Способ получения нуклеината натрия из биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink Российский патент 2021 года по МПК C12P19/34 C12N1/12 

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к способам получения биологически активных веществ на основе нуклеиновых кислот, а именно к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris, которая может быть использована в качестве иммуностимулятора на основе нуклеиновых кислот для ветеринарного использования при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, микробиологической, биотехнологической, ветеринарной и пищевой промышленности для получения препаратов и продуктов на основе нуклеиновых кислот.

Микроводоросли рода Chlorella vulgaris Bejerink были обнаружены в 1890 году голландским ученым микробиологом и ботаником Мартином Биллем (Уиллем) Бейеринком. Данные микроводоросли являются наиболее распространенным видом из рода хлорелловых. По палеонтологическим исследованиям ископаемых образцов докембрийского периода, микроводоросль Chlorella vulgaris насчитывает достаточно большой генетический возраст, около 2 млрд. лет, что ставит данную микроводоросль по генетической выживаемости и сохранении в первоначальном виде до наших времен на ступень выше, чем генетический возраст дрожжей, осетровых и лососевых рыб. Можно сделать вывод, что ДНК микроводорослей является весьма предрасположенной к выживанию, а значит, может иметь и отличительные стороны в фармакологических эффектах при действии на организм [1-2].

В литературных источниках малоизвестно о получении нуклеината натрия из зеленых микроводорослей и в основном большее внимание направлено на получение рибонуклеината натрия из хлебопекарных дрожжей (препараты РНК) или получение дезоксирибонуклеината натрия из молок лососевых и осетровых рыб (препараты ДНК). В данном случае, для получения нуклеината натрия используются зеленые микроводоросли рода Chlorella vulgaris Beyerink, которые содержат в себе достаточное количество как РНК, так и ДНК компонентов, что было определено исследованиями [1]. Поэтому в качестве аналогов изобретения используются только те, которые по своей сущности и технологии получения нуклеината натрия являются наиболее близкими к заявленному изобретению.

Известен способ получения нуклеината натрия из дрожжей в водной среде при 100-110°С, включающий сам гидролиз, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты от дрожжевого клеточного шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением гидроксида натрия и затем осаждение рибонуклеината натрия из полученного раствора этиловым спиртом [3].

К недостаткам данного способа следует отнести сложность в технологии процесса выделения и использование вредных веществ при промывке, например, диэтилового эфира, к тому же образование осадка серовато-желтого цвета свидетельствует о присутствии достаточно большого количества белков, что мало допустимо.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, заключающийся в экстракции РНК из дрожжей гидролизом при помощи 10-12% раствора хлористого натрия при 100-110°С с последующим отделением раствора РНК от клеточного шлама и осаждение РНК соляной кислотой, промывку выпавшего осадка этиловым спиртом и сушку. Избавление от пигментов и белков в данном изобретении осуществляется при растворении РНК в воде, доведении раствора до рН=8.0-8.2 гидроксидом натрия, выдерживании в течение часа при 37-40°С с добавлением панкреатина. Осаждение рибонуклеината осуществляется подкисленным соляной кислотой до рН=1-2 этиловым спиртом. Полученный осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением едкого натра, затем осаждают этанолом, осадок фильтруют, снова промывают этиловым спиртом и сушат [4].

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и многостадийность осаждений РНК, причем не исключены потенциальные потери конечного продукта при стадиях переосаждения.

Известен также ряд способов получения натриевой соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб.

Практически все способы используют схему выделения нуклеината натрия гидролизом в цитратно-солевом растворе, осаждение ДНК в виде натриевой соли при помощи этилового спирта или изопропанола и отмывку 70% этиловым спиртом, сушку и растворение в буфере в случае хранения. Недостатком всех этих способов является использование животного сырья, а именно молок рыб, что приводит к уничтожению большого количества невосполнимого источника биоресурса.

Известен способ выделения ДНК из микроводоросли Haematococcus pluvialis (патент РФ 2573944, 2016 - Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина, авторы Лобакова Е.С. и др.) [5].

Данный способ заключается в выделении ДНК из микроводорослей методом фенол-хлороформной экстракции. Подготовка биомассы представляет собой разрушение прочных клеточных стенок с применением трехкратного замораживания образцов при -4°С с последующим оттаиванием, инкубацию в течение часа в ТЕ буфере и лизоциме при 37°С, затем инкубацию с интенсивным перемешиванием в течение часа при 40°С с додецилсульфатом натрия, высаливание белков при добавлении 1М раствора хлорида натрия на холоду, затем экстракцию фенол-хлороформом.

Недостатком данного способа считается использование фенол-хлороформной экстракции ДНК. Полученная ДНК лишь после многократной промывки в этиловом спирте может быть использована в качестве препарата, в ином случае полученная ДНК пригодна для молекулярной биологии и ПЦР анализа. Тем не менее данный способ не предполагает получение нуклеината натрия как ветеринарно-медицинского препарата.

Процесс получения нуклеината натрия из микроводоросли совпадает лишь с некоторыми стадиями в технологии получения соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб. В работе применены некоторые принципы выделения нуклеиновых кислот, указанных в пособиях по биохимии [6].

Цель изобретения - получение чистого продукта нуклеината натрия, отвечающего всем нормам и характеристикам, а также обладающего выраженным фармакологическим эффектом и положительным действием на организм, используя зеленые микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink.

Предложенный способ получения препарата нуклеината натрия в виде порошка белого цвета из предварительно подготовленной сухой биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink предусматривает механическое лизирование клеточной оболочки микроводоросли, очистку биоматериала от мешающих компонентов (липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др.), гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей ацетоном или изопропанолом, центрифугирование, промывку осадка спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен препарат нуклеинат натрия из зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, обладающий такими же биологическими и лечебными свойствами, как и эталонные образцы, при этом были подобраны технологические условия процесса выделения нуклеиновых кислот с использованием биотехнологической установки в виде биореактора, который состоит из круглодонной трехгорлой колбы, колбонагревателя, холодильника, градусника и перемешивающего устройства с лопастной мешалкой.

Анализ на чистоту полученного препарата, его количество, содержание иных примесей осуществляется спектрофотометром, планшетным фотометром или сканером, фотоэлектроколориметром.

Исследование токсичности полученного препарата обеспечивается выполнением всех норм и правил, указанных в ГОСТ 31674-2012 [7].

Для осаждения нуклеината натрия из раствора в качестве органического растворителя используют изопропанол (1:1), этиловый спирт (1:2), или ацетон (1:3) [8].

Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink реализуется следующим образом.

Пример. Пример описывает способ получения нуклеината натрия из сухой биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink (штамм ИФР № C-111).

Перед выделением нуклеиновых кислот 50 г сухой биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris помещают в ступку и растирают в течение 10 минут. Далее к полученной гомогенной массе приливают 150 мл 0,5 н. охлажденной до 0°С хлорной кислоты и продолжают промывать клеточный материал в течение 5 минут, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают. Далее к полученной гомогенной массе приливают смесь этилового спирта с этилацетатом (1:1) и продолжают перетирать еще в течение 5 минут. Этиловый спирт и этилацетат, экстрагировавшие пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3500 об/мин. Процедуру промывки чистым спиртом проводят до полного отсутствия запаха этилацетата и максимального осветления клеточной массы от пигментов. Подготовленный таким образом биоматериал, готов к экстракции нуклеиновых кислот.

Для этого подготовленную биомассу Chlorella vulgaris, количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывая осадок 360 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, рН=7. Добавляют к смеси 40 мл детергента (SDS, натрия додецилсульфата) с концентрацией 100 мл/дм³ для дополнительного лизиса клеточных стенок и ядра. Нагревают смесь до 100°С, медленно, в течение 40-60 минут. Затем в течение 2-3 часов выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием. При этом клеточная стенка хлореллы и оболочка ядра разрушается, под действием высокой для нее температуры и внесенного детергента. Основная часть белка под действием высокой температуры денатурирует и образуется в осадке с клеточным шламом.

По окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, а денатурированный белок с клеточным шламом отделяют центрифугированием, высушивают, растирают и взвешивают.

Клеточный шлам отбрасывают, он может быть использован как добавка в рацион животных после дополнительной отмывки, сушки и перетирания в порошок.

Замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону (1:2, 2 - ацетон) или изопропанолу (1:1).

Далее помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа.

Образовавшиеся в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием. Промывают осадок 70% этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе. Растирают в порошок до мелкодисперсного состояния и проводят качественные и количественные испытания. При длительном хранении, порошок нуклеината натрия разбавляют в буферном растворе и хранят при низкой температуре.

Выход порошка нуклеината натрия составил около 6,02 г из навески биомассы микроводорослей 50,0 г (по сухой массе). Порошок получается белого цвета. Содержание белка не более 1.5%.

Чистота полученного препарата соответствует нормам.

Проверка общей токсичности препарата по ГОСТ 31674-2012 показала отрицательный результат воздействия на одноклеточные микроорганизмы Infusoria рода Stylonychia mytilus в сравнении с эталонным образцом нуклеината натрия фармакопейной чистоты [9].

Приготовление цитратно-солевого раствора

Цитратно солевой раствор для экстракции нуклеината натрия готовится следующим образом. В колбу на 500 мл помещается навеска 100 г натрия хлорида (для 20%) и 5 г натрия цитрата (для 1%). Колба заполняется 200 мл дистиллированной воды и ставится на ультразвуковую баню до полного растворения соли и доводится до метки водой. Необходимо также обеспечить рН раствора от 6 до 7. Солевой раствор используется при гидролизе в необходимом количестве.

Список литературы

1. Роик Б.О. Определение количества ДНК в суспензионном препарате «АльгаВет» на основе микроводоросли Chlorella vulgaris / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Современный агропромышленный комплекс глазами молодых ученых: Материалы научно-образовательной школы аспирантов Ассоциации аграрных вузов Центрального Федерального округа России. - Орел, 2017. - С. 97-101.

2. Лечебно-профилактический препарат для животных на основе нуклеиновых кислот из микроводоросли Chlorella vulgaris/ Б.О. Роик, М.М. Наумов, В.А. Лукьянов, Н.М. Наумов // Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных: материалы IV Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию заслуж. деятеля науки РФ Л.П. Тельцова, Саранск, 15-16 ноября 2017 г. / редкол.: В.С.Темлякова, А.С. Зенкин, Л.П. Тельцов. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2017. - 6,68 Мб.

3. Пояснительная записка к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11.

4. Земсков В.М. и др. Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - С. 7-8.

5. Патент РФ 2573944, 2016 «Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина», авторы Лобакова Е.С. и др.

6. Выделение и очистка продуктов биотехнологии. Методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / авт.-сост.: Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 70 с.

7. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - Москва: ФГУП «Стандартинформ», 2014. -17 с.

8. Патент BY 6691 С1.

9. Роик Б.О. Скрининговые исследования препарата нуклеиновых кислот на инфузориях рода Stylonychia mytilus / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора Кабыша Андрея Александровича. - Троицк, 2017. С. 350-359.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к способам получения биологически активных веществ на основе нуклеиновых кислот, а именно к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris. Способ получения препарата нуклеината натрия из микроводоросли предусматривает механическое лизирование клеточной оболочки микроводоросли, очистку биоматериала от липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др., гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей этанолом, изопропанолом или ацетоном, центрифугирование, промывку осадка этиловым спиртом, сушку. Полученный продукт может использоваться в качестве иммуностимулятора при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, ветеринарной и пищевой промышленности для получения препаратов и продуктов на основе нуклеиновых кислот. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения нуклеината натрия из биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink, заключающийся в том, что из предварительно подготовленной сухой биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink в количестве 50 г экстрагируют нуклеинат натрия, для чего подготовленную биомассу количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывают осадок 360 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, с рН раствора 7, добавляют к смеси 40 мл детергента натрия додецилсульфата с концентрацией 100 мг/дм³ для дополнительного лизиса клеточных стенок и ядра, нагревают смесь до 100°С медленно, в течение 40-60 минут, затем в течение 2-3 часов выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием, по окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону в отношении 1:2 или изопропанолу 1:1, затем помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа, образовавшиеся при этом в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием, промывают осадок 70%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе и растирают в порошок до мелкодисперсного состояния.

2. Способ получения нуклеината натрия из биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink по п. 1, отличающийся тем, что производят предварительную подготовку сухой биомассы микроводоросли, для чего 50 г сухой биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris помещают в ступку и растирают в течение 10 минут, к полученной гомогенной массе приливают 150 мл 0,5 н. охлажденной до 0°С хлорной кислоты и продолжают промывать клеточный материал в течение 5 минут, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин, надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают, к полученной гомогенной массе приливают смесь этилового спирта с этилацетатом 1:1 и продолжают перетирать еще в течение 5 минут, этиловый спирт и этилацетат, экстрагировавшие пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3500 об/мин, затем промывают чистым спиртом до полного отсутствия запаха этилацетата и максимального осветления клеточной массы от пигментов.