Способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния Российский патент 2024 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, микробиологии и микробной экологии, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биологии, научных исследованиях.

Длительное хранение жизнеспособных микроорганизмов является необходимым элементом многих технологий в области медицины, биологии, сельского хозяйства. В настоящее время разработаны достаточно эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие у них сохранение жизнеспособности, генетической и фенотипической стабильности. Во всех случаях выбор способа сохранения (консервирования) конкретного объекта основывается на сохранении микроорганизмами жизнеспособности, морфологических, физиологических, биохимических и генетических характеристик с учетом максимально возможного времени их хранения, а также надежности реализации используемого метода при хранении микроорганизмов в течение длительного времени. В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют методы пересева, лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации (Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие, Том 3, Клиническая микробиология под редакцией В.В. Меньшикова. М.: Лабора, 2009. - 879 с).

Наиболее надежными, удобными и обеспечивающими длительные сроки хранения микроорганизмов и биологического материала методами являются криоконсервация и лиофилизация, а также эти методы обеспечивают возможность сохранения высокой биохимической активности и генетической стабильности микроорганизмов (В. Д. Похиленко. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 (12). - С.99-121).

Сохранение жизнеспособности микроорганизмов в течение длительного периода времени является сложной задачей, особенно в случае облигатно анаэробных бактерий.

Из уровня техники известно несколько направлений повышения эффективности сохранения жизнеспособных культур бактерий, входящих в состав иммунобиологических и пробиотических препаратов. Известны технические решения, которые с этой целью используют различные способы культивирования микроорганизмов, их хранения и консервирования с применением различных стабилизирующих растворов, защитных сред, гелей с использованием охлаждения при высоком давлении, а также устройства для реализации способа позволяющего осуществлять криоконсервацию с высоким процентом выживаемости микроорганизмов.

Известно, что при периодических пересевах используют свежие питательные среды и пересевы проводят один-два раза в месяц, что приводит к снижению активности продуцентов биологически важных веществ. Существенными недостатками метода считаются возможность заражения, краткосрочность хранения, а также трудоемкость работы и расход реактивов, входящих в состав питательных сред, в больших количествах (Промышленная микробиология. /Под ред. Н. С. Егорова. М., 1989, с. 149-167).

Известен способ хранения микроорганизмов на питательных средах под слоем вазелинового масла. Для этого микроорганизмы выращивают на физиологически соответствующей питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла при этом способствует замедлению скорости обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Недостаток этого способа заключается в том, что хранение под маслом вызывает задержку роста микробов (1,5-2 раза по сравнению с периодическими пересевами культур) и снижает скорость использования ими питательных субстратов, также в качестве недостатка можно отметить разбрызгивание масла при обжигании петли (Промышленная микробиология. /Под ред. Н. С.Егорова. М., 1989, с. 149-167 Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф Герхардта. М., 1983, т.16 с. 535.)

Лиофилизация является известным способом, рутинно применяемым в фармацевтической отрасли, в том числе в производстве вакцин, и применяется с целью удаления воды, содержащейся в материале, чтобы сделать материал более устойчивым при температуре окружающей среды и облегчить его сохранение. Лиофилизация обеспечивает большую стабильность для широкого круга микроорганизмов, в отличие от методов периодических пересевов. Метод лиофилизации удобен для практических целей, однако титр жизнеспособных клеток микроорганизмов после лиофилизации оказывается низким в результате применения защитных сред, и продолжает снижаться при хранении даже при +4°С, а также в результате процесса лиофилизации остаются жизнеспособными наиболее устойчивые клетки в культуре, которые могут и не обладать желаемыми свойствами. Консервация микроорганизмов считается успешной в том случае, когда микроорганизмы восстанавливают свою жизнеспособность с минимальной потерей в титре. Однако отклонение температуры от физиологических условий до субфизиологических условий и обратно может привести к повреждению клеток путем разнообразных механизмов, поэтому преодоление повреждений является основной задачей заявленного способа.

Для лиофилизации бактерий необходимы защитные среды, которые содержат сахара и белковые соединения (A.M. Белоус Криоконсерванты / A.M. Белоус, М.И. Шраго, Н.С. Пушкарь. - Киев: Наукова думка, 1979. -198 с. ). Без добавления таких веществ бактерии обычно лиофилизации не выдерживают.При использовании для лиофилизации суспензий клеток в воде или солевом растворе бактерии гибнут [5]. Известно, что находящиеся в защитных средах сахара, проникая в клетку и создавая там высокое осмотическое давление, препятствуют образованию кристаллов льда и разрушению клетки в процессе замораживания. Белковые компоненты защитной среды не проникают в клетку, но заставляют клеточную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании. Для предотвращения образования кристаллов льда проводят быстрое замораживание ампул. В немецкой национальной коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) в качестве защитной среды при лиофилизации бактерий используют снятое молоко. Относительно времени сохранения жизнеспособности лиофилизированных бактерий можно отметить, что в различных публикациях указаны сроки от 5 до 35 лет (Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения: пер. с англ. / О. Смит.- М., 1963. - 430).

Известен способ получения лиофилизата живой туляремийной вакцины RU 2716505 C1 20200312. Для этого используют в необходимой концентрации клетки F. tularensis штамма 15 НИИЭГ и вспомогательные вещества, в качестве консервантов используют трегалозу и декстран со средней молекулярной массой 30000-40000, полученную смесь разливают по 2 мл во флаконы, замораживают на полках сублимационной сушильной установки до температуры полного замерзания минус 35-45°С, выдерживают при ней 2-3 ч, осуществляют сублимационное высушивание при глубине вакуума (0,1±0,01) мбар со скоростью повышения температуры полок не более 5°С в час до температуры препарата 24-26°С, выдерживают при ней 1-2 ч, после чего герметизируют в условиях вакуума. Изобретение обеспечивает получение лиофилизата живой туляремийной вакцины, обеспечивающее требуемое качество вакцины и отличается от заявленного способа микроорганизмами, для которых предназначен способ консервации, условиями культивирования микроорганизмов, условиями и параметрами лиофилизации.

Известен патент США № US 4559298, в котором описан способ улучшенной криоконсервации биологических материалов, заключающийся в охлаждении биологического материала до стеклообразного состояния под давлением в присутствии водного раствора, содержащего криоконсервирующие агенты. Способ улучшения включает: (а) применение достаточного количества проникающих криоконсервантов с эквивалентным количеством непроникающих криоконсервантов для уменьшения повреждения биологического материала при криоконсервации, (б) обработку биологического материала раствором, криоконсервантов, со скоростью и продолжительностью до остекловывания, (в) воздействие давления, достаточного для остекловывания биологического материала при охлаждении без существенного зарождения или роста кристаллов льда и без значительного повреждения биологического материала.

Известен способ длительного хранения прихотливых бактерий (патент РФ 2535984), в частности, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, в консервированной крови путем замораживания, с использованием 18-24-часовой культуры, в стерильных пробирках из полипропилена с плотными крышками, отличающийся тем, что используют стерильную консервированную донорскую человеческую цельную кровь, бактериальные культуры замораживают в морозильной камере холодильника при -20°С, культуры для замораживания выращивают на физиологически соответствующих каждому микроорганизму питательных средах, культивирования бактерий с инкубацией в обычной атмосфере и в СО₂-инкубаторе.

Известны факты изменения структуры и физико-химических свойств микроорганизмов в результате замораживания-высушивания, уменьшение размеров лиофилизированных клеток, у отдельных штаммов микроорганизмов происходят задержка скорости роста и пигментообразования, снижение уровня антибиотической активностей или даже потеря отдельных признаков (Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф Герхардта. М., 1983, т.16 с. 535).

Известен способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- и бифидобактерий RU(11) 2272837. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов: лактобактерина, бифидумбактерина, ацилакта и др. Изобретение предусматривает комплексное использование нативного дрожжевого аутолизата в составе питательных и защитных сред для лиофилизации в количестве 5-25% от объема бактериальной суспензии. Защитная среда содержит обезжиренное молоко и нативный дрожжевой аутолизат, взятые в соотношении 1:(0,5-1). Изобретение обеспечивает унификацию сырья и процесса приготовления питательных и защитных сред, удешевление способа получения пробиотиков, повышает эффективность их производства. Изобретение отличается составом питательных и защитных сред, способом культивирования и процессом лиофилизации.

Ни один из приведенных выше аналогов не показал высокой эффективности длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния.

Достигаемый технический результат заявленного способа заключается в унификации процесса подготовки жизнеспособных бактериальных культур к лиофилизации, унификации защитных сред, самом процессе лиофилизации, минимизация потери бактериальных облигатно анаэробных микроорганизмов при проведении процесса лиофилизации до 0,01-0,02% за счет соблюдения анаэробных условий, что позволяет сохранить жизнеспособность (выживаемость) прихотливых микроорганизмов при консервации в течение длительного времени и повысить эффективность применения заявленного способа для научных и медицинских целей.

Указанный технический результат достигается тем, что способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния заключается в поверхностном культивировании штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂. Затем биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой в соотношении биомассы, снятой с 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 10⁹-10¹² клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, в качестве которой используют 20% обезжиренное молоко, разлитое во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂. Затем флаконы закрывают ватными пробками и далее проводят предварительную заморозку биомассы облигатно анаэробных бактериальных культур в защитной стабилизирующей среде в течении 16 часов при температуре минус 70°С, затем флаконы с бактериальной суспензии облигатно анаэробных бактерий помещают в предварительно охлажденную до минус 50°С лиофильную сушку, проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30°С в час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3°С в час и выдерживают при данной температуре в течении 48-72 часов, перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, затем через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой. В качестве защитной среды используют сахарозо-желатиновую среду, в количестве 20% от объема бактериальной суспензии.

Предлагаемый способ позволяет обеспечить сохранение жизнеспособных микроорганизмов, обеспечить высокий уровень их выживаемости, в том числе сохранить физиолого-биохимические свойства и исходный титр микроорганизмов в культуре, в течение 5 лет хранения.

Предлагаемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1

Было протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды 20% обезжиренного молока. Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показали, что все 34 культуры сохранили свою жизнеспособность в течение 5 лет хранения при использовании заявленного способа.

Пример 2

Протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды сахарозо-желатиновой среды. Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 2, показали, что все 34 культуры сохранили свою жизнеспособность в течение 5 лет хранения при использовании заявленного способа.

Пример 3

Протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды 5% водный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 3, показали, что культуры не сохранили жизнеспособность при использовании заявленного способа.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ длительного сохранения облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния. Используют поверхностное культивирование штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям, в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси N₂ - 80%, СО₂ - 10%, Н₂ - 10%). Биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой, в качестве которой используют обезжиренное молоко или сахарозо-желатиновую среду в количестве 20% от объема бактериальной суспензии, в соотношении 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 10⁹-10¹² клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, разлитой во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, затем флаконы закрывают ватными пробками и проводят их предварительную заморозку в защитной стабилизирующей среде в течение 16 часов при температуре минус 70°С путем перемещения в течение 5 минут из анаэробных условий в низкотемпературный морозильник. По истечении 16 часов флаконы с бактериальной суспензии облигатно анаэробных бактерий помещают в лиофильную сушку, которую предварительного охладили до минус 50°С, затем проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30 град/час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3 град/час и выдерживают при данной температуре в течение 48-72 часов. Перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, затем через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой. Способ позволяет унифицировать процесс подготовки жизнеспособных бактериальных культур к лиофилизации, унифицировать защитные среды и процесс лиофилизации, минимизировать потери бактериальных облигатно анаэробных микроорганизмов при проведении процесса лиофилизации до 0,01-0,02%. 3 табл., 3 пр.

Способ длительного сохранения и консервирования облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния, заключающийся в поверхностном культивировании штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям, в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, затем биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой в соотношении биомассы, снятой с 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 10⁹-10¹² клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, в качестве которой используют обезжиренное молоко или сахарозо-желатиновую среду, в количестве 20% от объема бактериальной суспензии, разлитые во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, после чего флаконы закрывают ватными пробками и далее проводят предварительную заморозку биомассы облигатно анаэробных бактериальных культур в защитной стабилизирующей среде в течение 16 часов при температуре минус 70°С, затем флаконы с бактериальной суспензией облигатно анаэробных бактерий помещают в предварительно охлажденную до минус 50°С лиофильную сушку, затем проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30°С в час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3°С в час и выдерживают при данной температуре в течение 48-72 часов, перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, а через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N₂, 10% СО₂, 10% Н₂, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой.