Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink Российский патент 2021 года по МПК C12P19/34 C07H21/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности, к способам получения биологически активных веществ на основе нуклеиновых кислот, а именно к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris, которая может быть использована в качестве иммуностимулятора на основе нуклеиновых кислот для ветеринарного использования при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, микробиологической, биотехнологической, ветеринарной и пищевой промышленности для получения препаратов и продуктов на основе нуклеиновых кислот.

Микроводоросли рода Chlorella vulgaris Bejerink были обнаружены в 1890 году голландским ученым микробиологом и ботаником Мартином Биллем (Уиллем) Бейеринком. Данные микроводоросли являются наиболее распространенным видом из рода хлорелловых. По палеонтологическим исследованиям ископаемых образцов докембрийского периода, микроводоросль Chlorella vulgaris насчитывает достаточно большой генетический возраст, около 2 млрд. лет, что ставит данную микроводоросль по генетической выживаемости и сохранении в первоначальном виде до наших времен на ступень выше, чем генетический возраст дрожжей, осетровых и лососевых рыб. Можно сделать вывод, что ДНК микроводорослей является весьма предрасположенной к выживанию, а значит, может иметь и отличительные стороны в фармакологических эффектах при действии на организм [1-2].

В литературных источниках малоизвестно о получении нуклеината натрия из зеленых микроводорослей и в основном большее внимание направлено на получение рибонуклеината натрия из хлебопекарных дрожжей (препараты РНК) или получение дезоксирибонуклеината натрия из молок лососевых и осетровых рыб (препараты ДНК). В данном случае, для получения нуклеината натрия используются зеленые микроводоросли рода Chlorella vulgaris Bejerink, которые содержат в себе достаточное количество как РНК, так и ДНК компонентов, что было определено исследованиями [1]. Поэтому в качестве аналогов изобретения используются только те, которые по своей сущности и технологии получения нуклеината натрия являются наиболее близкими к заявленному изобретению.

Известен способ получения нуклеината натрия из дрожжей в водной среде при 100-110°С, включающий сам гидролиз, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты от дрожжевого клеточного шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением гидроксида натрия и затем осаждение рибонуклеината натрия из полученного раствора этиловым спиртом [3].

К недостаткам данного способа следует отнести сложность в технологии процесса выделения и использование вредных веществ при промывке, например, диэтилового эфира, к тому же образование осадка серовато-желтого цвета свидетельствует о присутствии достаточно большого количества белков, что мало допустимо.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, заключающийся в экстракции РНК из дрожжей гидролизом при помощи 10-12% раствора хлористого натрия при 100-110°C с последующим отделением раствора РНК от клеточного шлама и осаждение РНК соляной кислотой, промывку выпавшего осадка этиловым спиртом и сушку. Избавление от пигментов и белков в данном изобретении осуществляется при растворении РНК в воде, доведении раствора до рН=8.0-8.2 гидроксидом натрия, выдерживании в течение часа при 37-40°C с добавлением панкреатина. Осаждение рибонуклеината осуществляется подкисленным соляной кислотой до рН=1-2 этиловым спиртом. Полученный осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением едкого натра, затем осаждают этанолом, осадок фильтруют, снова промывают этиловым спиртом и сушат [4].

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и многостадийность осаждений РНК, причем не исключены потенциальные потери конечного продукта при стадиях переосаждения.

Известен также ряд способов получения натриевой соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб.

Практически все способы используют схему выделения нуклеината натрия гидролизом в цитратно-солевом растворе, осаждение ДНК в виде натриевой соли при помощи этилового спирта или изопропанола и отмывку 70% этиловым спиртом, сушку и растворение в буфере в случае хранения. Недостатком всех этих способов является использование животного сырья, а именно молок рыб, что приводит к уничтожению большого количества невосполнимого источника биоресурса.

Известен способ выделения ДНК из микроводоросли Haematococcus pluvialis (патент РФ 2573944, 2016 - Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина, авторы Лобакова Е.С. и др.) [5].

Данный способ заключается в выделении ДНК из микроводорослей методом фенол-хлороформной экстракции. Подготовка биомассы представляет собой разрушение прочных клеточных стенок с применением трехкратного замораживания образцов при -4°C с последующим оттаиванием, инкубацию в течение часа в ТЕ буфере и лизоциме при 37°С, затем инкубацию с интенсивным перемешиванием в течение часа при 40°C с додецилсульфатом натрия, высаливание белков при добавлении 1М раствора хлорида натрия на холоду, затем экстракцию фенол-хлороформом.

Недостатком данного способа считается использование фенол-хлороформной экстракции ДНК. Полученная ДНК лишь после многократной промывки в этиловом спирте может быть использована в качестве препарата, в ином случае полученная ДНК пригодна для молекулярной биологии и ПЦР анализа. Тем не менее, данный способ не предполагает получение нуклеината натрия как ветеринарно-медицинского препарата.

Процесс получения нуклеината натрия из микроводоросли совпадает лишь с некоторыми стадиями в технологии получения соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб. В работе применены некоторые принципы выделения нуклеиновых кислот, указанных в пособиях по биохимии [6].

Цель изобретения - получение чистого продукта нуклеината натрия, отвечающего всем нормам и характеристикам, а также обладающего выраженным фармакологическим эффектом и положительным действием на организм, используя зеленые микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink.

Предложенный способ получения препарата нуклеината натрия в виде порошка белого цвета из предварительно подготовленной сухой лиофилизированной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink предусматривает очистку биоматериала от мешающих компонентов (липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др.), гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей этанолом или изопропанолом (ацетоном), центрифугирование, промывку осадка спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния.

Использование в настоящем изобретении лиофилизированного материала микроводоросли означает, что материал подготовлен по методу лиофильной сушки. Таким образом, клетки микроводоросли разрушаются за счет обезвоживания и представляют собой гомогенную лизированную сухую клеточную биомассу, которая может быть использована для достижения поставленной цели напрямую при гидролизе, исключая дополнительное механическое или физико-химическое лизирование клеток.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен препарат нуклеинат натрия из зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, обладающий такими же биологическими и лечебными свойствами, как и эталонные образцы, при этом были подобраны технологические условия процесса выделения нуклеиновых кислот с использованием биотехнологической установки в виде биореактора, который состоит из круглодонной трехгорлой колбы, колбонагревателя, холодильника, градусника и перемешивающего устройства с лопастной мешалкой.

Анализ на чистоту полученного препарата, его количество, содержание иных примесей осуществляется спектрофотометром, планшетным фотометром или сканером, фотоэлектроколориметром.

Исследование токсичности полученного препарата обеспечивается выполнением всех норм и правил, указанных в ГОСТ 31674-2012 [7].

Для осаждения нуклеината натрия из раствора в качестве органического растворителя используют изопропанол (1:1), этиловый спирт (1:2), или ацетон (1:3) [8].

Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink реализуется следующим образом.

Пример 1. Пример описывает способ получения нуклеината натрия из сухой лиофилизированной биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink (штамм ИФР № С-111). Для этого проводят предварительную подготовку биомассы, для чего 50 г (±0,5) сухой лиофилизированной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris помещают в емкость и далее приливают охлажденную 0,5 н. хлорную кислоту, промывают клеточную массу в течение 5 минут энергичным перемешиванием, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают. Далее к полученной гомогенной массе приливают этиловый спирт и продолжают промывать клеточный осадок в течение 5 минут. Этиловый спирт, экстрагировавший пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3500 об/мин. Подготовленный таким образом биоматериал, готов к экстракции нуклеиновых кислот.

Для этого подготовленную биомассу Chlorella vulgaris, количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывая осадок 400 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, рН=7. Добавляют к смеси 40 мл детергента (SDS, натрия додецилсульфата) с концентрацией 100 мл/дм для дополнительного лизиса клеточных мембран и стенок ядра, затем 10 мл изоамилового спирта для депротеинизации клеточной массы. Нагревают смесь до 90-100°С, медленно, в течение 40-60 минут. Затем в течение 2-3 часов выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием. При этом клеточная стенка хлореллы и оболочка ядра разрушается, под действием высокой для нее температуры и внесенного детергента. Основная часть белка под действием изоамилового спирта и высокой температуры денатурирует и образуется в осадке с клеточным шламом.

По окончании процесса, смеси дают остыть до комнатной температуры, добавляют около 100 мл цитратно-солевого раствора, перемешивают, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, а денатурированный белок с клеточным шламом отделяют центрифугированием, высушивают, растирают и взвешивают. Клеточный шлам отбрасывают, он может быть использован как добавка в рацион животных после дополнительной отмывки, сушки и перетирания в порошок.

Замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону (1:2). Далее помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа. Образовавшиеся в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием. Промывают осадок 70%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе. Растирают в порошок до мелкодисперсного состояния и проводят качественные и количественные испытания. При длительном хранении, порошок нуклеината натрия разбавляют в буферном растворе и хранят при низкой температуре.

Выход порошка нуклеината натрия составил 6,04 г из навески биомассы микроводорослей 50,0 г. Порошок получается белого цвета. Содержание белка не более 1.5%.

Чистота полученного препарата соответствует нормам.

Проверка общей токсичности препарата по ГОСТ 31674-2012 показала отрицательный результат воздействия на одноклеточные микроорганизмы Infusoria рода Stylonychia mytilus в сравнении с эталонным образцом нуклеината натрия фармакопейной чистоты по примеру [9].

Пример 2. Процесс проводят, как указано в примере 1, только без добавки изоамилового спирта. При этом следует брать объемы к навеске сухой хлореллы 50 г 370 мл цитратно-солевого раствора и 30 мл детергента в виде SDS. Осаждение нуклеината натрия проводить в ацетоне (1:2, 2 - объем ацетона).

Выход порошка нуклеината натрия составил 6,8 г из навески биомассы микроводорослей 50,0 г (по сухой массе). Порошок получается бело-бежевого цвета. Содержание белка не более 1,5%.

Чистота полученного препарата соответствует нормам.

Проверка общей токсичности препарата по ГОСТ 31674-2012 показала отрицательный результат воздействия на одноклеточные микроорганизмы Infusoria рода Stylonychia mytilus в сравнении с эталонным образцом нуклеината натрия фармакопейной чистоты по примеру [9].

Приготовление цитратно-солевого раствора

Цитратно солевой раствор для экстракции нуклеината натрия готовится следующим образом. В колбу на 500 мл помещается навеска 100 г натрия хлорида (для 20%) и 5 г натрия цитрата (для 1%). Колба заполняется 200 мл дистиллированной воды и ставится на ультразвуковую баню до полного растворения соли и доводится до метки водой. Необходимо также обеспечить рН раствора от 6 до 7. Солевой раствор используется при гидролизе в необходимом количестве.

Список литературы

1. Роик Б.О. Определение количества ДНК в суспензионном препарате «АльгаВет» на основе микроводоросли Chlorella vulgaris I Б.О. Роик, М.М. Наумов // Современный агропромышленный комплекс глазами молодых ученых: Материалы научно-образовательной школы аспирантов Ассоциации аграрных вузов Центрального Федерального округа России. - Орел, 2017. - С. 97-101.

2. Лечебно-профилактический препарат для животных на основе нуклеиновых кислот из микроводоросли Chlorella vulgaris/ Б.О. Роик, М.М. Наумов, В.А. Лукьянов, Н.М. Наумов // Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных: материалы IV Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию заслуж. деятеля науки РФ Л.П. Тельцова, Саранск, 15-16 ноября 2017 г. / редкол.: В.С. Темлякова, А.С. Зенкин, Л.П. Тельцов. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2017. - 6,68 Мб.

3. Пояснительная записка к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11.

4. Земсков В.М. и др., Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - С. 7-8.

5. Патент РФ 2573944, 2016 «Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина», авторы Лобакова Е.С. и др.

6. Выделение и очистка продуктов биотехнологии. Методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / авт.-сост.: Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 70 с.

7. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - Москва: ФГУП «Стандартинформ», 2014. - 17 с.

8. Патент BY 6691 С1.

9. Роик Б.О. Скрининговые исследования препарата нуклеиновых кислот на инфузориях рода Stylonychia mytilus / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора Кабыша Андрея Александровича. - Троицк, 2017. С. 350-359.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способы получения нуклеината натрия из сухой лиофилизированной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink, штамм ИФР № С-111, предусматривающие гидролиз в цитратно-солевом растворе, отделение от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей этиловым спиртом, центрифугирование, промывку осадка этиловым спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния. Технический результат - получение чистого продукта. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink, заключающийся в том, что производят предварительную подготовку сухой лиофилизированной биомассы зеленой микроводоросли, для чего 50 г сухой лиофилизированной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink, штамм ИФР № С-111, помещают в емкость, приливают 0,5 н. охлажденную хлорную кислоту, промывают клеточную массу в течение 5 мин энергичным перемешиванием, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин, надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают, к полученной гомогенной массе приливают этиловый спирт и продолжают промывать клеточный осадок в течение 5 мин, этиловый спирт, экстрагировавший пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, затем подготовленную биомассу количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывают осадок 400 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, с рН раствора 7, добавляют к смеси 40 мл детергента натрия додецилсульфата с концентрацией 100 мл/дм³ для дополнительного лизиса клеточных мембран и стенок ядра, затем 10 мл изоамилового спирта, нагревают смесь до 90-100°С медленно, в течение 40-60 мин, затем в течение 2-3 ч выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием, по окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону в отношении 1:2, затем помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа, образовавшиеся при этом в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием, промывают осадок 70% этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе воздуха, азота в лабораторном концентраторе и растирают в порошок до мелкодисперсного состояния.

2. Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink, заключающийся в том, что производят предварительную подготовку сухой лиофилизированной биомассы зеленой микроводоросли, для чего 50 г сухой лиофилизированной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink, штамм ИФР № С-111, помещают в емкость, приливают 0,5 н. охлажденную хлорную кислоту, промывают клеточную массу в течение 5 мин энергичным перемешиванием, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин, надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают, к полученной гомогенной массе приливают этиловый спирт и продолжают промывать клеточный осадок в течение 5 мин, этиловый спирт, экстрагировавший пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, затем подготовленную биомассу количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывают осадок 370 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, с рН раствора 7, добавляют к смеси 30 мл детергента натрия додецилсульфата с концентрацией 100 мл/дм³ для дополнительного лизиса клеточных мембран и стенок ядра, нагревают смесь до 90-100°С медленно, в течение 40-60 мин, затем в течение 2-3 ч выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием, по окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону в отношении 1:2, затем помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 ч, образовавшиеся при этом в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием, промывают осадок 70% этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе воздуха, азота в лабораторном концентраторе и растирают в порошок до мелкодисперсного состояния.