СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ НЕФРОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СУРЬМЫ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/29 A61K31/4045 A61P13/12 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано при изучении методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности сурьмы, на функциональное состояние почек.

Токсическое действие сурьмы и ее соединений известно из трех основных источников: ее применяли в качестве лекарств на протяжении долгих лет, исследования здоровья работников сурьямных производств и ее присутствие в современной городской среде и домашних условиях (McCallum RI. Occupational exposure to antimony compounds. J Environ Monit. 2005 Dec; 7(12): 1245-50. doi: 10.1039/b509118g. Epub 2005 Oct 26. PMID: 16307078). Исходя из этого, можно сказать, что человек довольно часто имеет контакт с этим металлом. При поступлении в организм сурьма накапливается в различных органах и оказывает негативное воздействие на них (Friedrich K, Vieira FA, Porrozzi R. Disposition of antimony in rhesus monkeys infected with Leishmania braziliensis and treated with meglumine antimoniate // J Toxicol Environ Health A. 2012; 75(2): 63-75. doi: 10.1080/15287394.2012.624826; Tanu T, Anjum A, Jahan M. Antimony-Induced Neurobehavioral and Biochemical Perturbations in Mice // Biol Trace Elem Res. 2018 Nov; 186(1): 199-207. doi: 10.1007/s12011-018-1290-5). Очень часто в литературе встречаются сведения о ее нефротоксичности. Соединения сурьмы при попадании в организм приводят к протеинурии, некрозу канальцев, описаны также случаи острой почечной недостаточности вследствие приема препаратов, содержащих данный металл (Vikrant S, Gupta D, Kaushal SS. Sodium stibogluconate-associated acute interstitial nephritis in a patient treated for visceral leishmaniasis // Saudi J Kidney Dis Transpl. 2015 Jul-Aug; 26(4): 757-60. doi: 10.4103/1319-2442.160203; Wan F, Zhong G, Wu S. Arsenic and antimony co-induced nephrotoxicity via autophagy and pyroptosis through ROS-mediated pathway in vivo and in vitro. Ecotoxicol Environ Saf. 2021 Sep 15, 221: 112442. doi: 10.1016/j.ecoenv.2021.112442; Mlika BR, El Aïdli S, Ben Brahim M. Effets indésirables du traitement systémique de la leishmaniose cutanée par Glucantime: expérience Tunisienne [Adverse events related to systemic treatment using Glucantime for cutaneous leishmaniasis: a report from Tunisia]. Med Trop (Mars). 2008 Oct; 68(5): 499-501. French).

Известен «Способ лечения и профилактики интоксикации тяжелыми металлами у животных», включающий применение комплексообразующего лекарственного средства (Патент RU 2366415, 10.09.2009. Бюл. №25, Рыжов А.А., Карпенко Л.Ю.). В случае обитания животных в зоне, загрязненной соединениями тяжелых металлов, применяют профилактическую дозировку препарата «Хелавит» 0,2-0,4 мл на 10 кг массы перорально с кормом при постоянном применении. Однако существенным недостатком препарата является его высокая нефро- и гепатотоксичность. При применении данного препарата ускоряется выведение с мочой и важных микроэлементов - кальция, железа, меди, происходит нарушение обменных процессов, что затрудняет его длительное использование в профилактических целях.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ профилактики токсического действия сурьмы у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий применение аскорбиновой кислоты (Kato ЛС, Morais-Teixeira Е, Reis PG, Silva-Barcellos NM, Salaün P, Campos PP, Dias Corrêa-Junior J, Rabello A, Demicheli C, Frézard F. Hepatotoxicity of pentavalent antimonial drug: possible role of residual Sb(III) and protective effect of ascorbic acid. Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(1): 481-8. doi: 10.1128/AAC.01499-13). В ходе данного исследования лабораторные крысы были поделены на 2 группы: 1 группа получала сурьму в дозе 80 мг/кг/день в виде антимониата меглюмина, 2 группа получала препараты сурьмы в сочетании с аскорбиновой кислотой (15 мг/кг/день) на протяжении 20-дневного периода. Недостатком данного метода является непродолжительный срок эксперимента, который не позволяет в полной мере оценить профилактический эффект аскорбиновой кислоты. Отсутствие безопасного и эффективного способа детоксикации объясняет необходимость поиска новых средств для лечения и профилактики токсического действия сурьмы.

Наиболее простой и доступный метод профилактики хронической сурьмяной интоксикации состоит в использовании естественного антиоксиданта Мелатонина.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа уменьшения нефротоксичности сурьмы у экспериментальных животных.

Основным техническим результатом предложенного изобретения является значительное снижение выраженности нефротоксического действия сурьмы при хроническом отравлении, за счет цитопротекторного действия антиоксиданта мелатонина, и улучшения морфофункционального состояния почек. Профилактическое введение мелатонина в условиях хронической интоксикации хлоридом сурьмы оказывает выраженный антиоксидантный эффект, приводящий к снижению процессов липопероксидации и одновременному повышению активности супероксиддисмутазы и каталазы, и тем самым устраняет дисбаланс в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты.

Для достижения данного технического результата заявляемое изобретение способа профилактики нефротоксического действия сурьмы у экспериментальных животных имеет следующие существенные признаки: крысам ежедневно внутрижелудочно вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор хлорида сурьмы в дозе 3 мг/кг в пересчете на металл в течение двух месяцев, где на единицу раствора равную 1 мл приходится 0,3 мг сурьмы.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что впервые применяется мелатонин с целью профилактики нефротоксических эффектов сурьмы при длительном поступлении металла в организм. Одновременное введение (что означает введение в пределах одного срока - 2 мес.) мелатонина и хлорида сурьмы обеспечивает уменьшение нефротоксического воздействия металла у экспериментальных животных путем уменьшения деструктивного действия продуктов свободнорадикального окисления, стабилизации мембран клеток, что подтверждается результатами изучения морфофункционального состояния почек и увеличения антиоксидантного потенциала. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

Проведенный заявителем анализ уровня техники позволил установить, что аналоги, характеризующиеся совокупностью существенных признаков, тождественных всем признакам заявляемого способа отсутствуют. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Результаты поиска известных решений в данной и смежных областях показали, что сущность заявляемого изобретения не следуют для специалистов явным образом из известного уровня техники. В научно-медицинской литературе не выявлено описания использования данного антиоксиданта с целью профилактики хронической токсической нефропатии вызванной длительным введением хлорида сурьмы у экспериментальных крыс. Следовательно, изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики нефротоксического действия сурьмы, путем снижения накопления и повышения выведения ее из организма при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом:

Для получения токсического вещества хлорид сурьмы растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг вещества. На каждые 100 г. веса крысы вводится 1 мл раствора, что не является водной нагрузкой на организм животного.

Раствор мелатонина готовится ежедневно перед внутрижелудочным введением. В дистиллированной воде растворяют таблетки Мелаксена таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл. приходится 0,5 мг мелатонина.

Через 2 месяца эксперимента проводится изучение основных процессов мочеобразования в условиях 6 часового спонтанного диуреза, содержание белка в моче, процессов перекисного окисления липидов и гистологическое исследование тканей почки. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. С целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ) определяют активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах.

Пример. На 70-ти половозрелых крысах самцах линии Вистар массой 300-350 гр. было проведено исследование: 1-я контрольная группа - интактные животные, группы 2, 3 и 4, животные, которым ежедневно вводился токсический раствор соли сурьмы через атравматичный зонд в желудок в дозе 3 мг/кг на протяжении двух недель (20 крыс), одного месяца (20 крыс) и двух месяцев (20 крыс). Половина опытных животных также получала раствор мелатонина, который также вводился внутрижелудочно с помощью гибкого зонда в дозе 5 мг/кг. В качестве токсиканта выступал хлорид сурьмы, растворенный в дистиллированной воде так, чтобы на единицу раствора, равную 1 мл, приходилось 0,3 мг вещества. На каждые 100 г. массы тела крысы был введен 1 мл раствора (0,3 мг Sb3+), во избежание водной нагрузки на организм животных. Раствор хлорида сурьмы вводился ежедневно животным через зонд на протяжении двух месяцев. Основные процессы мочеобразования, уровень натрия и калия в крови и их почечная обработка почками были изучены в условиях спонтанного 6-часового диуреза. Для исследования функции почек в условиях спонтанного диуреза животных помещали в обменные клетки и собирали мочу в течение 6 часов. После окончания эксперимента для исследования плазмы и тканей крысы были подвергнуты эвтаназии, которая производилась под наркозом (Золетил-100, 5 мг/100 г.) Содержание натрия и калия в биологических образцах определялось ионоселективным методом на анализаторе электролитов АЭК-1, Кверти-Мед, Россия. Концентрацию креатинина в моче и плазме крови, общего белка в моче определяли спектрофотометрически. Измерения выполняли на спектрофотометре «Solar» Беларусь. При помощи формул Ю.В. Наточина (1974) произвели расчеты скорости клубочковой фильтрации, величины канальцевой реабсорбции воды, экскреции натрия, калия, фильтрационного заряда катионов и относительной канальцевой реабсорбции натрия. Состояние процессов перекисного окисления липидов оценивали по уровню гидроперекисей в плазме крови и малонового диальдегида в эритроцитах. Антиоксидантный статус оценивался по активности катал азы и супероксиддисмутазы (СОД).

Для проведения гистологических исследований образцы тканей почек фиксировались в 10% нейтральном формалине, затем подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводили в проходящем свете с помощью микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.

Эксперименты с животными были проведены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» (1985), 11-ой статьей Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. №199).

Для статистической обработки результатов использовались программы Statistica 10.0 StatSoft, США и Microsoft Excel. Данные были представлены в виде медианы (Me) и [Q25÷Q75] интерквартильного размаха в связи с малым количеством вариантов в выборке. Различия между показателями в экспериментальных группах определяли с применением U-критерия Манна Уитни. Корреляционный анализ был проведен с использованием критерия r_s Спирмена. Различия считались достоверными при р<0,05.

Проведенные опыты показали, что внутрижелудочное введение сурьмы на протяжении одного и двух месяцев приводит к нарушению процессов мочеобразования (Таблица 1, 2).

Спустя один месяц экспериментов у крыс происходило значительное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза (р≤0,001) вследствие снижения относительной канальцевой реабсорбции воды (р≤0,001). Объем диуреза спустя 2 месяца снижался как относительно одного месяца интоксикации, так и относительно контроля (р≤0,001), вследствие уменьшения скорости клубочковой фильтрации (р≤0,001), несмотря на достоверное снижение канальцевой реабсорбции воды (р≤0,01), но существенно меньшее, чем через 1 месяц. Нарушения деятельности почек проявлялись выраженной протеинурией как через 1 месяц интоксикации, так, особенно, через 2 месяца, когда содержание белка в моче возрастало в 7 раз (р≤0,001).

Изучение электролитовыделительной функции почек показало повышенную экскрецию натрия через один месяц вследствие понижения канальцевой реабсорбции катиона (Таблица 2). Вместе с тем через два месяца на фоне снижения канальцевой реабсорбции экскреция натрия от контрольных значений достоверно не отличалась, вероятно вследствие развивающейся патологии клубочкового аппарата. Уменьшение фильтрационного заряда натрия было обусловлено снижением скорости клубочковой фильтрации воды и уменьшением концентрации катиона в плазме крови.

Экскреция калия увеличивалась после одного месяца экспериментов, вероятно, из-за тенденции к увеличению фильтрационного заряда и вследствие изменения канальцевой обработки катиона в условиях гиперкалиемии. Развитие гиперкалиемии может быть связано с воздействием тяжелого металла на биологические мембраны клеток крови и разрушением эритроцитов (Ахполова В.О., Брин В.Б. Современные представления о кинетике и патогенезе токсического воздействия тяжелых металлов (обзор литературы) // Вестник новых медицинских технологий. 2020. Т. 27. №1. С. 55-61; Brin Vadim, Dzerassa Tsarakhova, Nikolai Sokolovsky, Elmira Gagloeva Experimental model of nephropathy in rats with prolonged antimony intoxication // Archiv euromedica. 2022. Vol. 12. №3. DOI: 10.35630/2199-885Х/2022/12/3.32). Повышению содержания калия в плазме могло также способствовать и развитие некробиотических процессов в ткани почек. Через два месяца эксперимента росту содержания калия в плазме крови способствовало падение фильтрационного заряда катиона.

Опыты показали, что у крыс при внутрижелудочном введении раствора хлорида сурьмы развивается оксидативный стресс, о чем говорит повышение концентрации гидроперекисей и малонового диальдегида в мембранах эритроцитов и подавление активности антиоксидантов супероксиддисмутазы и каталазы по срокам исследования (Таблица 3). Исследование функциональных взаимосвязей между процессами мочеобразования и состоянием процессов перекисного окисления липидов и ферментов антиоксидантной защиты при формировании модели нефропатии при токсическом действии сурьмы и на фоне профилактического введения мелатонина выявило достоверные корреляционные связи. Уменьшение активности ферментов антиоксидантной защиты каталозы и супероксиддисмутазы имело тесную связь со степенью протеинурии и снижением канальцевой реабсорбции воды и натрия.

Морфологическое исследование тканей почки выявило признаки токсической нефропатии. У крыс с введением хлорида сурьмы в течение двух месяцев отмечалось появление свободных эозинофильных белковых масс в полости капсулы Боумена-Шумлянского с увеличением ее просвета и признаками компрессии капиллярного аппарата на фоне гидропической дистрофии эндотелия. Почечные канальцы с выраженной гиалиново-капельной белковой дистрофией и частичным некрозом эпителия, в просветах определяются эозинофильные белковые массы. Строма отечная, сосуды с признаками гиалиноза.

Изолированное введение мелатонина в дозе 5 мг/кг веса у контрольной группы крыс не вызывает достоверных изменений основных процессов мочеобразования. Профилактическое применение мелатонина в дозе 5 мг/кг смягчало проявления нефропатии при токсическом действии сурьмы (Таблица 1, 2). Введение мелатонина уменьшало степень изменения активности процессов липопероксидации в клетках, относительно значений в группе с изолированным введением сурьмы, и способствовало компенсаторному повышению активности каталазы и супероксиддисмутазы (Таблица 3). Морфологически на фоне профилактики мелатонином экспериментальной модели с хронической интоксикацией сурьмой в почках крыс также выявлялись выраженные альтеративные изменения, однако отмечалась тенденция к снижению уровня патологических изменений (Рисунок 1). Количество эозинофильных белковых масс в полости капсулы Боумена-Шумлянского значительно уменьшилось (а), что в свою очередь значительно снизило компрессионное влияние на капиллярный аппарат клубочка. Дистрофические изменения эпителия почечных канальцев сохранялись (б), но признаки некроза, достоверно выявленные при моделировании хронической интоксикации сурьмой, в данной группе животных уже не определялись. Это, в свою очередь, подтверждает положительный профилактический эффект мелатонина.

Результаты эксперимента показывают, что внутрижелудочное ведение антиоксиданта мелатонина крысам линии Вистар на фоне хронической интоксикации солями сурьмы уменьшает степень развития оксидативного стресса, препятствует развитию нарушений морфофункционального состояния почек при хронической интоксикации. Проведенное исследование показало перспективность дальнейшей разработки методов профилактики токсической нефропатии с применением в качестве эффективного средства - эндогенного антиоксиданта Мелатонина.

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, экспериментальной биологии. Способ включает ежедневное внутрижелудочное введение детоксиканта и раствора хлорида сурьмы. В качестве детоксиканта крысам с первого дня эксперимента вводят через зонд в желудок в течение двух месяцев антиоксидант мелаксен в дозе 5 мг/кг. Раствор сурьмы вводят через зонд в желудок один раз в сутки ежедневно в течение двух месяцев в дозе 3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг сурьмы. Способ позволяет значительно снизить выраженность нефротоксического действия сурьмы при хроническом отравлении, за счет цитопротекторного действия антиоксиданта мелатонина, и значительно улучшить морфофункциональное состояние почек. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ профилактики токсической нефропатии у крыс в эксперименте, включающий ежедневное внутрижелудочное введение детоксиканта и тяжелого металла, отличающийся тем, что в качестве детоксиканта животным с первого дня эксперимента вводят через зонд в желудок антиоксидант мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор хлорида сурьмы, вводимый через зонд в желудок один раз в сутки ежедневно в течение двух месяцев в дозе 3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг сурьмы.