СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ НЕФРОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХРОМА У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 A61K31/4045 A61P13/12 

Изобретение относится к экологии, экспериментальной медицине, токсикологии и может быть использовано при исследовании и разработке механизмов профилактики токсических нефропатий, вызванных длительным воздействием тяжелых металлов на организм, в частности хрома.

Загрязнение окружающей среды в результате жизнедеятельности человека является наиболее острой проблемой современности. Особую опасность представляют бионеразлагаемые загрязнители - тяжелые металлы. Соединения хрома признаны потенциальными нефротоксикантами у людей и животных (Sun Н Brocato J, Costa М. OralChromiumExposureandToxicity. Curr Environ Health Rep.2015;2(3):295-303. https://doi.org/10.1007/s40572-015-0054-z; Chen Q. Y, Murphy A., Sun H, Costa M. Molecular and epigenetic mechanisms of Cr(VI)-induced carcinogenesis. ToxicolApplPharmacol. 2019;377:114636. https://doi.org/10.1016/j.taap.2019.114636). Это объясняется медленным выведением металла из организма и способностью накапливаться в паренхиматозных органах. Высокая нефротоксичность хрома связывается с увеличением продукции свободных радикалов, что вызывает окислительное повреждение мембранных структур (Аксенова М.Е. Тяжелые металлы: механизмы нефротоксичности Нефрология и диализ. -2000.- Т. 2, №1-2. С. 55; Des Marais Т. L., Costa М. Mechanisms of Chromium-Induced Toxicity. CurrOpinToxicol. 2019; 14:1-7. https://doi.org/10.1016/j.cotox. 2019.05.003). Актуальным является разработка методов профилактики нефротоксического действия соединений хрома.

При токсическом воздействии тяжелых металлов на сегодняшний день применяются различные детоксиканты (тиоловые соединения - унитиол, сукцимер, тиосульфат натрия, различные комплексоны - пентацин, динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин, α-пеницилламин и др.). Вместе с тем, наряду с терапевтическим эффектом они могут способствовать развитию аллергических реакций, лейкопении, тромбоцитопении, расстройств желудочно-кишечного тракта, и др. (Машковский М.Д., 1998). Они способны увеличить выведение из организма микроэлементов и таких жизненно важных ионов, как железо, кальций и др. (Дубищев А.В., 1994; Elias М.М., Girardi G.P., 1991), вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное и профилактическое применение (Ahmed S, Rahman A, Saleem М, Athar М, Sultana S. 1999, Husain N., MahmoodR. 2020,).

Ранее была показана эффективность применения универсального эндогенного адаптогена, естественного антиоксиданта - гормона эпифиза мелатонина, при нефропатиях, вызванных токсическим действием ртути, свинца, кадмия (Брин В.Б., Митциев А.К. 2016, 2020), однако возможности его применения с целью профилактики нефропатии, вызванной длительным поступлением хрома в организм, ранее не изучались.

Наиболее близким к заявляемому является способ снижения нефротоксического действия хрома (Sabiha F, Riaz М. Vitamin С attenuates potassium dichromate-induced nephrotoxicity and alterations in renal brush border membrane enzymes and phosphate transport in rats // Clinica Chimica Acta, 2007, Volume 386, Issues 1-2, Pages 94-99, doi. org/10.1016/j.cca.2007.08.006) заключающийся в том, что животным однократно внутрибрюшинно вводили бихромат калия (К2Сг207) (15 мг/кг массы тела). Нефротоксичность оценивали по уровню повышения азота мочевины и креатинина в сыворотке крови. Предварительное введение однократной дозы витамина С (250 мг/кг массы тела) защищало почки от повреждающего действия хрома.

• Недостатком способа является то, что при внутрибрюшинном введении возможны воспалительные процессы в брюшной полости, что осложняет трактовку результатов экспериментов, а также точность и контроль дозозависимого эффекта хрома. При этом внутрижелудочный способ введения более приближен к естественным условиям поступления тяжелых металлов в организм в условиях загрязнения внешней среды.

• Следующим недостатком является высокая доза используемого витамина, так как гипервитаминоз может снижать собственные защитные резервы организма.

• Авторы данного исследования не описывают возможность применения витамина С для профилактики нефротоксического действия хрома при длительном введении металла в организм. В современных условиях экологии чаще встречается хроническая интоксикация, нежели острая, поэтому более актуально изучение хронического воздействия хрома. Также нет достоверных данных о профилактическом влиянии на патогенетические звенья нефропатии.

Целью данного исследования было изучить профилактическое действие мелатонина на морфо-функциональные изменения почек при длительном внутрижелудочном введении в организм бихромата калия.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики нефротоксического действия хрома у крыс в эксперименте.

Технический результат, получаемый в результате использования изобретения, состоит в обеспечении значительного снижения нефротоксического действия хрома у крыс при хроническом отравлении за счет цитопротекторного действия антиоксиданта мелатонина, что подтверждается результатами функционального и гистологического исследования почек.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа профилактики нефротоксического действия хрома у крыс в эксперименте имеет следующие отличительные признаки: крысам линии Вистар каждый день в течение двух месяцев вводят водный раствор антиоксиданта мелатонина в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением через зонд в желудок 0,5 мл раствора бихромата калия, содержащего 0,05 мг хрома, на 100 г массы тела животного.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что впервые применяется естественный антиоксидант мелатонин с целью профилактики нефротоксического влияния хрома у крыс при длительном поступлении металла в организм. Одновременное введение (что означает введение в пределах одного срока - 2 мес.) бихромата калия и мелатонина обеспечивает уменьшение патологического воздействия хрома на почки у крыс. Мелатонин, являясь мощным антиоксидантом, стабилизирует мембраны клеток и уменьшает деструктивное действие продуктов свободнорадикального окисления. Это подтверждается результатами изучения функций почек и гистологического исследования тканей органа. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики нефротоксического действия хрома у крыс при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсической хром индуцированной нефропатии у крыс, путем восстановления структуры и функции почек за счет цитопротекторного действия антиоксиданта мелатонина, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом:

Для получения токсического вещества бихромат калия растворяют в дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома (в пересчете на металл). Раствор мелатонина готовится таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,5 мг мелатонина. Раствор мелатонина готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением.

Двум группам животных ежедневно один раз в сутки в течение двух месяцев вводили в желудок при помощи шприца через атравматичный зонд - 0,5 мл раствора бихромата калия на каждые 100 г веса экспериментальных животных, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм. Одновременно, с первого дня введения бихромата калия, одной из групп каждый день вводится раствор мелатонина через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг с помощью шприца многоразового использования со специально изогнутой иглой, на которую надет зонд.

Изучение основных процессов мочеобразования проводится в условиях 6-часового спонтанного диуреза. По истечении времени эксперимента крысы забиваются под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы и тканей. Расчеты основных показателей функционального состояния почек производятся по общепринятым формулам Наточина Ю.В.

Для проведения гистологических исследований образцы тканей почки фиксируются в 10% нейтральном формалине, после чего подвергаются заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Zeiss Primo Star под увеличением 40×100×400.

Сущность способа подтверждается результатами исследования функционального состояния почек (нарушения электролито-водовыделительной функции почек, протеинурия) и морфологического исследования тканей почки, демонстрирующих уменьшение проявлений токсической нефропатии у крыс при введении мелатонина на фоне хронической интоксикации бихроматом калия в течение двух месяцев.

Фиг. 1. - Ткань почек при хронической интоксикации бихроматом калия в дозе 0,5 мг/кг в течение двух месяцев.

Краткое описание чертежа: (а) - резко расширены просветы внутриклубочковых мочевых пространств за счет эозинофильных белковых масс; (б) признаки гидропической дистрофии эндотелиоцитов, эпителий почечных канальцев с выраженной гиалиново-капельной дистрофией; (в) канальцы с некротическими изменениями; (г) выраженный отек в строме и воспалительная, преимущественно мононуклеарная инфильтрация; (д) выраженное застойное венозное полнокровие.

Фиг. 2. - Ткань почек при хронической интоксикации бихроматом калия в течение двух месяцев на фоне профилактического введения мелатонина в дозе 5 мг/кг

Краткое описание чертежа: (а) уменьшение компрессии капиллярного аппарата клубочка за счет снижения количества эозинофильных белковых масс в просветах полости капсулы Боумена - Шумлянского (б) редукция признаков гидропической дистрофии эндотелиоцитов; (в) снижения уровня гиалиново-капельной дистрофии и отсутствием некротических изменений эпителия почечных канальцев с выраженной положительной динамикой, (г) в строме уменьшение выраженности отека и воспалительной инфильтрации на фоне сохраняющегося застойного венозного полнокровия. Окр. эозином и гематоксилином, × 400.

Пример. Двум группам крыс самцов линии Вистар массой 300-350 г вводили через зонд в желудок 0,5 мл раствора бихромата калия («Полихим», Россия), содержащего 0,05 мг хрома на 100 г массы тела животного в течение двух месяцев. Мелатонин (препарат Мелаксен - Unipharm, USA) в дозе 5 мг/кг массы тела ежедневно вводили половине опытных животных через зонд в желудок. Контролем служили интактные крысы, получавшие соответствующее количество воды через зонд в желудок.

В период исследований экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении опытов руководствовались Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных (1985) и Правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003).

Исследование функционального состояния почек у крыс проводили в условиях 6 часового спонтанного диуреза через две недели, один и два месяца эксперимента. В плазме крови и моче определяли концентрацию общего белка, креатинина (PV1251A, «SOLAR», Беларусь; наборы реактивов Агат-Мед, Москва, Россия), натрия и калия (с помощью анализатора электролитов АЭК-01, КвертиМед, Россия). На основании полученных данных были рассчитаны функциональные показатели почек: объем диуреза (V, мл/ч/100 г), скорость клубочковой фильтрации (по клиренсу эндогенного креатинина F, мл/ч/100 г), относительная канальцевая реабсорбция воды (R_H2O, %), фильтрационный заряд (Ff_Na) натрия и калия Ff_K (мкмоль/ч/100 г), их экскреция (U_Na×V, UK×V мкмоль/ч/100 г) и относительная канальцевая реабсорбция натрия (R_Na, %).

Статистический анализ результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel 2016 и STATISTICA 10.0., StatSoft с учетом распределения признаков в группах по критерию Шапиро-Уилка. Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25÷Q75). Статистическую значимость различий в группах животных оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни. Для оценки статистической зависимости рядов наблюдений использовали коэффициент ранговой корреляции (r_s) Спирмена. Уровнень статистической значимости р≤0,05.

Исследования мочеобразовательной функции почек показали, что внутрижелудочное введение бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг в течение двух месяцев приводит к нарушению электролито-водовыделительной функции почек, протеинурии (Таблица 2.), подтверждая данные литературы о выраженной нефротоксичности соединений хрома (Сr⁶⁺). Интоксикация вызывала развитие полиурии через две недели и один месяц вследствие уменьшения канальцевой реабсорбции воды (Таблица 1.). Через два месяца полиурия сохранялась, не смотря на достоверное уменьшение клубочковой фильтрации воды. Изучение электролитовыделительной функции показало, что под влиянием хрома происходит увеличение выведения натрия с мочой, вследствие подавления канальцевой реабсорбции катиона в начальные сроки эксперимента. Через два месяца фильтрационный заряд натрия уменьшался, вследствие уменьшения скорости клубочковой фильтрации воды и гипонатриемии, однако интенсивность натриуреза продолжала увеличиваться вследствие подавления канальцевого транспорта натрия (Таблица 2.).

Содержание калия в плазме крови возрастало по срокам экспериментов. Это возможно связано с гемотоксическим действием соединений хрома, которые, воздействуя на мембраны форменных элементов, могут вызывать их разрушение. Экскреция калия увеличивалась вследствие роста фильтрационного заряда калия через один месяц. Через два месяца уровень калийуреза сохранялся высоким, не смотря на то что выявлялось уменьшение фильтрационного заряда катиона относительно опыта через месяц, вероятно вследствие изменения почечной обработки калия в условиях гиперкалиемии.

На фоне профилактического введения мелатонина изменения показателей мочеобразования были менее выражены. У экспериментальных животных, получавших в течение двух месяцев раствор мелатонина в дозе 5 мг/кг на фоне введения хрома, происходило достоверное увеличение диуреза относительно контрольной группы вследствие снижения канальцевой реабсорбции воды, но уровень реабсорбции оставался достоверно выше, чум у крыс с изолированным введением раствора бихромата калия (Таблица 1.). Скорость клубочковой фильтрации не менялась относительно интактного контроля.

Применение мелатонина уменьшало степень изменения почечной обработки электролитов относительно контроля, получавшего перорально только бихромат калия.

Мелатонин препятствовал росту экскреции натрия за счет менее выраженного уменьшения канальцевой реабсорбции катиона. Экскреция калия возрастала в более поздние сроки и была ниже чем у опыта с введением только хрома вероятно вследствие менее выраженных изменений концентрации калия в плазме крови (Таблица 2.).

Важным маркером нарушения функции почек является содержание белка в моче. Токсическое поражение бихроматом калия почечной ткани приводило к развитию выраженной протеинурии. На фоне внутрижелудочного введения мелатонина концентрация белка в моче достоверно уменьшалась (Таблица 1.).

Морфологически у животных при внутрижелудочном введением бихромата калия в течение двух месяцев отмечаются следующие изменения: просветы внутриклубочковых мочевых пространств резко расширены за счет эозинофильных белковых масс (а). На фоне сморщивания капиллярный аппарат клубочка имеет признаки гидропической дистрофии эндотелиоцитов (б). Эпителий почечных канальцев с выраженной гиалиново-капельной дистрофией. Часть канальцев с некротическими изменениями (в). В строме выраженный отек и воспалительная, преимущественно мононуклеарная инфильтрация (г). Также обращает на себя внимание выраженное застойное венозное полнокровие (д).

У крыс на фоне профилактического введения мелатонина, при хронической интоксикации бихроматом калия через два месяца наблюдалось уменьшение компрессии капиллярного аппарата клубочка за счет снижения количества эозинофильных белковых масс в просветах полости капсулы Боумена - Шумлянского (а) с редукцией признаков гидропической дистрофии эндотелиоцитов (б); состояние эпителия почечных канальцев с выраженной положительной динамикой в виде снижения уровня гиалиново-капельной дистрофии и отсутствием некротических изменений. (в). В строме уменьшение выраженности отека и воспалительной инфильтрации на фоне сохраняющегося застойного венозного полнокровия (г).

Таким образом, профилактическое введение антиоксиданта мелатонина крысам линии Вистар на фоне хронической интоксикации способно смягчить нефротоксические эффекты хрома, оказывая благоприятное влияние на сохранность основных показателей функционального и морфологического состояния почек. Полученные данные позволяют рекомендовать применение Мелаксена для разработки способов коррекции нарушений мочеобразовательной функции почек при воздействии на организм соединений хрома.

Изобретение относится к экологии, экспериментальной медицине, токсикологии и может быть использовано при исследовании и разработке механизмов профилактики токсических нефропатий, вызванных длительным воздействием тяжелых металлов на организм, в частности хрома. Способ включает введение мелатонина и бихромата калия. Крысам каждый день в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелатонин в дозе 5 мг/кг и водный раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг веса крыс, где на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома по металлу. Изобретение обеспечивает снижение нефротоксического действия хрома у крыс при хроническом отравлении. 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ профилактики нефротоксического действия хрома у крыс в эксперименте, включающий введение антиоксиданта и бихромата калия, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта животным каждый день в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелатонин в дозе 5 мг/кг и водный раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг веса крыс, где на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома по металлу.