СПОСОБ АКТИВАЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ МИЕЛОИДНОЙ ТКАНИ СТАРЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК A61K35/14 A61K35/44 A61K35/50 A61P7/00 A61P43/00 

Изобретение относится к области клеточной биологии и может найти применение в медицине для восстановления гемопоэза у лиц пожилого и старческого возраста.

В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии (Grossman Т. Latest advances in antiaging medicine. Keio J Med. 2005; 54(2):85-94).

В течение процесса старения стволовые клетки претерпевают как количественные, так и качественные изменения, которые влияют как на скорость старения, так и на продолжительность жизни организма. С возрастом, вследствие угнетения выработки факторов роста, развивается распространенный G1/S блок клеточного цикла, что приводит к прогрессивной убыли стволовых клеток и снижает регенерационные возможности различных тканей и органов. Исследования на человеке и различных животных показали, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) стареют, показывая существенное снижение функциональной способности с увеличением возраста. Поддержание нормальной функции ГСК является критически важным для коагуляции крови, транспорта кислорода, а также в повышении специфической и неспецифической резистентности организма.

Преодоление генерализованного G1/S блока клеточного цикла с целью активации регенерации миелоидной ткани при старении обеспечивается применением заместительной гормональной терапии: стимуляцией оси СТГ-инсулиноподобные факторы роста (ИПФР). Повышение уровня ИПФР приводит к преодолению блока для процессов дифференциации и пролиферации клеток и последующему самообновлению тканей (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).

В то же время, проведенные исследования по восстановлению регенерации тканей в возрастном аспекте с использованием факторов роста зачастую противоречат друг другу. Так было установлено, что пожилые люди с высоким уровнем гормона ИПФР-1 живут дольше и уровень регенерации тканей у них выше, чем у пожилых людей с низким уровнем ИФР-1 (Brugts et al. Low Circulating IGF-I Bioactivity in Elderly Men is Associated with Increased Mortality. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2008; DOI: 10.1210/jc.2007-1633).

Однако исследования на лабораторных мышах установили, что гипофизэктомия (Bartke A., Brown-Borg H., Mattison J. et al. Prolonged longevity of hypopitui-tary mice// Exp. Gerontol. 2001. Vol.36. P.21-28.), a также генетические модификации (Coschigano et al., Endocrinology. 2000, 141(7):2608-2613), направленные на снижение чувствительности рецептора к соматотропному гормону (СТГ) приводят к увеличению продолжительности жизни мышей. На сегодняшний день доказана возможность инсулина и ИПФР-1 существенно снижать устойчивость клеток организма к стрессу через угнетение работы транскрипционных факторов FOXO и SKN-1 вследствие снижения образования агентов периферической стресс-лимитирующей системы (Direct Inhibition of the Longevity-Promoting Factor SKN-1 by Insulin-like Signaling in C. elegans Tullet JMA, Hertweck MT, Ai. JH, Baker J, Hwang JY, Liu S, Oliveira RP, Baumeister R, and Blackwell TK Cell, Vol 132, 1025-1038, 21 March 2008).

Следующим направлением в активации регенерации миелоидной ткани при старении является коррекция антиоксидантного статуса с использованием антиоксидантов (витамин Е, витамин С). Однако все антиоксиданты обладают очень ограниченной «емкостью» для поглощения активных форм кислорода и инактивации продуктов свободнорадикального окисления (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления миелоидной ткани старых лабораторных животных (лабораторные крысы возраст 3 года, масса 300 г) в физиологических условиях (без воздействия ионизирующего излучения), путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты, в количестве 2 млн клеток на 1 животное (или 6·10⁶ клеток/кг) (Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на регенерацию миелоидной ткани старых животных в условиях воздействия ионизирующего излучения / А.П. Ястребов, И.Ю. Маклакова, Д.Ю. Гребнев, С.Е. Емельянова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2008. - №4. - С.93-97.) - прототип.

Данный способ обеспечивает активацию регенераторного потенциала тканей, ингибированного при старении. Однако использование трансплантации ММСК оказывает недостаточное действие на активацию регенерации миелоидной ткани у старых лабораторных животных.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации регенерации миелоидной ткани при старении.

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в снижении количества цитогенетически измененных клеток.

Технический результат достигается тем, что в способе активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных путем внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг, дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг.

Сущность изобретения состоит в сочетанной трансплантации лабораторным животным ММСК и ГСК.

Свойство ММСК вырабатывать хемоаттрактант для ГСК (SDF-1) обеспечит увеличение пула ГСК в костном мозге за счет трансплантированных (аллогенных) ГСК, что в свою очередь будет способствовать восстановлению гемопоэза (Журнал Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Том II, №3, 2007. Страница 21-22. «Регуляция хоуминга клеток-предшественников в область инфаркта миокарда методом пролонгированной секреции фактора SDF-1»).

Доза трансплантируемых ГСК (300 тыс. клеток/кг) подобрана экспериментальным путем.

Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и формировать микроокружение для ГСК. ММСК способствуют направленной миграции ГСК: вырабатывая SDF-1 (определяет миграцию ГСК через рецепторы CXCR4 на поверхности ГСК). ММСК способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции ряда цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста стволовой клетки. Постоянным продуктом секреции ММСК является простагландин Е2 (иммуносупрессивный фактор), способный снижать экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 на поверхности периферических лимфоцитов, что препятствует их активации.

Из анализа научно-технической и патентной литературы сочетанной внутривенной трансплантации ММСК и ГСК, приводящей к снижению количества цитогенетически измененных клеток, оказывающих цитопротективное действие на миелоидную ткань, а следовательно, к повышению активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 36 белых лабораторных мышах-самцах возраста 3 года, массой 50 г. Эксперименты по получению культуры ММСК и ГСК выполнены на 18 лабораторных животных мышах-самках возраста 3-4 месяца, массой 30 г, срок гестации 18 дней. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария, предусмотренных «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г. и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». Манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с положениями Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии.

Количество экспериментальных животных и распределение их по сериям экспериментов представлены в таблице 1.

Животным опытной группы внутривенно однократно вводилась суспензия ММСК и ГСК соответственно в дозе 6 млн кл./кг и 300 тыс. кл./кг, животным контрольной группы внутривенно однократно вводили 0,9% раствор NaCl - 0,2 мл внутривенно (см. Таблицу 1). Кроме того, животным по прототипу вводили ММСК в количестве 6 млн клеток/кг (см. Таблицу 2). Забой животных осуществлялся на 1 и 7 сутки после трансплантации клеток.

Таблица 1 Распределение животных по сериям экспериментов Животные Путь введения Препарат Время проведения аутопсии органов 24 часа 7 сутки Старые в/в ММСК 6 млн кл./кг и ГСК 300 тыс. кл./кг в 0,2 мл физраствора 9 шт. 9 шт. в/в 0,9% р-р NaCl 0,2 мл 9 шт. 9 шт.

Таблица 2 Распределение животных по сериям экспериментов Животные Путь введения Препарат Время проведения аутопсии органов 24 часа 7 сутки Старые в/в ММСК 6 млн кл./кг 0,5 мл физраствора 9 шт. 9 шт. в/в 0,9% р-р NaCl 0,5 мл 9 шт. 9 шт.

Приготовление, окраску, микроскопию и подсчет микроядер в полихроматофильных нормобластах костного мозга крыс осуществляли следующим образом.

На обезжиренное оптическое стеклышко наносили сыворотку AB₀ (IV) группы крови человека. Далее стеклянной палочкой, круговыми движениями готовили суспензию клеток костного мозга (она должна быть определенной плотности - иметь беловатую опалесцирующую окраску). Затем каплю этой суспензии наносили на край обезжиренного предметного стекла. Распределение материала по стеклу осуществляли перемещением позади шлифованного стекла под углом 45°. Оптимальная длина мазка - 2-3 см.

Мазок высушивался на воздухе в течение суток.

Окрашивание мазков по Паппенгейму производили на следующий день с последующей фиксацией в метаноле в течение 1 минуты. (Краситель - Май-Грюнвальд (спиртовой раствор) смешивался с фосфатным буфером 1:1. Время покраски - 1,5 мин.)

Затем сливаем краску и без промывания заливаем раствором красителя Романовского-Гимзы. Время покраски - 10 минут.

Раствор Романовского-Гимзы готовили на водопроводной воде 1:6 (10 мл Романовского + 60 мл воды). Краску готовили непосредственно перед окрашиванием.

Затем промывали в гистологичеких стаканчиках под струей воды (струя не на стекла).

Цитологические препараты костного мозга анализировались с помощью микроскопа Micros МС-50(Австрия) при увеличении 100*15.

Микроядерный тест (МЯТ) рассчитывали как отношение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами к 1000 подсчитанных полихроматофильных эритроцитов, выраженное в промилях (Методические рекомендации по оценке мутагенной активности химических веществ микроядерным тестом, подготовлены Всесоюзным научно-исследовательским институтом дезинфекции и стерилизации Министерства здравоохранения СССР, Москва 1984).

$$МЯТ=\frac{Числополихроматофильныхэритроцитовсмикроядрами}{1000полихроматофильныхэритроцитов}*1000\%$$

Получение культуры ММСК

Производилось выделение плаценты (срок гестации 18 дней), образец ткани массой 1 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при pH 7.2, без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин. при 37°C). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных не измельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-МЕМ, содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g.

Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл./см² на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания).

1.1. Условия культивирования ММСК

Культивирование производилось при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% СO₂.

1.2. Подсчет клеток

Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: X=а*10000, где X - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

1.3. Субкультивирование ММСК

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°C. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с СЭК (10%), и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в нужной концентрации (10000 кл./ см²).

1.4. Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).

Выделение ГСК

Для выделения ГСК использовали набор Mouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set-DM. (StemCell Technologies, Канада).

Методы статистической обработки полученных результатов

Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий между подгруппами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.

Анализируя данные микроядерного теста старых лабораторных животных, мутагенного действия ММСК не выявлено, т.к. количество ядер соответствует спонтанному уровню мутагенеза (таблица 3).

Таблица 3 Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 1 сутки после введения, М±m (n=9) Параметры Значение Заявляемый способ Прототип Микроядерный тест, % 3,37±0,30 8,83±1,83

Как видно из таблицы, по заявляемому способу микроядерный тест в 2,3-2,9 раза ниже по сравнению с прототипом.

Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки по заявляемому способу и способу по прототипу показаны в таблице 4.

Таблица 4 Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки после введения, М±m (n=9) Параметры Значение Старые Прототип Микроядерный тест, % 1,50±0,30 5,60±1,27

Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу микроядерный тест в 3,6-3,8 раза ниже по сравнению с прототипом, что приводит к снижению спонтанного уровня мутагенеза у старых лабораторных животных. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в физиологических условиях у старых лабораторных животных сочетанная трансплантация ММСК и ГСК на 7 сутки приводит к уменьшению содержания цитогенетически измененных клеток. Сравнивая данные по активации регенерации у старых лабораторных животных после трансплантации ММСК и сочетанной трансплантации ММСК и ГСК, следует отметить существенно большую эффективность сочетанной трансплантации. Так, после сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на 7 сутки в физиологических условиях установлено, что содержание цитогенетически измененных клеток уменьшалось после введения ММСК и сочетанной трансплантации соответственно на 41,0% и 57,1%.

Выводы

У старых лабораторных животных в физиологических условиях ММСК и ГСК оказывает цитопротективное действие на миелоидную ткань за счет уменьшения цитогенетически измененных клеток.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных. Способ включает внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг. Дополнительно животным вводят гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг. Способ позволяет уменьшить количество цитогенетически измененных клеток, способствует активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных. 4 табл., 1 пр.

Способ активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных, включающий внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг, отличающийся тем, что дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг.