти антитела проявляют большую эффективность, чем их фукозилированные аналоги как in vitro, так и in vivo [см., например, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); патенты США № 6946292 и 7214775].

Настоящее изобретение дополнительно включает фрагменты мышиных антител к собачьему IL-R_α, описанные здесь. Фрагменты антитела включают F(ab)₂-фрагменты, которые могут быть получены ферментативным расщеплением IgG, например, пепсином. Fab-фрагменты могут быть получены, например, восстановлением F(ab)₂ дитиотреитолом или меркаптоэтиламином. Fab-фрагмент представляет собой цепь V_L-C_L, присоединенную к цепи V_H-C_H1 дисульфидным мостиком. F(ab)₂-фрагмент представляет собой два Fab-фрагмента, которые, в свою очередь, соединены двумя дисульфидными мостиками. Fab-фрагмент молекулы F(ab)₂ включает участок Fc-области, между которыми располагаются дисульфидные мостики. F_v-фрагмент представляет область V_L или V_H.

В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область тяжелой цепи, например, собачью константную область, такую как константная область собачьей тяжелой цепи IgG-A, IgG-B, IgG-C и IgG-D , или ее вариант. В еще одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область легкой цепи, например, константную область собачьей легкой цепи, такую как константная область собачьей легкой цепи лямбда или каппа, или ее вариант. В качестве примера, и не ограничения, константная область собачьей тяжелой цепи может происходить из IgG-B, и константная область собачьей легкой цепи может происходить из легкой цепи каппа.

Конструирование антитела

Канинизированные мышиные антитела к собачьему IL-R_α по настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы включать модификации остатков собачьей каркасной области и/или собачьего каркаса в вариабельных областях родительского (т.е. собачьего) моноклонального антитела, например, для улучшения свойств антитела.

Экспериментальные и диагностические применения

Мышиные антитела к собачьему IL-R_α и/или канинизированные мышиные антитела к собачьему IL-4 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут быть пригодны в диагностических тестах для детектирования белка собачьего IL-R_α, например, для обнаружения его экспрессии в связи с и/или в отношение атопического дерматита.

Например, такой способ включает следующие стадии:

(а) покрытие субстратом (например, поверхности лунки планшета для микротитрования, например, пластикового планшета), мышиным антителом к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающим фрагментом;

(b) нанесение образца, подлежащего тестированию на присутствие собачьего IL-R_α, на субстрат;

(c) промывка планшета для удаления несвязанного материала в образце;

(d) нанесение детектируемых меченных антител (например, связанных с ферментом антител), которые также специфичны для антигена IL-R_α;

(e) промывка планшета для удаления несвязанных, меченных антител;

(f) если меченные антитела связаны с ферментом, то наносят реагент, который превращается под действием фермента в флуоресцентный сигнал;

(g) детектирование присутствия меченного антитела.

В дополнительном варианте осуществления меченное пероксидазой антитело, которая взаимодействует с ABTS (например, 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой)] или 3,3',5,5'-тетраметилбензидином с изменением окраски, которое можно детектировать. Альтернативно, если антитело метят детектируемым радиоизотопом (например, ³H), то его можно детектировать с использованием сцинтилляционного счетчика в присутствии сцинтиллянта. Мышиные антитела к собачьему IL-R_α по настоящему изобретению могут использоваться в процедуре вестерн-блоттинга или иммуноблоттинга белка.

Такая процедура является частью настоящего изобретения и включает, например:

(i) контактирование мембраны или другого твердого субстрата, подлежащего тестированию на присутствие связанного собачьего IL-R_α или его фрагмента, с мышиным антителом к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению. Такая мембрана может иметь форму нитроцеллюлозной или виниловой мембраны (например, мембраны из поливинилиденфторида (PVDF)], на которую перенесены белки, подлежащие тестированию на присутствие собачьего IL-R_α, проведением ПААГ-электрофореза в неденатурирующих условиях (электрофорез в полиакриламидном геле) или SDS-ПААГ-электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) (например, после электрофоретического разделения в геле). Перед контактированием мембраны с мышиным антителом к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающим фрагментом, мембрану необязательно блокируют, например, обезжиренным сухим молоком или тому подобное для того, чтобы связывать неспецифические сайты связывания белка с мембраной;

(ii) промывание мембраны один или несколько раз для удаления несвязанного мышиного антитела к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающего фрагмента и других несвязанных веществ; и

(iii) детектирование связанного мышиного антитела к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающего фрагмента.

Детектирование связанного антитела или антигенсвязывающего фрагмента может быть проведено конъюгацией антитела или антигенсвязывающего фрагмента с вторичным антителом (антителом против иммуноглобулина), которое мечено детектируемой меткой, и затем детектирование присутствия вторичного антитела.

Мышиные антитела к собачьему IL-R_α и его антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, также могут использоваться для иммуногистохимии. Такой способ является частью настоящего изобретения и включает, например (1) контактирование клетки, тестируемой на присутствие собачьего IL-R_α, с мышиным антителом к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению; и (2) детектирование антитела или его фрагмента на клетке или в ней. Если антитело или антигенсвязывающий фрагмент сами по себе помечены детектируемой меткой, то они могут детектироваться непосредственно. Альтернативно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно конъюгировать с детектируемым меченным вторичным антителом, которое затем детектируется.

Методики визуализации включают ОФЭКТ-визуализацию (однофотонная эмиссионная компьютерная томография) или ПЭТ-визуализацию (позитронно-эмиссионная томография). Метки включают, например, йод-123 (¹²³I) и технеций-99m (^99mTc), например, в сочетании с ОФЭКТ-визуализацией или ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O или ¹⁸F, например, в сочетании с ПЭТ-визуализацией или индий-111 [см., например, Gordon et al., International Rev. Neurobiol., 67: 385-440 (2005)].

Перекрестно-блокирующие антитела

Кроме того, антитело к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включает любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом в собачьем IL-R_α, с которым связываются антитела и фрагменты, описанные здесь, и любое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые перекрестно блокируют (частично или полностью) или перекрестно блокируются (частично или полностью) антителом или фрагментом, обсуждаемым здесь, на связывание с собачьим IL-R_α; и также любой его вариант.

Перекрестно-блокирующие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обсуждаемые здесь, могут быть идентифицированы на основе их способности перекрестно конкурировать с антителами, описанными здесь (на основе CDR, как показано ниже в примере 5), т. е. 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8 и/или 11D3; или более конкретно 11B6 и/или 6C12; и еще более конкретно 4D8, 4H3, 2E2 и/или 11H2, в стандартных анализах связывания (например, BIACore^®, ELISA, как показано ниже, или проточная цитометрия). Например, можно использовать стандартные анализы на основе ELISA, в которых рекомбинантный собачий белок IL-R_α иммобилизуется, одно из антител метят флуоресцентной меткой, и оценивается способность немеченых антител конкурировать на связывание меченого антитела. Дополнительно или альтернативно можно использовать анализ BIAcore^® для оценки способности антител к перекрестной конкуренции. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание, например, 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8 и/или 11D3; или более конкретно, 11B6 и/или 6C12; и еще более конкретно 4D8, 4H3, 2E2 и/или 11H2, с собачьим IL-R_α, демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, 11D3, 11B6, 6C12, 4D8, 4H3, 2E2 и/или 11H2 за связывание с собачьим IL-R_α и, таким образом, в некоторых случаях может связываться с таким же эпитопом на собачьем IL-R_α как и 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, 11D3, 11B6, 6C12, 4D8, 4H3, 2E2 и/или 11H2. Как указано выше, антитела и фрагменты, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и любые антитела к IL-R_α или фрагменты по настоящему изобретению, также являются частью настоящего изобретения.

Фармацевтические композиции и введение

Для приготовления фармацевтических или стерильных композиций канинизированного мышиного антитела к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающего фрагмента их можно смешать с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом [см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].

Композиции терапевтических и диагностических агентов могут быть получены смешиванием с приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, взвесей, водных растворов или суспензий [см., например, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]. В одном варианте осуществления анти-IL-R_α-антитела по настоящему изобретению разбавляют до соответствующей концентрации в растворе ацетата натрия с рН 5-6 и добавляют NaCl или сахарозу для обеспечения тоничности. Дополнительные добавки, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80, могут быть добавлены для повышения стабильности.

Токсичность и терапевтическая эффективность композиций антител, вводимых самостоятельно или в комбинации с другим агентом, можно определить стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (доза, вызывающая гибель 50% популяции) и ED₅₀ (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции). Соотношение доз, вызывающих токсические и терапевтические эффекты, представляет терапевтический индекс (LD₅₀/ED₅₀). В конкретных аспектах желательны антитела с высокими значениями терапевтического индекса. Данные, полученные в тестах в клеточной культуре и исследованиях на животных, могут быть использованы для составления диапазона доз для применения в собаках. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с проявлением низкой токсичности или без токсичности. Доза может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и способа введения.

Способ введения может варьироваться. Подходящие пути введения включают пероральный, ректальный, трансмукозальный, кишечный, парентеральный; внутримышечный, подкожный, внутрикожный, интрамедуллярный, интратекальный, прямой интравентрикулярный, внутривенный, внутрибрюшинный, интраназальный, интраокулярный, ингаляционный, инсуффляционный, местный, кожный, чрескожный или внутриартериальный. В конкретных вариантах осуществления мышиное антитело к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить инвазивным путем, таким как инъекция. В еще одних вариантах осуществления изобретения мышиное антитело к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающий фрагмент или его фармацевтическая композиция вводятся внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутриартериально или путем ингаляции, аэрозольной доставкой. Введение неинвазивными путями (например, перорально, например, в пилюле, капсуле или таблетке) также входит в объем настоящего изобретения.

Композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области. Например, фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить инъекцией с помощью подкожной иглы, включая, например, заранее заполненный шприц или автоинъектор. Фармацевтические композиции, раскрытые здесь, также могут вводиться с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций; таких как устройства, раскрытые в патентах США № 6620135; 6096002; 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556.

Фармацевтические композиции, раскрытые здесь, также можно вводить инфузией. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, содержащих фармацевтические композиции, включают: патент США № 4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США № 4447233, в котором раскрыт инфузионный насос для доставки лекарственного средства с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором раскрыт имплантируемый инфузионный аппарат с регулируемым потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, в котором раскрыта осмотическая система для доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отсеки. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули хорошо известны специалистам в данной области техники.

Альтернативно, мышиное антитело к собачьему IL-R_α или канинизированное мышиное антитело к IL-R_α можно вводить местным, а не системным путем, например, инъекцией антитела непосредственно в больной сустав при артрите или очаг поражения патогеном, характеризующиеся иммунопатологией, часто в виде композиции-депо или композиции с пролонгированным высвобождением. Кроме того, антитело можно вводить в системе для целенаправленной доставки лекарственного средства, например, в липосоме, покрытой тканеспецифическим антителом, направленных, например, в больной сустав при артрите или очаг поражения патогеном, характеризующиеся иммунопатологией. Липосомы будут целенаправленно доставляться и избирательно захватываться пораженной тканью.

Схема введения зависит от нескольких факторов, включая скорость метаболизма терапевтического антитела в сыворотке или ткани, степень проявления симптомов, иммуногенность терапевтического антитела и доступность клеток-мишеней в биологическом матриксе. Предпочтительно, схема введения обеспечивает доставку достаточного количества терапевтического антитела для подавления целевого заболевания, одновременно минимизируя нежелательные побочные эффекты. Следовательно, степень биологической доставки частично зависит от конкретного терапевтического антитела и тяжести патологического состояния, подлежащего лечению. Имеется руководство по выбору подходящих доз терапевтических антител [смотри, например, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Kresina (ed.) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY (1991); Bach (ed.) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY (1993); Baert, et al. New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)].

Определение соответствующей дозы проводится ветеринарным врачом, например, с использованием параметров или факторов, известных или предполагаемых в данной области, для воздействия на лечение. Обычно доза начинается с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и затем повышается с небольшими приращениями до тех пор, пока не будет достигнут требуемый или оптимальный эффект соотносительно к любым отрицательным побочным эффектам. Важные диагностические показатели включают симптомы, например, воспаления, или уровень продуцированных воспалительных цитокинов.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, могут быть доставлены непрерывной инфузией или в дозах, например, ежедневно, 1-7 раз в неделю, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в четыре месяца, раз в полгода, раз в год и т. д. Дозы могут вводиться, например, внутривенно, подкожно, местно, перорально, интраназально, ректально, внутримышечно, интрацеребрально, интраспинально или путем ингаляции. Общая недельная доза обычно составляет, по меньшей мере, 0,05 мкг/кг массы тела, чаще, по меньшей мере, 0,2 мкг/кг, 0,5 мкг/кг, 1 мкг/кг, 10 мкг/кг, 100 мкг/кг, 0,25 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг или выше (см., например, Yang et al. New Engl. J. Med., 349: 427-434 (2003); Herold et al. New Engl. J. Med., 346: 1692-1698 (2002); Liu et al. J. Neurol. Neurosurg. Psych., 67: 451-456 (1999); Portielji et al. Cancer Immunol. Immunother., 52: 133-144 (2003)]. Дозы также могут быть введены для достижения заранее определенной целевой концентрации канинизированного мышиного антитела к собачьему IL-R_α в сыворотке крови субъекта, такой как 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 мкг/мл или выше. В еще одних вариантах осуществления канинизированное мышиное антитело к собачьему IL-R_α по настоящему изобретению вводится подкожно или внутривенно, раз в неделю, раз в две недели, раз в 4 недели, раз в месяц, раз в два месяца или раз в 4 месяца в 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 или 2500 мг/субъекта.

Антигенные пептиды, распознаваемые mAb к собачьему IL-R_α, также можно использовать в качестве вакцин для индукции выработки антител, которые блокируют связывание собачьего IL-4 и собачьего IL-13 с рецепторами IL-4 типа I и типа II. Такие вакцины могут быть пригодны в качестве терапевтических вакцин для таких заболеваний, как атопический дематит. Для использования этих антигенных пептидов в качестве вакцин, один или несколько из этих пептидов можно конъюгировать химически или с помощью методов технологии рекомбинантной ДНК с другим белком-носителем для усиления иммуногенности этих пептидов и индукции выработки пептид-специфических антител. Специалистам в данной области техники известны способы конъюгации пептидов с белками-носителями. Пептидные вакцины могут быть использованы для вакцинации животных при введении в/м, п/к, пероральным путем или с помощью спрея или in ovo. Пептидные вакцины могут быть использованы в качестве субъединичных белков, экспрессированных из бактериальных, вирусных, дрожжевых или бакуловирусных вирусных систем. Альтернативно, такие пептидные вакцины могут быть доставлены введением различных вирусных или бактериальных векторов, которые экспрессируют такие пептидные вакцины, что можно осуществить методами, известными специалистам в данной области. Пептидные вакцины можно вводить в дозах от 1 до 1000 мкг, и необязательно они содержат адъювант и приемлемый фармацевтический носитель.

Как здесь используется, термины «ингибировать» или «лечить» или «лечение» включают замедление развития симптомов, связанных с расстройством, и/или снижение тяжести симптомов такого расстройства. Термины также включают ослабление имеющихся неконтролируемых или нежелательных симптомов, предупреждение развития дополнительных симптомов, и ослабление или предупреждение основных причин таких симптомов. Таким образом, термины означают, что положительный результат получен у субъекта позвоночного с расстройством, заболеванием или симптомом или с риском развития такого расстройства, заболевания или симптома.

Как здесь используется, термины «терапевтически эффективное количество», «терапевтически эффективная доза» и «эффективное количество» относятся к количеству канинизированного мышиного антитела к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, которые при введении самостоятельно или в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом в клетку, ткань или субъекту, эффективны для того, чтобы вызвать оцениваемое ослабление одного или более симптомов заболевания или состояния, или замедление прогрессирования такого заболевания или состояния. Терапевтически эффективная доза также относится к такому количеству связывающего соединения, которое достаточно для достижения, по меньшей мере, частичного ослабления симптомов, например, лечения, заживления, профилактики или улучшения такого состояния или повышения скорости лечения, заживления, профилактики или ослабления таких состояний. Применительно к отдельному активному ингредиенту, вводимому самостоятельно, терапевтически эффективная доза относится только к одному этому ингредиенту. Применительно к комбинации терапевтически эффективная доза относится к комбинированным количествам активных ингредиентов, которые обеспечивают терапевтический эффект, независимо от того, вводились ли они в комбинации, последовательно или одновременно. Эффективное количество терапевтического агента приведет к улучшению диагностического показателя или параметра, по меньшей мере, на 10%; обычно, по меньшей мере, на 20%; предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере, на 40% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 50%. Эффективное количество также может привести к улучшению субъективного показателя в тех случаях, когда субъективные показатели используются для оценки тяжести заболевания.

Другие комбинированные виды лечения

Как описано выше, канинизированное мышиное антитело к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающий фрагмент, и/или антигенный пептид по настоящему изобретению можно вводить совместно с одним или несколькими другими терапевтическими агентами (такими как ингибитор, как описано в следующем абзаце) и/или мышиным (или канинизированным) антителом к собачьему TSLP (см., например, патент США № 789242). Антитело(а) можно конъюгировать с агентом (в виде иммунокомплекса) и/или можно вводить отдельно от агента или другого антитела. В последнем случае (отдельное введение) антитела можно вводить до, после или одновременно с агентом или можно вводить совместно с другими известными терапевтическими агентами.

Наборы

Кроме того, обеспечиваются наборы, содержащие один или несколько компонентов, которые включают, не ограничиваясь этим, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как здесь обсуждалось, которые специфически связываются с IL-R_α (например, канинизированное мышиное антитело к собачьему IL-R_α или его антигенсвязывающий фрагмент) в сочетании с одним или несколькими дополнительными компонентами, включая, не ограничиваясь этим, фармацевтически приемлемый носитель и/или ингибитор, такой как ингибитор янус-киназы (JAK), например, оклацитиниб [см., международную заявку WO 2013/040241], ингибитор тирозинкиназы селезенки (SYK) [см., например, патент США № 8759366], или антагонист хемоаттрактантной молекулы, гомологичной рецепторам, экспрессированной на ТН2-клетках (см., например, международные заявки WO 2010/099039; WO 2010/031183; и патент США № 5546422]. Связывающая композиция и/или ингибитор, как описано непосредственно выше, могут быть формулированы в виде чистой композиции или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем в фармацевтической композиции.

В одном варианте осуществления набор включает связывающую композицию по настоящему изобретению (например, канинизированное мышиное антитело к собачьему IL-R_α или его фармацевтическую композицию в одном контейнере (например, в стерильном стеклянном или пластиковом флаконе) и его фармацевтическую композицию и/или ингибитор, как описано выше, в другом контейнере (например, в стерильном стеклянном или пластиковом флаконе).

Если набор включает фармацевтическую композицию для парентерального введения субъекту, то набор также может включать устройство для проведения такого введения. Например, набор может включать одну или несколько игл для подкожных инъекций, или другие инъекционные устройства, как описано выше. Набор может также включать вкладыш в упаковку, содержащий информацию, касающуюся фармацевтических композиций и лекарственных форм в наборе. Как правило, такая информация помогает владельцам домашних животных и ветеринарным врачам эффективно и безопасно использовать включенные в набор фармацевтические композиции и лекарственные формы. Например, следующая информация, касающаяся комбинации по изобретению, может быть представлена во вкладыше: данные по фармакокинетике, фармакодинамике, результаты клинических испытаний, показатели эффективности, показания и применение, противопоказания, предупреждения, меры предосторожности, побочные реакции, сведения о передозировке, правильной дозировке и введении, как поставляются, надлежащие условия хранения, ссылки, информация о производителе/дистрибьюторе и патентная информация.

В целях удобства антитело или специфический связывающий агент, раскрытый здесь, могут быть представлены в наборе, то есть упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями для проведения диагностического или детектируемого анализа. Когда антитело помечено ферментом, то набор будет включать субстраты и кофакторы, которые требуются для фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и тому подобное. Относительные количества различных реагентов могут широко варьироваться для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут быть представлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включая эксципиенты, которые при растворении обеспечивают раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.

Примеры

Пример 1

Идентификация и клонирование α-цепи рецептора собачьего IL-4

кДНК, кодирующую прогнозированную полноразмерную альфа-цепь рецептора собачьего IL-4 (SEQ ID NO: 1), идентифицировали в результате поиска в базе данных GenBank (инвентарный номер XM_547077.4, см. также заявку на патент США 7208579B2). Данная прогнозированная кДНК кодирует 823 аминокислоты (SEQ ID NO: 2), включая лидерную последовательность из 25 аминокислот, и идентифицирована с инвентарным номером # XP_547077.3. Прогнозированный белок α-цепи зрелого рецептора IL-4 (SEQ ID NO: 4) имеет 65% идентичность с α-цепью человеского IL-4 (инвентарный номер # NP_000409.1) и 70% идентичность с α-цепью рецептора свиного IL-4 (инвентарный номер # NP_999505.1). Прогнозированный белок α-цепи зрелого рецептора собачьего IL-4 кодируется нуклеотидной последовательностью, идентифицированной как SEQ ID NO: 3. В результате сравнения прогнозированной α-цепи зрелого рецептора IL-4 с известными последовательностями α-цепи рецептора человеческого IL-4 идентифицирован внеклеточный домен (ECD) α-цепи зрелого белка рецептора IL-4 и обозначен как SEQ ID NO: 6. Последовательность ДНК, кодирующая ECD α-цепи зрелого рецептора собачьего IL-4, идентифицируется как SEQ ID NO: 5.

Полноразмерная ДНК α-цепи рецептора собачьего IL-4 с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 1):

atgggcagactgtgcagcggcctgaccttccccgtgagctgcctggtgctggtgtgggtggccagcagcggcagcgtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgcccctgggcgtgagcatcagctgcctggtgatcctggccatctgcctgagctgctacttcagcatcatcaagatcaagaagggctggtgggaccagatccccaaccccgcccacagccccctggtggccatcgtgatccaggacagccaggtgagcctgtggggcaagagaagcagaggccaggagcccgccaagtgcccccactggaagacctgcctgaccaagctgctgccctgcctgctggagcacggcctgggcagagaggaggagagccccaagaccgccaagaacggccccctgcagggccccggcaagcccgcctggtgccccgtggaggtgagcaagaccatcctgtggcccgagagcatcagcgtggtgcagtgcgtggagctgagcgaggcccccgtggacaacgaggaggaggaggaggtggaggaggacaagagaagcctgtgccccagcctggagggcagcggcggcagcttccaggagggcagagagggcatcgtggccagactgaccgagagcctgttcctggacctgctgggcggcgagaacggcggcttctgcccccagggcctggaggagagctgcctgcccccccccagcggcagcgtgggcgcccagatgccctgggcccagttccccagagccggccccagagccgcccccgagggccccgagcagcccagaagacccgagagcgccctgcaggccagccccacccagagcgccggcagcagcgccttccccgagcccccccccgtggtgaccgacaaccccgcctacagaagcttcggcagcttcctgggccagagcagcgaccccggcgacggcgacagcgaccccgagctggccgacagacccggcgaggccgaccccggcatccccagcgccccccagccccccgagccccccgccgccctgcagcccgagcccgagagctgggagcagatcctgagacagagcgtgctgcagcacagagccgcccccgcccccggccccggccccggcagcggctacagagagttcacctgcgccgtgaagcagggcagcgcccccgacgccggcggccccggcttcggccccagcggcgaggccggctacaaggccttctgcagcctgctgcccggcggcgccacctgccccggcaccagcggcggcgaggccggcagcggcgagggcggctacaagcccttccagagcctgacccccggctgccccggcgcccccacccccgtgcccgtgcccctgttcaccttcggcctggacaccgagccccccggcagcccccaggacagcctgggcgccggcagcagccccgagcacctgggcgtggagcccgccggcaaggaggaggacagcagaaagaccctgctggcccccgagcaggccaccgaccccctgagagacgacctggccagcagcatcgtgtacagcgccctgacctgccacctgtgcggccacctgaagcagtggcacgaccaggaggagagaggcaaggcccacatcgtgcccagcccctgctgcggctgctgctgcggcgacagaagcagcctgctgctgagccccctgagagcccccaacgtgctgcccggcggcgtgctgctggaggccagcctgagccccgccagcctggtgcccagcggcgtgagcaaggagggcaagagcagccccttcagccagcccgccagcagcagcgcccagagcagcagccagacccccaagaagctggccgtgctgagcaccgagcccacctgcatgagcgccagc

Полноразмерный белок α-рецептора собачьего IL-4 с сигнальной последовательностью, выделенной жирным шрифтом (SEQ ID NO: 2):

MGRLCSGLTFPVSCLVLVWVASSGSVKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDLWAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMGPTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWSPSTTWLNYYEPWEQHLPLGVSISCLVILAICLSCYFSIIKIKKGWWDQIPNPAHSPLVAIVIQDSQVSLWGKRSRGQEPAKCPHWKTCLTKLLPCLLEHGLGREEESPKTAKNGPLQGPGKPAWCPVEVSKTILWPESISVVQCVELSEAPVDNEEEEEVEEDKRSLCPSLEGSGGSFQEGREGIVARLTESLFLDLLGGENGGFCPQGLEESCLPPPSGSVGAQMPWAQFPRAGPRAAPEGPEQPRRPESALQASPTQSAGSSAFPEPPPVVTDNPAYRSFGSFLGQSSDPGDGDSDPELADRPGEADPGIPSAPQPPEPPAALQPEPESWEQILRQSVLQHRAAPAPGPGPGSGYREFTCAVKQGSAPDAGGPGFGPSGEAGYKAFCSLLPGGATCPGTSGGEAGSGEGGYKPFQSLTPGCPGAPTPVPVPLFTFGLDTEPPGSPQDSLGAGSSPEHLGVEPAGKEEDSRKTLLAPEQATDPLRDDLASSIVYSALTCHLCGHLKQWHDQEERGKAHIVPSPCCGCCCGDRSSLLLSPLRAPNVLPGGVLLEASLSPASLVPSGVSKEGKSSPFSQPASSSAQSSSQTPKKLAVLSTEPTCMSAS

Зрелый полноразмерный белок рецептора собачьего IL-4 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 4):

VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDLWAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMGPTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWSPSTTWLNYYEPWEQHLPLGVSISCLVILAICLSCYFSIIKIKKGWWDQIPNPAHSPLVAIVIQDSQVSLWGKRSRGQEPAKCPHWKTCLTKLLPCLLEHGLGREEESPKTAKNGPLQGPGKPAWCPVEVSKTILWPESISVVQCVELSEAPVDNEEEEEVEEDKRSLCPSLEGSGGSFQEGREGIVARLTESLFLDLLGGENGGFCPQGLEESCLPPPSGSVGAQMPWAQFPRAGPRAAPEGPEQPRRPESALQASPTQSAGSSAFPEPPPVVTDNPAYRSFGSFLGQSSDPGDGDSDPELADRPGEADPGIPSAPQPPEPPAALQPEPESWEQILRQSVLQHRAAPAPGPGPGSGYREFTCAVKQGSAPDAGGPGFGPSGEAGYKAFCSLLPGGATCPGTSGGEAGSGEGGYKPFQSLTPGCPGAPTPVPVPLFTFGLDTEPPGSPQDSLGAGSSPEHLGVEPAGKEEDSRKTLLAPEQATDPLRDDLASSIVYSALTCHLCGHLKQWHDQEERGKAHIVPSPCCGCCCGDRSSLLLSPLRAPNVLPGGVLLEASLSPASLVPSGVSKEGKSSPFSQPASSSAQSSSQTPKKLAVLSTEPTCMSAS

Полноразмерная ДНК зрелого рецептора собачьего IL-4 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 3):

gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgcccctgggcgtgagcatcagctgcctggtgatcctggccatctgcctgagctgctacttcagcatcatcaagatcaagaagggctggtgggaccagatccccaaccccgcccacagccccctggtggccatcgtgatccaggacagccaggtgagcctgtggggcaagagaagcagaggccaggagcccgccaagtgcccccactggaagacctgcctgaccaagctgctgccctgcctgctggagcacggcctgggcagagaggaggagagccccaagaccgccaagaacggccccctgcagggccccggcaagcccgcctggtgccccgtggaggtgagcaagaccatcctgtggcccgagagcatcagcgtggtgcagtgcgtggagctgagcgaggcccccgtggacaacgaggaggaggaggaggtggaggaggacaagagaagcctgtgccccagcctggagggcagcggcggcagcttccaggagggcagagagggcatcgtggccagactgaccgagagcctgttcctggacctgctgggcggcgagaacggcggcttctgcccccagggcctggaggagagctgcctgcccccccccagcggcagcgtgggcgcccagatgccctgggcccagttccccagagccggccccagagccgcccccgagggccccgagcagcccagaagacccgagagcgccctgcaggccagccccacccagagcgccggcagcagcgccttccccgagcccccccccgtggtgaccgacaaccccgcctacagaagcttcggcagcttcctgggccagagcagcgaccccggcgacggcgacagcgaccccgagctggccgacagacccggcgaggccgaccccggcatccccagcgccccccagccccccgagccccccgccgccctgcagcccgagcccgagagctgggagcagatcctgagacagagcgtgctgcagcacagagccgcccccgcccccggccccggccccggcagcggctacagagagttcacctgcgccgtgaagcagggcagcgcccccgacgccggcggccccggcttcggccccagcggcgaggccggctacaaggccttctgcagcctgctgcccggcggcgccacctgccccggcaccagcggcggcgaggccggcagcggcgagggcggctacaagcccttccagagcctgacccccggctgccccggcgcccccacccccgtgcccgtgcccctgttcaccttcggcctggacaccgagccccccggcagcccccaggacagcctgggcgccggcagcagccccgagcacctgggcgtggagcccgccggcaaggaggaggacagcagaaagaccctgctggcccccgagcaggccaccgaccccctgagagacgacctggccagcagcatcgtgtacagcgccctgacctgccacctgtgcggccacctgaagcagtggcacgaccaggaggagagaggcaaggcccacatcgtgcccagcccctgctgcggctgctgctgcggcgacagaagcagcctgctgctgagccccctgagagcccccaacgtgctgcccggcggcgtgctgctggaggccagcctgagccccgccagcctggtgcccagcggcgtgagcaaggagggcaagagcagccccttcagccagcccgccagcagcagcgcccagagcagcagccagacccccaagaagctggccgtgctgagcaccgagcccacctgcatgagcgccagc

Внеклеточный домен белка α-цепи рецептора собачьего IL-4 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 6):

vkvlhepscfsdyistsvcqwkmdhptncsaelrlsyqldfmgsenhtcvpenredsvcvcsmpiddaveadvyqldlwagqqllwsgsfqpskhvkprtpgnltvhpnishtwllmwtnpyptenhlhseltymvnvsndndpedfkvynvtymgptlrlaastlksgasysarvrawaqtynstwsdwspsttwlnyyepweqhlp

ДНК внеклеточного домена α-цепи рецептора собачьего IL-4 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 5):

gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgccc

Внеклеточный домен α-цепи рецептора собачьего IL-4 с С-концевой 8 HIS-меткой (SEQ ID NO: 8):

vkvlhepscfsdyistsvcqwkmdhptncsaelrlsyqldfmgsenhtcvpenredsvcvcsmpiddaveadvyqldlwagqqllwsgsfqpskhvkprtpgnltvhpnishtwllmwtnpyptenhlhseltymvnvsndndpedfkvynvtymgptlrlaastlksgasysarvrawaqtynstwsdwspsttwlnyyepweqhlpHHHHHHHH

ДНК внеклеточного домена α-цепи рецептора собачьего IL-4 с С-концевой 8 HIS-меткой (SEQ ID NO: 7):

gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgccccaccaccaccaccaccaccaccac

Внеклеточный домен α-цепи рецептора собачьего IL-4 плюс Fc-область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 10):

vkvlhepscfsdyistsvcqwkmdhptncsaelrlsyqldfmgsenhtcvpenredsvcvcsmpiddaveadvyqldlwagqqllwsgsfqpskhvkprtpgnltvhpnishtwllmwtnpyptenhlhseltymvnvsndndpedfkvynvtymgptlrlaastlksgasysarvrawaqtynstwsdwspsttwlnyyepweqhlEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ДНК внеклеточного домена α-цепи рецептора собачьего IL-4 плюс Fc-область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 9):

gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgtacaccctgccccccagcagagacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaag

Пример 2

Мышиные антитела к альфа-цепи рецептора собачьего IL-4

Получение моноклональных антител к α-цепи рецептора собачьего IL-4:

В общем трех мышей Balb/c многократно иммунизировали (по 10 мкг каждый раз) в течение 17 суток. Иммунизирующий антиген представлял собой слитый белок внеклеточный домен(ECD) альфа-цепи собачьего IL-4-R-человеческая F-область. После иммунизации у каждой мыши отбирали пробы крови, готовили сыворотку и тестировали на реактивность с HIS-меченным белком ECD альфа-цепи рецептора IL-4. Клетки селезенки мыши с самым высоким титром антител к ECD альфа-цепи рецептора IL-4 в сыворотке сливали с клетками миеломной линии P3X63Ag8.653. Примерно через 2 недели после слияния супернатант из предполагаемых клеток гибридомы тестировали с помощью ELISA на их реактивность к HIS-меченному белку ECD альфа-цепи рецептора IL-4. Гибридомы, дающие сильные положительные сигналы в ELISA, субклонировали ограничивающим разведением и снова тестировали на реактивность к HIS-меченному белку ECD альфа-цепи рецептора IL-4.

Подтверждение реактивности моноклональных антител к α-цепи рецептора собачьего IL-4:

Реактивность антител, секретированных гибридомными клетками, к ECD альфа-цепи рецептора собачьего IL-4, подтверждали с использованием ELISA. Клетки гибридомы культивировали с использованием биореакторов CELLine (Integra-biosciences) в течение 10-30 суток. Клетки первоначально поддерживали в среде DMEM с добавлением 4 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки c ультранизким содержанием IgG (FBS) производства Gibco. Клетки гибридомы высевали в камеры для клеток биореактора CELLine с клеточной плотностью примерно 2×10⁶ клеток/мл в 15 мл той же среды, с концентрацией FBS, повышенной до 20%. Наружную камеру заполняли 1 л питательной среды (DMEM с 4 мМ L-глутамина и 2% стандартной FBS). Клетки гибридомы в клеточной камере культивировали примерно до титра 2,5×10⁷ клеток/мл в течение 3-7 суток. Затем 10 мл суспензии клеток отбирали из клеточной камеры и заменяли свежей средой для обеспечения повторного прироста клеток и последующего сбора клеток. Эту процедуру повторяли при необходимости для получения адекватного количества mAb из каждого клона гибридомы. Собранные клеточные суспензии центрифугировали и супернатанты фильтровали через 0,2 мкм мембранные фильтры. Для очистки антител супернатант каждого клона очищали с использованием колонки с протеином G-сефарозой 4 со скоростью 5 мл (GE Healthcare) под действием гравитационного потока. После промывки буфером Трис-ЭДТА (TE) с pH 8,0 связанные антитела элюировали с использованием 0,1 М глицинового буфера, рН 2,7, с последующей нейтрализацией Трис-буфером с pH 8,0. Антитела концентрировали и буфер обменивали на забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с использованием центробежных фильтров Centriprep YM-10 kDa (Millipore). Концентрации антител определяли количественно с использованием спектрофотометрии. Очищенные mAb против α-цепи рецептора собачьего IL-4 тестировали на реактивность с HIS-меченным ECD альфа-цепи рецептора собачьего IL-4 с помощью ELISA следующим образом: HIS-меченный белок ECD альфа-цепи рецептора собачьего IL-4 разводили до 10 мкг/мл в буфере для покрытия (карбонат/бикарбонат с рН 9,0) и разливали из расчета 100 мкл/лунку в 96-луночных планшетах с плоским дном для постановки ELISA (NUNC). Планшеты инкубировали при 4°C в течение ночи. Затем планшеты трижды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина-20 (PBST). Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего буфера (5% обезжиренное молоко в PBST) и планшеты инкубировали при 37°C в течение 60 мин. Затем планшеты промывали три раза PBST. Затем в первые лунки соответствующих рядов добавляли 100 мкл тестируемых mAb, разведенных в блокирующем буфере. Затем тестируемые mAb разбавляли в три раза до соответствующего положения в планшете. После инкубации планшетов при 37°C в течение 60 мин планшеты трижды промывали PBST. Затем к планшетам добавляли из расчета 100 мкл на лунку разведения 1:2000 конъюгированного с пероксидазой хрена козьего антимышиного IgG (KPL), затем планшеты инкубировали при 37°C в течение 60 мин. Затем планшеты трижды промывали PBST и в лунки планшетов добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, субстрат (TMB) (производства KPL) из расчета 100 мкл/лунку. Цветную реакцию развивали в течение 5-20 мин при 37°С перед измерением поглощения при длине волны 650 нм.

Различные мышиные моноклональные антитела к собачьему IL-R_α (mAb) анализировали с помощью ELISA на их способность связываться с внеклеточным доменом собачьего IL-R_α. Как показано на фиг.1, большинство этих mAb проявляли положительное дозозависимое связывание.

Пример 3

Идентификация ДНК и прогнозируемых белковых последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклональных антител к α-цепи рецептора собачьего IL-4

Последовательность ДНК мышиных VH и VL цепей идентифицировали после выделения мРНК из каждой гибридомы с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Последовательности (SEQ ID NO) ДНК и прогнозируемых аминокислотных последовательностей VH и VL этих гибридом приведены ниже. ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, и аминокислоты, соответствующие прогнозированной сигнальной последовательности, подчеркнуты, соответствующие CDR выделены жирным шрифтом, и FR не подчеркнуты и не выделены жирным шрифтом (т.е. сигнальная последовательность-FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4).

mAb 1A3

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 11)

ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCGGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGGGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGTGGTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGTAAGGGGGGACCTTTACTACGGTAGTAGTTTCGATGCTTATTGGGGCCGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 12)

MDSRLNLVFLVLILKGVRCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDFGMHWVRQA PEKGLGWVAYISSGSGTIYYADTVRGRFTISRDNVKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCVRGDLYYG SSFDAYWGRGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 13)

ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTTCATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 14)

MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSFMFWYQQ KPGSSPKPWIYDTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGT KLELK

mAb 1A9

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 15)

ATGGAATGGCCTTGTATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTCCGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTCCTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACGGATTTATCCTGGAGATGGAGATACTAAGTACAATGGGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCGGAGGACTCTGCGGTTTACTTCTGTGCAAGAGATGATTACGACGAGGCTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 16)

MEWPCIFLFLLSVTEGVHSQVPLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQR PGKGLEWIGRIYPGDGDTKYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDDYDEA SWGQGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 17)

ATGGGCATCAAGATGGAGTTTCAGACCCAGGTCTTTGTATTCGTGTTGCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTTCGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAATCACTGATTTACTTGGCATCCAACCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAATCTGAAGACCTGGCAGATTATTTCTGTCTGCAACATTGGAATTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 18)

MGIKMEFQTQVFVFVLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAW YQQKPGQSPKSLIYLASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYPFTFG SGTKLEIK

mAb 1В12

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 19)

ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTATTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTATTCCTAGCAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCGCAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGATCAGCTACTATGGTAACCGATATTACTTTACTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 20)

MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQS HGKSLEWIGDIIPSNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSAAYMELRSLTSEDSAVYYCARGISYYG NRYYFTMDYWGQGTSVTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 21)

ATGAGGTGCCTAGCTGAGTTCCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGAGCCATTGGGGATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTTTTGGTTCGTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGACATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 22)

MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLF WFVQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTF GSGTKLDIK

mAb 10С12

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 23)

ATGGAATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGTGTGAAGCAGACACCTGTGCACGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTTGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGATCGAAACTGGGACGAGGGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 24)

MEWSWIFLFLLSVTAGVQSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHCVKQT PVHGLEWIGAIDPETCGTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRSKLGRG WYFDVWGTGTTVTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 25)

ATGGAATCACAGACCCAGGTCCTCATGTTTCTTCTGCTCTGGGTATCTGGTGCCTGTGCAGACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 26) MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQ KPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPYTFGGGT KLEIK

mAb 10F2

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 27)

ATGGCTGTCCTGGCACTGCTCCTCTGCCTGGTGACATTCCCAAACTGTGTCCTGTCCCAGGTGCACCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCTTTAACCAGCTATGGTGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAGAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAGCACATATTTTCATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGATGACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAATTGAACAGTCTACAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAACAAGGGACGATCTATGATGGTTACTACAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 28)

MAVLALLLCLVTFPNCVLSQVHLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQP PGEGLEWLGVIWGDGSTYFHSALISRLSISKDDSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKQGTIYDG YYNYAMDYWGQGTSVTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 29)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAACTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAACCTTTTATATGGTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAGGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 30)

MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLTVSVGEKVTMSCKSSQNLLYGGNQKNYL AWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVRAEDLAVYYCQQYYDYPYT FGGGTKLEIK

mAb 10E10

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 31)

ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAACCTACGATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTAGAGATGGTCGTACTACTTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCACCACAGCGTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCGAGAAGTAGCCCCTTTGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 32)

MGWSWIFLFLLSGTAGVHSQVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYDIHWVKQR PGQGLEWIGWIYPRDGRTTYNEKFKAKATLTVDTSSTTAYMELHSLTSEDSAVYFCARSSPFGY WGQGTTLTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 33)

ATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTCAGAATCACAGGCATAATATGTGACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTAATAATTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGCTGCTACTTATCACTGTCACCAGTATTGGAGTATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 34)

MKFPSQLLLFLLFRITGIICDIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQK PGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDAATYHCHQYWSIPYTFGGGTK VEIK

mAb 10G8

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 35)

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAATTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGGGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGCATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATACTGACTGCAGACAAATCCTCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTCTAACTGGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 36)

MEWSWVFLFLLSVIAGVQSQVQLQQSGAELVGPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQT PVHGLECIGAIDPETGGTAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCLTGFDYWG QGTTLTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 37)

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGTCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTGAATTCCAGCTACTTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 38)

MDFQVQIFSFLLISVSVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVNSSYLYWY QQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPYTFGG GTKLEIK

mAb 11В6

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 39)

ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGCAAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGATTACTGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGGAATAAACTTGAATACATGGGGTACATAAACTACAGTGGTAACACTTACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATAACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTATTACCTGCAATTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGATATGGGGGATTACGACAGGGTTCCTGGCACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 40)

MMVLSLLYLLTALPGILSEVQLQESGPGLAKPSQTLSLTCSVTGYSITSDYWNWIRKFP GNKLEYMGYINYSGNTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGGLRQGS WHFDVWGPGTTVTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 41)

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATCATAGTTACCCAGCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 42)

MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQ KPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPATFGGGT KLEIK

mAb 11D3

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 43)

ATGGGTTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATATCTTCACAACCTATGGAATGTACTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGTTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACATCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGTAGTTGCCGGGTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 44)

MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTTYGMYWVKQA PGKGLKWMGWINTYSGVPTYVDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVVAGWFAY WGQGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 45)

ATGGACATGAGGACCCCTGCTCAGTTTCTTGGAATCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGGTATCAAATGTGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAAGAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATATATTGATAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAATATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 46)

MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKCDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYLSWFQ QKPGKSPKTLIYRANILIDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGG TKLEIK

mAb 11H2

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 105)

ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGACGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATATGTTAGTAGTGGTGGTGGTAGTATCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCT

CCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTATTTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGGCATGGGTCCCCCTTCGGTAGTAGCCGAGGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGC

CAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 106)

MNLGLSLIFLVLVLKGVQCDVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQT PEKRLEWVAYVSSGGGSIYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHGSPFG SSRGAWFAYWG

QGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 107)

ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGC

AAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAGGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAC

AGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAATTATTACTGTCAACATTATGATGGTTTTCCGTTCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 108)

MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQK QGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHYDGFPFTFGGGTK LELK

mAb 6С12

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 109)

ATGGGTTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGATACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACCTTTGGAATGAGCTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAGCACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTTCATATTTCTGTGCAAGACACACCTTCCAAAGTCGCGGGTTGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 110)

MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLIQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTFGMSWVKQA PGKGLKWMGWISTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTASYFCARHTFQSR GLAYWGQGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 111)

ATGGGCATCAAAATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTACTACTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCACCAGTGTGCAGACTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 112)

MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVITTVAW YQQKPGQS

PKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTITSVQTEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGT KLEIK

mAb 4H3

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 113)

ATGGGATGGAGCTGTATCATGCTCTTCTTGGCAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATACACTGGATGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTCGACAAACCCTCCATCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAGCATTCGGTAGTACCTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 114)

MGWSCIMLFLAATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWIHWMKQR PGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLTVDKPSITAYMQLSSLTSEDSAVYYCAAFGSTYG FAYWGQGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 115)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATATTGCTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGTTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 116)

MDSQAQVLILLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYL AWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLYTF GGGTKLEIK

mAb 4D8

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 117)

ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGACGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCGGACACTATAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGACATGGGTCCCCCTACGGTAGTAGTCGAGGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 118)

MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVTLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQT PEKRLEWVAYISPGGGSTYYPDTIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCTRHGSPYG SSRGAWFAYWGQGTLVTVSA

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 119)

ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGGAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATGATGGTATTCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 120)

MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQK QGKSPQLLVYNGKTLAEGVPARFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHDGIPVTFGAGTK LELK

mAb 2E2

Тяжелая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 121)

ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGC

TGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTGACTATCACATGCATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTC

GCATACATTAGTAAAGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGAAAAGGGCCGATTCACCATCT

CCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCAT

GTATTACTGTGCAAGATCCCCCGGCCCTAGTAGCTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGG

ACCACGGTCACCGTCTCCTCA

Тяжелая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 122)

MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCVASGFTFSDYHMHWVRQT PEKRLEWV

AYISKGGGSTYYPDTEKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSPGPSSFYW YFDVWGTG

TTVTVSS

Легкая цепь: последовательность ДНК (SEQ ID NO: 123)

ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCC

AGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGC

AAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTG

GTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAC

AGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTA

TGGTATTCCGGTCACGGTCGGTGTAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

Легкая цепь: аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 124)

MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQK QGKSPQLL

VYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGIPVTVGVGTKLELK

Пример 4

Конструирование клеточной линии СНО, экспрессирующей альфа-цепь рецептора собачьего IL-4 и применение в тестах блокирования лигандом

Синтезировали ген, кодирующий полноразмерную альфа-цепь рецептора собачьего IL-4 (cIL-4R_α, SEQ ID NO: 4), и субклонировали в экспрессионные векторы млекопитающих. Полученную плазмиду трансфектировали в клетки CHO DG44. Через 48 ч после трансфекции клетки разливали в 96-луночные планшеты для получения клонов из одной клетки. После 4-недельной инкубации было получено примерно 130 клонов. Все клоны подвергали скринингу на экспрессию cIL-4R_α с помощью FACS с использованием моноклонального антитела к cIL-4R_α 6B2. По результатам оценки стабильности были выбраны три клона. Стабильность контролировали по 20 проходам FACS.

Для оценки способности моноклональных антител, специфичных к альфа-цепи рецептора собачьего IL-4, блокировать связывание собачьего IL-4 с собачьим IL-4 R альфа, экспрессированным на поверхности клеток CHO, тест блокирования лигандом проводили следующим образом:

Реагенты и оборудование:

• клеточная культуральная среда: среда CD OptiCHO+8 мМ L-глутамина+0,018% F-68

• буфер для FACS: буфер для окрашивания BD Pharmingen (BD номер по каталогу: 554657)

• стрептавидин, конъюгированный с R-фикоэритином (Life Technologies: SB66)

• собачий IL-4 (R&D system, номер по каталогу # 754-CL/CF)

• набор для конъюгации биотина Lightning-Link типа A (Novus: 704-0010), используемый для биотинилирования собачьего IL-4 в соответствии с рекомендациями производителя

• проточный цитометр: BD Accuri-C6

Процедура:

1. Клетки CHO-DH44-canIL-4Rα культивировали до титра 2-4×10⁶ клеток/мл с более чем 96% жизнеспособностью.

2. Клетки центрифугировали, супернатант отбрасывали и клетки суспендировали в буфере для FACS до титра 2×10⁷ клеток/ мл.

3. Клетки разливали в 96-луночный U-образный планшет, по 50 мкл в каждую лунку.

4. mAb против собачьего IL-4R_α в буфере для FACS разбавляли в три раза в 96-луночном планшете сверху вниз до нижней лунки, начиная с 50 мкг/мл.

5. 50 мкл каждого разведенного Ab переносили в клеточный планшет и затем инкубировали на льду в течение 30 мин.

6. Клетки дважды промывали буфером для FACS.

7. Клетки ресуспендировали в 100 мкл биотинилированного собачьего IL-4 при 0,32 мкг/мл в буфере для FACS и инкубировали на льду в течение 30 мин.

8. Клетки дважды промывали буфером для FACS.

9. Клетки подвергали реакции в 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с R-фикоэритрином (разведение 1:1000) в буфере для FACS и инкубировали на льду в течение 30 мин.

10. Клетки дважды промывали буфером для FACS.

11. Клетки доводили до 300 мкл буфером для FACS.

12. Каждого образца с помощью BD Accuri-C6 анализировали 10000 клеток.

13. Полученное показание анализировали FlowJo для получения средней интенсивности флуоресценции (MFI).

Строили кривую зависимости доза-эффект для связывания собачьего IL-4 с собачьим IL-4R_α, экспрессированным на поверхности клеток CHO, с использованием клеточного анализа связывания CHO-cIL-4Rα (см. фиг. 2A). По данной кривой было определено, что половинная максимальная эффективная концентрация (EC50) составляла 25 нМ. Затем были получены кривые зависимости доза-эффект для связывания CHO-cIL-4Rα с мышиными моноклональными антителами к собачьему IL-R_α (mAb): 11B6, 4D8, 4H3, 2E2, 11H2 и 6C12 (см. фиг. 2B). Значения половинных максимальных эффективных концентраций (EC50) для каждого из антител представлены в таблице 2 ниже.

Таблица 2
Связывание/блокирование для различных mAB mAB EC50 (нМ) IC50 (нМ) 11B6 7,5 53,2 4D8 1,1 4,2 4H3 1,6 3,9 2E2 1,2 2,1 11H2 1,2 1,7/1,0* 6C12 8,6 19,3 *Определение по данным двух опытов

Затем мышиные моноклональные антитела против собачьего IL-R_α (mAb) анализировали на их способность блокировать связывание собачьего IL-4 с использованием клеточного анализа связывания в системе CHO-cIL-4Rα. Как показано на фиг. 3А, пять mAb, 11B6, 4D8, 4H3, 2E2 и 11H2, демонстрировали высокую блокирующую способность. В дополнительном исследовании тестировали шесть mAb (6C12) и сравнивали с одним из пяти тестированных mAb (11H2), показанных на фиг. 3A. Как следует из фиг. 3B и таблицы 2, mAb 6C12 имеет достоверно более высокую половинную максимальную ингибирующую концентрацию (IC50), чем mAb 11H2. Четыре моноклональных антитела против сIL-4Rα, 4D8, 2E2, 4D8 и 11H2 показывали превосходную способность к блокированию, как следует из данных фиг. 3A и 3B, и также таблицы 2.

Пример 5

Аминокислотные последовательности мышиных CDR

СDR из мышиных моноклональных антител против α-цепи рецептора собачьего IL-4:

Таблица 3
Канонические структуры L1 L2 L3 H1 H2 H3 1A3 L1-1 L2-1 L3-1 H1-1 H2-3A H3-12 1A9 L1-2A L2-1 L3-1 H1-1 H2-2A H3-7 1B12 L1-4 L2-1 L3-1 H1-1 H2-2B H3-15 10C12 L1-3 L2-1 L3-1 H1-1 * H3-11 10F2 L1-3 L2-1 L3-1 H1-1 H2-1 H3-15 10E10 L1-2A L2-1 L3-1 H1-1 H2-2B H3-6 10G8 L1-6 L2-1 L3-1 H1-1 H2-2B H3-4 11B6 L1-1 L2-1 L3-1 H1-1 H2-1 H3-13 11D3 L1-2A L2-1 L3-1 H1-1 H2-2A** H3-6 11H2 L1-6 L2-1 L3-1 H1-1 H2-3A H3-15 6C12 L1-6 L2-1 L3-1 H1-1 H2-2A H3-10 4D8 L1-6 L2-1 L3-1 H1-1 H2-3A H3-15 4H3 L1-3 L2-1 L3-3 H1-1 H2-3A H3-9 2E2 L1-6 L2-1 L3-1 H1-1 H2-3A H3-13 * Цистеин в CDR ** Наилучшее распределение, которое можно было сделать с точки зрения конкретного паттерна

Пример 6

Эпитопное картирование мышиных антител против альфа-рецептора собачьего IL-4

Взаимодействие антител с их родственными белковыми антигенами опосредуется связыванием специфических аминокислот антител (паратопов) со специфическими аминокислотами (эпитопами) антигенов-мишеней. Эпитоп является антигенной детерминантой, которая вызывает специфическую реакцию иммуноглобулина. Эпитоп состоит из группы аминокислот на поверхности антигена. Интересующий белок может содержать несколько эпитопов, которые распознаются различными антителами. Эпитопы, распознаваемые антителами, классифицируются как линейные или конформационные эпитопы. Линейные эпитопы формируются участком непрерывной последовательности аминокислот в белке, тогда как конформационные эпитопы состоят из аминокислот, которые прерываются (например, находятся далеко друг от друга) в первичной аминокислотной последовательности, но объединяются при трехмерном фолдинге белков.

Эпитопное картирование относится к процессу идентификации аминокислотных последовательностей (то есть эпитопов), которые распознаются антителами на их антигенах-мишенях. Идентификация эпитопов, распознаваемых моноклональными антителами (mAb) на антигенах-мишенях, имеет важные применения. Например, она может помочь в разработке новых терапевтических средств, диагностических средств и вакцин. Эпитопное картирование также может помочь в выборе оптимизированных терапевтических mAb и помочь выяснить их механизмы действия. Информация об эпитопе альфа-рецептора IL-4 также может выявить уникальные эпитопы и определить защитные или патогенные эффекты вакцин. Идентификация эпитопа также может привести к разработке субъединичных вакцин на основе химической или генетической конъюгации идентифицированного пептидного эпитопа с белком-носителем или другими иммуностимулирующими агентами.

Эпитопное картирование может быть выполнено с использованием поликлональных или моноклональных антител, и для идентификации эпитопа используется несколько методов в зависимости от предполагаемой природы эпитопа (то есть линейной и конформационной). Картирование линейных эпитопов является более прямым и относительно простым в работе. С этой целью коммерческие службы для картирования линейных эпитопов часто используют сканирование пептидов. В этом случае синтезируется химически перекрывающийся набор коротких пептидных последовательностей белка-мишени и тестируется на их способность связываться с интересующими антителами. Стратегия является быстрой, высокопроизводительной и относительно недорогой для выполнения. С другой стороны, картирование прерывистого эпитопа является технически более сложным и требует применения более специализированных методов, таких как совместная рентгеновская кристаллография моноклонального антитела с его белком-мишенью, обмен водорода-дейтерия (H/D), масс-спектрометрия, сопряженная с ферментативным расщеплением, а также несколько других методов, известных специалистам в данной области.

Картирование эпитопов альфа-рецептора собачьего IL-4 с использованием масс-спектроскопии

Для идентификации эпитопов, распознаваемых mAb к альфа-рецептору собачьего IL-4, использовали метод, основанный на химическом сшивании и детектировании масс-спектрометрией [CovalX Instrument Incorporated]. Применение данной технологии для эпитопного картирования альфа-цепи рецептора собачьего IL-4 позволило идентифицировать эпитопы, распознаваемые mAb, перечисленные в таблице 4.

Результаты эпитопного картирования альфа-рецептора собачьего IL-4 с использованием шести антител, приведенных в таблице 4, показывают, что mAb распознают специфические пептидные эпитопы, которые находятся во внеклеточном домене альфа-рецептора собачьего IL-4. Примечательно, что для каждого из шести моноклональных антител (mAb) было идентифицировано два-три эпитопа. Интересно отметить, что для одного из эпитопов, идентифицированных для mAb 2E2, аминокислотная последовательность была такая же, как и для mAb 11B6 (то есть SEQ ID NO: 158). Как показано в таблице 4 ниже, mAb: 4D8, 11H2 и 11B6 все распознают эпитоп с меткой «¹», который является фрагментом той же линейной аминокислотной последовательности; mAbs: 11H2, 4H3 и 2E2 все распознают эпитоп с меткой «²», который является фрагментом другой линейной аминокислотной последовательности; и mAb 4H3 и 2H2 распознают эпитоп с меткой «³», который является фрагментом третьей линейной аминокислотной последовательности. Эта относительное постоянство при идентификации соответствующих эпитопов указывает на то, что данные шесть моноклональных антител распознают ограниченное число фрагментов альфа-рецептора собачьего IL-4 в его внеклеточном домене.

Таблица 4
Эпитопы альфа-рецептора IL-4, распознаваемые моноклональными антителами к альфа-рецептору собачьего IL-4 Антитело SEQ ID NO: Последовательность эпитопа 4D8 125
126 SAELRLSYQLD
FQPSKHVKPRT¹ 11H2 127
128 AGQQLLWSGSFQPSKHVKPRT¹
TLKSGASYS² 4H3 154
155
156 EDSVCVCSMPI³
MWTNPYPTENHL
ASTLKSG² 11B6 157
158 WSGSFQPSKHVKPR¹
VYNVTYMGPTLR 2E2 159
160
161 VLHEPSCFSDYISTSVCQ
ENREDSVCVCSMPI³
KSGASYSARVRAW² 6C12 158
162 VYNVTYMGPTLR
YYEPWEQHLP ^1,2,3идентифицировано три отдельных группы эпитопов из трех фрагментов антигена

Вместе с CDR, представленными в примере 5, для шести антител, приведенных в таблице 4 выше, определено отношение «один к одному» между каждым набором CDR и их соответствующими эпитопами в таблице 4. Данное отношение позволяет установить определенную связь между набором из 6 CDR в примере 5 для каждого из шести антител в таблице 4 и соответствующих эпитопов, с которыми они связываются. Следовательно, антитела (например, канинизированные антитела) с определенным набором из 6 CDR, представленных в примере 5, которые связываются с соответствующие эпитопами из таблицы 4, также являются частью настоящего изобретения.

Пример 7

Конструирование канинизированных моноклональных к альфа-рецептору собачьего IL-4

Для осуществления процесса канинизации определяли последовательность ДНК, которая кодирует тяжелую и легкую цепи собачьего IgG. Последовательность ДНК и белковая последовательность собачьей тяжелой и легкой цепей известны в данной области и могут быть получены поиском в базе данных NCBI генов и белков. Как указано выше, для собачьих антител существуют четыре известных субтипа IgG: IgG-A, IgG-B, IgG-C и IgG-D и два типа легких цепей, то есть каппа и лямбда. Не желая связываться каким-либо конкретным подходом, общий процесс получения канинизированных тяжелых и легких цепей, которые могут быть смешаны в различных комбинациях для получения канинизированных mAb к альфа-рецептору собачьего IL-4, включает следующую схему:

i) Определение последовательности ДНК областей VH и VL, содержащих CDR желательных mAb к альфа-рецептору IL-4.

ii) Определение CDR H-цепи и L-цепи желательных mAb к рецептору IL-4.

iii) Определение подходящей последовательности для H-цепи и L-цепи собачьего IgG.

iv) Определение последовательности ДНК, кодирующей эндогенные CDR H-цепи и L-цепи собачьего IgG вышеуказанной последовательности.

v) Замена последовательности ДНК, кодирующей эндогенные собачьи CDR H-цепи и L-цепи, на последовательности ДНК, кодирующие желательные CDR антитела к альфа-рецептору IL-4. Кроме того, необязательно замена некоторых остатков собачьей каркасной области на выбранные остатки из желаемых каркасных областей mAb к рецептору IL-4.

vi) Синтез ДНК со стадии (v), клонирование ее в подходящую экспрессионную плазмиду и трансфекцию плазмид, содержащих желаемые канинизированные H-цепи и L-цепи, в клетки HEK 293.

vii) Очистка экспрессированного канинизированного антитела из супернатанта клеток HEK 293.

viii) Тестирование очищенного канинизированного антитела на связывание с альфа-цепью рецептора собачьего IL-4.

Применение вышеописанных стадий приводило к получению набора последовательностей H-цепи и L-цепи, для которых последовательности (SEQ ID NO) приведены в таблице 5 ниже.

Таблица 5
Последовательности полноразмерных канинизированных тяжелой и легкой цепей Н-цепь или L-цепь Нуклеиновая кислота Аминокислота vH1 SEQ ID NO: 163 SEQ ID NO: 164 vH2 SEQ ID NO: 165 SEQ ID NO: 166 vH3 SEQ ID NO: 167 SEQ ID NO: 168 vL1 SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 170 vL2 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 172 vL3 SEQ ID NO: 173 SEQ ID NO: 174

Настоящее изобретение относится к канинизированным антителам, полученным комбинацией различных канинизированных тяжелых и легких цепей, приведенных в таблице 5 выше; такие антитела имеют особенно тесное связывание с альфа-рецептором собачьего IL-4. В конкретном варианте осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170. В более конкретном варианте осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 163, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 169. В еще одном варианте осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172. В более конкретном варианте осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 165, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 171. В еще одном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174. В более конкретном варианте осуществления данного типа тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 167, и легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 173. Результаты исследования связывания альфа-рецептора IL-4 данными канинизированными антителами показаны на фиг. 4, как описано в примере 8 ниже.

Как указано выше, Fc-область канинизированных антител основана на модифицированных последовательностях собачьего IgG-B, с целью удаления эффекторных функций ADCC и CDC. Fc-области этих антител могут быть заменены модифицированной Fc-областью из других изотипов собачьих IgG и/или могут быть объединены с заменой шарнирных областей, как обсуждалось выше, и приведено в качестве примера и описано в предварительной заявке на патент США 62/030812, поданной 30 июля 2014 г.; предварительной заявке на патент США 62/057541, поданной 30 сентября 2014 г.; предварительной заявке на патент США 62/092496, поданной 16 декабря 2014 г.; предварительной заявке на патент США 62/172511, поданной 8 июня 2015 г.; и WO 2015/091910, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

Канинизированное антитело 4Н3 (vH1)

SEQ ID NO: 163

gaggtgcagctggtggagagcggaggcgacctggtgaaacccggaggcagcctgagactgagctgtgtggccagcggctacaccttcaccaactactggattcattgggtgaggcaggctcccggcaaaggactgcagtgggtggccaggattgatcccaacagcggcggcaccaagtacaacgagaagttcaagagcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctctacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcaccaggttcggcagcacctacggcttcgcctactggggccaaggcaccctggtgaccgtgagcagcgcttccacaaccgcgccatcagtctttccgttggccccatcatgcgggtcgacgagcggatcgactgtggccctggcgtgcttggtgtcgggatactttcccgaacccgtcacggtcagctggaactccggatcgcttacgagcggtgtgcatacgttcccctcggtcttgcaatcatcagggctctactcgctgtcgagcatggtaacggtgccctcatcgaggtggccctccgaaacgttcacatgtaacgtagcacatccagcctccaaaaccaaggtggataaacccgtgccgaaaagagagaatgggcgggtgcctcgaccccctgattgccccaagtgtccggctccggaaatgctcggtggaccctcagtgtttatcttccctccgaagcccaaggacactctgctgatcgcgcgcactccagaagtaacatgtgtagtggtggcacttgatcccgaggaccccgaagtccagatctcctggtttgtagatgggaaacagatgcagaccgcaaaaactcaacccagagaggagcagttcgcaggaacataccgagtggtatccgtccttccgattggccaccaggactggttgaaagggaagcagtttacgtgtaaagtcaacaataaggcgttgcctagccctattgagcggacgatttcgaaagctaggggacaggcccaccagccatcggtctatgtccttccgccttcccgcgaggagctctcgaagaatacagtgagccttacatgcctcattaaggatttcttcccgcctgatatcgacgtagagtggcaatcaaacggtcaacaggagccggaatccaagtatagaaccactccgccccagcttgacgaggacggatcatactttttgtattcaaaactgtcggtggataagagccggtggcagagaggtgacaccttcatctgtgcggtgatgcacgaagcactccataatcactacacccaagagagcctctcgcattcccccggaaag

SEQ ID NO: 164

evqlvesggdlvkpggslrlscvasgytftnywihwvrqapgkglqwvaridpnsggtkynekfksrftisrdnakntlylqmnslraedtavyyctrfgstygfaywgqgtlvtvssasttapsvfplapscgstsgstvalaclvsgyfpepvtvswnsgsltsgvhtfpsvlqssglyslssmvtvpssrwpsetftcnvahpasktkvdkpvpkrengrvprppdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvaldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfagtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspgk

Канинизированное антитело 4Н3 (vH2)

SEQ ID NO: 165

gaggtgcagctggtggagagcggcggagatctggtgaagcccggcggaagcctgagactgagctgtgtggccagcggctacaccttcaccaactactggattcattgggtgagacaggcccctggcaagggcctgcagtggatcggcaggatcgaccccaacagcggcggcaccaagtacaacgagaagttcaagagcaaggccaccctgagcgtggacaaggccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccgcctttggcagcacctacggcttcgcctactggggccagggaaccctggtgaccgtgagcagcgcttccacaaccgcgccatcagtctttccgttggccccatcatgcgggtcgacgagcggatcgactgtggccctggcgtgcttggtgtcgggatactttcccgaacccgtcacggtcagctggaactccggatcgcttacgagcggtgtgcatacgttcccctcggtcttgcaatcatcagggctctactcgctgtcgagcatggtaacggtgccctcatcgaggtggccctccgaaacgttcacatgtaacgtagcacatccagcctccaaaaccaaggtggataaacccgtgccgaaaagagagaatgggcgggtgcctcgaccccctgattgccccaagtgtccggctccggaaatgctcggtggaccctcagtgtttatcttccctccgaagcccaaggacactctgctgatcgcgcgcactccagaagtaacatgtgtagtggtggcacttgatcccgaggaccccgaagtccagatctcctggtttgtagatgggaaacagatgcagaccgcaaaaactcaacccagagaggagcagttcgcaggaacataccgagtggtatccgtccttccgattggccaccaggactggttgaaagggaagcagtttacgtgtaaagtcaacaataaggcgttgcctagccctattgagcggacgatttcgaaagctaggggacaggcccaccagccatcggtctatgtccttccgccttcccgcgaggagctctcgaagaatacagtgagccttacatgcctcattaaggatttcttcccgcctgatatcgacgtagagtggcaatcaaacggtcaacaggagccggaatccaagtatagaaccactccgccccagcttgacgaggacggatcatactttttgtattcaaaactgtcggtggataagagccggtggcagagaggtgacaccttcatctgtgcggtgatgcacgaagcactccataatcactacacccaagagagcctctcgcattcccccggaaag

SEQ ID NO: 166

evqlvesggdlvkpggslrlscvasgytftnywihwvrqapgkglqwigridpnsggtkynekfkskatlsvdkakntlylqmnslraedtavyycaafgstygfaywgqgtlvtvssasttapsvfplapscgstsgstvalaclvsgyfpepvtvswnsgsltsgvhtfpsvlqssglyslssmvtvpssrwpsetftcnvahpasktkvdkpvpkrengrvprppdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvaldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfagtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspgk

Канинизированное антитело 4Н3 (vH3)

SEQ ID NO: 167

gaggtgcagctggtggagagcggcggcgatctggtgaagcctggcggaagcctgagactgagctgcgtggccagcggctacaccttcaccaactactggattcattggatgaggcaggcccctggcaagggactgcagtggatcggcagaatcgaccccaacagcggcggcaccaagtacaacgagaagttcaagagcaaggccaccctgagcgtggacaaggccaagaacaccgcctacatgcagctgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccgcctttggcagcacctacggcttcgcctattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcttccacaaccgcgccatcagtctttccgttggccccatcatgcgggtcgacgagcggatcgactgtggccctggcgtgcttggtgtcgggatactttcccgaacccgtcacggtcagctggaactccggatcgcttacgagcggtgtgcatacgttcccctcggtcttgcaatcatcagggctctactcgctgtcgagcatggtaacggtgccctcatcgaggtggccctccgaaacgttcacatgtaacgtagcacatccagcctccaaaaccaaggtggataaacccgtgccgaaaagagagaatgggcgggtgcctcgaccccctgattgccccaagtgtccggctccggaaatgctcggtggaccctcagtgtttatcttccctccgaagcccaaggacactctgctgatcgcgcgcactccagaagtaacatgtgtagtggtggcacttgatcccgaggaccccgaagtccagatctcctggtttgtagatgggaaacagatgcagaccgcaaaaactcaacccagagaggagcagttcgcaggaacataccgagtggtatccgtccttccgattggccaccaggactggttgaaagggaagcagtttacgtgtaaagtcaacaataaggcgttgcctagccctattgagcggacgatttcgaaagctaggggacaggcccaccagccatcggtctatgtccttccgccttcccgcgaggagctctcgaagaatacagtgagccttacatgcctcattaaggatttcttcccgcctgatatcgacgtagagtggcaatcaaacggtcaacaggagccggaatccaagtatagaaccactccgccccagcttgacgaggacggatcatactttttgtattcaaaactgtcggtggataagagccggtggcagagaggtgacaccttcatctgtgcggtgatgcacgaagcactccataatcactacacccaagagagcctctcgcattcccccggaaag

SEQ ID NO: 168

evqlvesggdlvkpggslrlscvasgytftnywihwmrqapgkglqwigridpnsggtkynekfkskatlsvdkakntaymqlnslraedtavyycaafgstygfaywgqgtlvtvssasttapsvfplapscgstsgstvalaclvsgyfpepvtvswnsgsltsgvhtfpsvlqssglyslssmvtvpssrwpsetftcnvahpasktkvdkpvpkrengrvprppdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvaldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfagtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspgk

Канинизированное антитело 4Н3 (vL1)

SEQ ID NO: 169

gacatcgtgatgacccagacccctctgagcctgtccgtgagccctggcgaacctgccagcatcagctgcaagagcagccagagcctgctgaacagcaggaccaggaagaactacctggcctggttcagacagaagcccggccagagcccccagagactgatctactgggccagcaccagagagagcggcgtgcctgacagatttagcggcagcggcagcggcacagacttcaccctgaggatcagcagagtggaggccgacgatgccggcgtgtactactgcaagcagagctacaacctgtacaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagaggaacgacgctcagccagccgtgtacctcttccagccttcgccggaccagcttcatacggggtcagcgtcggtggtgtgcctgttgaactcgttttaccccaaggacattaacgtgaagtggaaggtagacggggtaattcaagacactggcattcaagagtccgtcacggaacaagactcaaaagactcaacgtattcactgtcgtcaaccttgacgatgtcaagcaccgagtatcttagccatgagctgtattcgtgcgagatcacccacaagtccctcccctccactcttatcaaatcctttcagcggtcggaatgtcagcgggtcgat

SEQ ID NO: 170

divmtqtplslsvspgepasisckssqsllnsrtrknylawfrqkpgqspqrliywastresgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaddagvyyckqsynlytfgqgtkveikrndaqpavylfqpspdqlhtgsasvvcllnsfypkdinvkwkvdgviqdtgiqesvteqdskdstyslsstltmssteylshelysceithkslpstliksfqrsecqrvd

Канинизированное антитело 4Н3 (vL2)

SEQ ID NO: 171

gacatcgtgatgacccagacccctctgagcctgagcgtgagccctggagagcctgccagcatcagctgcaagagcagccagagcctgctgaacagcaggaccaggaagaactacctggcctggtacaggcagaagcctggccagagcccccagctgctgatctactgggccagcaccagagagagcggagtgcctgacaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaggatcagcagagtggaggccgatgacgccggcgtgtactactgcaagcagagctacaacctgtacaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagaggaacgacgctcagccagccgtgtacctcttccagccttcgccggaccagcttcatacggggtcagcgtcggtggtgtgcctgttgaactcgttttaccccaaggacattaacgtgaagtggaaggtagacggggtaattcaagacactggcattcaagagtccgtcacggaacaagactcaaaagactcaacgtattcactgtcgtcaaccttgacgatgtcaagcaccgagtatcttagccatgagctgtattcgtgcgagatcacccacaagtccctcccctccactcttatcaaatcctttcagcggtcggaatgtcagcgggtcgat

SEQ ID NO: 172

divmtqtplslsvspgepasisckssqsllnsrtrknylawyrqkpgqspqlliywastresgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaddagvyyckqsynlytfgqgtkveikrndaqpavylfqpspdqlhtgsasvvcllnsfypkdinvkwkvdgviqdtgiqesvteqdskdstyslsstltmssteylshelysceithkslpstliksfqrsecqrvd

Канинизированное антитело 4Н3 (vL3)

SEQ ID NO: 173

gacatcgtgatgacccagacccctctgagcctgagcgtgagccctggagagcctgccagcatcagctgcaagagcagccagagcctgctgaacagcaggaccaggaagaactacctggcctggtaccagcagaagcctggccagagcccccagctgctgatctactgggccagcaccagagagagcggagtgcctgacaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaggatcagcagagtggaggccgatgacgccggcgtgtactactgcaagcagagctacaacctgtacaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagaggaacgacgctcagccagccgtgtacctcttccagccttcgccggaccagcttcatacggggtcagcgtcggtggtgtgcctgttgaactcgttttaccccaaggacattaacgtgaagtggaaggtagacggggtaattcaagacactggcattcaagagtccgtcacggaacaagactcaaaagactcaacgtattcactgtcgtcaaccttgacgatgtcaagcaccgagtatcttagccatgagctgtattcgtgcgagatcacccacaagtccctcccctccactcttatcaaatcctttcagcggtcggaatgtcagcgggtcgat

SEQ ID NO: 174

divmtqtplslsvspgepasisckssqsllnsrtrknylawyqqkpgqspqlliywastresgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaddagvyyckqsynlytfgqgtkveikrndaqpavylfqpspdqlhtgsasvvcllnsfypkdinvkwkvdgviqdtgiqesvteqdskdstyslsstltmssteylshelysceithkslpstliksfqrsecqrvd

Пример 8

Реактивность канинизированных антител к альфа-рецептору собачьего IL-4

Канинизированные антитела тестировали на реактивность для альфа-рецептора собачьего IL-4, как показано ниже:

1. Покрытие альфа-рецептором IL-4 из расчета 200 нг/лунку иммунопланшета и инкубация планшета при 4°С в течение ночи.

2. Промывание планшета 3 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим 0,05% твина 20 (PBST).

3. Блокирование планшета 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

4. Промывание планшета 3 раза PBST.

5. Трехкратное разведение канинизированного антитела в каждой колонке или ряду планшета для разведения, начиная с 0,3 мкг/мл.

6. Перенос разведенного канинизированного антитела в каждую колонку или ряд иммунопланшетов и инкубация планшета в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

7. Промывка планшета 3 раза PBST.

8. Внесение в каждую лунку планшета 1:4000 разведенной Fc-области антисобачьего IgG, меченного пероксидазой хрена, и затем инкубация планшета в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

9. Промывание 3 раза PBST.

10. Внесение субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) в каждую лунку планшета и инкубация планшета в течение 10-15 мин при комнатной температуре для развития окраски.

11. Внесение 100 мкл 1,5 М фосфорной кислоты в каждую лунку для остановки реакции. Анализ на ридере при 450 нм с длиной волны 540 нм.

Как показано на фиг. 4, исследовали связывание пяти (5) антител к альфа-рецептору IL-4: 4H3 M-C, c4H3 H1-L1, c4H3 H2-L2, c4H3 H3-L3 и 2G9 M-C. Антитело 2G9 M-C использовали в качестве отрицательного контроля. Антитело 4H3 M-C представляет собой химерное антитело, состоящее из мышиных вариабельных областей тяжелой цепи описанного здесь антитела 4H3 вместе с собачьими константными областями и легкой цепи из мышиного антитела 4H3. Антитела c4H3 H1-L1, c4H3 H2-L2, c4H3 H3-L3 представляют собой три канинизированных варианта мышиного 4H3-антитела и содержат специфические тяжелые цепи и легкие цепи, как показано в таблице 5 выше. Антитело 2G9 M-C представляет собой химерное антитело, состоящее из мышиных вариабельных областей тяжелой цепи мышиного антитела к антигену, который полностью отличен от альфа-рецептора IL-4, вместе с собачьими константными областями и легкой цепью из мышиного антитела к этому отличному антигену. Соответственно, антитело 2G9 MC не связывалось с альфа-рецептором IL-4, тогда как остальные четыре исследованных антитела, то есть 4H3 MC, c4H3 H1-L1, c4H3 H2-L2 и c4H3 H3-L3, все связывались относительно тесно (см. фиг. 4).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело к альфа-рецептору собачьего IL-4, которое блокирует связывание указанного рецептора с собачьим интерлейкином-4. Также раскрыто применение антитела по настоящему изобретению в лечении астмы и атопического дерматита у собак. Изобретение обеспечивает связывание с альфа-рецептором собачьего IL-4 с высокой аффинностью. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Выделенное антитело млекопитающего или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются со специфичностью с α-рецептором собачьего интерлейкина-4 (IL-4R_α), включающие три определяющих комплементарность области легкой цепи (CDR): CDR1 легкой цепи (CDRL1), CDR2 легкой цепи (CDRL2) и CDR3 легкой цепи (CDRL3); и три CDR тяжелой цепи: CDR1 тяжелой цепи (CDRH1), CDR2 тяжелой цепи (CDRH2) и CDR3 тяжелой цепи (CDRH3), выбранные из группы, состоящей из:

(а) CDRL1, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; CDRL2, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDRL3, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; CDRH1, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; CDRH2, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; CDRH3, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152;

(b) CDRL1, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; CDRL2, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; CDRL3, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; CDRH1, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; CDRH2, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; и CDRH3, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 151;

(c) CDRL1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; CDRL2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; CDRL3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; CDRH1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; CDRH2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и CDRH3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153; и

(d) CDRL1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; CDRL2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; CDRL3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; CDRH1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; CDRH2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; и CDRH3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149; и

где антитело и его антигенсвязывающий фрагмент связываются с собачьим IL-4R_α и блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим интерлейкином-4.

2. Выделенное антитело млекопитающего или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое представляет собой канинизированное антитело или его канинизированный антигенсвязывающий фрагмент.

3. Выделенное канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131, CDRL2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138, CDRH1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, CDRH2 включает SEQ ID NO: 147 и CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152.

4. Канинизированное антитело по п. 2 или 3 или его канинизированный антигенсвязывающий фрагмент, которые включают шарнирную область, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: ID NO: 104.

5. Канинизированное антитело по п. 3 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 и SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 и SEQ ID NO: 174, или комбинацию указанной тяжелой цепи с указанной легкой цепью.

6. Выделенное канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 2-4 или 5, где при связывании с собачьим IL-4R_α указанное антитело млекопитающего или его антигенсвязывающий фрагмент или указанное канинизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются, по меньшей мере, с одним аминокислотным остатком в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 или любой их комбинации; где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с собачьим IL-4R_α и блокируют связывание собачьего IL-4R_α с собачьим интерлейкином-4.

7. Канинизированное антитело по п. 5 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанная комбинация указанной тяжелой цепи с указанной легкой цепью выбрана из группы, состоящей из тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166, и легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 172, и тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174.

8. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь канинизированного антитела по п. 5.

9. Экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п. 8.

10. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п. 9 для применения в экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь канинизированного антитела.

11. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из атопического дерматита, астмы и их комбинации, содержащая терапевтически эффективное количество канинизированного антитела по пп. 2-6 или 7 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.