СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2021 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, токсикологии и может быть использовано для моделирования поражений, вызванных длительной алкогольной интоксикацией у экспериментальных животных.

Высокий уровень потребления алкогольных напитков, увеличение числа больных, отрицательное влияние алкоголя на здоровье населения, большой материально-экономический ущерб, нанесенный алкоголизмом, в настоящее время выдвинули эту проблему в число важнейших, имеющих медицинское и социальное значение. Длительная алкогольная интоксикация с достаточной частотой проявляется поражениями не только печени, но и других органов, в частности почек. Что сопровождается характерными признаками поражения, как со стороны почек: протеинурия, изменение размера клубочков, нарушение эпителия проксимальных и, особенно, дистальных отделов канальцев, расширение вен и их умеренное полнокровие (Целых Е.Д., 2002), так и со стороны печени: увеличение размеров печеночных клеток, жировая дистрофия печеночных структур (Травенко Е.Н., Породенко В.А. Патоморфологические изменения в печени при отравлениях этанолом. Судебная медицина. 2019; 5(2):21-26). Способам лечения алкогольных полиорганных поражений в современных экспериментальных исследованиях уделено мало внимания. Между тем, экспериментальное моделирование позволяет детально изучить патогенез и разработать пути лечения этой патологии. Предлагаемая модель позволяет воссоздать за относительно короткий промежуток времени все изменения связанные с длительной алкогольной интоксикацией.

Известен способ моделирования алкогольной висцеропатии [Патент на изобретение SU №1628077, 1988] осуществляемый путем внутрижелудочного введения через зонд 48%-ного этанола на протяжении 60 дней в дозе 1 мл на 100 г. веса животного. Через каждые 4 дня дополнительно вводили суспензию тетурама на 48%-ном растворе этанола внутрижелудочным зондом в дозе 25 мг/кг.

Недостатком данного способа является длительность реализации модели (60 дней), а также свойства ингибитора - тетурама, который способен вызывать гепатиты, невриты и кожные аллергические заболевания.

Известен способ моделирования алкогольной кардиомиопатии [Патент на изобретение RU 2646454, 2018], заключающийся в принудительной алкоголизации животных 10%-ным водным раствором этанола в течение 13-ти недель, последующем отборе животных с высоким предпочтением к алкоголю и продолжении алкоголизации до конца 24 недели от начала алкоголизации. К концу 24-й недели формируется дилатационная алкогольная кардиомиопатия, которая характеризуется значительным угнетением сократительной функции и статистически значимой дилатацией левого желудочка.

Недостатком способа является длительность реализации модели, а также преимущественное поражение сердечной ткани и невозможность адекватно оценить повреждение других внутренних органов.

Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования алкогольиндуцированного цирроза печени у белых беспородных крыс, взятый нами за прототип, при котором используют внутрижелудочное введение 40% этанола через день в течение 3 недель, в дозе 3,0 г/кг и одновременное внутрибрюшинное введение 1% раствора N-нитрозодиметиламина в дозе 5 мг/кг последовательно в течение 4 суток каждой недели [Патент на изобретение RU 2669024, 2016].

Недостатком способа является преимущественное поражение печени и невозможность адекватно оценить повреждение других внутренних органов, также действие N-нитрозодиметиламина, который представляет опасность своим ярко выраженным канцерогенным действием.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования хронической алкогольной интоксикации.

Решение этой задачи позволяет более полно изучить патофизиологические механизмы развития хронической алкогольной интоксикации, создать способ моделирования хронической алкогольной интоксикации, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способ моделирования хронической алкогольной интоксикации, включает следующие существенные признаки: в качестве токсического вещества используют 40%-ный раствор этанола вводимый через зонд в желудок один раз в сутки в течение 30 дней в дозе 3,0 г/кг. Одновременно вместе с этанолом вводится неконкурентный ингибитор алкогольдегидрогеназы - амид изовалериановой кислоты в дозе 500 мг/кг в течение месяца, где на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг вещества.

Данный способ отличается от прототипа использованием ингибитора алкогольдегидрогеназы - амида изовалериановой кислоты, нетоксичного, безопасного вещества, который вводится через зонд в желудок.

Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введение ингибитора алкогольдегидрогеназы - амида изовалериановой кислоты в дозе 500 мг/кг у крыс совместно с 40%-ным этанолом в дозе 3,0 г/кг приводит к нарушению метаболизма этанола и развитию хронической алкогольной интоксикации в более короткие сроки. Это является удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической алкогольной интоксикации у крыс в эксперименте, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном и легко воспроизводимом способе развития хронической алкогольной интоксикации, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения действующего раствора - амид изовалериановой кислоты растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг амида изовалериановой кислоты. На каждые 100 г веса крысы вводят 0,9 мл действующего раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.

Раствор амида изовалериановой кислоты вводится через зонд в желудок каждый день в течение 30 дней одновременно вместе с 40%-ным раствором этанола в дозе 3,0 г/кг веса животного.

По истечении времени эксперимента (30 дней) экспериментальные животные забивались под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы крови и тканей. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных (1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗРФ №708 от 23.08.2010).

Функциональное состояние почек оценивается с применением общепринятых методов исследования (Наточин Ю.В. Физиология почки: формулы и расчеты. Л. «Наука». 1974. - 56 с.), с использованием биохимических наборов реагентов для исследования мочи и плазмы крови фирмы «Ольвекс» и «Агат-Мед», Россия на спектрофотометре «Solar» (Беларусь).

Для проведения гистологических исследований образцы тканей почки и печени фиксируются в 10% нейтральном формалине, после чего подвергаются заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Zeiss Primo Star под увеличением 40×100×400.

Полученные результаты обрабатывались статистически с учетом распределения признаков в группах с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения изучаемых данных применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартного пакета программ Microsoft Excel 2016 и Statistica10.0. Различия считались достоверными при р<0,05.

Достижение поставленной цели подтверждено результатами исследования функционального состояния почек (нарушения электролито-водовыделительной функции почек, протеинурия) и морфологического исследования тканей почки и печени, демонстрирующих развитие токсической нефропатии и гепатопатии.

Фиг. 1. - Ткань почек при хронической алкогольной интоксикации.

Краткое описание чертежа: (а) - пролиферация мезангиоцитов, (б) - гиалиново-капельная дистрофия эпителия почечных канальцев, (в) - очаговые кровоизлияния.

Фиг. 2. - Ткань печени при хронической алкогольной интоксикации. Краткое описание чертежа: (а) - центролобулярное полнокровие, (б) - тельца Мэллори, (в) - жировые вакуоли в гепатоцитах, (г) - внутрипеченочный холестаз.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Крысам-самцам линии Вистар массой 200-300 г вводили раствор амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг совместно с 40%-ным этанолом в дозе 3,0 г/кг каждый день в течение 30 дней.

Контролем служили три группы животных, содержащиеся в стандартных условиях вивария:

1. Интактные животные (10 крыс)

2. Крысы с изолированным внутрижелудочным введением 40%-го этанола в дозе 3,0 г/кг в течение месяца (10 крыс)

3. Животные с внутрижелудочным введением раствора амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг в течение месяца (10 крыс).

Изучение основных процессов мочеобразования, анализ содержания электролитов в крови (натрия и калия) и их почечной обработки проводили в условиях спонтанного диуреза через один месяц. Для изучения функции почек животные помещались в обменные клетки, где в течение 6 часов у них производился сбор мочи. Содержание натрия и калия в моче и плазме крови определяли ионоселективным методом на анализаторе электролитов «Кверти-Мед» Москва. Концентрацию креатинина в моче и плазме крови, общего белка в моче определяли спектрофотометрически.

Расчеты скорости клубочковой фильтрации, величины канальцевой реабсорбции воды, экскреции натрия и калия, фильтрационного заряда катионов и относительной канальцевой реабсорбции натрия производились по формулам Ю.В. Наточина (1974).

Опыты показали, что в контрольных группах №2 с изолированным введением этанола и №3 с введением только ингибитора алкогольдегидрогеназы в течение тридцати дней достоверных изменений морфофункционального состояния почек не выявлялось. Морфологическое исследование тканей печени также не выявило признаков алкогольного повреждения в эти сроки.

Сочетанное введение 40%-ного этанола в дозе 3,0 г/кг с раствором амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг каждый день в течение 30 дней приводит к развитию токсической алкогольной нефропатии.

Выявлялось уменьшение объема 6-часового спонтанного диуреза (р≤0,01), связанное со снижением скорости клубочковой фильтрации (р≤0,01), вопреки тенденции к снижению канальцевой реабсорбции воды (Таблица 1). Наблюдалось увеличение концентрации белка в моче (р≤0,01).

Изучение электролитовыделительной функции почек выявило увеличение экскреции натрия (р≤0,01) и калия (р≤0,001) с мочой. Токсическое воздействие этанола вызывало изменения в электролитном составе плазмы крови (табл. 2). Снижение уровня натрия (р<0,05) было связано с высокими потерями натрия с мочой вследствие поражения канальцевого аппарата почек и снижения канальцевой реабсорбции катиона (р≤0,001), (табл. 2), невзирая на достоверное уменьшение фильтрационного заряда катиона. Фильтрационный заряд калия имел тенденцию к снижению вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации воды (р≤0,01), однако экскреция катиона все же была выше контроля (р≤0,001), вероятно вследствие изменения канальцевой обработки катиона в условиях гиперкалиемии (р≤0,05).

Морфологические изменения почек при хронической алкогольной интоксикации подтверждались данными гистологических исследований, выявившими картину мезангиопролиферативного гломерулонефрита, характерного токсической алкогольной нефропатии. При этом в тканях почек определялись следующие изменения (Приложение: Фиг. 1.): множественные мелкоточечные кровоизлияния в строму, пролиферация и гипертрофия мезангиальных клеток, расширение мезангия. Также отмечались гиалиново-капельная дистрофия и частичный некроз эпителия канальцев. Имели место зоны с очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрацией стромы.

Морфологические изменения в печени при хронической алкогольной интоксикации также носили выраженный характер (Приложение: Фиг. 2.). Отмечались центролобулярное полнокровие, в цитоплазме гепатоцитов определялись жировые вакуоли и тельца Мэллори. В печеночных протоках признаки холестаза.

Предлагаемый способ моделирования хронической алкогольной интоксикации является эффективным, позволяет подробно изучить функциональные изменения и патофизиологические механизмы токсического влияния этанола на функции почек и печени и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики хронической алкогольной интоксикации.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии и токсикологии, и может быть использовано для моделирования хронической алкогольной интоксикации у крыс в эксперименте. Для этого экспериментальным животным ежедневно в течение 30 дней вводят 40%-ный раствор этанола в дозе 3 г/кг одновременно с ежедневным введением раствора амида изовалериановой кислоты в желудок в дозе 500 мг/кг веса животного, где на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг амида изовалериановой кислоты. Способ позволяет повысить воспроизводимость развития хронической алкогольной интоксикации в более короткие сроки. 2 табл., 1 пр., 2 ил.

Способ моделирования хронической алкогольной интоксикации у крыс в эксперименте, включающий внутрижелудочное введение экспериментальным животным 40%-ного этанола в дозе 3 г/кг, отличающийся тем, что животным ежедневно в течение 30 дней вводят раствор этанола через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора амида изовалериановой кислоты в желудок в дозе 500 мг/кг веса животного, где на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг амида изовалериановой кислоты.