СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЖИВЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ У ЛЮДЕЙ И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения бактерийных препаратов, на основе лактобактерий, и может быть использовано при приготовлении лечебно-профилактических бактерийных препаратов, предназначенных для использования в медицинской практике и ветеринарии.

Известен способ получения препарата "Лактобактерин сухой" (ФС 42252ВС-89). Способ заключается в следующем. Посевной материал лактобацилл вносят в пробирки с 10,0 см³ среды МРС-1 и подращивают в течение 48 ч при температуре (37. . .39)^oС. Полученные таким образом бульонные культуры засевают в бутыли вместимостью 5,0 дм³ со стерильной жидкой питательной средой МРС-1 из расчета (0,3. ..0,5) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют в течение 48 ч при температуре (37...39)^oС. Приготовленные культуры смешивают с сахарозо-желатиновой средой высушивания в соотношении 1:1, замораживают со скоростью 0,005^oС•мин^-1, а затем сублимируют в течение 110 ч при температуре 37^oС. В 1 см³ регидратированного препарата содержится 0,86 млрд. молочнокислых бактерий. При хранении в течение 1 года сохраняется до 75% жизнеспособных микробов.

К недостаткам этого способа следует отнести невозможность получения данным способом высокой концентрации лактобацилл в биопрепарате, а также гибель не менее 25% микроорганизмов при хранении биопрепарата в течение 1 года. Указанные недостатки объясняются тем, что, во-первых, на этапе культивирования не удается достичь высокого выхода биомассы, во-вторых, при замораживании с очень низкой скоростью (0,005^oС•мин^-1) внутриклеточная вода не замерзает, увеличивается концентрация солевых растворов, что приводит к повреждению клеточных структур, и, в-третьих, длительное время высушивания (110 ч) замедляет процессы перехода бактерий в анабиотическое состояние, увеличивая тем самым долю мертвых клеток в готовом продукте.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения сухого препарата на основе живых лактобацилл для лечения и профилактики воспалительных заболеваний у крупного рогатого скота - (патент RU 2072655 V, от 27.01.1997). Способ заключается в следующем: музейные культуры лактобацилл, хранящиеся в лиофилизированном состоянии, засевают в пробирки с жидкой питательной средой МРС-1 и выращивают в течение 48 ч при температуре (37... 39)^oС. Лактобациллы из пробирок пересевают в матрацы со скошенной агаризованной питательной среды МРС-4. Через 48 ч полученный микробный газон смывают средой МРС-1 и используют для засева бутылей вместимостью 5,0 дм³. Лактобациллы вносят в бутыли из расчета (0,7...1,0) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют при температуре (37...39)^oС. К выращенным культурам стерильно добавляют пептон до конечной концентрации 5%(вес/объем) и разливают в пенициллиновые флаконы по 2,0 см³. Флаконы помещают в сублимационную камеру. Замораживание ведут со скоростью 1^oС•мин^-1 до минус (40...42)^oС и выдерживают при этой температуре (75...85) мин. Затем создают разрежение 0,7...1,3 мм рт.ст. Подводят тепло и подогревают культуру со скоростью (2... 4)^oС•мин^-1 до (24...25)^oС. Досушивание ведут в течение (7...10) ч. По окончании процесса флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками. В 1 см³ целевого продукта после регидратации содержится не менее 5,0 млрд. живых клеток.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести: 1) вариабельность концентрации живых микробов во флаконах одной серии препарата (50...60)%; 2) высокую гибель микробов при высушивании биопрепарата и при хранении в течение (1. ..2) лет. Указанные недостатки объясняются тем, что: 1) розлив во флаконы осуществляется ручным встряхиванием бутыли с полуфабрикатом, при этом его гомогенизации не происходит, что приводит к большому расхождению значений содержания живых микробов во флаконах одной серии, а также к нестандартности внешнего вида готового препарата; 2) применяемая защитная среда содержит большое количество гетерогенного белка - пептона (5% вес/объем), обладающего высокой гидрофильностью, и не имеет в своем составе веществ, снижающих ее, что приводит к повреждению клеточных структур при замораживании, увеличивая долю мертвых клеток в готовом препарате, а также к вспениванию во время сублимации.

Задачей изобретения является получение бактерийного препарата в форме таблетки с минимальным расхождением в концентрации живых микробов во флаконах одной серии, снижение гибели микробов при высушивании и увеличение срока хранения препарата.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемый способ получения бактерийного препарата на основе лактобацилл, предусматривающий получение биомассы клеток глубинным культивированием в жидкой питательной среде, ее замораживание и сублимационное обезвоживание, внесены следующие отличия:
1. Перед замораживанием к биомассе лактобацилл добавляют полиглюкин до конечной концентрации 1,5% (вес/объем).

2. Розлив микробной суспензии во флаконы осуществляют при постоянной работе перемешивающего устройства аппарата (скорость вращения мешалки - (0,3...0,5) об•(об•мин^-1).

3. Замораживание осуществляют со скоростью 2^oС•мин^-1.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. Музейные культуры штаммов лактобацилл, хранящиеся в лиофилизированном состоянии, засевают в пробирки с жидкой питательной средой МРС-1 и раздельно выращивают в течение 48 ч при температуре (37. ..39)^oС. Лактобациллы из пробирок пересевают в матрацы со скошенной агаризованной МРС-4. Через 48 ч полученный микробный газон смывают средой МРС-1 и используют для засева бутылей вместимостью 5,0 дм³. Лактобациллы вносят в бутыли из расчета (0,7...1,0) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют при температуре (37...39)^oС. Раздельно выращенные культуры двух штаммов лактобацилл объединяют в емкости с перемешивающим устройством, стерильно добавляют полиглюкин до конечной концентрации 1,5%(вес/объем) и разливают по 2,0 см³ в пенициллиновые флаконы при постоянной работе мешалки со скоростью (0,3...0,5) об•(об•мин^-1). Флаконы помещают в сублимационную камеру. Замораживание ведут со скоростью 2^oС•мин^-1 до температуры минус (30...35)^oС и выдерживают при этой температуре (75...85) мин. Затем при помощи вакуумного насоса создают разрежение в камере (0,7...1,3) мм рт.ст. Подводят тепло и подогревают культуру со скоростью (2...4)^oС•мин^-1 до 28^oС. Досушивание ведут в течение (7...10) ч. По окончании процесса флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками. В 1 см³ целевого продукта после регидратации содержится не менее 5 млрд. живых лактобацилл.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет получать бактерийный препарат с концентрацией не менее 5,0 млрд. жизнеспособных лактобацилл в 1 см³. Обеспечивает сохранение структуры микробных клеток, тем самым повышая долю живых микробов при хранении препарата в течение 1 года или увеличивая срок хранения препарата до 2 лет.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Доказательство эффективности среды высушивания и режима замораживания
Для проведения исследования использовали нативные культуры штаммов лактобацилл, выращенные в бутылях емкостью 5,0 дм³. Сублимационное обезвоживание проводили по условиям прототипа и объекта. В высушенных препаратах после регидратации определяли количество живых клеток, для этого по одной и той же методике отбирали одинаковые по массе пробы, после регидратации которых проводили определение количества живых клеток методом последовательных разведении. Выживаемость рассчитывали из отношения концентраций жизнеспособных клеток до и после сублимационного обезвоживания. Выживаемость лактобацилл в препарате при хранении рассчитывали из отношения концентрации жизнеспособных клеток сразу после высушивания и через 1, 2 года хранения при температуре минус (18...22)^oС. Полученные результаты, представленные в таблице 2, показывают, что выживаемость лактобацилл при высушивании с использованием защитной среды и режимов сублимации по заявляемому способу достоверно превышают показатели прототипа в 1,3 раза, а выживаемость лактобацилл в препарате при хранении в течение 1 года и 2 лет - в 1,25 и в 1,5 раза соответственно.

Пример 2. Доказательство эффективности условий розлива полуфабриката.

Для проведения исследования использовали нативные культуры штаммов лактобацилл, выращенные в бутылях емкостью 5,0 дм³. Розлив полуфабриката во флаконы осуществляли по условиям прототипа и объекта. Препарат высушивали. У высушенных препаратов оценивали внешний вид и после регидратации определяли в них количество живых клеток, для этого по одной и той же методике отбирали одинаковые по объему пробы, после регидратации которых проводили определение количества живых клеток методом последовательных разведении. Полученные результаты, представленные в таблице 3, показывают, что при соблюдении условий розлива по заявляемому способу препарат во флаконах стабильно имеет вид таблетки серовато-белого цвета с желтоватым оттенком, с расхождением в концентрации живых клеток не более 10,0%, при аналогичных характеристиках препарата по прототипу: внешний вид - неоформленная масса темно-коричневого цвета, расхождение в концентрации живых клеток - (50...60)%.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения бактерийных препаратов на основе лактобактерий, и может быть использовано при приготовлении лечебно-профилактических бактерийных препаратов, предназначенных для использования в медицинской практике и ветеринарии. Способ получения бактерийного препарата на основе лактобацилл предусматривает получение биомассы клеток глубинным культивированием в жидкой питательной среде, ее замораживание и сублимационное обезвоживание, при этом перед замораживанием к биомассе лактобацилл добавляют полиглюкин до конечной концентрации 1,5% (вес/объем), розлив микробной суспензии во флаконы осуществляют при постоянной работе перемешивающего устройства аппарата (скорость вращения мешалки - (0,3-0,5) об•(об•мин^-1), а замораживание осуществляют со скоростью 2^oС•мин^-1. Технический результат: получение бактерийного препарата в форме таблетки с минимальным расхождением в концентрации живых микробов во флаконах одной серии, снижение гибели микробов при высушивании и увеличение срока хранения препарата. 2 табл.

Способ получения сухого препарата на основе живых лактобацилл для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии у людей и животных, включающий раздельное выращивание двух штаммов лактобацилл на плотных и в жидких питательных средах, смешивание культур в соотношении 1:1 и их высушивание, отличающийся тем, что в качестве криопротектора используется полиглюкин в конечной концентрации 1,5%, розлив микробной суспензии во флаконы осуществляется из аппарата при постоянной работе его перемешивающего устройства, замораживание осуществляется со скоростью 2°С·мин^-1.