Способ моделирования лейкозной инфекции у животных Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования лейкозной инфекции у морских свинок.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) принадлежит к роду Deltaretrovirus, семейству Retroviridae, подсемейству Oncovirinae. Онкогенный вирус заражает крупный рогатый скот и создает серьезные проблемы для животноводческой промышленности во всем мире.

Передача вируса восприимчивому крупному рогатому скоту может осуществляться через кровь, а также всеми секретами и экскретами при попадании в них лимфоцитов, зараженных вирусом. После заражения ВЛКРС интегрирует свой генетический материал в геном хозяина, создавая провирус, идентичную ДНК-копию генома РНК вируса, что позволяет ему установить пожизненную персистирующую инфекцию. Главной клеточной мишенью вируса лейкоза являются В-лимфоциты, другими основными мишенями для ВЛКРС также являются хелперные и киллерные Т-клетки [Panei C.J., Takeshima Sn., Omori T. et al. Estimation of bovine leukemia virus (BLV) proviral load harbored by lymphocyte subpopulations in BLV-infected cattle at the subclinical stage of enzootic bovine leucosis using BLV-CoCoMo-qPCR // BMC Vet Res. – 2013. – Vol. 9. – P. 95].

В соответствии с нормативными документами Всемирной организации по охране здоровья животных [OIE (World Organisation for Animal Health) Enzootic bovine leukosis. Chapter 2.4.11 in Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. – 2018. – P. 2] устойчивый иммунный ответ на экспериментальное заражение ВЛКРС можно вызвать у лабораторных животных: кроликов, крыс и морских свинок.

Известен способ моделирования лейкозной инфекции путем однократного внутривенного введения кроликам 1 мл крови от больной лейкозом коровы [Гулюкин М.И. и др. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте // Вопросы вирусологии. – 2015. – Т. 60, №5. – С. 33]. Этот способ сложно воспроизводим на более мелких лабораторных животных, в то же время использование кроликов требует достаточно высоких материальных затрат, в том числе, связанных с их кормлением и содержанием. Другим существенным недостатком является невозможность использования большого количества кроликов в эксперименте, особенно когда требуется изучение разных схем и доз введения иммунобиологических препаратов с целью разработки методов коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного экспериментальной ретровирусной инфекцией.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных [Патент RU 2740470 С1 Способ моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных. Патентообладатель ФГБОУ ВО «Мичуринский ГАУ», опубл. 14.01.2021 Бюл. №2], включающий внутрибрюшинное введение 5-6-месячным крысам линии Wistar свежеприготовленной фракции мононуклеаров крови BLV-инфицированного крупного рогатого скота. Этот способ имеет несколько недостатков в плане его применения с целью изучения противовирусной активности препаратов. Допустимый забираемый объем крови у крыс из периферической вены хвоста составляет лишь 1 мл [Патент RU 2719912 С1 Способ забора крови у крыс из периферических вен хвоста. Патентообладатель ФГБОУ ВО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, опубл. 23.04.2020 Бюл. №12], что ограничивает возможность использования более широкой панели тестирований для оценки количественных и функциональных характеристик разных звеньев иммунной системы.

Также необходимо отметить, что в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению специфической противовирусной активности лекарственных средств [Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. – М.: Гриф и К, 2012. – С. 533] при моделировании не смертельных вирусных инфекций, когда показателем оценки эффективности препарата не является выживаемость, величина дозы заражения должна быть максимальной (с учетом титра вируса).

Рекомендуемый авторами режим центрифугирования стабилизированной антикоагулянтом крови при 1000 об/мин в течение 10 минут позволит в лучшем случае достичь лишь выделения ограниченного числа лимфоидных клеток, что не способствует получению фракции, содержащей высокую концентрацию вируса. Кроме того, заражающая доза вводится двукратно с интервалом в неделю по стандарту мутности МакФарланда (R092B стандарт 1 ед) без учета титра вируса.

Техническим результатом является разработка доступного, быстро воспроизводимого и высокоэффективного способа моделирования инфекции ВЛКРС на морских свинках, пригодного для изучения специфической противовирусной активности различных химических соединений, биологически активных веществ и иммуномодуляторов.

Указанный технический результат достигается путем выделения лимфоцитов из свежеполученной стабилизированной крови больной лейкозом коровы на градиенте плотности 17 %-ного раствора рентгеноконтрастного вещества тразографа (или его аналога). Кровь стабилизируют в специальных одноразовых стерильных вакуумных пробирках, обработанных ЭДТА-К3.

Выделение лимфоцитов осуществляют следующим образом: из 76 или 60%-ного тразографа (или его аналога) с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см³. В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 1-2 мл 17%-ного раствора тразографа, на который наслаивают по 1-2 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g. В результате центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовавшийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой, в нем определяют титр вируса путем последовательных двукратных разведений выделенных лимфоцитов из неразведенного состояния в пропорции 1:1, 1:2 и так далее в 12-ти разведениях до 1:2048. Каждое разведение наносят на предметное стекло в количестве 30 мкл, затем высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте и исследуют с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) [Патент RU 2767688 С1 Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл.18.03.2022, Бюл. №8]. Инфицирование животных осуществляют путем однократного внутрибрюшинного введения выделенной клеточной взвеси (титр вируса 1:2) в объеме 1 мл.

Отличительными признаками предложенного способа является то, что для заражения морских свинок используется клеточная взвесь, выделенная на градиенте плотности тразографа, которая вводится c учетом титра вируса однократно в объеме 1 мл. Предлагаемый способ позволяет получить клеточную суспензию, имеющую большой выход лимфоцитов (до 90 %), в которых локализуется вирус лейкоза крупного рогатого скота, а также является удобной моделью для поиска и разработки наиболее эффективных методов коррекции иммунных нарушений или терапевтического вмешательства у животных.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. С целью изучения эффективности способа моделирования лейкозной инфекции 10-ти морским свинкам вводят однократно внутрибрюшинно клеточную взвесь, выделенную от больной лейкозом коровы, имеющую титр вируса 1:2, в объеме 1 мл. В качестве контроля используют 5 морских свинок, которым внутрибрюшинно вводят 1 мл физиологического раствора. Кровь у морских свинок отбирают микропипеткой из ретроорбитального венозного сплетения на 14, 21, 30, 60, 90, 120 и 180-е сутки после введения лимфоидных клеток. Наличие лейкозной инфекции у морских свинок опытной группы устанавливают полимеразной цепной реакцией (ПЦР) на оборудовании BioRad (США) с использованием тест-системы «ЛЕЙКОЗ» для выявления вируса крупного рогатого скота (изготовитель ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора), а также с помощью РНИФ.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты диагностических исследований крови морских свинок, инфицированных ВЛКРС

Группа Метод исследования Срок исследования после инфицирования, сутки 14 21 30 60 90 120 180 Опытная ПЦР 6/10 10/10 1/5 5/5 4/5 4/5 5/5 РНИФ 10/10 10/10 5/5 5/5 4/5 4/5 5/5 Контрольная ПЦР 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 РНИФ 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Примечание: числитель – количество положительно прореагировавших животных; знаменатель – количество животных в группе.

По результатам ПЦР исследований у 100% морских свинок опытной группы к 21-м суткам от начала эксперимента идентифицирован провирус лейкоза крупного рогатого скота, тогда как с помощью РНИФ инфицирование всех животных экспериментальной группы было установлено уже на 14-е сутки и подтверждалось в дальнейшем в течение всего периода исследований.

Выявление ДНК провируса, несмотря на его отсутствие у некоторых особей в отдельные сроки, во всех случаях подтверждалось при более позднем исследовании на 180-е сутки.

Следует отметить, что все животные контрольной группы были негативны.

Таким образом, на основании диагностических исследований можно сделать вывод о заражении ВЛКРС всех морских свинок, используемых в эксперименте.

Пример 2. С целью изучения иммунного статуса отбирают 10 морских свинок. Пять интактных морских свинок служат контролем, остальным (n=5) внутрибрюшинно вводят клеточную взвесь от больной лейкозом коровы в объеме 1 мл. На 30-е и 90-е сутки после инфицирования животных производят отбор проб крови.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Иммунологические параметры крови морских свинок, инфицированных ВЛКРС

Показатель Срок
исследования, сутки Группа Опытная Контрольная Лейкоциты, 10⁹/л 30 13,72±1,86^⃰ 9,06±0,54 90 13,34±0,95 ^⃰ 10,76±0,50 Лимфоциты, % 30 65,0±2,77 ^⃰ 54,66±2,66 90 62,4±1,63 59,33±0,66 Лимфоциты, 10⁹/л 30 9,05±1,62 ^⃰ 4,94±0,32 90 8,28±0,42 ^⃰ 6,39±0,37 Т-лимфоциты, % 30 7,8±1,59 ^⃰ 15,33±2,18 90 11,4±1,47 ^⃰ 16,0±1,16 Т-лимфоциты, 10⁹/л 30 0,67±0,13 0,75±10 90 0,94±0,14 1,01±0,05 В-лимфоциты, % 30 24,8±3,73 19,33±4,05 90 23,4±1,60 ^⃰ 17,66±1,45 В-лимфоциты, 10⁹/л 30 2,18±0,38 ^⃰ 0,93±0,15 90 1,95±0,22 ^⃰ 1,12±0,07 Цитотоксические Т-лимфоциты, % 30 25,4±2,29 ^{⃰ ⃰} 11,33±0,88 90 29,0±2,57 ^⃰ 16,66±2,60 Цитотоксические Т-лимфоциты, 10⁹/л 30 2,15±0,12 ^{⃰ ⃰ ⃰} 0,56±0,06 90 2,36±0,12 ^{⃰ ⃰} 1,06±0,20 Миелопероксидаза, у.е. 30 1,52±0,20 ^⃰ 0,96±0,13 90 1,25±0,04 ^{⃰ ⃰} 0,99±0,05 Катионные белки, у.е. 30 1,51±0,13 ^⃰ 1,13±0,03 90 1,37±0,12 1,12±0,10

Примечание: *р˂0,05; **р˂0,01; ***р˂0,001.

Анализ параметров иммунной системы на 30-е сутки после инокуляции клеточной взвеси показал, что у морских свинок наблюдаются характерные для развития лейкозной инфекции изменения. В частности, в группе инфицированных ВЛКРС относительно контроля происходило увеличение числа лейкоцитов в 1,51 раза (р<0,05), а также лимфоидных клеток как в относительном (%), так и в абсолютном (10⁹/л) выражении, соответственно в 1,19 (р<0,05) и 1,83 (р<0,05) раза. Увеличение концентрации лимфоидных клеток происходило за счет В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов на фоне снижения процентного содержания Т-лимфоцитов.

Другим признаком, указывающим на развитие лейкозной инфекции, являлась гиперреактивность бактерицидных систем нейтрофилов, характеризующаяся усилением ферментной активности миелопероксидазы в 1,58 раза (р<0,05) и увеличением содержания катионных белков в 1,33 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой.

Аналогичная картина изменений сохранилась и на 90-е сутки после инфицирования морских свинок взвесью лимфоидных клеток. Также как и в первый срок наблюдения происходил достоверный рост концентрации лейкоцитов, абсолютного содержания общего числа лимфоцитов, В-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов при одновременном снижении процентного содержания Т-лимфоцитов. Также оставалась повышенной функциональная активность нейтрофилов, особенно это касалось миелопероксидазы, концентрация которой возрастала в 1,26 раза (р<0,05).

Следовательно, динамика показателей иммунного статуса сопровождается характерными для лейкозной инфекции изменениями, что подтверждает пригодность этого способа для изучения возможности управления развития инфекционного процесса с помощью различных биологически активных веществ и иммуномодуляторов с потенциальной противовирусной активностью.

Таким образом, заявленный способ моделирования инфекции ВЛКРС является доступным в материально-техническом отношении, быстро воспроизводимым, так как дает возможность изучения терапевтической активности исследуемого препарата уже на 14-е сутки после введения инфекта и в дальнейшем в течение продолжительного периода времени.

Помимо этого, способ высокоэффективный, так как позволяет воспроизвести инфекцию на 100% экспериментального поголовья. Морская свинка является достаточно удобной моделью в плане многопланового исследования разных параметров иммунной системы (клеточного и гуморального звеньев), так как позволяет производить отбор проб крови в необходимом объеме (от 6 до 8 мл) для этих целей с достаточно короткими интервалами времени (14-ть суток) между взятиями крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования лейкозной инфекции у экспериментальных животных. Для этого морским свинкам внутрибрюшинно вводят взвесь лимфоидных клеток, выделенных из крови больной лейкозом коровы. При этом из свежеполученной стабилизированной ЭДТА-КЗ крови больной коровы выделяют взвесь лимфоцитов центрифугированием на градиенте плотности 17%-ного раствора тразографа. В ней методом последовательных разведений в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) определяют титр вируса и в объеме 1,0 мл однократно вводят выделенную клеточную взвесь, имеющую титр вируса 1:2, экспериментальным животным. Контроль заражения осуществляют методом РНИФ. Изобретение обеспечивает доступный быстро воспроизводимый и высокоэффективный способ моделирования лейкозной инфекции на морских свинках, пригодный для изучения специфической противовирусной активности различных химических соединений, биологически активных веществ и иммуномодуляторов. 2 пр., 2 табл.

Способ моделирования лейкозной инфекции у животных, включающий внутрибрюшинное введение морским свинкам с учетом титра вируса взвеси лимфоидных клеток, выделенных из крови больной лейкозом коровы, отличающийся тем, что из свежеполученной стабилизированной ЭДТА-К3 крови больной коровы выделяют взвесь лимфоцитов центрифугированием на градиенте плотности 17 %-ного раствора тразографа, в ней методом последовательных разведений в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) определяют титр вируса 1:2 и в объеме 1,0 мл однократно вводят экспериментальным животным, контроль заражения осуществляют методом РНИФ.