Способ выделения лимфацитов и гранулоцитов Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии, и касается выделения лимфоцитов и гранулоцитов из периферической крови.

Известен способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования дефибрилированной крови в градиенте плотности фиколл - верографин, причем выделение гранулоцитов следует за выделением лимфоцитов и характеризуется большой примесью эритроцитов в гранулоцитарной взвеси .

Однако известный способ сложен, трудоемок и длителен в исполнении.

Цель изобретения - упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей Alcea rosea в концентрации 1-2°/о и подконтрастного препарата типа верографина.

Способ осуществляют следующим образом.

К 1-2°/о-ному раствору полисахарида добавляют 76%-ный раствор верографина или 80% иодомида-380 или иодомида-300. Плотность смеси должна быть в пределах (1,75±0,001)-10 кг/м. На 1 объем градиента плотности наслаивают равный объем дефибринированной крови. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и температуре 18°С. После центрифугирования пастеровской пипеткой отсасывают верхнее кольцо, в котором находятся лимфоциты, и отдельно нижнее кольцо, состоящее из гранулоцитов. В полученных взвесях клеток лизируют эритроциты раствором 0,83/о-ного хлористого аммония, после чего клетки дважды отмывают раствором Хенкса. Пример I. Готовят градиент плотности путем смешивания 1%-ного водного раствора полисахарида, выделенного из стеблей Alcea rosea, и ,76% раствора верографина до J (1,075±0,001)-10 кг/см, плотность жидкости контролируют весовым методом. В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции. Пробирку центрифугируют при 2000 об/мин и 18°С 20 мин. При этом образуется на границе двух фаз тонкое и плотное кольцо, представляющее собой лимфоциты, а под ним - второе кольцо, более широкое и рыхлое, представленное гранулоцитами. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем отдельно нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83%-ного хлористого аммония для лизиса примеси эритроцитов и через 10 мин центрифугируют при

1500 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса.

В выделенных взвесях производят подсчет количества клеток в камере Горяева. Определяют процентный выход лимфоцитов и гранулоцитов их жизнеспособность (по трипановому синему) и находят процентное содержание примесей в каждой взвеси клеток. Кроме того, определяют функциональную активность выделенных лимфоцитов в лимфоцитотоксическом тесте (10 опытов) и в реакции розеткообразования (РОК) (15 опытов).

Результаты изучения свойств клеток, выделенных с помощью предлагаемого способа, показали, что процентный выход лимфоцитов составляет в среднем 45%, гранулоцитов - 65%. Во взвеси лимфоцитов примесь гранулоцитов и эритроцитов составляет не более 10%. В гранулоцитарной взвеси примесь эритроцитов составляет не более 5%, лимфоцитов - не выше 20%. Жизнеспособность -лимфоцитов и гранулоцитов составляет 90-100%.

Исследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови стандартных доноров на градиенте плотности 1%-ный полисахарид-Ь верографин и фиколл + верографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показывает совпадение результатов в 100% случаев.

Результаты сравнительного изучения Т и В-лимфоцитов, выделенных известным и предлагаемым способом, представлены в табл.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что функциональная активность лимфоцитов, выделенных с использованием градиента плотности на основе 1% раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных с помощью раствора фиколла.

Пример 2. Готовят градиент плотности смешиванием 2%-ного водного раствора полисахарида из стеблей Alcea rosea и 76%-ного раствора верографина до р (1,075 + 0,001 )-10 кг/м (контролируется взвешиванием). В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции. Пробирку центрифугируют при тех же условиях, что и в примере 1. В результате центрифуги{)ования в пробирке образуется тонкое и плотное кольцо, содержащее лимфоциты, и под ним второе кольцо - более рыхлое и широкое, содержащее гранулоциты. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83%-ного раствора хлорстого аммония для лизиса эритроцитов и через 10 мин центрифугируют при 1500 об/ ин в течение 10 мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса. В выделенных взвесях определяют процентные выходы клеток, оценивают их свойства, теми же методами, что и в примере 1. Результаты оценки характеристик клеток, выделенных с помощью 2°/о-ного раствора полисахарида, с верографином, показывают, что выход лимфоцитов составляет 50%, а гранулоцитов - 70%. Примеси гранулоцйтов и эритроцитов в лимфоцитарной взвеси составляют не более 10%. В гранулоцитарной взвеси примеси эритроцитов не более 5%, лимфоцитов 15-20%. Жизнеспособность клеток в среднем составляет 95%. Исследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови 20 стандартных доноров с помощью градиента плотности: 2% полисахарид + верографин и раствор фиколла-Ьверографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показало совпадение результатов в 100% случаев. Сравнительное определение Т и В-лимфоцитов, проведенное методом розеткообразования, показало, что функциональная активность клеток, выделенных с использованием 2%-ного раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных центрифугированием в градиенте плотности фиколл + верографии (таблица 2). Для приготовления градиента плотности применяют полисахарид из стеблей штокрозы розовой (Alcea rosea), полученный в лабораторных условиях Ботанического института им. В. Л. Комарова АН СССР. Полисахарид представляет собой смесь кислого (состав: пентозы, гексозы и уроновые кислоты) и нейтрального (типа глюкана) полисахаридов. В настоящее время разрабатывается нормативно-техническая документация (регламент и ТУ), необходимая для организации выпуска градиента плотности в качестве диагностического реактива. Предлагаемый способ одномоментного выделения гранулоцитов и лимфоцитов внедрен в иммунологической лаборатории ЛНИИ и ГиПК. Для выявления запредел ьных параметров, при которых положительный эффект (наличие двух колец) не может быть достигнут, проводились следующие эксперименты. Готовили градиент плотности путем смещивания 0,5, 0,75, 2,25, 2,5%-ного водного раствора полисахарида и 76%-ного раствора верографина ,075-0,001/10 кг/см. Плотность жидкости контролируют весовым методом. В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции. Установлено, что 2,25 и 2,5%-ные растворы полисахаридов в связи с высокой вязкостью создают трудности для приготовления точных по плотности растворов, что не дает возможности использовать их в да чьнейшей работе. При исследовании растворов полисахаридов низкой концентрации (0,5 и 0,75) не наблюдается желаемого эффекта - образование двух колец. Поэтому для выделения лимфоцитов и гранулоцитов рекомендуется использовать 1-2%-ный раствор полисахарида. Предложенный способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов заметно упрощает процедуру получения взвесей клеток, так как благодаря одномоментному получению двух видов клеток исключается многостадийность процесса их выделения. На первом этапе на градиент плотности фиколл +верографин (по прототипу) наслаивают дефибринированную кровь, разведенную физиологическим раствором 1:1, а на градиент плотности полисахарид-f верографин наслаивают неразведенную дефибринированную кровь. Отличием II этапа является разница во времени центрифугирования ч в количестве оборотов (1500 об/мин - 30 мин и 2000 об/мин - 20. мин.). На III этапе при центрифугировании на градиенте плотности фиколл-t-верографин образуется только одно кольцо, представленное лимфоцитами. При центрифугировании на градиенте плотности полисахарид+ верографин образуется одномоментно два кольца: верхнее - лимфоциты, нижнее - гранулоциты. Это дает возможность на последующих этапах (IV и V) получить более чистые взвеси гранулоцитов: примесь эритроцитов в гранулоцитарной взвеси при использовании предлагаемого способа составляет 5-10%, а общепринятого 10-20%.

Таблица 1

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ГРАНУЛОЦИТОВ путем центрифугирования дефибринированной крови в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с поатедующей их очисткой, отличающийся тем, что. с целью упрощения способа, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей Alcea rosea в концентрации -2°/о и подконтрастного препарата типа верографина.

Прим РОК То I-J. Bf. Всз чание:розеткообразующие клетки. Т-су6популяция лимфоцитов, характеризующаяся наличием la антигена на поверхностной мембране, который определяет способность клеток к спонтанному обр-азованию розеток с эритроцитами барана. Т-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся отсутствием 1а антигенов и неспособностью к спонтанному розеткообразованию. В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для FC, - фрагмента иммуноглобулина, что обусловливает способность этих клеток к образованию розеток с эритроцитами барана, несущими фиксированные молекулы 1. В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для Cj компонента комплемента, обусловливающего образование розеток с эритроцитами барана, имеющими молекулы Сз - компонента комплемента. Таблица 2