СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ КОАГУЛОПАТИИ У КРЫС Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, и может быть использовано для моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте.

Влияние соединений кадмия на биологические системы и организм в целом активно изучается в настоящее время (Авцин А.П. и соавт. 1991). Особое внимание уделяется эффектам длительного воздействия соединений кадмия. Показано, что кадмий способен к накоплению в органах и тканях человека, оказывая цитотоксическое, генотоксическое и органотоксическое действие, вызывая полиорганные структурно-функциональные повреждения.

Анализ современной литературы показывает, что процессы внутрисосудистого свертывания крови могут быть составляющим компонентом многих патологических процессов в организме: патологии сердечно-сосудистой системы, гипертонической болезни, нарушения мозгового кровообращения, патологии печени и почек ( A.Sh., Galian S.L. 2006; Момот А.П. и др. 2011; Мельник А.А. 2016). Актуальным является изучение процессов системы гемостаза и их роль в развитии соматической патологии при хронической интоксикации (Власов А.П, Григорьева Т.Н., Лещанкина Н.Ю., 2009). Современные схемы лечения включают антикоагулянтную терапию и длительный, иногда пожизненный прием пероральных антикоагулянтов (Shaft S.T., et al. 2014; Oliveira M., et al. 2017; Monahan R.C., et al. 2017), что может приводить к осложнениям в виде развития антикоагулянт-ассоциированной нефропатии (Kalaitzidis R.G., Duni A., Liapis G., Balafa О., et al. Anticoagulant-related nephropathy: a case report and review of the literature of an increasingly recognized entity. Int Urol Nephrol. 2017; 49: 1401-7.). Таким образом проблема коррекции системы гемостаза при хронической интоксикации остается открытой. Актуальным является разработка способов моделирования хронической токсической коагулопатии, для последующего изучения методов профилактики данной патологии.

Существуют лишь единичные работы, описывающие разнонаправленные и противоречивые изменения в системе гемостаза под влиянием различных соединений тяжелых металлов. У рабочих, профессионально подвергающихся воздействию тяжелых металлов, описывается статистически значимое увеличение времени свертывания крови с повышением образования тромбина. В опытах ex vivo, было показано повышение протромботической активности эритроцитов вследствие увеличения экспрессии фосфатидилсерина на внешней поверхности мембран эритроцитов (Maseko Р.В, van Rooy М., Taute Н., 2021, https://doi.or2/10.1177/0748233720983114; Notariale, R., Infantino, R., Palazzo, E., & Manna, C. 2021, https://doi.org/10.3390/ijms22126604). Однако сложности вызывает экстраполяция данных экспериментов (ex vivo) на процессы, происходящие в живом организме. Следует отметить, что ряд современных авторов утверждает, что воздействие высоких доз тяжелых металлов (ртути и свинца) не оказывает влияния на свертывающую систему крови (Nielsen, V.G. Lethal concentrations of mercury or lead do not affect coagulation kinetics in human plasma//J Thromb Thrombolysis 2019, 48, 697-698. doi.org/10.1007/s11239-019-01921-х.). Так, в эксперименте не отмечено существенной разницы в значениях кинетических параметров свертывания по сравнению со значениями, полученными для плазмы без добавления металла.

Такая противоречивость и разрозненность сведений определили цель предлагаемого изобретения - создание модели хронической токсической коагулопатии.

Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования коагулопатии(Arbi S, Oberholzer HM, Van Rooy MJ, Venter С, Bester MJ. Effects of chronic exposure to mercury and cadmium alone and in combination on the coagulation system of Sprague-Dawley rats // Ultrastruct Pathol. 2017 Jun 15:1-9. doi: 10.1080/01913123.2017.1327909), включающий введением в организм крыс Sprague-Dawley сточных вод с питьевой водой с содержанием хлорида кадмия (CdCl₂) в дозе, превышающей ПДК в 1000 раз (приблизительно 0.696 мг/кг) в течение 28 дней. Было выявлено, что соли кадмия способны активировать прокоагулянтные свойства тромбоцитов.

Недостатком данного способа является выбор соединения кадмия, способ и длительность введения, сложность определения количества кадмия, поступающей в организм с питьевой водой на единицу массы тела животного и отсутствие сведений о состоянии плазменного звена системы гемостаза при воздействии тяжелого металла на организм экспериментальных животных.

Известно, что разные химические соединения тяжелых металлов имеют разные физико-химические свойства, и соответственно разную токсичность, и разные органы мишени повреждающего воздействия (Eto К, Takizawa Y, Akagi Н, et al. 1999, doi:10.1177/019262339902700608).

Недостатком данного способа является воздействие кадмия на организм в течение 28 дней, что не позволяет получить способ моделирования хронической коагулопатии. Эксперимент, проводимый в течение двух месяцев с введением низких дозировок кадмия является более приближенным к натуральным условиям, моделирует поступление кадмия в организм с водой и пищей из окружающей среды в условиях антропогенного загрязнения. Более информативно в разные сроки (две недели, один и два месяца) в динамике, изучение механизмов развития коагулопатии.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте.

Решение этой задачи позволяет более полно изучить в динамике патофизиологические механизмы развития коагулопатии при хронической кадмиевой интоксикации, создать способ моделирования хронической токсической коагулопатии, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на крысах и экономически выгодный.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте, включающий введение экспериментальным животным соединения кадмия, отличается тем, что белым крысам линии Wistar каждый день в течение 60 дней вводят раствор сульфата кадмия через атравматичный зонд в желудок в дозе 0,3 мг/кг веса животного, где на единицу раствора, равную 0,3 мл, приходится 0,03 мг кадмия по металлу.

Данный способ отличается от прототипа использованием в качестве токсического вещества - сульфата кадмия, длительностью и дозировкой введения металла.

Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введение сульфата кадмия в течение 60 дней в дозе 0,3 мг/кг приводит к развитию токсической коагулопатии у крыс. Это является удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте. В научно-медицинской литературе нами не выявлено описание использования сульфата кадмия для моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном и легко воспроизводимом способе моделирования хронической токсической коагулопатии, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом. Для получения токсического вещества сульфат кадмия растворяют в дистиллированной воде таким образом, что в единице раствора, равной 0,3 мл, содержится 0,03 мг кадмия (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,3 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор сульфата кадмия вводят через атравматичный зонд в желудок в дозе 0,3 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней.

Материалом для исследования является цельная кровь, а также плазма крови богатая и бедная тромбоцитами. Забор крови, стабилизация и получение образцов плазмы осуществляются с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики, СПб.: Формат, 2006, 208 с).

В пробах плазмы крови определяются следующие показатели: количество тромбоцитов и их агрегационную активность (индуктор АДФ - 10,0 мкг/мл), содержание фибриногена, активность протеина С и антитромбина АТ(III), относительное время полимеризации фибрин-мономеров (ВПФМ), время спонтанного эуглобулинового лизиса (ВСЭЛ), растворимые фибринмономерные комплексы (РФМК) (Елыкомов В.А., Момот А.П. Способ определения количества растворимого комплекса фибрин-мономера в плазме крови/ Авторское свидетельство 1371219, 1987, СССР; Баркаган, З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза, М.: Нъюдиамед-АО, 2008, 292 с.). Использовали агрегометр Helena (Великобритания) и коагулометр автоматический Helena - АС4, с использование диагностических наборов «Helena» (Великобритания); спектрофотометр «PV1251A», Solar, Беларусь; диагностические наборы «Технология стандарт», Барнаул.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ "STATISTICA 10.0" (StatSoft) и Microsoft Excel 2016. Данные были представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25;Q75) в связи с малым количеством вариантов в выборке. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.

Пример. Крысам-самцам линии Вистар в течение двух недель, одного и двух месяцев (по 10 крыс в каждой группе) ежедневно один раз в сутки через зонд в желудок вводили раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг веса животного. Контролем служили интактные животные (10 крыс) содержащиеся в стандартных условиях вивария. Для изучения системы гемостаза в крови определяли показатели, характеризующие состояние клеточного звена: количество тромбоцитов и их агрегационную активность; коагуляционного звена: АЧТВ, ПВ, ВПФМ, активность протеина С, активность AT (III), время ВСЭЛ; содержание фибриногена и уровня тромбинемии - РФМК. При проведении опытов на животных руководствовались правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. №199).

Опыты показали, что через две недели и один месяц введения сульфата кадмия выявлялось увеличение концентрации фибриногена, концентрации тромбоцитов и их агрегационной активности (таблица 1). Одновременно возрастала активность протеина С и антитромбина III. Через один месяц происходило также укорочение АЧТВ (р≤0,001). Гиперкоагуляционная направленность изменений системы гемостаза компенсировалась активацией противосвертывающей системы и процессов фибринолиза. Время спонтанного эуглобулинового лизиса укорачивалось (р≤0,01). Через два месяца гиперкоагуляционная направленность системы гемостаза сохранялась, но выявлялось истощение противосвертывающей системы и фибринолиза (Полученные результаты отражены в таблице 1).

Активность протеина С сохранялась выше фона, но выявлялось уменьшение активности антитромбина (р≤0,001). Время спонтанного эуглобулинового лизиса укорачивалось (р≤0,001). На фоне значимого повышения уровня растворимых фибринмономерных комплексов (р≤0,001), можно констатировать развитие состояния тромботической готовности. Вместе с тем количество тромбоцитов и их агрегационная активность сохранялись повышенными (р≤0,01 и р≤0,001), уровень фибриногена был значимо выше контроля (р≤0,01). Состояние гиперкоагуляции и тромбинемии чаще сопровождаются расходованием фибриногена и тромбоцитопенией, вследствие активации процессов «непрерывного внутрисосудистого свертывания крови». Однако по данным литературы, при длительной стимуляции системы гемостаза при хронических патологических процессах и интоксикациях возможно развитие тромбинемии при сохраняющихся высоких уровнях острофазного белка фибриногена и также увеличения количества тромбоцитов (Петрищев Н.Н., Попаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний, Санкт-Петербург, 1999. - 120 с; А.П. Момот, Л.П. Цывкина, И.А. Тараненко Современные методы распознавания тромботической готовности, Барнаул, Изд-во Алт. ун-та, 2011, С.138.), что наблюдалось при хронической интоксикации в наших исследованиях.

Предлагаемый способ моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте является эффективным, позволяет подробно изучить патофизиологические механизмы формирования токсической коагулопатии при длительной кадмиевой интоксикации и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики нарушений свертывающей системы крови.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, и может быть использовано для моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс в эксперименте. Для этого крысам ежедневно один раз в сутки в течение 60 дней внутрижелудочно вводят раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг веса животного. При этом на единицу раствора, равную 0,3 мл, приходится 0,03 мг кадмия по металлу. Изобретение обеспечивает развитие токсической коагулопатии у животных за счет оптимальной дозы и срока воздействия металла, что может быть использовано при поиске средств профилактики и коррекции токсической коагулопатии. 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования хронической токсической коагулопатии у крыс, включающий внутрижелудочное введение экспериментальным животным соединения кадмия, отличающийся тем, что крысам каждый день в течение 60 дней вводят раствор сульфата кадмия через зонд в желудок в дозе 0,3 мг/кг веса животного, где на единицу раствора, равную 0,3 мл, приходится 0,03 мг кадмия по металлу.