СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНАТА НАТРИЯ Российский патент 1997 года по МПК C12P19/34 C07H21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения медицинских препаратов.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, включающий гидролиз дрожжей в водной среде при 100-110^oС, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты (РНК) от дрожжевого шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением едкого натра и осаждение из раствора рибонуклеината натрия этиловым спиртом (см.Пояснительную записку к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11).

Недостатком известного способа является сложность технологического процесса, использование вредных веществ при промывке (диэтиловый эфир) и невысокое качество продукта, имеющего серовато-желтый цвет, что объясняется высоким содержанием белков.

Наиболее близким к заявляемому по своей технической сущности является способ получения рибонуклеината натрия. (Земскова В.М. и др. Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине, Рига, Зинатне, 1985, с. 7-8). Способ включает экстракцию РНК из дрожжей 10-12%-ным раствором хлористого натрия при 100-110^oС с последующим отделением раствора РНК от дрожжевого шлама и осаждением соляной кислотой. Выпавшую в осадок РНК промывают этиловым спиртом и сушат. Для очистки от пигментов и белков РНК растворяют в воде и доводят рН до 8,0-8,2 добавлением едкого натра. Затем к раствору добавляют панкреатин и выдерживают около часа при 37-40^oС. Осаждение нуклеиновой кислоты проводят охлажденным и подкисленным соляной кислотой до рН 1-2 этиловым спиртом. Осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением гидроокиси натрия. Нуклеинат натрия осаждают из полученного раствора этиловым спиртом, осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом и сушат.

Недостатком известного способа является сложность его осуществления и невысокое качество конечного продукта.

Изобретение направлено на упрощение способа получения нуклеината натрия и повышение его качества.

Указанный результат достигается тем, что способ получения нуклеината натрия включает экстракцию рибонуклеиновой кислоты из биомассы дрожжей, отделение биомассы, осаждение рибонуклеиновой кислоты, обработку рибонуклеиновой кислоты протеолитическим ферментом и осаждение нуклеината натрия этиловым спиртом из водного раствора рибонуклеиновой кислоты и едкого натра, при этом обработке протеолитическим ферментом подвергают экстракт, полученный после отделения биомассы, по завершении которой уменьшают рН экстракта до 3,8-4,2, после чего осуществляют коагуляцию белков и осветление раствора, а осаждение рибонуклеиновой кислоты из экстракта осуществляют хлористым кальцием.

Указанный результат достигается также тем, что экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л экстракта.

Отличительными признаками заявляемого способа являются:
обработке протеолитическим ферментом подвергается экстракт рибонуклеиновой кислоты после отделения биомассы дрожжей;
уменьшение рН обработанного экстракта до 3,8-4,2;
осуществление коагуляции белков в обработанном экстракте и осветление раствора;
осаждение рибонуклеиновой кислоты из экстракта хлористым кальцием;
обработка экстракта протеолитическим ферментом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л раствора.

Обработка экстракта рибонуклеиновой кислоты протеолитическим ферментом до ее осаждения позволяет разложить белки, содержащиеся в экстракте, и таким образом снизить их содержание в осаждаемой рибонуклеиновой кислоте, что в свою очередь благотворно сказывается на качестве конечного продукта нуклеината натрия.

Уменьшение рН раствора, подвергнутого протеолитической обработке, позволяет обеспечить осаждение белков. При этом если рН больше 4,2, то процесс осаждения практически не идет, а снижение рН до величины менее 3,8 приводит к выпадению РНК и ее нежелательным потерям.

Проведение коагуляции белков в обработанном экстракте и последующее осветление раствора, например, фильтрацией до осаждения РНК позволяет освободить его от осажденных и скоагулировавших белков, что снижает их содержание в последующем осаждаемой РНК, что повышает качество конечного продукта.

В процессе проведения экспериментов проверялось влияние последовательности выполнения операций, составляющих способ, на качество получаемого продукта. В частности, обработке ферментом подвергали уже осажденную РНК с последующей корректировкой рН, коагуляцией, осветлением и повторным осаждением и в соответствии с последовательностью операций, предлагаемой заявляемым способом, то есть обработкой ферментами экстракта РНК до ее осаждения, корректировкой рН, коагуляцией и осветлением.

Установлено, что если обработку ферментами осуществлять до осаждения РНК, то ее содержание в веществе, идущем на последующую обработку для получения нуклеината натрия, составляет 98,8% а при обработке ферментами после осаждения, как это предусмотрено в способе, выбранном в качестве прототипа - 75,6%
Осаждение РНК из экстракта хлористым кальцием, а не соляной кислотой, как в прототипе, также позволяет, как показали опыты, снизить количество примесей в конечном продукте.

Оптимальное количество протеолитических ферментов, необходимых для обработки экстракта РНК, установлено опытным путем.

Если вводить ферменты в количестве менее 10 е.а. то процесс ферментолиза идет очень медленно, и для достижения заметного результата необходимо значительное время, что снизит выход целевого продукта, так как одновременно будет идти процесс разложения РНК. Если вводить ферменты в количестве более 100 е.а. то процесс идет столь активно, что приводит к расщеплению РНК, а значит к нежелательным потерям.

Кроме того, что заявляемый способ обеспечивает получение продукта более высокого качества, он более прост в осуществлении.

В общем случае способ реализуется следующим образом.

Исходное сырье, в качестве которого могут быть использованы любые дрожжи (хлебопекарные, пивные, кормовые, белково-витаминный концентрат и т.п.) заливают водным раствором щелочи (NaOH, КОН, аммиак) или хлористого натрия с рН 7,0-9,5, нагревают до 60-110^oС при перемешивании и выдерживании при достигнутой температуре от 10 до 60 мин для осуществления экстракции. Установлено империческое правило, что чем выше температура раствора и рН, тем меньше времени необходимо для завершения процесса экстракции.

После этого биомассу отделяют от экстракта любым из известных приемов - фильтрованием, сепарацией, центрифугированием.

Полученный экстракт обрабатывают любым из известных ферментных препаратов, содержащих протеолитические ферменты, например, протосубтилин или панкреатин.

Для обеспечения процесса обработки в соответствии с регламентом применения данного ферментного препарата корректируется рН раствора с помощью кислот или щелочей, и раствор нагревается или охлаждается до оптимальной температуры. Процесс ферментолиза осуществляется в течение установленного регламентом времени при необходимой температуре и при постоянном перемешивании.

После завершения процесса ферментолиза доводят рН реакционной среды до значения 3,8-4,2 добавлением любой из минеральных кислот (серная, соляная и т.д.).

Для осуществления операции коагуляции обработанный, как указано выше, экстракт нагревают при перемешивании до 80-100^oС, выдерживают при достигнутой температуре 5-15 мин.

Затем экстракт осветляют путем удаления выпавших осадков любым из известных приемов-сепарированием, центрифугированием, фильтрованием.

В полученный осветленный раствор РНК вносят хлористый кальций, в результате чего выпадает в осадок нерастворимая кальциевая соль РНК. Полученный осадок отфильтровывают, ресуспендируют, промывают охлажденной до 0-5^oС водой, а затем доводят рН суспензии до 1-2 любой минеральной кислотой. В результате этого в осадок выпадает свободная РНК. Ее отделяют от раствора любым из известных методов, промывают водой и каким-либо органическим растворителем (этанол, ацетон и т.п.) После промывки РНК растворяют в воде с добавлением едкого натра до рН 6,2-6,5 и из полученного раствора осаждают этиловым спиртом нуклеинат натрия. Осадок промывают спиртом и сушат.

Полученный таким образом препарат представляет собой белый с сероватым оттенком порошок, который легко растворим в воде с образованием опалесцирующих растворов и практически не растворим в 95% этаноле. Содержание основного вещества в нем составляет более 90% белковые примеси отсутствуют.

По описанной выше методике осуществлялись серии опытов для выявления оптимальной последовательности проведения операций и их параметров.

Результаты для удобства сведены в представленных ниже табл. 1 и 2.

Таким образом, из полученных данных следует, что получение максимально чистой РНК обеспечивает заявленная совокупность операций с указанным порядком их выполнения и оптимальными условиями проведения.

Использование: микробиологическая промышленность, биотехнология. Сущность изобретения: рибонуклеиновую кислоту экстрагируют из биомассы дрожжей, биомассу отделяют и экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом с последующим снижением рН до 3,8-4,2 и нагреванием экстракта до 80-100^oС, затем экстракт освобождают от примесей, а целевой продукт осаждают в виде кальциевой соли хлористым кальцием, промывают и переосаждают минеральной кислотой. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения нуклеината натрия, включающий экстракцию рибонуклеиновой кислоты из биомассы дрожжей, отделение биомассы, осаждение рибонуклеиновой кислоты минеральной кислотой, растворение рибонуклеиновой кислоты, обработку раствора протеолитическим ферментом и осаждение нуклеината натрия этиловым спиртом из водного раствора рибонуклеиновой кислоты и едкого натра, отличающийся тем, что обработку рибонуклеиновой кислоты протеолитическим ферментом осуществляют в экстракте после отделения биомассы, затем снижают рН до 3,8 4,2, нагревают экстракт до 80 100^oС, отделяют скоагулированные примеси и перед осаждением минеральной кислотой рибонуклеиновую кислоту предварительно высаживают из полученного раствора в виде кальциевой соли хлористым кальцием. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом из расчета 10 100 е.а. на 1 л экстракта.