ВЫСОКОАФФИННЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К РЕЦЕПТОРУ IL-4 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин-4 (IL-4, также известный как фактор, стимулирующий B-клетки, или BSF-1) первоначально был охарактеризован в отношении его способности стимулировать пролиферацию B-клеток в ответ на низкие концентрации антител, направленных к поверхностному иммуноглобулину. Показано, что IL-4 обладает широким спектром биологических активностей, включая стимуляцию роста T-клеток, тучных клеток, гранулоцитов, мегакариоцитов и эритроцитов. IL-4 индуцирует экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости класса II в покоящихся B-клетках и усиливает секрецию изотипов IgE и IgG1 стимулированными B-клетками.

Биологические активности IL-4 опосредованы специфичными рецепторами IL-4 на клеточной поверхности. Рецептор IL-4 альфа человека (hIL-4R) (SEQ ID NO: 1) описан, например, в патентах США No. 5599905, 5767065 и 5840869. Антитела к hIL-4R описаны в патенте США No. 5717072.

Способы получения антител, пригодных в качестве терапевтических средств для человека, включают создание химерных антител и гуманизированных антител (смотри, например, US 6949245). Смотри, например, WO 94/02602 (Abgenix) и US 6596541 (Regeneron Pharmaceuticals) (обе публикации включены в данное описание в виде ссылки), описывающие способы получения трансгенных мышей, способных продуцировать антитела человека.

Способы применения антител к hIL-4R описаны в патентах США No. 5714146, 5985280 и 6716587.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к антителам человека, предпочтительно рекомбинантным антителам человека, которые специфично связывают рецептор интерлейкина-4 человека (hIL-4R). Антитела человека характеризуются связыванием с hIL-4R с высокой аффинностью и способностью нейтрализовать активность hIL-4. В конкретных вариантах антитела человека способны блокировать связывание комплекса hIL-13/hIL-13R1 c hIL-4R и таким образом ингибировать передачу сигнала посредством hIL-13. Антитела могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы, чтобы повлиять на функциональность, например исключить остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933).

В одном варианте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который специфично связывает hIL-4R (SEQ ID NO: 1) с K_D, составляющей примерно 200 пМ или меньше, которую измеряют с использованием поверхностного плазмонного резонанса. В более конкретном варианте антитело или антигенсвязывающая часть имеют K_D меньше чем примерно 150 пМ, или меньше чем примерно 50 пМ, или меньше чем примерно 20 пМ. В различных вариантах антитело или антигенсвязывающий фрагмент блокирует активность hIL-4 с IC₅₀ примерно 200 пМ или меньше, как измерено в биоанализе люциферазы STAT6. В более конкретных вариантах антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеют IC₅₀ примерно 150 пМ или меньше, или примерно 100 пМ или меньше, или даже примерно 50 пМ или меньше, как измерено в биоанализе люциферазы. В различных вариантах антитело или антигенсвязывающий фрагмент блокирует активность hIL-13 с IC₅₀, составляющей примерно 100 пМ или меньше, как измерено в биоанализе люциферазы STAT6. В более конкретных вариантах антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеют IC₅₀ примерно 75 пМ или меньше, или примерно 50 пМ или меньше, или даже примерно 20 пМ или меньше.

Во втором аспекте антитело согласно изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из последовательностей

или по существу сходной последовательности.

В третьем аспекте антитело согласно изобретению содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из последовательностей

или по существу сходной последовательности.

В одном варианте антитело или фрагмент антитела согласно изобретению содержит HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбранные из группы, состоящей из последовательностей

В предпочтительном варианте антитело или фрагмент антитела содержат HCVR/LCVR, выбранные из последовательностей SEQ ID NO: 51/59, 259/267, 275/283, 291/299, 579/59 или 581/59.

В четвертом аспекте изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим HCVR, при этом молекула нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей

или по существу идентичной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию.

В пятом аспекте изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим LCVR, при этом молекула нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей

или по существу идентичной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию.

В одном варианте антитело согласно изобретению содержит HCVR и LCVR, кодируемые парой нуклеотидных последовательностей, выбранной из группы, состоящей из последовательностей

В предпочтительном варианте антитело или фрагмент антитела содержат HCVR/LCVR, кодируемые нуклеотидными последовательностями, выбранными из последовательностей SEQ ID NO: 50/58, 258/266, 274/282, 290/298, 578/58 или 580/58.

В шестом аспекте отличительным признаком изобретения является антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфично связывают hIL-4R, содержащее три определяющие комплементарность области тяжелой цепи и три определяющие комплементарность области легкой цепи (CDR), где

CDR1 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID NO: 582), где X¹ = Gly; X² = Tyr или Phe; X³ = Thr или I; X⁴ = Phe; X⁵ = Asn или Arg; X⁶ = Ser; X⁷ = Tyr и X⁸ = Gly;

CDR2 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID NO: 583), где X¹ = Ile, X² = Ser или Arg, X³ = Thr или Tyr, X⁴ = Tyr или Asp, X⁵ = Asn или Gly, X⁶ = Gly или Ser, X⁷ = Lys или Asn и X⁸ = Thr;

CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶-X¹⁷-X¹⁸-X¹⁹-X²⁰-X²¹ (SEQ ID NO: 584), где X¹ = Ala или Val, X² = Arg или Lys, X³ = Asp или Glu, X⁴ = Gly или Glu, X⁵ = Ala или Arg, X⁶ = Arg или Ser, X⁷ = Ile или Gly, X⁸ = Val или Ser, X⁹ = Val или Trp, X¹⁰ = Ala или Phe, X¹¹ = Gly или Asp, X¹² = Thr или Pro, X¹³ = Thr или отсутствует, X¹⁴ = Pro или отсутствует, X¹⁵ = Tyr или отсутствует, X¹⁶ = Tyr или отсутствует, X¹⁷ = Tyr или отсутствует, X¹⁸ = Gly или отсутствует, X¹⁹ = Met или отсутствует, X²⁰ = Asp или отсутствует и X²¹ = Val или отсутствует;

CDR1 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶ (SEQ ID NO: 585), где X¹ = Gln, X² = Asp или Ala, X³ = Ile, X⁴ = Ser или Asn, X⁵ = Asn или Ile и X⁶ = Trp или Phe;

CDR2 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID NO: 586), где X¹ = Ala или Val, X² = Ala или Thr и X³ = Ser; и

CDR3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID NO: 587), где X¹ = Gln, X² = Gln, X³ = Ala или Tyr, X⁴ = Asn, X⁵ = Ser, X⁶ = Phe или His, X⁷ = Pro, X⁸ = Ile или Trp и X⁹ = Thr.

В седьмом аспекте изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR3 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи, где домен CDR3 тяжелой цепи выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361 и 377; и домен CDR3 легкой цепи выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 и 385. В предпочтительном варианте области CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи выбраны из пар последовательностей SEQ ID NO: 57 и 65; 265 и 273; 281 и 289; и 297 и 305.

В следующем варианте отличительным признаком изобретения является антитело человека или фрагмент антитела, содержащие домен CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357 и 373, или по существу сходной с ними последовательности; домен CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359 и 375, или по существу сходной с ними последовательности; домен CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361 и 377, или по существу сходной с ними последовательности; домен CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365 и 381 или по существу сходной с ними последовательности; домен CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367 и 383, или по существу сходной с ними последовательности; и домен CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 и 385 или по существу сходных с ними последовательностей. В предпочтительном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат области CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 53, 55, 57 и области CDR легкой цепи SEQ ID NO: 61, 63, 65; области CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 261, 263, 265 и области CDR легкой цепи SEQ ID NO: 269, 271, 273; области CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 277, 279, 281 и области CDR легкой цепи SEQ ID NO: 285, 287, 289; и области CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 293, 295, 297 и области CDR легкой цепи SEQ ID NO: 301, 303, 305.

В восьмом аспекте изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, содержащим три CDR из HCVR и три CDR из LCVR, при этом HCVR/LCVR выбраны из группы, состоящей из 51/59, 579/59, 581/59, 259/267, 275/283 и 291/299.

В одном варианте отличительным признаком изобретения является антитело человека или фрагмент антитела, содержащие CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи, где CDR3 тяжелой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 и 376; и CDR3 легкой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 и 384.

В следующем варианте отличительным признаком изобретения является антитело человека или фрагмент антитела, содержащие домен CDR1 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 и 372 или по существу идентичной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию; домен CDR2 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 и 374 или по существу идентичной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию; домен CDR3 тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 и 376 или по существу сходной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию; домен CDR1 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 и 380 или по существу сходной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию; домен CDR2 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 и 382 или по существу сходной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию; и домен CDR3 легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 и 384, или по существу сходной последовательности, имеющей с ними, по меньшей мере, 95% гомологию. В предпочтительном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит области CDR тяжелой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 52, 54, 56, и области CDR легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 60, 62, 64; области CDR тяжелой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 260, 262, 264, и области CDR легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 268, 270, 272; области CDR тяжелой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 276, 278, 280, и области CDR легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 284, 286, 288; и области CDR тяжелой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 292, 294, 296, и области CDR легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 300, 302, 304.

Изобретение охватывает анти-hIL-4R-антитела, имеющие модифицированную картину гликозилирования. В некоторых применениях может быть полезна модификация для удаления нежелательных сайтов гликозилирования, или антитело, в котором отсутствует остаток фукозы, присутствующий на олигосахаридной цепи, например, чтобы увеличить функцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (смотри Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). В других применениях может быть осуществлена модификация галактозилирования, чтобы модифицировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).

В девятом аспекте изобретение относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам, несущим молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, и к клеткам-хозяевам, в которые введены такие векторы, а также к способам получения антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно изобретению, получаемых посредством культивирования клеток-хозяев согласно изобретению. Клеткой-хозяином может быть прокариотическая или эукариотическая клетка, предпочтительно клеткой-хозяином является клетка E. coli или клетка млекопитающего, такая как клетка CHO.

В десятом аспекте отличительным признаком изобретения является композиция, содержащая рекомбинантное антитело человека, которое специфично связывает hIL-4R, и приемлемый носитель.

В одиннадцатом аспекте отличительным признаком изобретения являются способы ингибирования активности hIL-4 с использованием антитела или его антигенсвязывающей части согласно изобретению. В конкретных вариантах антитела согласно изобретению также блокируют связывание комплекса hIL-13/hIL-13R1 с hIL-4R. В одном варианте способ включает контактирование hIL-4R с антителом согласно изобретению или его антигенсвязывающей частью, так что ингибируется активность hIL-4 или hIL-4/hIL-13. В другом варианте способ включает введение антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающей части человеку, страдающему нарушением, которое ослабляется при ингибировании активности hIL-4 или hIL-4/hIL-13. Нарушением, которое можно лечить, является любое заболевание или состояние, которое улучшается, ослабляется, ингибируется или предотвращается посредством удаления, ингибирования или уменьшения активности hIL-4 или hIL-4/hIL-13.

Кроме того, в объем изобретения входит применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела согласно любому из пунктов формулы изобретения 1-9 в производстве лекарственного средства для применения с целью ослабления или ингибирования IL-4-опосредованного заболевания или нарушения у человека.

Опосредованное IL-4 нарушение или родственные нарушения, которые можно лечить антителами или фрагментами антител согласно изобретению включают, например, артрит (включая септический артрит), герпетиформные заболевания, хроническую идиопатическую крапивницу, склеродерму, гипертрофическое рубцевание, болезнь Уиппла, доброкачественную гиперплазию простаты, легочные нарушения, такие как астма в легкой, умеренной или тяжелой форме, воспалительные нарушения, такие как воспалительное заболевание кишечника, аллергические реакции, болезнь Кавасаки, серповидно-клеточную болезнь, синдром Черджа-Строса, диффузный токсический зоб, преэклампсию, синдром Шегрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез и нефроз.

Другие объекты и преимущества будут очевидны при рассмотрении следующего далее подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1(A-C). Оценка профиля связывания антител, полученная в анализе последовательного связывания на основе OCTET^TM. Фиг. 1(A) представляет собой гистограмму, на которой показаны результаты, полученные в том случае, когда первым антителом, на которое действуют связанным антигеном, является контрольное антитело. Фиг. 1(B): первым антителом, на которое действуют связанным антигеном, является VAB16F3-1. Фиг. 1(C): первым антителом, на которое действуют связанным антигеном, является VAK5H4-4. Второе антитело: 1 = контроль; 2 = VX4E7-9; 3 = VX3F7-6; 4 = VAB16G-1; 5 = VAB16F3-1; 6 = VAB15C8-17; 7 = VAB11G8-1; 8 = VAB10C1-5; 9 = VAB10G8-19; 10 = VAB8G10-1; 11 = VAB7B9-3; 12 = VAB6C10-14; 13 = VAB5C5-11; 14 = VAB3B4-10; 15 = VAB4D5-3; 16 = VAB1H1-2; 17 = VAK5H4-4; 18 = VAK7G8-5; 19 = VAK8G11-13; 20 = VAK9C6-11; 21 = VAK10G6-7; 22 = VAK11D4-1; 23 = VAK12B11-9; и 24 = VAK10G12-5. Незаштрихованные столбики показывают уровень связывания первого антитела, заштрихованные столбики показывают дополнительное связывание вторым антителом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Перед описанием способов, следует указать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и описанными условиями экспериментов, так как такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, используется только в целях описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно понимает специалист в той области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или проверке настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей публикации, ниже описаны предпочтительные способы и материалы.

Определения

Термин «IL4R человека» (hIL-4R) в используемом в настоящем описании смысле относится к рецептору цитокина человека, который специфично связывает интерлейкин-4 (IL-4), IL-4Rα (SEQ ID NO: 1). Термин «интерлейкин-13 человека» (hIL-13) относится к цитокину, который специфично связывает рецептор IL-13, и термин «комплекс hIL-13/hIL-13R1» относится к комплексу, образованному при связывании hIL-13 с комплексом hIL-13R1, и такой комплекс связывает рецептор hIL-4, инициируя биологическую активность.

Подразумевается, что термин «антитело» в используемом в настоящем описании смысле относится к молекулам иммуноглобулина, содержащим четыре полипептидных цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в данном описании LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми находятся более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые распределены от амино-конца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») в используемом в настоящем описании смысле относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, hIL-4R). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два F(ab)'-фрагмента, связанный дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), который состоит из домена VH; и (vi) изолированную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны с использованием способов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет получать из них одну непрерывную цепь, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); смотри, например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как димерные антитела, также подпадают под такой термин (смотри, например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448).

«Нейтрализующее» или «блокирующее» антитело в используемом в настоящем описании смысле относится к антителу, связывание которого с hIL-4R приводит к ингибированию биологической активности hIL-4 и/или hIL-13. Такое ингибирование биологической активности hIL-4 и/или IL-13 можно оценить измерением одного или нескольких индикаторов биологической активности hIL-4 и/или hIL-13, известных в данной области, таких как индуцированная hIL-4- и/или IL-13 активация клеток и связывание hIL-4 с hIL-4R (смотри примеры ниже).

«CDR» или определяющая комплементарность область представляет собой область гипервариабельности, с рассеянными внутри нее областями, которые являются более консервативными, называемыми «каркасными областями» (FR). В других вариантах анти-hIL-4R-антитела или фрагмента согласно изобретению FR могут быть идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть природными или искусственно модифицированными.

Термин «поверхностный плазмонный резонанс» в используемом в настоящем описании смысле относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ взаимодействий в режиме реального времени посредством регистрации изменений в концентрациях белков на биосенсорной матрице, например, используя систему BIAcore^TM (Pharmacia Biosensor AB).

Термин «эпитоп» означает антигенную детерминанту, которая взаимодействует со специфичным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образуют пространственно близкие аминокислоты из разных участков линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп образуется соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В некоторых случаях эпитоп может содержать остатки сахаридов, группы фосфорила или сульфонильные группы антигена.

Термин «значительная идентичность» или «по существу идентичный» в том случае, когда он относится к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, указывает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов с другой нуклеиновой кислотой (или комплементарной ей нитью) имеет место идентичность нуклеотидных последовательностей, составляющая, по меньшей мере, около 95% и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, которую измеряют, используя любой хорошо известный алгоритм определения идентичности последовательностей, например FASTA, BLAST или Gap, которые обсуждаются ниже.

По отношению к полипептидам термин «значительное сходство» или «по существу сходный» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT и с использованием весовых оценок за пробел по умолчанию, имеют, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 98% или 99% идентичность последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются в результате консервативных аминокислотных замен. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой остаток аминокислоты заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В общем, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства белка. В тех случаях когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, идентичность последовательностей в процентах или степень сходства можно повысить, корректируя консервативную природу замены. Способы осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. Смотри, например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) содержащие амид боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат и (7) содержащие серу боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительные группы консервативных замен аминокислот: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение при оценке с использованием матрицы логарифмической функции правдоподобия PAM250, описанной в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45. «Умеренно консервативной» заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение при оценке с использованием матрицы логарифмической функции правдоподобия PAM250.

Сходство последовательностей в случае полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют, используя компьютерную программу анализа последовательностей. Компьютерная программа анализа белков сопоставляет сходные последовательности, используя параметры сходства с учетом различных замен, делеций и других модификаций, включая консервативные аминокислотные замены. Например, компьютерная программа GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию, чтобы определить гомологию последовательностей или идентичность последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутантным вариантом. Смотри, например, GCG Version 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнить, используя FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами, программа в GCG Version 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и дает процент идентичности последовательностей в областях наилучшего выравнивания между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Pearson (2000) выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN с использованием параметров по умолчанию. Смотри, например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.

Получение антител человека

Способы получения антител человека включают, например, Veloclmmune^TM (Regeneron Pharmaceuticals), методику XenoMouse^TM (Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21; Abgenix), способ «минилокуса» и фаговый дисплей (смотри, например, US 5545807, US 6787637). Методика Veloclmmune^TM (US 6596541) включает способ получения высокоспецифичного полностью человеческого антитела к выбранному антигену.

Грызунов можно иммунизировать любым способом, известным в данной области (смотри, например, Harlow and Lane (1988) выше; Malik and Lillehoj (1994) Antibody techniques, Academic Press, CA). В предпочтительном варианте антиген hIL-4R вводят непосредственно мышам, которые имеют локусы ДНК, кодирующие и вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи каппа Ig человека (Veloclmmune^TM, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6596541), с адъювантом, чтобы стимулировать иммунный ответ, например, полным или неполным адъювантом Фрейнда, системой адъювантов MPL+TDM (Sigma) или RIBI (мурамил-дипептиды) (смотри O'Hagan (2000) Vaccine Adjuvant, Human Press, NJ). Адъювант может предотвращать быстрое рассеяние полипептида в результате секвестрации антигена в локальном депо и может содержать факторы, которые могут стимулировать иммунный ответ хозяина. Методика Veloclmmune^TM заключается в создании трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, функционально связанные с эндогенными локусами константных областей мыши, так что мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепи человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело. В конкретном варианте клетка представляет собой клетку CHO.

Антитела могут быть терапевтически применимы в блокировании взаимодействия лиганд-рецептор или ингибировании взаимодействия компонентов рецептора, а не для того, чтобы вызвать гибель клеток в результате фиксации комплемента (комплементзависимая цитотоксичность) (CDC) и участия зависимой от антител опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC). Константная область антитела является важной для обеспечения способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать зависимую от клеток цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основе того, требуется ли опосредование цитотоксичности антителом.

Иммуноглобулины человека могут существовать в двух формах, которые связаны с гетерогенностью шарнира. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную структуру из четырех цепей с молекулярной массой примерно 150-160 кД, в которой димеры удерживаются вместе межцепочечной дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны посредством межцепочечных дисульфидных связей, и молекула с молекулярной массой примерно 75-80 кД образована ковалентно связанными легкой и тяжелой цепями (полуантитело). Такие формы очень трудно отделить даже после аффинной очистки. Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG является следствием, но не ограничена структурными различиями, связанными с шарнирной областью изотипа антитела. Действительно единичная аминокислотная замена в шарнирной области шарнира IgG4 человека может существенно уменьшать появление второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) до уровней, обычно наблюдаемых с использованием шарнира IgG1 человека. Настоящее изобретение охватывает антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнирной области, в области CH2 или CH3, которые могут быть желательны, например, при получении, чтобы повысить выход требуемой формы антитела.

Антитела согласно изобретению предпочтительно получают с применением методики Veloclmmune^TM. Трансгенную мышь, у которой эндогенные вариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина заменены соответствующими вариабельными областями человека, стимулируют представляющим интерес антигеном и лимфатические клетки (такие, как B-клетки) извлекают из организма мышей, которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки могут быть слиты с линией клеток миеломы, чтобы получить иммортализованные линии клеток гибридомы, и такие линии клеток гибридомы подвергают скринингу и селекции, чтобы идентифицировать линии клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, специфичные по отношению к представляющему интерес антигену. ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, может быть выделена и связана с требуемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела может быть продуцирован в клетке, такой как клетка CHO. Альтернативно ДНК, кодирующая антиген-специфичные химерные антитела или вариабельные области легкой и тяжелой цепей, может быть выделена непосредственно из антиген-специфичных лимфоцитов.

В одном варианте трансгенная мышь содержит до 18 функциональных генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 12 функциональных генов вариабельных областей легкой цепи каппа человека. В другом варианте трансгенная мышь содержит до 39 генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 30 генов вариабельных областей легкой цепи каппа человека. В еще одном варианте трансгенная мышь содержит до 80 генов вариабельных областей тяжелой цепи человека и 40 генов вариабельной области легкой цепи каппа человека.

В общем, антитела согласно настоящему изобретению имеют очень высокие аффинности, обычно имеют K_DS примерно от 10^-9 до 10^-12 М, которые измеряют посредством связывания с антигеном, либо иммобилизованным на твердой фазе, либо в растворе.

Сначала выделяют высокоаффинные химерные антитела, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Как описано ниже, антитела характеризуют и подвергают селекции в отношении требуемых свойств, включая аффинность связывания с hIL-4R, способность блокировать связывание hIL-4 с hIL-4R и/или избирательность по отношению к белку человека. Константные области мыши заменяют требуемыми константными областями человека, чтобы создать полностью человеческие антитела согласно изобретению, например дикого типа или модифицированные IgG4 или IgG1 (например, SEQ ID NO: 588, 589, 590). В то время как выбираемая константная область может варьировать в зависимости от конкретного применения, такие свойства, как высокоаффинное связывание антигена и специфичность по отношению к мишени, присущи вариабельной области.

Картирование эпитопов и родственные методики

Для осуществления скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом, можно осуществить обычный анализ перекрестного блокирования, такой как анализ, описанный в Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Другие способы включают анализ мутантов, получаемых при аланиновом сканировании, пептидные блоты (Reineke (2004) Methods Mol. Biol, 248: 443-63) или анализ расщепления пептидов. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопа, удаление эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science, 9: 487-496).

Анализ профиля, основанный на модификации (MAP), также известный как анализ профиля на основании структуры антигена (ASAP), представляет собой способ, который позволяет классифицировать большие количества моноклональных антител (мАт), направленных против одного и того же антигена на основании сходства профиля связывания каждого антитела с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигена (публикация заявки на выдачу патента США No. 2004/0101920). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, либо явно отличающийся, либо частично перекрывающийся с эпитопом, представленным в другой категории. Такая методика позволяет быстро отфильтровывать генетически идентичные антитела, так что характеристика может быть сфокусирована на генетически различных антителах. В случае применения при скрининге гибридом MAP может облегчать идентификацию редких клонов гибридомы с требуемыми свойствами. MAP можно применять для сортировки hIL-4R-антител согласно изобретению на группы антител, связывающих разные эпитопы.

Агентами, применимыми для изменения структуры иммобилизованного антигена, являются ферменты, такие как, например, протеолитические ферменты, и химические агенты. Белок антигена может быть иммобилизован либо на поверхностях биосенсорных чипов, либо на шариках из полистирола. Последние могут подвергаться анализу, такому как мультиплексный анализ для регистрации Luminex^TM (Luminex Corp., TX). Вследствие того что Luminex^TM способен осуществлять мультиплексный анализ до 100 различных типов шариков, Luminex^TM обеспечивает почти неограниченные поверхности антигенов с разными модификациями, что приводит к повышенной разрешающей способности в анализе профиля эпитопов антител с помощью биосенсорного анализа.

Терапевтическое введение и препараты

Введение терапевтических средств согласно изобретению можно осуществлять вместе с подходящими носителями, эксципиентами и другими агентами, которые включают в препараты, чтобы обеспечить улучшенный перенос, доставку, переносимость и тому подобное. Множество подходящих препаратов можно найти в справочниках, известных всем специалистам в области фармацевтической химии: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003, 20^th ed, Lippincott Williams and Wilkins). К таким препаратам относятся, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие, как LIPOFECTIN^TM), ДНК-конъюгаты, безводные всасываемые пасты, эмульсии типа «масло в воде» и «вода в масле», карбовакс (полиэтиленгликоли различной молекулярной массы), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из указанных выше смесей может быть подходящей для лечения и терапии согласно настоящему изобретению, при условии, что активный ингредиент в препарате не инактивируется другими компонентами препарата, и препарат является физиологически совместимым и переносимым в случае используемого пути введения. Смотри также Powell et al. «Compendium of excipients for parenteral formulations» PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52: 238-311 и цитированные в указанной работе публикации для получения дополнительной информации, связанной с эксципиентами и носителями, хорошо известными специалистам в области фармацевтической химии.

Терапевтические молекулы согласно изобретению можно вводить пациенту таким способом, который подходит для данного показания, например парентерально, местно или путем ингаляции. В случае инъекции антагонист можно вводить, например, внутрисуставным, внутривенным, внутримышечным путем, в очаг поражения, внутрибрюшинным или подкожным путями, посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Предполагается и локальное введение в место заболевания или повреждения, как, например, трансдермальная доставка и замедленное высвобождение из имплантатов. Доставка путем ингаляции включает, например, назальную или пероральную ингаляцию, применение распылителя, ингаляцию антагониста в аэрозольной форме и тому подобное. Другими альтернативными вариантами являются глазные капли; пероральные препараты, включая пилюли, сиропы, лепешки или жевательные резинки; и местные препараты, такие как примочки, гели, спреи и мази.

Конкретные дозы и частота введения могут варьировать в зависимости от таких факторов, как путь введения, природа и тяжесть заболевания, подвергаемого лечению, от того, является ли состояние острым или хроническим, и массы и общего состояния здоровья пациента. Соответствующие дозы можно определить способами, известными в данной области техники, например в клинических испытаниях, которые могут включать в себя исследования с использованием возрастающих доз. Терапевтические молекулы согласно изобретению можно вводить однократно или многократно. В конкретных вариантах антитело или фрагмент антитела вводят в течение периода времени, составляющего, по меньшей мере, месяц или более, например один, два или три месяца или даже неограниченно. Для лечения хронических состояний обычно наиболее эффективно долговременное лечение. Однако для лечения острых состояний может быть достаточным введение в течение более коротких периодов, например от одной до шести недель. В общем, терапевтическое средство вводят вплоть до проявления у пациента существенной с медицинской точки зрения степени улучшения по сравнению с исходным уровнем по выбранному показателю или показателям. Уровень IL-4 можно контролировать во время и/или после лечения терапевтической молекулой согласно изобретению. Способы измерения уровней IL-4 в сыворотке известны в данной области, например с использованием ELISA и т.д.

Терапевтическое применение и комбинированная терапия

Антитела и фрагменты антител согласно изобретению применимы для лечения заболеваний и нарушений, состояние при которых можно улучшать, которые можно ингибировать или ослаблять посредством снижения активности IL-4. Такие нарушения включают нарушения, характеризуемые аномальной или избыточной экспрессией IL-4 или аномальным ответом хозяина на продукцию IL-4. Связанные с IL-4 нарушения, которые можно лечить антителами или фрагментами антител, включают, например, артрит (включая септический артрит), герпетиформные заболевания, хроническую идиопатическую крапивницу, склеродерму, гипертрофическое рубцевание, болезнь Уиппла, доброкачественную гиперплазию простаты, легочные нарушения, такие как астма (в легкой, умеренной или тяжелой форме), воспалительные нарушения, такие как воспалительное заболевание кишечника, аллергические реакции, болезнь Кавасаки, серповидно-клеточную болезнь, синдром Черджа-Строса, диффузный токсический зоб, преэклампсию, синдром Шегрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез, атопический дерматит, язвенный колит, фиброз и нефроз (смотри U.S. 7186809).

Изобретение относится к комбинированной терапии, при которой анти-IL-4R-антитело или фрагмент антитела вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством. Совместное введение и комбинированная терапия не ограничены одновременным введением, а включают схемы лечения, при которых анти-IL-4R-антитело или фрагмент антитела вводят, по меньшей мере, один раз в ходе лечения, которое включает в себя введение пациенту, по меньшей мере, одного другого терапевтического средства. Вторым терапевтическим средством может быть другой антагонист IL-4, такой как другое антитело/фрагмент антитела или растворимый рецептор цитокина, антагонист IgE, лекарственное средство против астмы (кортикостероиды, нестероидные средства, бета-агонисты, антагонисты лейкотриена, ксантины, флутиказон, сальметерол, альбутерол), которые могут быть доставлены путем ингаляции или другими подходящими способами. В конкретном варианте анти-IL-4R-антитело или фрагмент антитела согласно изобретению могут быть введены с антагонистом IL-1, таким как рилонацепт, или антагонистом IL-13. Второе средство может содержать один или несколько антагонистов рецептора лейкотриена для лечения таких нарушений, как аллергические воспалительные заболевания, например астма и аллергии. Примеры антагонистов рецептора лейкотриена включают без ограничения монтелукаст, пранлукаст и зафирлукаст. Второе средство может содержать ингибитор цитокина, такой как один или несколько TNF (этанерцепт, ENBREL^TM), антагонист IL-9, IL-5 или IL-17.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предлагаются для того, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как получать и применять композиции и способы согласно изобретению, и примеры не предназначены для ограничения объема, который авторы изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Предприняты попытки обеспечить точность в отношении используемых количественных показателей (например, количества, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые погрешности и отклонения. Если не оговорено особо, части представляют собой части по массе, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура указана в градусах по Цельсию, и давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Пример 1. Получение антител человека к рецептору IL-4 человека.

Мышей, имеющих локусы ДНК, кодирующие и вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи каппа Ig человека (Veloclmmune^TM, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; патент США No. 6596541), иммунизировали IL-4R человека (hIL-4R, SEQ ID NO: 1). hIL-4R вводили прямой инъекцией очищенного антигена в адъюванте или опосредованно, введением последовательности ДНК hIL-4R в ДНК-плазмиде, которая содержит ген hIL-4R и экспрессирует hIL-4R, используя аппарат экспрессии белков клеток хозяина, давая антигенный полипептид in vivo. Чтобы получить оптимальный иммунный ответ проводили последующие бустер-иммунизации животных каждые 3-4 недели и заборы крови проводили через 10 после каждой бустер-иммунизации для оценки развития ответа против антигена.

Когда у мышей достигался максимальный иммунный ответ, экспрессирующие антитела B-клетки собирали и сливали с клетками миеломы мышей с образованием гибридом. Необходимые с функциональной точки зрения моноклональные антитела собирали посредством скрининга кондиционированной среды гибридом или трансфицированных клеток в отношении специфичности, аффинности связывания антигена и эффективности блокирования связывания hIL-4 с hIL-4R (описано ниже).

Отобранные антитела, которые имели требуемую аффинность связывания антигена, эффективность и/или способность блокирования связывания hIL-4 с hIL-4R, включали (HCVR/LCVR):

Пример 2. Определение аффинности связывания антигена.

Аффинность связывания (K_D) выбранных антител по отношению к hIL-4R определяли с помощью анализа, в котором используют биосенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени (BIAcore^TM 2000). Коротко, антитело может быть иммобилизовано на поверхности из поликлональных антител против IgG GAM мыши, созданной посредством прямого химического связывания IgG GAM с чипом BIAcore^TM с образованием иммобилизованных на поверхности антител. Различные концентрации (в диапазоне от 12,5 нМ до 0,625 нМ) мономерного hIL-4R (R&D Systems) или димерного hIL-4R-hFc наносили посредством инъекции на поверхность с иммобилизованными антителами. Связывание антигена с антителом и диссоциацию связанного комплекса наблюдали в режиме реального времени. Равновесные константы диссоциации (K_D) и константы скорости диссоциации устанавливали, осуществляя кинетический анализ с использованием компьютерной программы для оценки данных BIA. Компьютерную программу для оценки данных BIA также использовали для расчета времени полужизни диссоциирующего комплекса антиген/антитело (T_1/2). Результаты показаны в таблице 1. Контроль: полностью человеческое анти-IL-4R-антитело (патент США No. 7186809; SEQ ID NO: 10 и 12). Результаты кинетических анализов выявили, что отобранные антитела содержали высокоаффинные антитела, которые способны связываться с димерным рецептором с K_D меньше 1 нМ. Также тестировали аффинность связывания анти-hIL-4R-антител с IL-4R либо мыши, либо обезьяны (Macaca fascicularis). Отобранные антитела (1) перекрестно не реагировали с IL-4R мыши; и (2) либо не могли связывать IL-4R обезьяны, либо связывали IL-4R обезьяны с очень низкой аффинностью.

Аффинность связывания антитело-антиген также оценивали, используя анализ конкурентного связывания в растворе на основе ELISA. Коротко, антитела (очищенные белки в концентрации 1 или 3,3 нг/мл) предварительно смешивали с серийными разведениями антигенного белка (мономерного или димерного) в диапазоне от 0 до 10 мкг/мл. Растворы смеси антитела и антигена затем инкубировали в течение двух-четырех часов при комнатной температуре, чтобы достичь равновесия связывания. Затем измеряли свободное антитело в смесях, используя количественный анализ ELISA типа «сэндвич». Коротко, 96-луночные планшеты Maxisorp^TM (VWR, West Chester, PA) покрывали 2 мкг/мл белка hIL-4R-hFc в PBS в течение ночи при 4ºC с последующим блокированием неспецифичного связывания белком БСА. Затем растворы смесей антитело-антиген переносили в покрытые планшеты Maxisorb^TM с последующей одночасовой инкубацией. Затем планшеты промывали буфером для промывки и связанные с планшетом антитела выявляли с использованием реагента: конъюгированных с HRP поликлональных антител козы против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch) или конъюгированных с HRP поликлональных антител козы против IgG человека (Jackson ImmunoResearch) в случае контрольного антитела и обрабатывали, используя колориметрические субстраты, такие как BD OptEIA^TM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). После остановки реакции 1 М фосфорной или серной кислотой регистрировали оптические плотности при 450 нм и данные анализировали, используя компьютерную программу GraphPad^TM Prism. Зависимость сигналов от концентрации антигена в растворе определяли, используя анализ, основанный на подгонке по четырем параметрам, и выражали в виде IC₅₀, концентрации антигена, необходимой для достижения 50% снижения сигнала от образцов антител в отсутствие антигена в растворе. IC₅₀ определяли, как описано выше, и суммировали в таблице 2. В предпочтительном варианте антитело или фрагмент антитела согласно изобретению имеет IC₅₀ для димерного hIL-4R, составляющую примерно 20 пМ или меньше, и IC₅₀ для мономерного hIL-4R примерно 150 пМ или меньше или примерно 100 пМ или меньше, которую измеряли в анализе конкуренции в растворе на основе ELISA.

Пример 3. Ингибирование взаимодействия hIL-4 и hIL-4R

Проводили скрининг способности отобранных антител блокировать связывание hIL-4 с hIL-4R в анализе блокирования hIL-4 BIAcore^TM и эффективность измеряли в количественном иммуноанализе блокирования hIL-4, который описан ниже. Результаты суммированы в таблице 3.

Способность антител блокировать связывание hIL-4 с рецептором hIL-4R определяли, используя поверхностный плазмонный резонанс. Очищенные молекулы hIL-4R-hFc улавливали поликлональными антителами козы против IgG человека, иммобилизованными на CM-5 при плотности 260 RU, чтобы получить поверхность, покрытую рецептором. Затем IL-4 человека (0,25 мл, 50 нМ) посредством инъекции наносили на покрытую рецептором поверхность и регистрировали количество связанного hIL-4 (первая инъекция hIL-4). Связанный hIL-4 затем удаляли импульсным воздействием 3 М MgCl₂ с последующим воздействием очищающего буфера. Затем инъецировали очищенные анти-hIL4R-антитела на покрытую рецептором поверхность с последующей второй инъекцией hIL-4 в такой же концентрации (вторая инъекция hIL-4). Снижение связывания hIL-4 в процентах в результате предварительного образования комплекса антитела с рецептором показано в таблице 3.

Чтобы дополнительно оценить способность блокировать связывание hIL-4 с hIL-4R проводили количественный иммуноанализ. Коротко, растворы 25 пМ hIL-4R-Fc предварительно смешивали с белком антитела в диапазоне от ~50 нМ до 0 нМ в серийных разведениях с последующей одночасовой инкубацией при комнатной температуре. Концентрацию свободного hIL-4R-Fc (не связанного с антителом) определяли, используя специфичный для hIL-4R ELISA типа «сэндвич». Планшеты для регистрации hIL-4R готовили, связывая биотинилированный hIL-4 (0,5 мкг/мл) с покрытыми стрептавидином 96-луночными планшетами. Предварительно связанные образцы антитело-антиген переносили в покрытый hIL-4 планшет для регистрации. После одночасовой инкубации при комнатной температуре планшет для регистрации промывали и связанный с планшетом hIL-4R-hFc выявляли, используя конъюгированные с HRP поликлональные антитела козы против hFc, и обрабатывали, используя колориметрические субстраты, такие как BD OptEIA^TM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). После остановки реакции 1 М фосфорной или серной кислотой регистрировали оптические плотности при 450 нм и данные анализировали, используя компьютерную программу GraphPad^TM Prism. IC₅₀ определяли как количество антитела, необходимое для уменьшения на 50% регистрируемого IL-4R-hFc, который связан с hIL-4, связанным с планшетом hIL-4. В предпочтительном варианте антитело или фрагмент антитела согласно изобретению имеет IC₅₀ блокирования 25 пМ hIL-4R или меньше чем примерно 50 пМ, или меньше чем примерно 40 пМ, или меньше чем примерно 30 пМ, или меньше чем примерно 20 пМ на основании измерений в ELISA.

Пример 4. Нейтрализация биологического действия hIL-4 in vitro

Путь опосредованной IL-4 сигнальной трансдукции подробно описан в литературе (например, смотри обзор Hebenstreit et al. 2006 Cytokine Growth Factor Rev.17(3): 173-88, 2006). IL-4 может стимулировать два рецепторных комплекса, типа I и типа II. Комплексы рецепторов типа I образуются в результате связывания IL-4 с IL-4R и последующей гетеродимеризации с общей гамма-цепью. Альтернативно комплекс IL4/IL4R может гетеродимеризоваться с рецептором 1 IL-13 с образованием рецепторных комплексов типа II. Комплексы типа I и типа II передают сигнал главным образом через STAT6. Поэтому оценивали способность отобранных антител блокировать передачу сигнала через STAT6, как описано ниже.

Создали линию клеток с высокой чувствительностью к hIL-4 и hIL-13. Клетки HEK293 стабильно трансфицировали STAT6 человека и плазмидой с репортером люциферазой для STAT6 и поддерживали в среде роста (DMEM, 10% FBS, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин). Сильный опосредованный рецептором IL-4 ответ достигали, когда добавляли 10 пМ hIL-4 в среду роста STAT6-трансфицированных клеток HEK293. Для биологического анализа ответа hIL-4 клетки промывали один раз в срезе для анализа (Optimem I (Gibco) плюс 0,1% FBS) и высевали по 1×10⁴ клеток/лунку (96-луночный планшет) в 80 мкл среды для анализа. Очищенные антитела серийно разводили в среде для анализа (конечные концентрации в диапазоне от 20 нМ до 0) и 10 мкл каждого из тестируемых антител добавляли к клеткам вместе с 10 мкл hIL-4 (фиксированная конечная концентрация 10 пМ). Затем клетки инкубировали при 37ºC, 5% CO₂ в течение 6 часов. Степень ответа клетки измеряли в анализе люциферазы (Promega Biotech). Результаты показаны в таблице 4.

Ингибирование зависимой от IL-4 биологической активности in vitro также подтверждали, используя либо клеточную линию эритробластов человека, TF1, либо модифицированную линию клеток TF1, сверхэкспрессирующих IL-13Rα (TF1/A12). В таком биоанализе 20000 клеток высевали в каждую лунку 96-луночного планшета в среду RPMI 1640, содержащую 10% FBS, 2 мМ L-глутамин и пенициллин и стрептомицин. Двадцать пять микролитров очищенных антител в диапазоне от 0 до 50 нМ (конечная концентрация) добавляли вместе с 25 мкл рекомбинантного белка hIL-4 до конечной концентрации либо 50 пМ в случае линии клеток TF1, либо 20 пМ в случае линии клеток TF1/A12. Затем клеткам давали возможность расти в течение 3 дней при 37ºC и конечное количество клеток измеряли, используя набор CCK8 (Dojindo, Japan). Способность антител блокировать рост клеток TF-1 показана в таблице 4 в виде концентрации антитела, необходимой для достижения 50% снижения пролиферации клеток.

Пример 5. Нейтрализация биологического действия hIL-13 in vitro

Так как показано, что IL-4R является модулятором активности IL-13 посредством его связывания с комплексом IL-13/IL-13R, то отобранные антитела тестировали в отношении их способности блокировать активность IL-13, используя модифицированный анализ STAT6-люциферазы HEK293, описанный выше, при этом модификация заключалась в замене 10 пМ IL-4 на 40 пМ hIL-13. Антитела также оценивали в отношении эффективности блокирования активности hIL-13 в анализе линии клеток TF-1, описанной выше, используя hIL-13 в концентрации 150 пМ в присутствии 0-50 нМ антител. Результаты показаны в таблице 5.

Пример 6. Оценка профиля связывания антитела

Профиль связывания антитела можно установить, определяя влияние, которое антитело (связанное со своим антигеном) может оказывать на способность панели разных антител впоследствии связывать тот же самый антиген. Например, антиген может быть иммобилизован на подложке с образованием покрытой антигеном поверхности, покрытая антигеном поверхность может быть насыщена антителом и затем покрытая антигеном и насыщенная антителом поверхность может быть подвергнута воздействию панели других антител. Степень связывания панели других антител с покрытой антигеном и насыщенной антителом поверхностью дает профиль связывания антитела. Основанные на OCTET^TM анализы последовательного связывания использовали для получения профиля связывания антител. Коротко, группу из 24 биосенсоров FA, содержащих стрептавидин, с высокой эффективностью связывания (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) сначала инкубировали с антигеном, биотин-hIL-4R-hFc, в концентрации 2 мкг/мл в течение 10 мин при 30ºC, чтобы достичь насыщения, и количество связанного антигена измеряли в виде изменения толщины (нм) биологического слоя за счет связанного белка, которое непосредственно измеряли по сдвигу длины волны. Связанные с биотин-hIL-4R-hFc биосенсоры затем инкубировали с первым антителом (контрольное антитело) в концентрации 50 мкг/мл в течение 15 мин при 30ºC, чтобы достичь насыщения, и количество связанного контрольного антитела измеряли в виде изменения толщины (нм) биологического слоя. Каждый биосенсор, связанный с контрольным антителом, затем инкубировали с одной из панелей из 24 разных анти-hIL-4R-антител (второе антитело) в концентрации 50 мкг/мл в течение 15 мин при 30ºC, и количество связанного второго антитела измеряли в виде изменения толщины биологического слоя. Такой же анализ повторяли, используя в качестве первого антитела анти-hIL-4R-антитело либо VAB16F3-1, либо VAK5H4-4. Результаты показаны на фиг. 1A-C.

Отобранные анти-hIL-4R-антитела также оценивали с использованием Вестерн-блота (данные не показаны). Коротко, мономер hIL-4R (200 нг на дорожку) и His-меченый мономер mfIL-4R (200 нг на дорожку) подвергали электрофорезу в SDS-ПААГ-гелях, используя как восстанавливающий, так и невосстанавливающий буфер для образцов. Каждый из четырех отдельных гелей переносили на PVDF-мембрану и каждую мембрану подвергали воздействию одного из четырех первых антител: анти-His-мAb (Qiagen), VAB 16F3-1, VAK 5H4-4 или контрольного анти-hIL-4R-антитела, используя в качестве второго антитела либо конъюгированное с HRP антитело козы против mIgG, либо антитело против hIgG (Pierce). Все три анти-hIL-4R-антитела узнавали невосстановленную форму hIL-4R. Только VAB 16F3-1 и VAK 5H4-4 выявляли восстановленную форму hIL-4R. Ни одно из анти-hIL-4R-антител не выявляло IL-4R обезьяны.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают hIL-4R с K_D менее 200 пМ, измеренной с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело и вектор на ее основе для получения антитела. Раскрыты система хозяин-вектор для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и способ получения перечисленных веществ с использованием такой системы. Описано применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для ослабления (ингибирования) заболеваний, опосредованных активностью hIL-4R. Раскрыта композиция на основе антитела или антигенсвязывающего фрагмента для использования в способе лечения заболевания или нарушения, опосредованного активностью hIL-4R у человека. Предложенные изобретения могут найти применение в терапии заболеваний, опосредованных активностью hIL-4R. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают hIL-4R (SEQ ID N0:1) с K_D, составляющей примерно 200 пМ или меньше, которую измеряют, используя поверхностный плазменный резонанс, содержащие последовательности HCVR/LCVR, выбранные из 579/59 и 581/59.

2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которые проявляют K_D в отношении hIL-4R (SEQ ID N0:1), составляющее меньше чем 150 пМ.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которые проявляют K_D в отношении hIL-4R (SEQ ID N0:1), составляющее меньше чем 50 пМ.

4. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов.

5. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.4, для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, которые специфично связывают рецептор IL-4.

6. Система хозяин - вектор для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, которые специфично связывают рецептор IL-4, содержащая вектор по п.5 в подходящей клетке-хозяине.

7. Система хозяин - вектор по п.6, в которой клетка-хозяин является прокариотической или эукариотической клеткой, выбранной из E.coli или клетки СНО.

8. Способ получения анти-IL-4R-антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий выращивание клеток системы хозяин - вектор по п.6 или 7 в условиях, обеспечивающих продукцию антитела или его фрагмента, и выделение экспрессированного таким образом антитела или фрагмента.

9. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-3 в производстве лекарственного средства для применения с целью ослабления или ингибирования опосредованного IL-4 заболевания или нарушения у человека.

10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3 для применения в способе лечения заболевания или нарушения у человека, в котором заболевание или нарушение улучшается, ослабляется или ингибируется посредством удаления, ингибирования или снижения активности интерлейкина-4 человека (hIL-4).

11. Применение по п.9, в котором заболевание или нарушение выбрано из артрита, герпетиформных заболеваний, хронической идиопатической крапивницы, склеродермы, гипертрофического рубцевания, болезни Уиппла, доброкачественной гиперплазии простаты, легочных нарушений, воспалительных нарушений, аллергических реакций, болезни Кавасаки, серповидно-клеточного заболевания, синдрома Черджа-Стросс, диффузного токсического зоба, преэклампсии, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза, атопического дерматита, язвенного колита, фиброза и нефроза.

12. Применение по п.11, в котором указанное легочное нарушение представляет собой астму, указанное воспалительное нарушение представляет собой воспалительное заболевание кишечника или указанный артрит представляет собой септический артрит.

13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где заболевание или нарушение выбрано из артрита, герпетиформных заболеваний, хронической идиопатической крапивницы, склеродермы, гипертрофического рубцевания, болезни Уиппла, доброкачественной гиперплазии простаты, легочных нарушений, воспалительных нарушений, аллергических реакций, болезни Кавасаки, серповидно-клеточного заболевания, синдрома Черджа-Стросс, диффузного токсического зоба, преэклампсии, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза, атопического дерматита, язвенного колита, фиброза и нефроза.

14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.13, где указанное легочное нарушение представляет собой астму, указанное воспалительное нарушение представляет собой воспалительное заболевание кишечника или указанный артрит представляет собой септический артрит.

15. Композиция, содержащая эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3 и приемлемый носитель для применения в способе лечения заболевания или нарушения у человека, в котором заболевание или нарушение улучшается, ослабляется или ингибируется посредством удаления, ингибирования или снижения активности интерлейкина-4 человека (hIL-4).