Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink Российский патент 2021 года по МПК C12P19/34 C12N1/12 

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности, к способам получения биологически активных веществ на основе нуклеиновых кислот, а именно к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris, которая может быть использована в качестве иммуностимулятора на основе нуклеиновых кислот для ветеринарного использования при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, микробиологической, биотехнологической, ветеринарной и пищевой промышленности для получения препаратов и продуктов на основе нуклеиновых кислот.

Микроводоросли рода Chlorella vulgaris Bejerink были обнаружены в 1890 году голландским ученым микробиологом и ботаником Мартином Биллем (Уиллем) Бейеринком. Данные микроводоросли являются наиболее распространенным видом из рода хлорелловых. По палеонтологическим исследованиям ископаемых образцов докембрийского периода, микроводоросль Chlorella vulgaris насчитывает достаточно большой генетический возраст, около 2 млрд. лет, что ставит данную микроводоросль по генетической выживаемости и сохранении в первоначальном виде до наших времен на ступень выше, чем генетический возраст дрожжей, осетровых и лососевых рыб. Можно сделать вывод, что ДНК микроводорослей является весьма предрасположенной к выживанию, а значит, может иметь и отличительные стороны в фармакологических эффектах при действии на организм [1-2].

В литературных источниках малоизвестно о получении нуклеината натрия из зеленых микроводорослей и в основном большее внимание направлено на получение рибонуклеината натрия из хлебопекарных дрожжей (препараты РНК) или получение дезоксирибонуклеината натрия из молок лососевых и осетровых рыб (препараты ДНК). В данном случае, для получения нуклеината натрия используются зеленые микроводоросли рода Chlorella vulgaris Beyerink, которые содержат в себе достаточное количество как РНК, так и ДНК компонентов, что было определено исследованиями [1]. Поэтому в качестве аналогов изобретения используются только те, которые по своей сущности и технологии получения нуклеината натрия являются наиболее близкими к заявленному изобретению.

Известен способ получения нуклеината натрия из дрожжей в водной среде при 100-110°С, включающий сам гидролиз, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты от дрожжевого клеточного шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением гидроксида натрия и затем осаждение рибонуклеината натрия из полученного раствора этиловым спиртом [3].

К недостаткам данного способа следует отнести сложность в технологии процесса выделения и использование вредных веществ при промывке, например, диэтилового эфира, к тому же образование осадка серовато-желтого цвета свидетельствует о присутствии достаточно большого количества белков, что мало допустимо.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, заключающийся в экстракции РНК из дрожжей гидролизом при помощи 10-12% раствора хлористого натрия при 100-110°С с последующим отделением раствора РНК от клеточного шлама и осаждение РНК соляной кислотой, промывку выпавшего осадка этиловым спиртом и сушку. Избавление от пигментов и белков в данном изобретении осуществляется при растворении РНК в воде, доведении раствора до рН=8.0-8.2 гидроксидом натрия, выдерживании в течение часа при 37-40°С с добавлением панкреатина. Осаждение рибонуклеината осуществляется подкисленным соляной кислотой до рН=1-2 этиловым спиртом. Полученный осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением едкого натра, затем осаждают этанолом, осадок фильтруют, снова промывают этиловым спиртом и сушат [4].

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и многостадийность осаждений РНК, причем не исключены потенциальные потери конечного продукта при стадиях переосаждения.

Известен также ряд способов получения натриевой соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб.

Практически все способы используют схему выделения нуклеината натрия гидролизом в цитратно-солевом растворе, осаждение ДНК в виде натриевой соли при помощи этилового спирта или изопропанола и отмывку 70% этиловым спиртом, сушку и растворение в буфере в случае хранения. Недостатком всех этих способов является использование животного сырья, а именно молок рыб, что приводит к уничтожению большого количества невосполнимого источника биоресурса.

Известен способ выделения ДНК из микроводоросли Haematococcus pluvialis (патент РФ 2573944, 2016 - Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина, авторы Лобакова Е.С.и др.) [5].

Данный способ заключается в выделении ДНК из микроводорослей методом фенол-хлороформной экстракции. Подготовка биомассы представляет собой разрушение прочных клеточных стенок с применением трехкратного замораживания образцов при -4°С с последующим оттаиванием, инкубацию в течение часа в ТЕ буфере и лизоциме при 37°С, затем инкубацию с интенсивным перемешиванием в течение часа при 40°С с додецилсульфатом натрия, высаливание белков при добавлении 1М раствора хлорида натрия на холоду, затем экстракцию фенол-хлороформом.

Недостатком данного способа считается использование фенол-хлороформной экстракции ДНК. Полученная ДНК лишь после многократной промывки в этиловом спирте может быть использована в качестве препарата, в ином случае полученная ДНК пригодна для молекулярной биологии и ПЦР анализа. Тем не менее, данный способ не предполагает получение нуклеината натрия как ветеринарно-медицинского препарата.

Процесс получения нуклеината натрия из микроводоросли совпадает лишь с некоторыми стадиями в технологии получения соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб. В работе применены некоторые принципы выделения нуклеиновых кислот, указанных в пособиях по биохимии [6].

Цель изобретения - получение чистого продукта нуклеината натрия, отвечающего всем нормам и характеристикам, а также обладающего выраженным фармакологическим эффектом и положительным действием на организм, используя зеленые микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink.

Предложенный способ получения препарата нуклеината натрия в виде порошка белого цвета из предварительно подготовленной пастообразной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink предусматривает механическое лизирование клеточной оболочки микроводоросли, очистку биоматериала от мешающих компонентов (липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др.), гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей этанолом или изопропанолом (ацетоном), центрифугирование, промывку осадка спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен препарат нуклеинат натрия из зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, обладающий такими же биологическими и лечебными свойствами, как и эталонные образцы, при этом были подобраны технологические условия процесса выделения нуклеиновых кислот с использованием биотехнологической установки в виде биореактора, который состоит из круглодонной трехгорлой колбы, колбонагревателя, холодильника, градусника и перемешивающего устройства с лопастной мешалкой.

Чистоту полученного препарата, его количество, содержание иных примесей осуществляется спектрофотометром, планшетным фотометром или сканером, фотоэлектроколориметром.

Исследование токсичности полученного препарата обеспечивается выполнением всех норм и правил, указанных в ГОСТ 31674-2012 [7].

Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink реализуется следующим образом.

Пример. Пример описывает способ получения нуклеината натрия из пастообразной биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink (штамм ИФР № С-111), полученной сразу после культивирования. Перед выделением нуклеиновых кислот, полученную при культивировании биомассу микроводорослей Chlorella vulgaris в виде густой пасты осаждают центрифугой, максимально отделяя межклеточную жидкость, и подготавливают к гидролизу. Для этого замораживают биомассу при -20°С и размораживают до комнатной температуры 2-3 раза. Таким образом, 40 г размороженного исходного сырья (пастообразный концентрат) количественно переносят в ступку и растирают аккуратно пестиком в течение 5 минут с инертным абразивным материалом, например, песком, для разрушения крепкой клеточной стенки хлореллы.

Далее к полученной гомогенной массе в количестве 50 мл приливают этиловый спирт с этилацетатом (1:1) и продолжают перетирать еще в течение 5 минут. Этиловый спирт и этилацетат, экстрагировавшие пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3500 об/мин. Процедуру промывки чистым спиртом проводят до полного отсутствия запаха этилацетата в осадочной массе микроводоросли. Затем полученный осадок промывают добавлением к нему 0,5 н. хлорной кислоты, осторожно перемешивая в течение 5 минут, и центрифугируют. После этого промывают осадок цитратно-солевым раствором (5% натрия хлорид и 0,5% натрия цитрат, смешанные 1:1 по объему, рН=7.0 раствора), тщательно перемешивают и снова центрифугируют при тех же условиях. Подготовленный таким образом биоматериал, готов к экстракции нуклеиновых кислот.

Для этого 50 г пастообразной биомассы Chlorella vulgaris, помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора с 350 мл цитратно-солевого раствора, той же концентрации, что и при промывке. Добавляют к смеси 20 мл детергента (SDS, натрия додецилсульфата) с концентрацией 100 мл/дм³. Нагревают смесь до 100°С, медленно, в течение 40 минут. Затем в течение 1,5-2 часа выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием. При этом клеточная стенка хлореллы разрушается под действием высокой для нее температуры и внесенного детергента, а основная часть белка денатурирует и образуется в осадке с клеточным шламом, нуклеиновые кислоты находятся в растворе.

По окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость. Осадок повторно гидролизуют в 110 мл цитратно-солевого раствора с 20 мл детергента в течение 30 минут, после выхода реактора на температурный режим (40 мин), при 100°С. Повторяют действия по отделению белка и шлама, и соединяют полученные гидролизаты. Замеряют общий объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С этиловому спирту (1:2). Далее помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа.

Образовавшиеся в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием. Промывают осадок 70%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе. Растирают в порошок до мелкодисперсного состояния. При длительном хранении, порошок нуклеината натрия разбавляют в буферном растворе и хранят при низкой температуре в холодильнике.

Выход порошка нуклеината натрия составил около 0,4 г из сухой навески биомассы микроводорослей 10,0 г (поясняем, что 40 г биомассы хлореллы, указанной вначале примера, относится к биомассе в состоянии густой пасты, которая содержит межклеточную жидкость, а 10 г являются пересчетом сухой массы микроводоросли, эквивалентной пасте). Порошок получается белого цвета. Содержание белка не более 1,5%.

Проверка общей токсичности препарата по ГОСТ 31674-2012 показала отрицательный результат воздействия на одноклеточные микроорганизмы Infusoria рода Stylonychia mytilus в сравнении с эталонным образцом нуклеината натрия фармакопейной чистоты по примеру [9].

Приготовление цитратно-солевого раствора

Цитратно солевой раствор для экстракции нуклеината натрия готовится следующим образом. В колбу на 500 мл помещается навеска 100 г натрия хлорида (для 20%) и 5 г натрия цитрата (для 1%). Колба заполняется 200 мл дистиллированной воды и ставится на ультразвуковую баню до полного растворения соли и доводится до метки водой. Необходимо также обеспечить рН раствора от 6 до 7. Солевой раствор используется при гидролизе в необходимом количестве.

Список литературы

1. Роик Б.О. Определение количества ДНК в суспензионном препарате «АльгаВет» на основе микроводоросли Chlorella vulgaris / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Современный агропромышленный комплекс глазами молодых ученых: Материалы научно-образовательной школы аспирантов Ассоциации аграрных вузов Центрального Федерального округа России. - Орел, 2017. - С. 97-101.

2. Лечебно-профилактический препарат для животных на основе нуклеиновых кислот из микроводоросли Chlorella vulgaris/ Б.О. Роик, М.М. Наумов, В.А. Лукьянов, Н.М. Наумов // Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных: материалы IV Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию заслуж. деятеля науки РФ Л.П. Тельцова, Саранск, 15-16 ноября 2017 г. / редкол.: В.С. Темлякова, А.С. Зенкин, Л.П. Тельцов. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2017. - 6,68 Мб.

3. Пояснительная записка к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11.

4. Земсков В.М. и др. Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - С. 7-8.

5. Патент РФ 2573944, - Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина, авторы Лобакова Е.С. и др.

6. Выделение и очистка продуктов биотехнологии. Методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / авт.-сост.: Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 70 с.

7. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - Москва: ФГУП «Стандартинформ», 2014. - 17 с.

8. Патент BY 6691 С1.

9. Роик Б.О. Скрининговые исследования препарата нуклеиновых кислот на инфузориях рода Stylonychia mytilus / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора Кабыша Андрея Александровича. - Троицк, 2017. С. 350-359.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris. Способ получения препарата нуклеината натрия предусматривает механическое лизирование клеточной оболочки микроводоросли, очистку биоматериала от липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др., гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей этанолом, центрифугирование, промывку осадка спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния. Продукт может быть использован в качестве иммуностимулятора для ветеринарного использования при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, биотехнологической, ветеринарной и пищевой промышленности. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink, заключающийся в том, что из предварительно подготовленной пастообразной биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink, полученной сразу после культивирования, экстрагируют нуклеинат натрия, для чего 50 г пастообразной биомассы Chlorella vulgaris помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора с 350 мл цитратно-солевого раствора, содержащего 5% натрия хлорида и 0,5% натрия цитрата, смешанных 1:1 по объему, с рН раствора7,0, добавляют к смеси 20 мл детергента натрия додецилсульфата с концентрацией 100 мг/дм³, нагревают смесь до 100°С, медленно, в течение 40 мин, затем в течение 1,5-2 ч выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием, по окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят в высокую емкость, осадок повторно гидролизуют в 110 мл цитратно-солевого раствора с 20 мл детергента в течение 30 мин после выхода реактора на температурный режим за 40 мин, при 100°С, повторяют действия по отделению белка и шлама и соединяют полученные гидролизаты, затем замеряют общий объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С этиловому спирту в соотношении 1:2, после чего помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 ч, образовавшиеся при этом в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием, промывают осадок 70%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе и растирают в порошок до мелкодисперсного состояния.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед выделением нуклеиновых кислот полученную при культивировании биомассу микроводорослей Chlorella vulgaris, в виде густой пасты, в количестве 40 г осаждают центрифугированием, максимально отделяя межклеточную жидкость, и подготавливают к гидролизу, для чего замораживают биомассу при -20°С и размораживают до комнатной температуры 2-3 раза, затем размороженный концентрат количественно переносят в ступку и растирают аккуратно пестиком в течение 5 мин с инертным абразивным материалом, к полученной гомогенной массе в количестве 50 мл приливают этиловый спирт с этилацетатом в отношении 1:1 и продолжают перетирать еще в течение 5 мин, затем этиловый спирт и этилацетат, экстрагировавшие пигменты и липиды отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, после чего оставшуюся массу промывают чистым спиртом до полного отсутствия запаха этилацетата в осадочной массе микроводоросли, затем полученный осадок промывают добавлением к нему 0,5 н. хлорной кислоты, осторожно перемешивая в течение 5 мин, и центрифугируют, после этого промывают осадок цитратно-солевым раствором, тщательно перемешивают и снова центрифугируют при тех же условиях.