СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ ПОСТИШЕМИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/30 A61P13/12 

Способ относится к области медицины, а именно к урологии, хирургии и регенеративной медицине. Многие операции на почке требуют временного пережатия почечных сосудов (нефролитотомия, резекция почки, реконструкция почечной артерии при вазоренальной гипертонии), что может приводить к нарушению функционального состояния органа. При подобных операциях на единственной почке в послеоперационном периоде возможно развитие острой почечной недостаточности (ОПН), создающей значительную угрозу жизни пациента. Кроме того, при развитии тяжелых инфекционных осложнений при ряде урологических заболеваний (обструктивный пиелонефрит, острый абсцедирующий простатит) или после хирургических операций может приводить к развитию инфекционно-токсического шока и/или сепсису, что также чревато развитием ОПН. В этих случаях ишемический фактор также играет важную патогенетическую роль в связи со снижением артериального давления и нарушением почечной микроциркуляции.

Лечение больных с развившейся ОПН предусматривает осуществление комплекса мероприятий в рамках интенсивной терапии вплоть до проведения гемодиализа. В связи с развитием современных направлений в медицине, основанных на клеточных технологиях и стимуляции регенерации клеточных структур поврежденных органов (регенеративная медицина) интенсивно изучается возможности профилактики и лечения ОПН с использованием стволовых клеток или продуктов их жизнедеятельности. При этом изучается возможность использования эмбриональных, фетальных стволовых или прогениторных клеток, а также стволовых клеток взрослого организма. При этом стволовые/прогениторные клетки получают из разных источников - костного мозга, органов эмбрионов или плодов, а также подкожной жировой ткани (Maeshima А, Nakasatomi М, Nojima Y. Regenerative medicine for the kidney: Renotropic factors, renal stem/progenitor cells, and stem cell therapy. Biomed Res Int 2014; 2014:595493. Doi: 10.1155/2014/595493)

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ лечения острой или хронической почечной недостаточности с использованием стволовых клеток костного мозга или почки подов. В соответствии с этим способом предварительно выделенные и затем культивированные в питательной среде стволовые клетки плодов вводятся непосредственно в поврежденную почку (Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю. и др. Функциональные последствия интрапаренхиматозного введения фетальных стволовых и прогениторных клеток человека при хронической и острой почечной недостаточности у крыс. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. №2. С. 70-76) или внутривенно (Kirpatovskii V.I., Kazachenko A.V., Plotnikov E.Y. et al. Experimental intravenous cell therapy of acute and chronic renal failure. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. Vol. 143, N 1. P. 160-165).

Недостатками этого способа являются необходимость длительного культивирования плодных клеток для получения достаточного количества клеточного материала, необходимость наличия дорогостоящих оборудования и реактивов, а также специально обученного персонала. Кроме того, инъекция клеток непосредственно в почку является инвазивным вмешательством, требующим проведение анестезиологического пособия и хирургического вмешательства, что в условиях ОПН создает дополнительные риски. Немаловажным фактором являются этические и юридические проблемы использования плодного материала для получения стволовых клеток.

Заявляемый способ позволяет избежать этих недостатков. Так как основан на том, что по данным многих авторов эффект клеточной терапии достигается не за счет включения пересаженных клеток в поврежденные структуры органа, а за счет действия секретируемых этими клетками гуморальных факторов (цитокинов, хемокинов, факторов роста, ангиогенных факторов), стимулирующих регенерацию, которые объединены термином «секретом стволовых клеток» (Bi В, Schmitt R, Israilova М. et al. Stromal cells protect against acute tubular injury via an endocrine effect. J Am Soc Nephrol. 2007; 18(9):2486-96). Использование продуктов секреции или метаболизма стволовых клеток позволяет достичь таких же результатов, что и при использовании самих клеток (van Koppen A, Joles JA, van Balkom BW et al. Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescues kidney function in rats with established chronic kidney disease. PLoS One 2012; 7(6):e38746. doi: 10.1371/journal.pone.0038746, Lavoie JR, Rosu-Myles M. Uncovering the secretes of mesenchymal stem cells. Biochimie 2013; 95(12):2212-21. Doi: 10.1016/j.biochi.2013.06.017).

Техническим результатом заявленного способа является повышение эффективности и безопасности профилактики и лечения острой почечной недостаточности за счет стимуляции регенераторных процессов в почке при использовании секретома эмбриональных тканей животных (продуктов секреции стволовых клеток эмбриональных тканей).

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что, также как и в известном способе, вводят стволовые клетки или продукты их жизнедеятельности.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что комплекс биологических активных пептидов и белков с молекулярной массой от 10 до 250 кДа, хроматографически выделенный из тканей эмбрионов животных или головного мозга эмбрионов свиньи, вводят подкожно накануне или в день операции в дозе 0,015-0,1 мл/кг, с последующим ежедневным введением в течение 10 дней.

В заявленном способе используют белково-пептидный комплекс, выделенный из тканей эмбрионов животных, в частности головного мозга эмбрионов свиньи (секретом стволовых клеток эмбриональных тканей), являющийся активным компонентом фармакопейного препарата «Целлекс». Данный комплекс содержит биологически активные пептиды и белки с молекулярной массой от 10 до 250 кДа, хроматографически выделенные из тканей эмбрионов животных или головного мозга эмбрионов свиньи, относящиеся к группам факторов роста и клеточной дифференцировки и ангиогенных факторов, производимых стволовыми клетками ткани эмбрионов, которыми она богата. Их концентрация в экстракте существенно выше, чем та, которая достигается в ткани вокруг имплантированных клеток, поскольку комплекс производимых ими активных метаболитов находится в концентрированном виде. Следует также учитывать, что при клеточной трансплантации не все сигнальные белковые или пептидные молекулы, способные стимулировать регенерацию клеточных структур, могут выделяться в окружающие ткани в связи с большой молекулярной массой и селективной проницаемостью клеточных мембран, тогда как в белково-пептидном комплексе, выделенном из эмбриональной ткани они присутствуют в полном спектре. В связи с высокой концентрацией биологически активных веществ и их высокой растворимостью при парентеральном введении, в том числе с помощью подкожных или внутримышечных инъекций, компоненты препарата могут через кровеносную систему достигать органа-мишени в биологически значимой концентрации, что позволяет избежать необходимости введения препарата непосредственно в почку, то есть исключить инвазивный характер терапии. Важным моментом для достижения значимого терапевтического эффекта является длительность лечебного воздействия. При терапии стволовыми клетками длительность их влияния определяется сроком сохранения жизнеспособности клеток после пересадки, который относительно короткий в связи с элиминацией введенных генетически чужеродных клеток иммунной системой организма. Имеются данные, что через 7 суток после введения стволовых клеток в почку жизнеспособными остаются лишь единичные клетки (Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Надточий О.Н. Перспективы использования стволовых клеток в лечении острой и хронической почечной недостаточности. Урология. 2007. №6. С. 82-87). При использовании заявляемого способа имеется возможность неоднократных повторных инъекций препарата, то есть курсовой терапии необходимой длительности.

Изобретение поясняется подробным описанием, таблицами, экспериментальными примерами и иллюстрацией, на которой изображено: а) гипертрофированный клубочек в почке крыс, леченых белково-пептидным секретомом эмбриональной ткани; б) сморщенный клубочек в почке крысы контрольной группа; в) делящиеся клетки канальцевого эпителия (указаны стрелкой).

Способ осуществляют следующим образом.

С целью профилактики развития ОПН в тех случаях, когда имеется риск ее развития, препарат белково-липидного комплекса эмбриональной ткани животных, в частности головного мозга, вводят подкожно накануне или в день операции в дозе 0,015-0,1 мл/кг (0,02-0,1 мг активных веществ) с последующим ежедневным подкожным введением препарата в той же дозе в течение 10 дней. В случае уже развившейся ОПН препарат вводят сразу же после установления диагноза подкожно в дозе 0,015-0,1 мл/кг и дальше ежедневно в той же дозе в течение 10 дней. При необходимости курс терапии повторяют.

Эффективность заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Стимуляция регенерации почки при моделировании ОПН с использованием белково-пептидного секретома эмбриональной ткани головного мозга свиньи.

У 10 крыс моделировали ОПН путем односторонней нефрэктомии и пережатием сосудистой ножки оставшейся почки на 60 минут с последующим восстановлением ее кровоснабжения. В контрольной серии (5 крыс) никакой терапии не проводили, а в опытной серии (5 крыс) ежедневно со дня операции подкожно вводили белково-пептидный комплекс, выделенный из головного мозга эмбрионов свиньи в течение 10 дней в дозе 0,1 мл/кг (0,03 мл на крысу). Через 14 суток удаляли оставшуюся почку и определяли ее массу взвешиванием и проводили гистологическое исследование удаленного органа.

Определение степени гипертрофии ишемизированной почки показало, что ее масса к 14-м суткам постишемического периода в контрольной серии (без терапии) возросла с 1,56±0,07 г (средняя масса одной интактной почки) до 1,80±0,05 г (на 13,4%), тогда как при терапии белково-пептидным секретомом масса почки увеличилась до 2,55±0,06 г (на 48,2%). Различия между группами оказались статистически высокодостоверными при р<0,001. При гистологическом исследовании препаратов удаленной почки оказалось, что в опытах с терапией белково-пептидным секретомом более половины клубочков были гипертрофированы, тогда как в контрольной серии более 1/3 клубочков были в коллабированном состоянии с признаками начинающегося гломерулосклероза (См. Фиг. а, б). В отдельных канальцах почек крыс, леченых белково-пептидным секретомом эмбриональной ткани выявляли делящиеся клетки эпителия почечных канальцев (См. Фиг. в), тогда как в контрольной серии этого не наблюдали.

Данный пример подтверждает, что терапия белково-пептидным секретомом ткани головного мозга эмбрионов свиньи стимулирует пролиферацию клеток почечных клубочков и регенерацию канальцевого эпителия в поврежденной ишемией почке и способствует более выраженной гипертрофии органа в условиях повышенной функциональной нагрузки.

Пример 2.

Стимуляция восстановления функции почек крыс с моделированной ОПН с помощью белково-пептидного секретома, выделенного из ткани головного мозга эмбрионов свиньи.

У 24 крыс-самцов моделировали ОПН путем односторонней нефрэктомии и пережатием сосудистой ножки оставшейся почки на 60 или 90 минут. В 1-й и 2-й группах (по 6 крыс в каждой) при ишемии 60 или 90 минут соответственно никакой терапии не проводили. В 3-й и 4-й сериях (по 6 крыс в каждой группе) при ишемии 60 или 90 минут соответственно ежедневно со дня операции подкожно вводили белково-пептидный секретом, выделенный из головного мозга эмбрионов свиньи в течение 10 дней в дозе 0,03 мл на крысу. Через 3, 7 и 14 дней после моделирования ОПН животных помещали на сутки в обменные клетки для сбора суточной мочи и брали пробы крови из хвостовой вены. Проводили биохимический анализ крови и мочи с определением концентрации мочевины, креатинина, натрия и кальция, на основе которых рассчитывали показатели, характеризующие функциональное состояние ишемизированной почки.

Анализ показал, что у всех животных развилась ОПН, что проявлялось в выраженном снижении клубочковой фильтрации, достоверным снижением канальцевой реабсорбции натрия и кальция, а также суточной экскреции креатинина (таблица 1). Наиболее выраженные изменения обнаружены у крыс 2-й группы. В опытных сериях (3-я и 4-я серии, терапия белково-пептидным секретомом) происходило более быстрое восстановление этих показателей. Клубочковая фильтрация уже к 7-м суткам приближалась к нормальным значениям, а через 14 суток даже в 3-й группе превышала их, тогда как в контрольных группах нормализации этого показателя не происходило. Значения канальцевой реабсорбции натрия и кальция также были выше у крыс, леченых белково-пептидным секретомом по сравнению с контрольными группами.

Таким образом, терапия крыс с ОПН белково-пептидным секретомом, выделенным из эмбрионального головного мозга свиньи, в соответствии с заявляемым способом способствует ускорению восстановления нарушенных функциональных показателей состояния почки как при ОПН средней степени тяжести (60-минутная ишемия), так и при тяжелой форме ОПН (90 минутная ишемия). Более быстро улучшалась как фильтрационная функция почек, так и реабсорбирующая функция почечных канальцев.

Пример 3.

Сравнение эффективности профилактики ОПН с использованием культивированных плодных мезенхимных стволовых клеток костного мозга (способ-прототип) и белково-пептидного секретома эмбриональных тканей (заявляемый способ).

У 18 крыс вызывали ОПН, удаляя правую почку и пережимая сосудистую ножку левой почки на 90 минут. В 1-й серии никакой терапии не проводили. Во 2-й серии сразу после снятия зажима и возобновления кровоснабжения почки в нее пункционно инсулиновым шприцом вводили 10⁶ культивированных мезенхимных клеток костного мозга плода человека. В 3-й серии аналогично вводили 10⁶ культивированных клеток плодной почки. В 4-й серии сразу после восстановления кровоснабжения в почке подкожно вводили белково-пептидный секретом, выделенный из головного мозга эмбрионов свиньи, в дозе 0,1 мл/кг с последующими ежедневными инъекциями препарата в течение 10 дней. Через 3 дня и 2 недели животных высаживали в обменные клетки для сбора суточной мочи и брали пробы крови из хвостовой вены с последующим биохимическим анализом крови и мочи и расчетом показателей функционального состояния почки, как описано в примере 2.

При оценке показателей функционального состояния почек выявили, что во всех 3 опытных сериях функциональные показатели менялись менее значительно, чем в серии без терапии (Таблица 2). Однако, в опытах с использованием заявляемого способа (4-я серия) восстановление функциональных показателей происходило более быстро, чем в опытах с использованием мезенхимных клеток костного мозга или почки плодов (2-я и 3-я серии). Наиболее выраженные различия выявлены на 3-й сутки после ишемического воздействия, когда по всем функциональным параметрам (диурез, концентрация мочевины и креатинина в крови, клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция натрия и кальция) в серии с терапией крыс белково-пептидным секретомом были получены достоверно лучшие результаты, чем при использовании обоих вариантов способа-прототипа.

При сравнении с использованием костномозговых мезенхимных клеток к 14 суткам после ишемии различия с заявляемым способом по большинству показателей исчезали, за исключением суточного диуреза и клубочковой фильтрации, которые были достоверно ближе к норме в опытах с использованием белково-пептидного секретома эмбриональных тканей.

Функциональные результаты использования клеток плодной почки оказались хуже, чем при использовании мезенхимных костномозговых клеток, и тем более хуже, чем при терапии белково-пептидным секретомом эмбриональных тканей.

Данный пример иллюстрирует преимущества заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом в отношении быстроты и полноценности восстановления функциональных показателей почки при развитии постишемической ОПН.

Пример 4.

Доказательство возможности лечения постишемической ОПН с использованием заявляемого способа.

У 12 крыс моделировали постишемическую ОПН, как описано в предыдущих примерах. У 6 из них никакой терапии не проводили (1-я группа), а у других 6 животных, начиная с 3-х суток, после установления биохимических показателей, характерных для ОПН, ежедневно в течение 10 дней подкожно вводили белково-пептидный секретом, выделенный из головного мозга эмбрионов свиней в дозе 0,1 мл/кг (2-я группа). Определяли биохимические показатели функционального состояния почек на 3-й сутки (начало терапии) и через 14 суток (окончание терапии). Результаты показали, что при исходно одинаковой степени ухудшения функции почки на 3-й сутки после моделирования ОПН на фоне терапии белково-пептидным секретомом тканей эмбрионов свиньи к 14-м суткам происходит достоверно более полноценное восстановление всех функциональных показателей по сравнению с контрольной серией (без терапии) (Табл. 3).

Представленные результаты свидетельствуют, что терапия белково-пептидным секретомом эмбриональных тканей свиньи после развития ОПН так же, как и при профилактическом введении этого препарата, способствует более полноценному восстановлению функционального состояния почки.

Таким образом, все представленные примеры свидетельствуют о высокой эффективности заявляемого способа в отношении профилактики и лечения постишемической ОПН за счет стимуляции регенерации поврежденных почечных структур (как клубочков, так и канальцев) и ускорения восстановления функциональной полноценности органа. Заявляемый способ имеет существенные преимущества перед другими, в частности введения культивируемых стволовых клеток в поврежденную почку или внутривенно, поскольку обеспечивает более высокие функциональные результаты, не требует длительного культивирования стволовых клеток при возможности немедленного использования готового препарата.

Представленный способ обеспечивает профилактику развития острой почечной недостаточности терапию белково-пептидным комплексом эмбриональных тканей, которую начинают заблаговременно при угрозе развития острой почечной недостаточности. Причем с целью лечения развившейся острой почечной недостаточности терапию белково-пептидным комплексов эмбриональных тканей свиньи начинают сразу же после установления диагноза ОПН и проводят в течение 10 дней.

Использование заявляемого способа позволяет добиться более быстрого и более полноценного восстановления функции поврежденных почек, исключает дорогостоящий и длительный этап их культивирования, а также позволяет устранить существующие этические и юридические ограничения.

Изобретение относится к медицине, а именно к области регенеративной медицины, и может быть использовано с целью профилактики и лечения острой почечной недостаточности. Комплекс биологических активных пептидов и белков с молекулярной массой от 10 до 250 кДа, представляющий собой активный компонент фармакопейного препарата «Целлекс», хроматографически выделенный из тканей эмбрионов животных или головного мозга эмбрионов свиньи, вводят подкожно перед операцией в дозе 0,015-0,1 мл/кг, с последующим ежедневным введением в течение 10 дней. Использование заявляемого способа позволяет добиться более быстрого и более полноценного восстановления функции поврежденных почек по сравнению с использованием культивирования стволовых клеток, исключает дорогостоящий и длительный этап их культивирования. 3 табл., 4 пр., 1 ил.

Способ профилактики и лечения острой постишемической почечной недостаточности при операции на почке, включающий введение стволовых клеток или продуктов их жизнедеятельности, отличающийся тем, что комплекс биологических активных пептидов и белков с молекулярной массой от 10 до 250 кДа, представляющий собой активный компонент фармакопейного препарата «Целлекс», хроматографически выделенный из тканей эмбрионов животных или головного мозга эмбрионов свиньи, вводят подкожно перед операцией в дозе 0,015-0,1 мл/кг, с последующим ежедневным введением в течение 10 дней.