ПРОТИВОРАКОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ АДЕНОВИРУС И ИНГИБИТОР КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ ИММУННОГО ОТВЕТА Российский патент 2021 года по МПК C12N7/00 C12N15/113 A61K38/19 

Уровень техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к противораковой композиции, содержащей опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Несмотря на стремительную разработку противораковых терапевтических средств, рак по-прежнему является одним из заболеваний с высоким уровнем смертности во всем мире. Основными способами лечения рака, традиционно применяемыми в клинической практике, являются хирургическое вмешательство, лучевая терапия и способы лечения с использованием противораковых средств, или способы максимального удаления из организма пациентов раковых клеток в качестве лечения, проводимого параллельно с вышеперечисленным. Однако эти виды лечения оказывают эффекты лечения только в том случае, когда раковые клетки полностью удалены на стадии, на которой относительно ранний рак еще не метастазирует, а также приводят к уничтожению других нормальных клеток, которые быстро делятся, и, таким образом, имеют недостаток, заключающийся в том, что могут быть вызваны различные побочные эффекты. Соответственно, недавно были проведены исследования по лечению рака с использованием опухолеспецифической иммунной активности организма в качестве иммунотерапевтического способа.

Однако иммунотерапию проводить сложно, поскольку рак характеризуется способностью не только «хитро» избегать и нарушать различные иммунные ответы, и, как результат, непрерывно поддерживать выживание опухолей, индуцируя формирование иммуносупрессорного микроокружения опухоли, но также уклоняться от активированного противоопухолевого иммунного ответа, даже в случае активации иммунной системы. Соответственно, с целью усиления иммунного ответа в отношении раковых клеток за счет улучшения в отношении иммуносупрессорного микроокружения опухоли были осуществлены разнонаправленные исследования с применением генов цитокинов, таких как IL-12, IL-18, IL-23, интерферон гамма (IFN-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), костимулирующих факторов, таких как молекулы В7, дендритных клеток (DC), непосредственно служащих в качестве антигенпрезентирующих клеток (АРС), Т-клеток, активированных опухолевыми антигенами, естественных клеток-киллеров (NKC) и т.д. Известно, что IL-12 продуцируется АРС, такими как моноциты, макрофаги и DC, и посредством прямого воздействия на цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и NK-клетки, которые могут эффективно устранять раковые клетки, активирует их, стимулирует продукцию IFN-γ, а также повышает способность к уничтожению раковых клеток в результате прямого воздействия на них. Кроме того, IL-12 играет важную роль в содействии дифференцировке в Т-хелперы 1 (ТН1) путем воздействия на наивные CD4⁺ лимфоциты, и, таким образом, активации противоракового иммунного ответа путем индуцирования и усиления клеточноопосредованного иммунного ответа, что играет ключевую роль в выработке противоракового иммунного ответа. Кроме того, VEGF является сигнальным белком, продуцируемым клетками, которые способствуют ангиогенезу и васкуляризации, и он не только воздействует на предшественников Т-клеток в костном мозге, приводя к подавлению пролиферации и созревания Т-клеток и дендритных клеток, но также выполняет важную функцию в процессе васкуляризации, обуславливая тем самым нежелательное явление, называемое метастазированием рака. Соответственно, VEGF не только является стимулятором роста опухоли, но также действует как супрессор противоракового иммунитета, и ожидается, что отрицательная регуляция VEGF с помощью VEGF shRNA (короткой рибонуклеиновой кислоты, образующей шпильки) будет обеспечивать восстановление иммунных ответов и повышение противораковых эффектов. Кроме того, GM-CSF служит для усиления иммунных ответов CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток за счет стимуляции DC к содействию дифференцировке DC в АРС, и также вовлечен в процесс регуляции экспрессии молекул, составляющих главный комплекс гистосовместимости (МНС) класса II первичных моноцитов. Кроме того, сообщалось, что сильный противораковый иммунный ответ индуцируется в результате индуцирования множества АРС к скоплению вокруг опухолей благодаря эффекту экспрессии GM-CSF в опухолях с целью эффективного процессирования опухолевых антигенов.

Исходя из этого, в лаборатории авторов настоящего изобретения также был описан противоопухолевый эффект IL-12 с применением YKL-1 [Ad-E1B55] в качестве избирательного в отношении опухоли онколитического аденовируса с удаленным геном Е1В, кодирующим белок весом 55 кДа, и также был описан противоопухолевый эффект GM-CSF с применением аденовируса RdB с избирательной в отношении опухоли способностью к уничтожению, усиленной благодаря удалению гена Е1В и модификации Rb-связывающего сайта Е1А. Однако, несмотря на улучшение в отношении иммуносупрессорного микроокружения опухоли, при применении иммунотерапевтического способа все еще остается множество ограничений для полного излечения рака из-за низкой иммуногенности опухолей.

Раскрытие настоящего изобретения

Техническая задача

В результате интенсивных исследований по разработке иммунотерапии для преодоления уклонения опухолей от иммунологического надзора, авторы настоящего изобретения не только подтвердили превосходный противораковый эффект IL-12 и shVEGF (нацеленная на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) короткая рибонуклеиновая кислота, образующая шпильки) или IL-12 и GM-CSF-релаксина in vivo благодаря получению рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего их одновременно, но также подтвердили, что противораковый эффект рекомбинантного аденовируса улучшался при совместном введении с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, тем самым завершая настоящее изобретение, основанное на этом.

Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксин.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение медицинского применения рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение медицинского применения рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака в виде комбинированного состава с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.

Однако подлежащие решению с помощью настоящего изобретения технические задачи не ограничиваются вышеупомянутыми задачами, и другие задачи, которые не упоминались, будут несомненно понятны специалистам в данной области из нижеследующего описания.

Техническое решение

Для достижения целей настоящего изобретения, описанных выше, настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу, содержащему ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); и ген, кодирующий релаксин, или рекомбинантному аденовирусу, содержащему ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); и ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.

В качестве варианта осуществления настоящего изобретения, из рекомбинантного аденовируса могут быть удалены одна или несколько из областей, выбранных из группы, состоящей из областей Е1 и E3.

В качестве другого варианта осуществления настоящего изобретения, ген, кодирующий IL-12, может предусматривать последовательность гена IL-12A (р35), последовательность, кодирующую IRES, и последовательность гена IL-12B (р40), и может быть вставлен в место области Е1 или E3 рекомбинантного аденовируса.

В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, гены, кодирующие GM-CSF и релаксин, могут предусматривать последовательность гена GM-CSF, последовательность, кодирующую IRES, и последовательность гена релаксина, и могут быть вставлены в место области Е1 или E3 рекомбинантного аденовируса.

В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF, может комплементарно связываться с мРНК VEGF, и может быть вставлен в место области Е1 или E3 рекомбинантного аденовируса.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, причем композиция включает: рекомбинантный аденовирус; и фармацевтически приемлемый носитель.

В качестве варианта осуществления настоящего изобретения, композицию можно вводить совместно с любым из ингибиторов контрольной точки иммунного ответа, выбранным из группы, состоящей из антагониста PD-1 (белка 1 запрограммированной гибели клеток), антагониста PD-L1 (лиганда белка 1 запрограммированной гибели клеток), антагониста PD-L2, антагониста CD27 (кластера дифференцировки 27), антагониста CD28, антагониста CD70, антагониста CD80, антагониста CD86, антагониста CD137, антагониста CD276, антагониста KIR (иммуноглобулин-подобных рецепторов клеток-киллеров), антагониста LAG3 (белка, кодируемого геном 3 активации лимфоцитов), антагониста TNFRSF4 (члена 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли), антагониста GITR (глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка), антагониста GITRL (лиганда GITR), антагониста 4-1BBL (лиганда 4-1ВВ), антагониста CTLA-4 (ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами антигена 4), антагониста A2AR (рецептора А2А аденозина), антагониста VTCN1 (ингибитора 1 активации Т-клеток, содержащего домен, подобный V-домену иммуноглобулина), антагониста BTLA (В- и Т-лимфоцитарного аттенюатора), антагониста IDO (индоламин-2,3-диоксигеназы), антагониста TIM-3 (Т-клеточного белка 3, содержащего иммуноглобулиновый домен и домен муцина), антагониста VISTA (супрессора активации Т-клеток, содержащего IgV-подобный домен), антагониста KLRA и их комбинации.

В качестве другого варианта осуществления настоящего изобретения, композиция может обеспечивать усиление противоопухолевого иммунитета.

В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы, первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза, и рак также может представлять собой рецидивный рак.

Благоприятные эффекты

Рекомбинантный аденовирус с вставленными в него генами IL-12 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксина, в соответствии с настоящим изобретением, проявляет превосходный противораковый эффект за счет улучшения иммунных функций, и было подтверждено, что такой противораковый эффект заметно усилен за счет совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, и, таким образом, настоящее изобретение можно применять в качестве ключевой методики в области лечения рака.

Описание чертежей

На фиг. 1 проиллюстрированы характеристики онколитического аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и shRNA для VEGF, и она представляет собой изображение, схематически иллюстрирующее генетическую структуру RdB/IL12/shVEGF Ad. RdB содержит модифицированный ElA (мутация в связывающем белки Rb сайте, обозначенном звездочкой), а Е1В-19 и Е1В, кодирующий белок весом 55 кДа (E1B), и область E3 (E3) удалены; и гены IL-12 мыши и shVEGF мыши вставлены в место области Е1 или E3 генома аденовируса соответственно.

На фиг. 2 проиллюстрированы характеристики онколитического аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и GM-CSF и релаксин (GMCSF-релаксин), и она представляет собой изображение, схематически иллюстрирующее генетическую структуру RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad. Гены IL-12 и GMCSF-релаксина вставлены в место области Е1 или E3 генома аденовируса соответственно. GMCSF и релаксин также могут экспрессироваться в системе экспрессии, соединенной посредством последовательности, кодирующей IRES (участок внутренней посадки рибосомы), и в настоящем изобретении IRES представляет собой регуляторную последовательность, обнаруживаемую в РНК некоторых вирусов и клеток.

На фиг. 3 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1; αPD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 3А показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 3В показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой. В опухоли мышей C57BL/6 в день 1, 3 и 5 вводили 5×10⁹ вирусных частиц (VP) (фиг. 3А; исходный объем опухоли: 80-100 мм³) аденовируса, Ad, и внутрибрюшинно вводили 200 мкг антитела к PD-L1. Объем опухолей отслеживали и ежедневно регистрировали до завершения эксперимента. Красной стрелкой указано время инъекции аденовируса, а черной стрелкой указано время инъекции антитела.

На фиг. 4 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 4А показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 4В показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.

На фиг. 5 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, и показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей при введении RdB/IL12/shVEGF Ad в относительно низкой дозе, составляющей 1×10⁹ VP.

На фиг. 6 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, и показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX в относительно низкой дозе, составляющей 1×10⁹ VP.

На фиг. 7 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный совместным введением HmT-Rd19-K35/IL21 Ad, RdB/GMCSF/shVEGF Ad и YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой.

На фиг. 8 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, на фиг. 8А показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 8В показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.

На фиг. 9 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к CTLA-4), у мышей с меланомой, на фиг. 9А показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 9В показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.

На фиг. 10 показаны результаты, подтверждающие противоопухолевый эффект иммунологической памяти, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 10А показаны результаты, подтверждающие изменение объема вторичных опухолей при введении RdB/IL12/shVEGF Ad, и на фиг. 10В показаны результаты, подтверждающие изменение объема вторичных опухолей при совместном введении RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1).

На фиг. 11 показаны результаты, подтверждающие, на основе ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), изменение экспрессии IL-12 и GMCSF в соответствии с множественностью инфекции (MOI) после инфицирования линии клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Нар-Т1) с использованием RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.

На фиг. 12 показаны результаты, подтверждающие, на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR), изменение экспрессии релаксина в соответствии с MOI после инфицирования линии клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Нар-Т1) с использованием RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.

На фиг. 13 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка.

На фиг. 14 показаны результаты, подтверждающие, на основе иммуногистологического способа, изменение в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка.

На фиг. 15 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в дренирующем лимфатическом узле (DLN).

На фиг. 16 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в популяции лимфоцитов, инфильтрованных в опухолевые ткани.

На фиг. 17 показаны результаты, подтверждающие изменение экспрессии IFN-γ в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1).

На фиг. 18 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа.

На фиг. 19 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей в день 23 после введения, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа.

На фиг. 20 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты количественного определения накопления меченного Alexa 488 αPD-1 в опухолевых тканях с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

На фиг. 21 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты, подтверждающие, на основе иммунофлуоресценции, что меченное Alexa 488 αPD-1 локализируется в участке, где имеет место экспрессия CD4+ или CD8+ Т-клетками.

На фиг. 22 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении системной инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты анализа изображения, полученного с помощью позитронной эмиссионной томографии (PET) с использованием антител, в динамике.

На фиг. 23 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении системной инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты оценки и сравнения распределения или поглощения ⁶⁴CU-αPD-1 в различных тканях, включая опухолевые ткани, в виде %ID/г.

Способы осуществления настоящего изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу, включающему: ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); и ген, кодирующий релаксин, или рекомбинантному аденовирусу, включающему: ген, кодирующий IL-12; и ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.

Хотя генная иммунотерапия рака была разработана как более перспективный подход, опухоли также выработали множество «стратегий», позволяющих избежать системы иммунологического надзора. С целью преодоления этих сложностей и усиления эффектов противоракового иммунитета была сконструирована система на основе онколитического аденовируса (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), одновременно экспрессирующая IL-12 и нацеленную на ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) короткую РНК, образующую шпильки (shRNA), или IL-12 и GM-CSF-релаксин, в качестве подходящего терапевтического адъюванта для восстановления иммуносупрессии и повышения противоопухолевого иммунитета. IL-12 служит для повышения противоопухолевого иммунитета путем индуцирования дифференцировки Т-хелперов 1 и активации цитотоксичности цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров. Известно, что shVEGF и GM-CSF служат для усиления иммунного ответа CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток посредством содействия пролиферации и созреванию Т-клеток и дендритных клеток и стимуляции DC к содействию дифференцировке DC в АРС соответственно, и ожидается, что такие эффекты дополнительно усиливают функцию IL-12. Таким образом, авторы настоящего изобретения впервые предприняли попытки протестировать генную иммунотерапию с применением технического признака аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-2 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксин, на опухолях. Согласно одному примеру настоящего изобретения, в результате введения рекомбинантного аденовируса (RdB/IL 12/shVEGF Ad, RdB/IL 12/GMCSF-RLX Ad) в модели меланомы на животных было экспериментально подтверждено, что степень ингибирования роста опухоли, доля животных с полной ремиссией и доля выживших мышей увеличивались.

Кроме того, IL-12 привлек значительное внимание в качестве основного цитокина для применения при противораковой иммунотерапии, и, в частности, в методе противораковой иммунотерапии в случае пациентов с ослабленным иммунитетом организма повторное введение IL-12 зачастую рассматривалось для достижения оптимальной терапевтической эффективности. Однако в клинической практике известно, что IL-12 характеризуется цитокин-ассоциированной токсичностью для всего организма, в частности, почек, и, таким образом, его применение характеризуется техническим ограничением, заключающимся в том, что IL-12 в качестве противоракового терапевтического средства должен применяться в пределах ограниченного диапазона доз. Исходя из этих технических условий, рекомбинантный аденовирус, одновременно экспрессирующий ген IL-12 в соответствии с настоящим изобретением и дополнительный ген, характеризуется отличающимся техническим признаком, заключающимся в решении проблемы токсичности для нормальных клеток вследствие высокой дозы и необходимости повторного введения IL-12, что было отмечено как ограничение противораковой иммунотерапии в предшествующем уровне техники, посредством индуцирования высокого онколитического эффекта даже при низком титре вируса.

Соответственно, рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению характеризуется тем, что он включает ген, кодирующий IL-12, и включает любое из гена, кодирующего GM-CSF, гена, кодирующего релаксин, и гена, кодирующего shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.

Применяемый в настоящем изобретении «ген, кодирующий IL-12», предусматривает последовательность гена IL-12A (р35) и последовательность гена IL-12B (р40), и может предусматривать последовательность, кодирующую IRES, между последовательностью гена IL-12A (р35) и последовательностью гена IL-12B (р40) для обеспечения эффективной трансляции вирусного белка. Предпочтительно последовательность гена IL-12A (р35), последовательность гена IL-12B (р40) и последовательность, кодирующая IRES, могут состоять из SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3 соответственно, но не ограничиваются ими.

Применяемые в настоящем изобретении «ген, кодирующий GM-CSF» и «ген, кодирующий релаксин» предусматривают последовательность гена GM-CSF и последовательность гена релаксина соответственно, и могут также предусматривать последовательность, кодирующую IRES, между последовательностью гена GM-CSF и последовательностью гена релаксина. Предпочтительно последовательность гена GMCSF, последовательность гена релаксина и последовательность, кодирующая IRES, могут состоять из SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 и SEQ ID No. 3 соответственно, но не ограничиваются ими.

Применяемый в настоящем изобретении «ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF», имеет шпилечную структуру, и относится к гену, способному опосредовать РНК-интерференцию или сайленсинг генов. Ген содержит последовательность, комплементарную мРНК VEGF, и термин «комплементарный» означает не только случай 100% комплементарности, но также неполную комплементарность, достаточную для обеспечения возможности подавления экспрессии гена VEGF посредством механизма РНК-интерференции, и означает предпочтительно 90% комплементарность, более предпочтительно 98% комплементарность и наиболее предпочтительно 100% комплементарность. В настоящем описании случай 100% комплементарности конкретно описан как полная комплементарность. В настоящем изобретении, хотя продукт гена также описан как shVEGF, но не ограничивается им, продукт гена может комплементарно связываться с мРНК VEGF, представленной SEQ ID No. 6 или 7, для подавления экспрессии VEGF.

Подразумевается, что последовательности гена также предусматривают последовательность гена, характеризующуюся значительной степенью идентичности или значительной степенью подобия. Вышеупомянутая значительная степень идентичности относится к случайной последовательности, отличающейся от последовательности по настоящему изобретению, и характеризующейся по меньшей мере 80% гомологией, более предпочтительно 90% гомологией и наиболее предпочтительно 95% гомологией с последовательностью по настоящему изобретению при выравнивании ее на соответствие последовательности по настоящему изобретению в максимально возможной степени, и выровненные последовательности анализируют с применением алгоритма, обычно применяемого в данной области. Вышеупомянутая значительная степень подобия в совокупности относится ко всем изменениям в последовательности гена, таким как удаление или вставка одного или нескольких оснований, которые не влияют на цель настоящего изобретения по минимизации гомологичной рекомбинации с рекомбинантным аденовирусным вектором. Следовательно, последовательность гена по настоящему изобретению не ограничена приведенными в качестве примера последовательностями SEQ ID NO 1-6, и подразумевается, что она входит в объем правовой охраны настоящего изобретения при условии, что последовательность в значительной степени не влияет на активность конечного продукта, требуемого согласно настоящему изобретению.

Между тем, в качестве рекомбинантного аденовируса по настоящему изобретению можно применять онколитический аденовирус, широко известный в данной области. Согласно одному примеру настоящего изобретения, рекомбинантный аденовирус содержит активный ген Е1А и инактивированный ген E1B-19, инактивированный ген E1B-55 или инактивированный ген E1B-19/E1B-55. В настоящем описании термин «инактивация», применяемый по отношению к гену, означает, что транскрипция гена и/или трансляция продукта гена не осуществляется надлежащим образом, и функция нормального белка, кодируемого геном, не проявляется. Например, инактивированный ген E1B-19 представляет собой ген, неспособный продуцировать активный белок E1B весом 19 кДа вследствие модификации в гене (замены, добавления и частичного или полного удаления). Удаление E1B-19 может обеспечить повышение способности к уничтожению клеток, и удаление гена E1B-55 делает рекомбинантный аденовирус опухолеспецифическим (см. заявку на патент Республики Корея №2002-23760). Термин «удаление», применяемый по отношению к вирусной геномной последовательности в настоящем описании, означает полное удаление и частичное удаление соответствующей последовательности.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения рекомбинантный аденовирус содержит область Е1А, причем его область E1B, то есть E1B, кодирующий белки весом 19 кДа и 55 кДа (E1B), удалена, и удалена область E3 (E3). Рекомбинантный аденовирус, включающий ген Е1А, будет обладать воспроизводимыми характеристиками. Ген, кодирующий IL-12, вставляют в место удаленной области E1B рекомбинантного аденовируса, и гены, кодирующие GM-CSF и релаксин или ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF, вставляют в место области E3. Между тем, сайт Е1А предусматривает модификацию, при которой остаток Glu 45 заменен на Gly, и модификацию, при которой последовательность из аминокислот 121-127 полностью заменена на Gly, в нуклеотидной последовательности, кодирующей Rb-связывающий сайт, расположенный в последовательности гена Е1А.

Кроме того, в настоящем изобретении также можно применять вирусы, отличные от аденовируса. Вирусы, которые можно применять в настоящем изобретении, предпочтительно могут представлять собой вирусы осповакцины (Puhlmann М. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), лентивирусы (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999)) или вирусы простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), но не ограничиваются ими.

Применяемый в настоящем изобретении рекомбинантный аденовирус содержит промотор, функционирующий в животных клетках, предпочтительно клетках млекопитающих. Промотор, подходящий для настоящего изобретения, предусматривает промотор, происходящий из вируса млекопитающего, и промотор, происходящий из генома клеток млекопитающего, и предусматривает, например, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор U6 и промотор H1, длинный концевой повтор (LTR) вируса лейкоза мышей (MLV) в качестве промотора, ранний промотор аденовируса, поздний промотор аденовируса, промотор гена 7.5K вируса осповакцины, промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор гена фактора элонгации 1-альфа (EF1 α), промотор гена металлотионеина, промотор гена β-актина, промотор гена IL-2 человека, промотор гена IFN человека, промотор гена IL-4 человека, промотор гена лимфотоксина человека, промотор гена GM-CSF человека, индуцируемый промотор, специфический в отношении раковых клеток промотор [например, промотор гена обратной транскриптазы теломеразы (TERT), модифицированный TERT-промотор, промотор гена простатического специфического антигена (PSA), промотор гена простатического специфического мембранного антигена (PSMA), промотор гена эмбрионального опухолевого антигена (СЕА), промотор гена сурвивина, промотор гена E2F, модифицированный промотор гена E2F, промотор гена альфа-фетопротеина (AFP), модифицированный AFP-промотор, гибридный E2F-AFP-промотор и гибридный E2F-TERT-промотор], тканеспецифичный промотор (например, промотор гена альбумина), промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека и промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) мыши, но не ограничивается ими. Наиболее предпочтительно промотором является промотор CMV. Предпочтительно, чтобы в экспрессионной конструкции для экспрессии трансгена последовательность полиаденилирования была присоединена ниже трансгена по последовательности. Последовательность полиаденилирования предусматривает терминатор гена бычьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), происходящую из SV40 последовательность полиаденилирования (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), поли(А) ВИЧ-1 (Klasens, В. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), поли(А) гена β-глобина (Gil, A., et al., Cell 49:399-406(1987)), поли(А) гена TK HSV (Cole, C.N. and Т.P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) или поли(А) полиомавируса (Batt, D.В and G.G. Biol. 15:4783-4790(1995)), но не ограничивается ими.

В применяемом в настоящем изобретении рекомбинантном аденовирусе последовательность гена IL-12, последовательность гена GM-CSF-релаксина или последовательность гена shVEGF функционально связаны с промотором. В контексте настоящего документа термин «функционально связан» относится к функциональному связыванию регуляторной последовательности для экспрессии нуклеиновой кислоты (например, набора промоторов, сигнальной последовательности и сайта связывания факторов регуляции транскрипции) и отличной последовательности нуклеиновой кислоты, и, соответственно, регуляторная последовательность осуществляет регуляцию транскрипции и/или трансляции отличной последовательности нуклеиновой кислоты.

Рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению может дополнительно содержать ген устойчивости к антибиотикам и репортерный ген (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP), люциферазы и β-глюкуронидазы) в качестве селективных маркеров. Ген устойчивости к антибиотикам предусматривает ген устойчивости к антибиотикам, обычно применяемый в данной области, например, ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину, и, предпочтительно, представляет собой ген устойчивости к неомицину. Вышеупомянутый селективный маркер может экспрессироваться даже в системе экспрессии, соединенной посредством отдельного промотора или последовательности, кодирующей IRES (участок внутренней посадки рибосомы), систем 2А (системы F2A, системы Р2А, системы Т2А), и IRES, который можно применять в настоящем изобретении, представляет собой регуляторную последовательность, обнаруживаемую в РНК некоторых типов вирусов и клеток.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, причем композиция включает рекомбинантный аденовирус; и фармацевтически приемлемый носитель; медицинскому применению рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака; и способу лечения рака, причем способ предусматривает стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количество рекомбинантного аденовируса.

Поскольку в фармацевтической композиции по настоящему изобретению применяется вышеописанный рекомбинантный аденовирус, описание общего содержания между ними будет опущено во избежание излишнего усложнения настоящего описания.

В контексте настоящего документа термин «предупреждение» относится ко всем механизмам, которые обеспечивают подавление рака (опухолей) или задержку проявления рака (опухолей) путем введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В контексте настоящего документа термин «лечение» относится ко всем механизмам, которые обеспечивают уменьшение интенсивности или благоприятное изменение симптомов рака (опухолей) путем введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем изобретении «индивидуум» относится к субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания, и, более конкретно, относится к млекопитающему, такому как человек или отличный от человека примат, грызун (крыса, мышь, морская свинка и т.д.), мышь, собака, кошка, лошадь, корова, овца, свинья, коза, верблюд и антилопа.

«Рак», который представляет собой заболевание, подлежащее предупреждению или лечению с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в общем случае относится к заболеваниям, связанным с клетками, характеризующимися «агрессивными» признаками, в случае которых клетки игнорируют нормальные ограничения в отношении роста и продолжают делиться и расти, признаками, проявляющимися в инвазии с проникновением в окружающие ткани, и метастатическими признаками, проявляющимися в распространении в другие участки организма. В настоящем изобретении термин «рак» применяют в том же смысле, что и злокачественная опухоль, и он может предусматривать солидную опухоль и опухоль кроветворных органов. Например, рак может представлять собой любое, выбранное из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза, и может также представлять собой рецидивный рак, но не ограничивается указанным.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать ингибитор контрольной точки иммунного ответа.

В контексте настоящего документа термин «контрольная точка иммунного ответа» в общем случае относится к белку, вовлеченному в опосредование стимуляции или подавления сигнальных молекул иммунного ответа на поверхности иммунных клеток, и раковые клетки избегают системы иммунологического надзора подвергаясь такому воздействию, в результате которого стимуляция иммунного ответа и, как результат, ингибирование раковых клеток, не осуществляются надлежащим образом с участием контрольной точки иммунного ответа. Предпочтительно ингибитор контрольной точки иммунного ответа может представлять собой антагонист PD-1, антагонист PD-L1, антагонист PD-L2, антагонист CD27, антагонист CD28, антагонист CD70, антагонист CD80, антагонист CD86, антагонист CD137, антагонист CD276, антагонист KIR, антагонист LAG3, антагонист TNFRSF4, антагонист GITR, антагонист GITRL, антагонист 4-1BBL, антагонист CTLA-4, антагонист A2AR, антагонист VTCN1, антагонист BTLA, антагонист IDO, антагонист TIM-3, антагонист VISTA, антагонист KLRA и их комбинацию, но не ограничивается ими.

Ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой антагонист или антитело, нацеленное на белок, являющийся контрольной точкой иммунного ответа, и проявляет противораковый эффект, обусловленный иммунным ответом в результате усиления действия белка, который стимулирует иммунный ответ, или в результате блокирования белка, который подавляет иммунный ответ. Поскольку ингибитор контрольной точки иммунного ответа использует систему иммунного ответа, которая обладает превосходным свойством памяти, в дополнение к преимуществам, заключающимся в меньшем числе случаев побочных эффектов, таких как рвота или алопеция, по сравнению с общепринятыми цитотоксическими противораковыми средствами, и значительных терапевтических эффектах, терапевтический эффект может сохраняться в течение длительного периода времени, даже после прекращения введения лекарственного средства, однако об усилении противоракового эффекта за счет совместного введения с рекомбинантным аденовирусом ранее не было известно. Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли попытки протестировать совместное введение с ингибитором контрольной точки иммунного ответа с целью усиления противоракового эффекта рекомбинантного аденовируса, и имеет место еще один технический признак, заключающийся в том, что обеспечивается медицинское применение рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака в виде состава для совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель в дополнение к активному ингредиенту. В этом случае фармацевтически приемлемый носитель обычно применяют в процессе составления, и он предусматривает лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидинон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.д., но не ограничивается ими. Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может дополнительно предусматривать смазывающее вещество, смачивающее средство, подсластитель, вкусоароматическое средство, эмульгатор, суспендирующее средство, консервант и т.д., в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и составы подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или наносить местно), и в соответствии с примером по настоящему изобретению усиливающую противоопухолевый иммунитет композицию по настоящему изобретению предпочтительно можно водить прямо в опухоль. Доза будет варьироваться в зависимости от состояния пациента и веса тела, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и продолжительности введения, но при этом может быть соответствующим образом выбрана специалистами в данной области.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем изобретении «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для лечения заболеваний при обоснованном соотношении польза/риск, приемлемом для терапевтического лечения, и уровень эффективной дозы может быть определен в соответствии с факторами, включающими тип заболевания у пациентов, тяжесть заболевания, активность лекарственных средств, чувствительность к лекарственным средствам, время введения, путь введения, скорость экскреции, период лечения и одновременно применяемые лекарственные средства, и другие факторы, хорошо известные в области медицины. Другую фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в виде отдельного терапевтического средства или в комбинации с другими терапевтическими средствами, можно вводить с терапевтическими средствами предшествующего уровня техники последовательно или одновременно, и можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое позволяет достичь максимального эффекта без каких-либо побочных эффектов, принимая во внимание все вышеупомянутые факторы, и специалисты в данной области без труда смогут определить такое количество.

Далее предлагаются предпочтительные примеры, помогающие понять настоящее изобретение. Однако нижеследующие примеры приведены исключительно для более легкого понимания настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается нижеследующими примерами.

Примеры

Материалы для экспериментов и экспериментальные способы

1. Эксперимент на животных

Самцы мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель были приобретены у Charles River Laboratories International, Inc. (Уилмингтон, Массачусетс), и их размножали в камере с ламинарным потоком воздуха в стерильных условиях. Все эксперименты на животных осуществляли с одобрения Ассоциации по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC), и проводили в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Университета Ханьянг.

2. Получение онколитического аденовируса

Аденовирус (Ad), в котором гены IL-12 и GM-CSF-релаксина или shVEGF были введены в место области Е1 и область E3 соответственно, получали, как проиллюстрировано на фигурах 1 и 2.

В частности, для конструирования челночного вектора Ad E1, экспрессирующего IL-12, был получен челночный вектор pXC1RdB/IL12 E1 путем вырезания гена IL-12 мыши из рСА14/IL12 и субклонирования гена в челночный вектор pXC1RdB E1. Кроме того, для конструирования shVEGF-экспрессирующего челночного вектора E3, полноразмерную комплементарную ДНК мыши, кодирующую shVEGF, клонировали с помощью RT-PCR с применением общей РНК, полученной из происходящих из костного мозга дендритных клеток. Комплементарная ДНК, кодирующая shVEGF (нуклеотиды 53-982 L15435 в Национальном центре биотехнологической информации), была получена с применением следующего набора праймеров: смысловой (5'-gatcccggaaggagagcagaagtcccatgttcaagagacatgggacttctgctctcctt tttttttggaaa-3'), антисмысловой (5'-tttccaaaaaaa aaggagagcagaagtcccatgtctcttgaacatgggacttctgctctccttccgggatc-3'). ПЦР-продукт расщепляли с использованием BamHI/Hind III, а затем клонировали в BamHI/Hind III-обработанный челночный вектор pSP72 E3/CMV-polA Ad E3, с получением тем самым челночного вектора pSP72 E3/shVEGF E3. Кроме того, получали челночный вектор pSP72 E3/GMCSF-RLX E3 путем клонирования гена GMCSF-IRES-релаксина в челночный вектор pSP72 E3/CMV-polA Ad E3.

Для гомологичной рекомбинации Е. coli BJ5183 трансформировали одновременно челночным вектором pXC1RdB/IL12 E1 и pdE1/shVEGF или pdE1/GMCSF-RLX, с получением тем самым pRdB/IL12/shVEGF Ad и pRdB/IL12/GMCSF-RLX Ad. Все вирусы были получены с применением клеток 293, и очистку, титрование и качественный анализ аденовируса осуществляли в соответствии с уровнем техники.

3. Оценка противоракового эффекта с применением животной модели

Клетки B16-F10 (5×10⁵) путем подкожной инъекции вводили в правый бок 6-7-недельных самцов иммунокомпетентных мышей C57BL/6. Если объем опухоли достигал примерно 100 мм³, мышей делили на группы с подобными показателями размера опухоли, и вводили им онколитические аденовирусы (RdB/IL12/shVEGF Ad; RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad) внутриопухолево в концентрации 5×10⁹ VP в день 1, 3 и 5. Кроме того, с целью подтверждения противоракового эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, в день 3, 6 и 9 мышам, которым вводили онколитический аденовирус, внутрибрюшинно вводили антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и антитело к CTLA-4 в качестве ингибиторов контрольной точки иммунного ответа в концентрации 200 мкг, и с целью дополнительной оценки синергического эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, проводили эксперимент, аналогичный вышеописанному, снова с применением онколитического аденовируса в дозе 1×10⁹ VP, которая является в пять раз более низкой, чем доза из предыдущего эксперимента с применением 5×10⁹ VP. Кроме того, в этом эксперименте PBS-обработанную группу (PBS) и группы, обработанные только ингибитором контрольной точки иммунного ответа (антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и антитело к CTLA-4), применяли в качестве контролей.

После этого с применением животной модели оценивали противораковый эффект путем измерения диаметра опухоли по вертикали с применением штангенциркуля для ежедневного отслеживания роста опухолей и подтверждения изменения в отношении доли выживших животных с течением времени. Кроме того, рассчитывали объем опухоли с применением следующей формулы: объем = 0,523L (W)², в которой L обозначает длину, a W обозначает ширину.

4. Оценка противоракового эффекта по иммунологической памяти

В день 50 после введения путем инъекции первичной опухоли в 3 животных моделях, в которых индуцировали меланому, успешно обработанным мышам путем инъекции вводили вторичную опухоль (повторная стимуляция) (в день 25 начиная с момента времени, когда первичная опухоль не могла быть привита). После этого таким же образом, как описано выше, оценивали противоопухолевой эффект иммунологической памяти путем измерения диаметра опухоли по вертикали для отслеживания роста опухолей раз в два дня и расчета среднего объема опухоли. В этом эксперименте группу, в которой развитие меланомы индуцировалось у здоровых мышей (нормальных), применяли в качестве контроля.

5. Статистический анализ

Все данные выражены в виде среднего ± стандартная ошибка. Сравнения выполняли с применением программного обеспечения Stat View (Abacus Concepts, Inc., Беркли, Калифорния) и критерия Манна-Уитни (непараметрический критерий суммы рангов). Р-значения, равные 0,05 или меньше, свидетельствуют о статистической значимости (*, Р<0,05; **, Р<0,01).

Результаты экспериментов

1. Подтверждение противоракового эффекта у мышей с меланомой

Целью авторов настоящего изобретения было подтвердить противораковый эффект рекомбинантного аденовируса и/или ингибитора контрольной точки иммунного ответа путем сравнения объема опухоли, введенной путем инъекции мышам с меланомой, наличия полной ремиссии и доли выживших мышей.

В результате было подтверждено, что у контрольных мышей, обработанных PBS или антителом к PD-L1, опухоли увеличивались достаточно быстро, чтобы соответственно к дню 11 или дню 15 объем опухоли достиг 3000 мм³ или более, что, таким образом, считается агрессивным ростом опухоли, тогда как в группе, обработанной RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, по результатам сравнения с PBS-обработанной группой в день 22, рост опухоли был подавлен на 99,3% или 99,5% (фигуры 3А и 4А) соответственно. Кроме того, если аденовирус и антитело к PD-L1 вводили совместно (RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+PD-L1), объем опухоли уменьшался более заметно, чем в группе, обработанной аденовирусом или антителом к PD-L1 по отдельности, таким же образом, как описано выше. Хотя противораковый эффект, аналогично таковому в группе, обработанной только аденовирусом (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), проявлялся до дня 27, начиная с момента, когда проходил один месяц, рост опухолей непрерывно подавлялся в группе, которой совместно с аденовирусом вводили антитело к PD-L1, тогда как в группе, обработанной только аденовирусом, темп роста опухолей со временем повышался, следовательно, можно было подтвердить значимую разницу в объеме опухоли между группой, обработанной только аденовирусом, и группой, которой совместно вводили аденовирус и антитело (фигуры 3А и 4А). Кроме того, можно было наблюдать, что в день 50 в контрольной группе, обработанной PBS или антителом к PD-L1, не можно было подтвердить полную ремиссию, тогда как в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad доли выживших мышей составляли 66% (4/6) и 50% (3/6) соответственно, и в случае, когда аденовирус и антитело к PD-L1 вводили совместно, доли выживших животных составляли 66% (4/6) и 100% (6/6), что соответствует полной ремиссии. Кроме того, было подтверждено, что все мыши в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-L1 или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+PD-L1 выживали до дня 44 или дня 50 соответственно, тогда как к тому же моменту времени в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad наблюдали долю выживших животных 66% (4/6), и все мыши в контрольной группе погибали от опухолей (фигуры 3В и 4В). Эти результаты означают, что противораковый эффект в результате лечения только антителом к PD-L1 в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа был довольно незначительным, тогда как в случае RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad проявлялся превосходный противораковый эффект, и противораковый эффект рекомбинантного аденовируса дополнительно усиливался при совместном введении с антителом к PD-L1.

2. Противораковый эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа

Авторы настоящего изобретения сравнили противораковые эффекты между введением только рекомбинантного аденовируса и совместным введением рекомбинантного аденовируса и ингибитора контрольной точки иммунного ответа с применением онколитического аденовируса в дозе (1×10⁹ VP), которая является в пять раз более низкой, чем доза из предыдущего эксперимента с применением 5×10⁹ VP, для более подробной оценки синергического эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа. Кроме того, на основе полученных результатов, в случае, когда в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа применяли антитело к PD-L1, антитело к PD-1 или антитело к CTLA-4, сравнивали противораковые эффекты этих антител, и в этом эксперименте в качестве рекомбинантного аденовируса применяли RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.

В итоге, в день 18 по результатам сравнения с объемом опухоли в PBS-обработанной группе, процент подавления роста опухоли в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad составлял 92,9%, при этом процент подавления роста опухоли повышался до 99,7% в результате совместного введения с антителом к PD-1, и процент подавления роста опухоли в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad (90,1%) также значительно повышался до 98,9% в результате совместного введения с антителом к PD-1 (фигуры 5 и 6). Кроме того, только у 17% (1/6) мышей в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad была достигнута полная ремиссия, при этом в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-1 доля животных с полной ремиссией составляла 83% (5/6), что соответствует значительному повышению.

Кроме того, с целью подтверждения того, проявлялся ли синергический эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа также в случае других типов рекомбинантных аденовирусов, вводили совместно HmT-Rd19-K35/IL21 Ad, RdB/GMCSF/shVEGF Ad или YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad и антитело к PD-1, а затем подтверждали обусловленные ими противораковые эффекты. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 7, факт заключается в том, что в случае большинства рекомбинантных аденовирусов объем опухоли уменьшался до некоторой степени за счет совместного введения антитела к PD-1, однако большинство рекомбинантных аденовирусов не характеризовались таким же заметным эффектом, как рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), и, в частности, эффект YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad в целом не был превосходным при сравнении с таковым для группы, обработанной только антителом к PD-1. Из этих результатов можно было увидеть, что синергический эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, не применим ко всем рекомбинантным аденовирусам, и является уникальным эффектом рекомбинантного аденовируса по настоящему изобретению.

Кроме того, было подтверждено, что, в результате подтверждения противоракового эффекта, обусловленного определенным типом ингибитора контрольной точки иммунного ответа, у контрольных мышей, обработанных PBS, антителом к PD-L1, антителом к PD-1 или антителом к CTLA-4, опухоли увеличивались достаточно быстро, чтобы соответственно к дню 11, 15, 18 или 11 объем опухоли достиг 3000 мм³ или более, что, таким образом, считается агрессивным ростом опухоли, тогда как в случае групп, обработанных RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к PD-1 и RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к CTLA-4, к дню 21, по результатам сравнения с PBS-обработанной группой, рост опухоли был значительно подавлен на 99,9%, 99,9% или 99,2% соответственно (фигуры 4А, 8А и 9А). Кроме того, в день 50 в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad доля животных с полной ремиссией составляла 50% (3/6), тогда как при совместном введении с антителом к PD-L1, антителом к PD-1 или антителом к CTLA-4 доля животных с полной ремиссией составляла 100% (6/6), 83% (5/6) и 83% (5/6) соответственно, что соответствует повышению. Кроме того, мыши, обработанные RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к PD-1 и RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad + антитело к CTLA-4, выживали до дня 50, дня 50 или дня 30 соответственно, тогда как к тем же моментам времени в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad наблюдали долю выживших животных 66% (4/6), 66 (4/6) и 83% (5/6) соответственно (фигуры 4В, 8В и 9В). Из этих результатов видно, что даже при применении не только антитела к PD-L1, но также антитела к PD-1 или антитела к CTLA-4, противораковый эффект рекомбинантного аденовируса усиливался, однако можно было наблюдать, что при совместном введении с антителом к PD-L1 или антителом к PD-L1 ассоциированный с противораковым эффектом синергический эффект RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad был более значительным, чем таковой при совместном введении с антителом к CTLA-4.

3. Подтверждение наличия эффекта иммунологической памяти в отношении рецидивного рака

Целью авторов настоящего изобретения было подтвердить наличие эффекта иммунологической памяти и противоракового эффекта в отношении рецидивного рака, обусловленных рекомбинантным аденовирусом по настоящему изобретению или совместным введением рекомбинантного аденовируса и ингибитора контрольной точки иммунного ответа путем сравнения объема вторичных опухолей, введенных путем инъекции мышам с меланомой и т.д.

В результате, могло быть подтверждено, что в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad рост вторичных опухолей был заметно ингибирован (фиг. 10А), и, в частности, рост вторичных опухолей был заметно ингибирован в результате совместного введения с антителом к PD-1 в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа (фиг. 10В). Эти результаты означают, что рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению может обеспечить предупреждение рецидива опухолей в досрочной перспективе благодаря эффекту усиления противоопухолевого иммунного ответа за счет иммунологической памяти, что свидетельствует о том, что эффект может быть усилен в результате совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, как и в случае вышеописанного противоракового эффекта.

4. Верификация противоракового эффекта RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad

(1) Подтверждение паттернов экспрессии IL-12, GM-CSF и релаксина

С целью верификации противоракового эффекта, обусловленного коэкспрессией генов IL-12, GM-CSF и релаксина (RLX), был получен RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, который представляет собой аденовирус, в котором ген IL-12 был вставлен в место области Е1 аденовируса, а гены GM-CSF и релаксина были вставлены в место области E3 аденовируса, как описано выше. RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad представляет собой специфический в отношении раковых клеток онколитический аденовирус, в котором ген E1B, будучи ранним геном аденовируса, был удален, а ген Е1А был модифицирован, и подтверждали уровень экспрессии IL-12, GM-CSF или RLX полученным аденовирусом. В частности, линию клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Нар-Т1) инфицировали RdB/IL12/GMCSF-RLX при множественности инфекции (MOI) 0,2, 0,5, 1,2 и 5, и спустя 48 часов собирали их среду. После этого уровни экспрессии IL-12 и GM-CSF подтверждали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), а уровень экспрессии релаксина подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).

В результате, как проиллюстрировано на фигурах 11 и 12, уровень экспрессии IL-12, GM-CSF или релаксина повышался в зависимости от MOI аденовируса, следовательно, коэкспрессия генов могла быть экспериментально подтверждена.

(2) Усиление противоракового эффекта, обусловленного совместным введением с αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка

С целью верификации усиления противоракового эффекта, обусловленного совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка, индуцированной введением путем подкожной инъекции линии клеток рака поджелудочной железы НаР-Т1, животным внутриопухолево вводили 7×10⁷ вирусных частиц (VP)/30 мкл RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и наряду с этим, внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг αPD-1, а затем наблюдали обусловленное в результате изменение объема опухолей. Кроме того, в качестве группы сравнения применяли группу с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.

В результате, как проиллюстрировано на фиг. 13, в случае опухолевой ткани, в которую вводили только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, опухоли росли непрерывно, так что в день 30 после первого введения вируса объем опухоли достигал 1,982±126 мм³, тогда как в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 рост опухолей до дня 30 после первого введения вируса был подавлен, с подавлением тем самым роста опухолей до уровня приблизительно 79% по сравнению с таковым в группе с введением одного из препаратов. Кроме того, в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 доля животных с полной ремиссией опухолей составляла приблизительно 50%, а в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad полная ремиссия вовсе не наблюдалась (не проиллюстрировано). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что противораковая терапевтическая эффективность RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad заметно улучшается при совместном введении с αPD-1.

(3) Изменение опухолевой ткани, обусловленное совместным введением с αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка

С целью конкретного подтверждения изменения опухолевых тканей, обусловленного совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, после совместного введения 7×10⁷ VP RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и 10 мг/кг αPD-1, как описано выше, собранные опухолевые ткани подвергали иммуногистологическому анализу. Кроме того, в качестве группы сравнения и контроля применяли соответственно группу с введением только αPD-1 или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и группу с введением PBS.

В результате, как проиллюстрировано на фиг. 14, могло быть подтверждено, что в опухолевой ткани, в которую вводили PBS, место некроза почти не подтверждалось, тогда как большинство опухолевых тканей, в которые совместно вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, подвергались некрозу. Кроме того, эффект, обусловленный совместным введением, то есть заметно сниженная степень пролиферации опухолевых клеток (PCNA) и повышенная степень некроза (TUNEL), были исключительными в сравнении со случаем, когда вводили только αPD-1 или только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.

(4) Изменение в отношении популяций клеток и экспрессии IFN-γ в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением с αPD-1

Для оценки того, могла ли быть индуцирована инфильтрация Т-клеток в опухолевые ткани, и активация указанных клеток, вследствие повышения степени инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани посредством RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, оценивали изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток в популяции инфильтрованных лимфоцитов в дренирующем лимфатическом узле (DLN) и опухолевых тканях. В результате, как проиллюстрировано на фигурах 15 и 16, в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad или αPD-1 и в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 наблюдали, что популяция IFN-γ-экспрессирующих CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток присутствовала на высоком уровне, по сравнению с группой с введением только PBS или αPD-1 (Р<0,001 или Р<0,01). В частности, могло быть подтверждено, что в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 популяция IFN-γ-экспрессирующих CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток также была значимо увеличена по сравнению с группой, которой вводили только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad или αPD-1 (Р<0,001), и этот результат указывает на то, что совместное введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 индуцирует инфильтрацию интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток в опухоли, и активацию указанных клеток.

Кроме того, для оценки уровня экспрессии IFN-γ в опухолевой ткани, в которую вводили аденовирус, опухолевые ткани извлекали из организма мышей, которым вводили аденовирус и т.д., и подвергали тонкому измельчению, а затем осуществляли ELISA-анализ уровня IFN-γ. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 17, могло быть подтверждено, что при внутриопухолевом введении только PBS или αPD-1 IFN-γ вовсе не был выявлен, и в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad было выявлено только 8,3 пг/мг IFN-γ на 1 г опухолевой ткани, тогда как в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 было выявлено 18,7 пг/мг IFN-γ на 1 г опухолевой ткани. Таким образом, было обнаружено, что вышеупомянутое совместное введение обеспечивало повышение активности иммунных клеток за счет повышения уровня экспрессии IFN-γ в опухолях, и, в конечном итоге, способствовало усилению противоракового эффекта.

(5) Подтверждение противоракового эффекта в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа

Для оценки того, могло ли совместное введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 характеризоваться оптимальной терапевтической эффективностью в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа, оценивали эффект совместного введения в опухоли, предварительно обработанные αPD-1, в отношении подавления роста опухолей. В частности, если рост опухолей не подвергался эффективному подавлению путем введения только αPD-1 (в день 9 после первой обработки антителом), вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad в общей сложности четыре раза с интервалом 2 дня. Кроме того, в качестве группы сравнения применяли группу с введением только αPD-1.

В результате, как проиллюстрировано на фиг. 18, введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, начинающееся в случае, когда объем опухоли достигал 915±78 мм³, обеспечивало эффективное подавление роста опухолей в течение 10 дней, начиная с первого дня введения. Интересно, что в группе с введением только αPD-1 наблюдали быстрое увеличение скорости роста опухоли, и, таким образом, в ней не происходило подавление роста опухолей, тогда как в группе с совместным введением происходило непрерывное подавление роста опухолей, даже в ходе вышеупомянутого периода. Кроме того, по результатам сравнения изменения объема опухоли (в день 23 после введения), эффект в виде подавления роста в группе с совместным введением был наиболее заметным. Таким образом, в случае вышеупомянутого совместного введения оптимальную противораковую терапевтическую эффективность наблюдали даже в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа. Соответственно, это свидетельствует о том, что вышеупомянутое совместное введение может стать видом терапии для пациента с толерантностью к ингибитору контрольной точки иммунного ответа в качестве единственного терапевтического препарата.

(6) Изменение в отношении инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad

Предполагалось, что экспрессия RLX в опухолевых тканях будет обуславливать синергическую противораковую терапевтическую эффективность за счет содействия внутриопухолевой инфильтрации αPD-1. Соответственно, была предусмотрена оценка того, обеспечивает ли RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad повышенную степень внутриопухолевой инфильтрации αPD-1 в ткани десмопластической опухоли поджелудочной железы. RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad вводили прямо в опухолевые ткани в день 0 или день 2, αPD-1 вводили внутрибрюшинно в день 2 (с: RdB/IL12/GMCSF-RLX + меченное Alexa 488 антитело к PD-1), и группу с введением только конъюгированного с Alexa 488 αPD-1 (b; меченное Alexa 488 антитело к PD-1) и группу с введением только PBS (a; PBS) применяли в качестве группы сравнения и контроля соответственно. Опухолевую ткань, обработанную, как описано выше, собирали в день 7, и с помощью иммунофлуоресцентного анализа количественно определяли накопление меченного Alexa 488 αPD-1 в опухолевой ткани. По результатам количественного определения накопления меченного Alexa 488 αPD-1 на единицу площади ткани, как проиллюстрировано на фиг. 20, в группе с введением только PBS или в группе с введением только αPD-1 наблюдали 14±2 A.U./мкм² или 21±1 A.U./мкм² соответственно, тогда как в группе с совместным введением наблюдали 32±6 A.U./мкм². Исходя из результата можно было увидеть, что RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad обеспечивал заметное улучшение в отношении инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани и способствовал улучшению в отношении локализации αPD-1 в опухолевых тканях. Кроме того, с целью подтверждения того, локализировалось ли меченное Alexa 488 αPD-1 в участке, где имела место экспрессия CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетками, по отношению к каждой опухолевой ткани, в которую вводили PBS (а: PBS) или конъюгированное с Alexa 488 αPD-1 (b: меченное Alexa 488 антитело к PD-1) по отдельности или совместно вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и конъюгированное с Alexa 488 αPD-1 (с: RdB/IL12/GMCSF-RLX + меченное Alexa 488 антитело к PD-1), осуществляли иммуноокрашивание по CD4+ CD8+. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 21, в группе с совместным введением совместную локализацию αPD-1 и CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток наблюдали на более высоком уровне, чем в группе с введением только меченного Alexa 488 αPD-1.

Для оценки внутриопухолевой инфильтрации αPD-1 в отношении всего организма, ⁶⁴Cu-αPD-1, в котором были конъюгированы αPD-1 и ⁶⁴Cu, вводили наряду с RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad хомякам, которым вводили НаР-Ti с применением 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты, с помощью вышеописанного способа, с получением тем самым иммуно-ПЭТ изображения. ПЭТ-сканирование осуществляли через 2, 12, 36 и 60 часов после введения ⁶⁴Cu-αPD-1, и для анатомического описания основную ПЭТ-визуализацию осуществляли наряду с КТ. В качестве группы сравнения применяли группу с введением только ⁶⁴Cu-αPD-1. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 22, внутриопухолевое поглощение ⁶⁴Cu-αPD-1 в группе с совместным введением и в группе с введением одного из препаратов, рассчитанное в виде SUV, было следующим: 0,26±0,06 и 0,36±0,05 (Р=0,072) через 2 часа; 0,90±0,22 и 1,68±0,45 (Р=0,018) через 12 часов; 2,14±0,19 и 2,97±0,67 (Р=0,062) через 36 часов; и 3,37±0,57 и 4,50±1,02 (Р=0,043) через 60 часов. Таким образом, было обнаружено, что во все вышеупомянутые моменты времени внутриопухолевое поглощение ⁶⁴Cu-αPD-1 в группе с совместным введением было значимо более высоким, чем в группе с введением только ⁶⁴Cu-αPD-1. Кроме того, распределение или поглощение ⁶⁴Cu-αPD-1 в различных тканях, включая опухолевые ткани, рассчитывали как %ID/г через 60 часов после введения ⁶⁴Cu-αPD-1. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 23, могло быть подтверждено, что поглощение, наблюдаемое в группе с введением одного из препаратов и в группе с совместным введением, было следующим: 1,80±0,13%ID/г, 2,80±0,41%ID/г (Р<0,05) соответственно в опухолевых тканях; и 1,10±0,11%ID/г, 1,94±0,23%ID/г (Р<0,05) соответственно в селезенке, и в группе с совместным введением степень поглощения ⁶⁴Cu-αPD-1 была повышена как в опухолевых тканях, так и в селезенке. Кроме того, помимо этих тканей, дренирующий лимфатический узел (DLN), известный как обогащенный Т-клетками участок, был увеличен в результате инфицирования RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad (результат не проиллюстрирован). Таким образом, если обобщить вышеупомянутые результаты экспериментов, можно увидеть, что инфицирование RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad обеспечивало ремоделирование или разрушение внеклеточного матрикса в опухолевых тканях и повышение степени поглощения αPD-1 в опухолевых тканях за счет усиленного иммунного ответа, обусловленного IL-12 и GM-CSF, и, в результате, синергического эффекта, имеющего место при совместном введении.

Вышеизложенное описание настоящего изобретения приведено в иллюстративных целях, и специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение, будет понятно, что настоящее изобретение без труда может быть модифицировано с получением других конкретных форм без изменения технической сути или основных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что вышеописанные примеры во всех аспектах являются лишь иллюстративными, а не ограничивающими.

--->

Перечень последовательностей

<110> Genemedicine Co.,Ltd.

<120> Anticancer composition comprising oncolytic adenovirus and immune

checkpoint inhibitor

<130> G19E10C0255P/RU

<150> KR 10-2017-0026339

<151> 2017-02-28

<160> 9

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> IL-12A

<400> 1

atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60

ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120

ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180

actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240

tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300

acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt 360

ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 420

cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480

gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540

gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 600

cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga 648

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> IL-12B

<400> 2

atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60

atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120

gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180

acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240

gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300

catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360

aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420

tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480

gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540

caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600

gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660

tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720

atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780

actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840

atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900

accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960

tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcctag 1008

<210> 3

<211> 597

<212> DNA

<213> IRES

<400> 3

tagcgatccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 60

aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 120

tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 180

tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 240

cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 300

acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 360

cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 420

tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 480

ggcctcggta cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 540

gaaccacggg gacgtggttt tccttttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 597

<210> 4

<211> 426

<212> DNA

<213> GM-CSF

<400> 4

atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc agcacccacc 60

cgctcaccca tcactgtcac ccggccttgg aagcatgtag aggccatcaa agaagccctg 120

aacctcctgg atgacatgcc tgtcacattg aatgaagagg tagaagtcgt ctctaacgag 180

ttctccttca agaagctaac atgtgtgcag acccgcctga agatattcga gcagggtcta 240

cggggcaatt tcaccaaact caagggcgcc ttgaacatga cagccagcta ctaccagaca 300

tactgccccc caactccgga aacggactgt gaaacacaag ttaccaccta tgcggatttc 360

atagacagcc ttaaaacctt tctgactgat atcccctttg aatgcaaaaa accagtccaa 420

aaatga 426

<210> 5

<211> 558

<212> DNA

<213> Relaxin

<400> 5

atgcctcgcc tgttcttgtt ccacctgcta gaattctgtt tactactgaa ccaattttcc 60

agagcagtcg cggccaaatg gaaggacgat gttattaaat tatgcggccg cgaattagtt 120

cgcgcgcaga ttgccatttg cggcatgagc acctggagca aaaggtctct gagccaggaa 180

gatgctcctc agacacctag accagtggca gaaattgtac catccttcat caacaaagat 240

acagaaacta taattatcat gttggaattc attgctaatt tgccaccgga gctgaaggca 300

gccctatctg agaggcaacc atcattacca gagctacagc agtatgtacc tgcattaaag 360

gattccaatc ttagctttga agaatttaag aaacttattc gcaataggca aagtgaagcc 420

gcagacagca atccttcaga attaaaatac ttaggcttgg atactcattc tcaaaaaaag 480

agacgaccct acgtggcact gtttgagaaa tgttgcctaa ttggttgtac caaaaggtct 540

cttgctaaat attgctga 558

<210> 6

<211> 441

<212> DNA

<213> Murine VEGF mRNA sequence

<400> 6

atgaactttc tgctctcttg ggtgcactgg accctggctt tactgctgta cctccaccat 60

gccaagtggt cccaggctgc acccacgaca gaaggagagc agaagtccca tgaagtgatc 120

aagttcatgg atgtctacca gcgaagctac tgccgtccga ttgagaccct ggtggacatc 180

ttccaggagt accccgacga gatagagtac atcttcaagc cgtcctgtgt gccgctgatg 240

cgctgtgcag gctgctgtaa cgatgaagcc ctggagtgcg tgcccacgtc agagagcaac 300

atcaccatgc agatcatgcg gatcaaacct caccaaagcc agcacatagg agagatgagc 360

ttcctacagc acagcagatg tgaatgcaga ccaaagaaag acagaacaaa gccagaaaaa 420

tgtgacaagc caaggcggtg a 441

<210> 7

<211> 576

<212> DNA

<213> Homo sapiens VEGF mRNA

<400> 7

atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60

gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggagggg ggcagaatca tcacgaagtg 120

gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180

atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240

atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300

aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360

agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420

aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480

tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540

gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> shVEGF sense

<400> 8

gatcccggaa ggagagcaga agtcccatgt tcaagagaca tgggacttct gctctccttt 60

ttttttggaa a 71

<210> 9

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> shVEGF anti-sense

<400> 9

tttccaaaaa aaaaggagag cagaagtccc atgtctcttg aacatgggac ttctgctctc 60

cttccgggat c 71

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описана противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа. Рекомбинантный аденовирус с вставленными в него генами IL-12 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-RLX Изобретение проявляет превосходный противораковый эффект за счет усиления иммунных функций, и было подтверждено, что такой противораковый эффект заметно усилен за счет одновременного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, и, таким образом, настоящее изобретение можно применять в качестве ключевой методики в области лечения рака. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 пр., 23 ил.

1. Рекомбинантный онколитический аденовирус для лечения рака, содержащий: ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); и ген, кодирующий релаксин, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный онколитический аденовирус содержит ген E1A.

2. Рекомбинантный аденовирус по п. 1, отличающийся тем, что из рекомбинантного аденовируса удалены любая одна или несколько из областей, выбранных из группы, состоящей из гена E1B-19, гена E1B-55 и области E3.

3. Рекомбинантный аденовирус по п. 2, отличающийся тем, что в рекомбинантном аденовирусе ген, кодирующий IL-12, вставлен в место области E1, и

ген, кодирующий GM-CSF, и ген, кодирующий релаксин, вставлены в место области E3.

4. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, причем композиция содержит: (a) рекомбинантный онколитический аденовирус по любому из пп. 1-3 и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция вводится одновременно, отдельно или последовательно в комбинации с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой любое, выбранное из группы, состоящей из антагониста белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), антагониста лиганда белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1), антагониста лиганда белка 2 запрограммированной гибели клеток (PD-L2), антагониста кластера дифференцировки 27 (CD27), антагониста кластера дифференцировки 28 (CD28), антагониста кластера дифференцировки 70 (CD70), антагониста кластера дифференцировки 80 (CD80, также известного как B7-1), антагониста кластера дифференцировки 86 (CD86, также известного как B7-2), антагониста кластера дифференцировки 137 (CD137), антагониста кластера дифференцировки 276 (CD276), антагониста иммуноглобулин-подобных рецепторов клеток-киллеров (KIR), антагониста белка, кодируемого геном 3 активации лимфоцитов

(LAG3), антагониста члена 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF4, также известного как CD134), антагониста глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка (GITR), антагониста лиганда глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка (GITRL), антагониста лиганда 4-1BB (4-1BBL), антагониста ассоциированного с цитолитическими T-лимфоцитами антигена 4 (CTLA-4), антагониста рецептора A2A аденозина (A2AR), антагониста ингибитора 1 активации T-клеток, содержащего домен, подобный V-домену иммуноглобулина (VTCN1), антагониста B- и T-лимфоцитарного аттенюатора (BTLA), антагониста индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), антагониста Т-клеточного белка 3, содержащего иммуноглобулиновый домен и домен муцина (TIM-3), антагониста супрессора активации Т-клеток, содержащего IgV-подобный домен (VISTA), антагониста лектин-подобных рецепторов подсемейства A клеток-киллеров (KLRA) и их комбинации.

7. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что рак представляет собой любое, выбранное из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза.

8. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что рак представляет собой рецидивный рак.

9. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция обеспечивает усиление противоопухолевого иммунитета.

10. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит ингибиторы контрольной точки иммунного ответа.