АМИДОПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИКОФЕОИЛХИННЫХ КИСЛОТ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C07C231/02 C07C235/40 A61K31/216 A61P1/00 A61P11/00 A61P13/00 A61P17/00 A61P19/00 A61P27/00 A61P29/00 A61P31/00 A61P37/00 A61P39/00 A61Q19/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к амидным производным полизамещенных хинных кислот (сокращенно «PSQ»), способу их получения, их применению в качестве лекарственного средства, в частности для лечения и/или профилактики воспаления, а также к фармацевтической, косметической или нутрицевтической композиции, их содержащим.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Воспаление - это совокупность реакций, генерируемых организмом в ответ на агрессию.

Воспаление может быть вызвано физической агрессией (например, теплом, холодом, ионизирующим излучением) или химической агрессией (кислотными или основными соединениями, бактериальными токсинами). Оно также может быть результатом инфекции (связанной с присутствием в организме живых патогенных организмов, таких как бактерии, вирусы, паразиты или грибки). Оно может также быть вызвано иммунной реакцией, вторичной к повторному введению в организм антигена (аллергия), такого как антибиотик. Наконец, оно часто является результатом некроза тканей, который сам по себе является вторичным по отношению ко многим причинам, например, окклюзии артерий.

Целью воспалительной реакции является защита организма, и воспаление, когда оно видно, классически проявляется в виде четырех клинических признаков: покраснение, боль, отек и/или повышение температуры.

Воспаление проходит через три последовательных этапа:

- стадия, характеризующаяся сосудисто-циркуляторными реакциями;

- стадия, характеризующаяся клеточными реакциями (продуктивная фаза);

- этап выздоровления или регенерации.

Существует два типа воспаления: острое воспаление и хроническое воспаление. Острое воспаление включает в себя устранение агента, ответственного за воспаление, и восстановление поврежденной ткани. Его признаки многочисленны: покраснение кожи при ожогах, припухлость миндалин при стенокардии, воспаление суставов при растяжениях связок или кашель для устранения патогенов при бронхите. Оно может прекратиться в течение нескольких минут или дней.

Хроническое воспаление - это длительное воспаление, вызванное постоянным наличием одного или нескольких факторов стресса, которые организм больше не может самопроизвольно прекращать и которые могут стать вредными для организма. Предрасполагающими факторами являются постоянная агрессия (например, желудочная кислота при язвенной болезни), неадекватный ответ организма на инфекцию, хроническое аутоиммунное заболевание (такое как ревматоидный артрит или язвенный колит). Именно воспаление и его последствия становятся заболеванием сами по себе, часто серьезным и инвалидизирующим. Это хроническое воспаление может поражать каждый орган: пищеварительный тракт (болезнь Крона), легкие (астма), кожа (псориаз), слизистая оболочка полости носа (ринит), сосуды (сосудистые заболевания), нервная система (рассеянный склероз), суставы (все ревматизмы). Лучшее понимание хронического воспаления также выявило его присутствие в ситуациях, когда задействованы другие механизмы: рак, трансплантационный иммунитет, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и т.д.

Клетки, присутствующие в зараженной или поврежденной ткани, такие как резидентные мононуклеарные фагоциты (макрофаги и дендритные клетки) и тучные клетки, являются первыми клетками, активированными сигналами опасности. В ответ на эту активацию они высвобождают активные соединения, называемые медиаторами воспаления, такие как гистамин, провоспалительные цитокины и лейкотриены или простагландины. Функциональными последствиями этой активации являются устранение патогена (например, путем фагоцитоза) и/или восстановление повреждения (ремоделирование внеклеточного матрикса).

Цитокины представляют собой небольшие белки, секретируемые клетками в ответ на различные раздражители. На уровне иммунного ответа они позволяют иммунным клеткам направлять ответ в соответствии с природой обнаруженного сигнала. Опосредующие воспаление цитокины включают интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8) и фактор некроза опухоли α (TNFα).

IL-6 продуцируется фагоцитами (макрофагами и дендритными клетками) и эндотелиальными клетками в случае воспаления. Он вызывает локальную активацию фагоцитов и модификацию эндотелия. Он способствует привлечению моноцитов крови к тканям и продукции белков острой фазы гепатоцитами.

TNFα продуцируется макрофагами, резидентными дендритными клетками и тучными клетками. TNFα стимулирует экспрессию молекул адгезии и выработку хемокинов эндотелиальными клетками, что позволяет рекрутировать лейкоциты крови (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты или NK-лимфоциты) к источнику воспаления. TNFα также активирует микробицидные системы фагоцитов и является митогенным для Т и В-лимфоцитов (для индуцирования адаптивного ответа, если врожденного ответа недостаточно для устранения инфекции). Наконец, TNFα активирует выработку факторов роста, которые будут необходимы для восстановления поврежденной ткани.

Простагландины, в частности простагландин Е2 (PGE2) и лейкотриены, в частности лейкотриен В4 (LTB4), являются липидными медиаторами воспаления и вызывают повышенную дилатацию и проницаемость сосудов, способствуя проникновению лейкоцитов в место воспаления.

Известно, что некоторые производные кофеиновой кислоты, такие как фенетиловый эфир кофейной кислоты (САРЕ), являются важными ингибиторами медиаторов воспаления, в частности LTB4 (Fitzpatrick et al.). Эти производные также известны своим цитопротекторным эффектом, в частности, благодаря индукции продукции гем-оксигеназы-1 (НО-1) (Xinyu Wang et al.).

HO-1 играет ключевую роль в цитопротекции от клеточного окислительного стресса. Она сильно индуцируется различными стимулами, которые вызывают клеточный стресс. Поскольку фермент ограничивает скорость метаболизма гема, НО-1 оказывает защитное действие, поддерживая соответствующий уровень клеточного гема и высвобождение биоактивных молекул, в частности биливердина, свободного железа и оксида углерода. Биливердин и его восстановленная форма, билирубин, являются мощными антиоксидантами, которые могут способствовать благотворному воздействию НО-1 (Baranano et al., 2002; Stacker et al., 1987.). Окись углерода действует как посредник защиты НО-1 и оказывает противовоспалительное и антиапоптотическое действие (Otterbein et al., 2003).

Диакафеоилхинные кислоты, в частности 3,4-О-дикафеоилхинная кислота и 4,5-О-дикафеоилхинная кислота, также известны в данной области своей противовоспалительной активностью. Известно, что эти соединения ингибируют синтез лейкотриена В4 (LTB4) и продукцию IL-8 (Gianfranco Peluso et al.).

3,4,5-Трикафеоилхинная кислота ингибирует выработку медиаторов воспаления (особенно цитокинов и хемокинов) в кератиноцитах, обработанных липополисахаридом, участвующим в патогенезе воспалительных заболеваний кожи (Lee, SA et al.).

Однако было показано, что другие производные кофеиновой кислоты, такие как метилкафеат или хлорогеновая кислота, не обладают значительным противовоспалительным эффектом (Xinyu Wang et al.), показывая, что небольшие структурные изменения могут отменять противовоспалительные свойства.

Существует потребность в новых соединениях, которые ингибируют медиаторы воспаления и вызывают даже более сильный цитопротекторный эффект, чем те, которые описаны в предшествующем уровне техники.

В ЕР 2128125 описаны противовирусные эффекты некоторых амидных производных дикафеоилхинной кислоты и их применение, особенно при лечении инфекции ВИЧ, вируса гепатита В и респираторно-синцитиального вируса. Противовоспалительные свойства этих соединений не оценивались.

Неожиданно, авторы изобретения показали, что новые амидные производные PCQ не только обладают противовоспалительными свойствами, но и значительно превосходят таковые дикафеоилхинных кислот.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что некоторые амидные производные PSQ обладают замечательными противовоспалительными эффектами и могут быть использованы при лечении воспаления. Авторы изобретения также обнаружили, что амидные производные PSQ обладают большим цитопротективным потенциалом, особенно в отношении клеток в воспалительном состоянии.

В первом аспекте настоящее изобретение, таким образом, относится к амидному производному соединения PSQ или смеси соединений общей формулы (IA):

где

• R_1A и R_2A представляет, независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- С₇-С₃₀ алкиларил или арилалкильную группу, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и

• Q₁ Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или их фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру или гидрату.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения соединения общей формулы (IA)

где

• R_1A и R_2A представляет, независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- С₇-С₃₀ алкиларил или арилалкильную группу, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и

• Q₁ Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера или гидрата,

отличающемуся тем, что содержит стадию а) на которой полизамещенная 25 хинная кислота взаимодействует с соединением формулы HNR_1AR_2A.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к соединению, полученному указанным способом по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению или смеси соединений общей формулы (IB):

где

• R_1B и R_2B представляет, независимо друг от друга:

- Н,

- C₁-C₃₀ алкильную группу,

- С₇-С₃₀ алкиларил или арилалкильную группу, или

- С₆-С₁₈ арильную группу,

и

• Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру или гидрату,

для применения в лечении и/или предотвращении воспаления.

Настоящее изобретение также относится к соединению или смеси соединений (амидное производное PSQ) общей формулы (IA):

где

• R_1A и R_2A представляет, независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- С₇-С₃₀ алкиларил или арилалкильную группу, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и

• Q₁ Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру или гидрату,

для применения в качестве лекарственного средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1: Схемы индукции различных изученных медиаторов воспаления: А. Схема индукции для IL-8, PGE2, IL-6 и TNF-α; В. Схема индукции для LTB4.

Фиг. 2: Измерения жизнеспособности NHEK через 26 ч после обработки различными концентрациями соединений РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАТ1658, РАТ1657 или РАТ1648. Процент жизнеспособности рассчитывали по отношению к необработанному негативному контролю (необработанный CTL) взятый за 100% и по отношению к положительному контролю для цитотоксичности (0.008% SDS). 1% DMSO: контроль носителя для соединений PAT. Планка погрешностей соответствует стандартному отклонению относительно среднего.

Фиг. 3: Измерения жизнеспособности NHEK через 50 после обработки различными концентрациями соединений РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАТ1658, РАТ1657 или РАТ1648. Процент жизнеспособности рассчитывали по отношению к необработанному негативному контролю (необработанный CTL) взятый за 100% и по отношению к положительному контролю для цитотоксичности (0.008% SDS). 1% DMSO: контроль носителя для соединений PAT. Планка погрешностей соответствует стандартному отклонению относительно среднего.

Фиг. 4: Подсчет продукции IL-8 клетками NHEKs в воспалительном состоянии, обработанными соединениями РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАТ1658, РАТ1657 или РАТ1648. Результаты выражены в процентах от состояния после обработки РМА (CTL) взятом за 100%. График показывает среднее измерений IL-8 в супернатантах из 3 независимых культур, а также стандартное отклонение. Критерии Р ниже 0.001 рассматриваются как очень высокодостоверные (***) (дисперсионный анализ (ANOVA) и сравнительный критерий Даннета относительно состояния, индуцированного РМА). Дексаметазон использовали в качестве референсной молекулы.

Фиг. 5: Подсчет продукции PGE2 клетками NHEKs в воспалительном состоянии, обработанные соединениями РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАT1658, РАТ1657 или РАТ1648. Результаты выражены в процентах от состояния после обработки РМА (CTL), взятом за 100%. График показывает среднее измерений PGE2 в супернатантах из 3 независимых культур, а также стандартное отклонение. Значения 0.01<р<0.05 рассматриваются в качестве достоверных (*); 0.001<р<0.01 высокодостоверных (**) и р<0.001 очень высокодостоверных (***) (дисперсионный анализ (ANOVA) и сравнительный критерий Даннета относительно состояния, индуцированного РМА). Индометацин использовали в качестве референсной молекулы.

Фиг. 6. Подсчет продукции IL-6 клетками NHEKs в воспалительном состоянии, обработанные соединениями РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАT1658, РАT1657 или РАT1648. Результаты выражены в процентах от состояния после обработки РМА в комбинации с кальций-ионофором в присутствии 0.8 мМ Са2+ (CTL), взятом за 100%. График показывает среднее измерений IL-6 в супернатантах из 3 независимых культур, а также стандартное отклонение. Значения р<0.001 рассматриваются как высокодостоверные (***) (дисперсионный анализ (ANOVA) и сравнительный критерий Даннета относительно состояния, индуцированного РМА/кальций-ионофором/0.8 мМ Са2+). Дексаметазон использовали в качестве референсной молекулы.

Фиг. 7. Подсчет продукции TNF-α клетками NHEKs в воспалительном состоянии, обработанные соединениями РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАT1658, РАT1657 или РАT1648. Результаты выражены в процентах от состояния после обработки РМА в комбинации с кальций-ионофором в среде, содержащей 0.06 мМ Са2+ (CTL), взятом за 100%. График показывает среднее измерений TNF-α в супернатантах из 3 независимых культур, а также стандартное отклонение. Значения р<0.001 рассматриваются как высокодостоверные (***) (дисперсионный анализ (ANOVA) и сравнительный критерий Даннета относительно состояния, индуцированного РМА/кальций-ионофор). Дексаметазон использовали в качестве референсной молекулы.

Фиг. 8. Подсчет продукции LTB4 клетками NHEKs в воспалительном состоянии, обработанными соединениями РАТ965, РАТ964, РАТ967, РАТ1658, РАТ1657 или РАТ1648. Результаты выражены в процентах от состояния после обработки арахидоновой кислотой в комбинации с кальций-ионофором (CTL), взятом за 100%. График показывает среднее измерений LTB4 в супернатантах из 3 независимых культур, а также стандартное отклонение. Значения р<0.001 рассматриваются как высокодостоверные (***) (дисперсионный анализ (ANOVA) и сравнительный критерий Даннета относительно состояния, индуцированного арахидоновой кислотой/кальций-ионофором). Нордигидрогваяретовую кислоту (NDGA) использовали в качестве референсной молекулы.

Фиг. 9. Вид сверху мыши, показывающий различные зоны нанесения. Зона А: зона нанесения ацетонового раствора ТРА; Зоны А и В: зоны нанесения мази (контроль и две концентрации соединения РАT1657); Зона С: остаток спины без нанесения.

Фиг. 10. Кривая, отражающая степень воспаления в зоне нанесения ацетонового раствора ТРА и в зоне лечения (зона А, Фиг. 9). Кривые, представленные кругами, треугольниками и квадратами относятся соответственно к контролю (мазь Excipial® одна) и к лечению соединением РАТ1657, включенным при концентрации 1.33% и 2.67% в мазь Excipial®.

Фиг. 11. Кривая, отражающая степень воспаления в зоне лечения и за пределами зоны нанесения ацетонового раствора ТРА (зона В, Фиг. 9). Кривые, представленные кругами, треугольниками и квадратами относятся соответственно к контролю (Excipial® мазь одна) и к лечению соединением РАТ1657, включенным при концентрации 1.33% и 2.67% в мазь Excipial®.

Фиг. 12. Кривая, отражающая степень воспаления в оставшейся зоне спины (зона С, Фиг. 9). Кривые, представленные кругами, треугольниками и квадратами относятся соответственно к контролю (Excipial® мазь одна) и к лечению соединением РАТ1657, включенным при концентрации 1.33% и 2.67% в мазь Excipial®.

Фиг. 13. Кривая, отражающая общий счет макроскопического воспаления кожи (сумма зон А, В и С) в виде функции от лечения. Кривые, представленные кругами, треугольниками и квадратами относятся соответственно к контролю (Excipial® мазь одна) и к лечению соединением РАТ1657, включенным при концентрации 1.33% и 2.67% в мазь Excipial®.

Фиг. 14. Кривая, отражающая среднюю площадь псориаза и индекс тяжести (PASI, по оси y) мышей в 5 группах лечения в течение эксперимента (время в днях по оси x). Кривые, представленные кругами, прерывистой линией, черными треугольниками, белыми квадратами и черными квадратами относятся соответственно к ALD/EP положительному контролю (индукция псориаза и нанесение нейтральной мази Excipial®), к ЕР/ЕР негативному контролю (без индукции псориаза и нанесение нейтральной мази Excipial®), к лечению референсным соединением Dermoval® (ALD/Dermoval®), и к лечению соединением РАТ1657, включенным при концентрации 1.33% (ALD/PAT/PAT 1657-1.33%) и 2.67% (ALD/PAT 1657-2.67%) в мазь Excipial®.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В контексте настоящего изобретения «Cx-Cy алкильная группа» означает циклическую или разветвленную циклическую, линейную или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную одновалентную углеводородную цепь, имеющую от x до y атомов углерода.

Следовательно, в контексте настоящего изобретения «С7-С30 алкильная» группа означает циклическую или разветвленную циклическую, линейную или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную одновалентную углеводородную цепь, имеющую от 7 до 30 атомов углерода, предпочтительно от 7 до 26 атомов углерода, более предпочтительно от 7 до 24 атомов углерода, еще более предпочтительно от 7 до 22 атомов углерода, более конкретно от 7 до 20 атомов углерода, в частности от 7 до 18 атомов углерода. Неограничивающие примеры включают гептил, октил, нонил, децил, ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил, пентадецил, гексадецил, гептадецил, октадецил, нонадецил, эйкозил, докозил, тетракозил, гексакозил, геранил, фарнезил, геранилгеранил, олеил, цитронеллил и скваленильную группы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения алкильные группы являются линейными.

В контексте настоящего изобретения Cx-Cy арильная группа означает ароматический углеводород, который соответствует правилу ароматичности Хюккеля, является моно- или полициклическим и имеет от x до y атомов углерода.

Следовательно, в контексте настоящего изобретения группа «Cx-Cy-арил» означает ароматический углеводород, который соответствует правилу ароматичности Хюккеля, является моно- или полициклическим и содержит от x до y атомов углерода. Примеры включают циклооктатетраен, бифенил, нафталин, азулен, антрацен, фенантрен, аннулен- 18 группы.

В контексте настоящего изобретения С7-С30 алкиларильная группа означает С1-С24 алкильную группу, ковалентно связанную с С6-С18 арильной группой.

В контексте настоящего изобретения арилалкильная группа С7-С30 означает арильную группу С6-С18, ковалентно связанную с алкильной группой С1-С24.

"Кофеоильная группа" означает радикал общей формулы (VI), полученный из кофеиновой кислоты:

"Малоильная группа" означает радикал общей формулы (VIIa) или (VIIb), полученный из яблочной кислоты:

"Кофеилмалоильная группа" означает радикал общей формулы (VIIIa) или (VIIIb):

"Малоилкофеоильная группа" означает радикал общей формулы (IXa) или (IXb) или (IXc) или (IXd):

«Полизамещенная хинная кислота» (сокращенно обозначаемая как «PSQ» в настоящем описании) означает моно-, ди, три- или тетраэфир, состоящий из молекулы хинной кислоты, в которой одна, две, три или все четыре спиртовые группы этерифицированы кофеиновой кислотой, яблочной кислотой или смесью кофеиновой кислоты и яблочной кислоты. Поэтому PSQ являются кислотами общей формулы (IV):

где Q₁ Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения PSQ представляет собой поликафеоилхинную кислоту (сокращенно обозначенную как «PCQ» в данном описании), соответствующую моно-, ди-, три- или тетраэфиру, состоящему из молекулы хинной кислоты, у которой одна, две, три или все четыре спиртовые группы этерифицированы кофеиновой кислотой. Следовательно, PCQ представляют собой кислоты общей формулы (IV), как определено выше, где Q1, Q3, Q4 и Q5 представляют независимо друг от друга группу ОН или кофеоильную группу при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является группой ОН.

Таким образом, различные изомеры PSQ представляют собой кислоты общей формулы (IV), причем Q1, Q3, Q4 и Q5 определены неограничивающим образом в таблицах 1-4 ниже.

В соответствии с настоящим изобретением «активатор карбоксильной группы» означает любой реагент или комбинацию реагентов, способных активировать группу карбоновой кислоты, чтобы позволить ей соединяться с нуклеофилом в мягких реакционных условиях. Неограничивающие примеры включают активаторы семейства карбодиимида, такие как дициклогексилкарбодиимид (DCC), диизопропилкарбодиимид (DIC), N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDCI) отдельно или в сочетании со спиртами, позволяющими транзиентное образование активированных сложных эфиров таких как, например, 1-гидроксибензотриазол (НОВТ), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), 1-гидроксисукцинимид (HOSu) или (гидроксиимино)цианоацетата этил. Полезный активатор также может быть частью семейства солей фосфония, урония и/или гуанидиния. Примеры включают (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР), (1-циано-2-этоксокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат (COMU), N,N,N',N'-тетраметил-O-(1Н-бензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфат (HBTU), (O-(6-хлор-1-гидроцибензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат (TCTU), (2-(7-аза-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3- тетраметилурония гексафторфосфат) (HATU).

Более конкретно, активатор карбоксильной группы выбран из диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола (НОВТ).

В настоящем изобретении «фармацевтически приемлемый» означает такой, который полезен при приготовлении фармацевтической композиции, которая, как правило, безопасна, нетоксична и не является биологически или иным образом нежелательной, и которая является приемлемой как для применения в ветеринарии, так и в фармацевтике для человека.

Выражение «фармацевтически приемлемые соли» соединения означает соли, которые являются фармацевтически приемлемыми, как определено в настоящем документе, и которые обладают желаемой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают:

(1) гидраты и сольваты,

(2) фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли, образованные с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; или образованные с фармацевтически приемлемыми органическими кислотами, такими как уксусная кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, камфорсульфоновая кислота, лимонная кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, гидроксинафтойная кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муконовая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, дибензоил-L-винная кислота, винная кислота, п-толуолсульфокислота, три метил уксусная кислота, трифторуксусная кислота и т.п., или

(3) фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований, образующиеся, когда кислотный протон, присутствующий в исходном соединении, заменен или ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или координировано с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают диэтаноламин, этаноламин, N-метилглюкамин, триэтаноламин, трометамин и тому подобное. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия.

В контексте настоящего изобретения «воспаление» означает совокупность реакций, генерируемых организмом в ответ на агрессию. Клинические признаки этих реакций включают покраснение, боль, припухлость и/или повышенную температуру, а биологические признаки включают рекрутирование клеток иммунной системы и высвобождение медиаторов воспаления, таких как провоспалительные цитокины, лейкотриены или простагландины.

Аналогично, «воспалительное заболевание» означает заболевание, возникающее в результате чрезмерного и часто хронического воспаления. К ним относятся воспалительные заболевания, возникающие в результате чрезмерного специфического ответа иммунной системы, такие как астма, псориаз, ринит, артроз и аутоиммунные заболевания, включая синдром Рейно, аутоиммунный тиреоидит, дерматит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, увеит, воспалительное заболевание кишечника (в частности болезнь Крона и язвенный колит), системная красная волчанка; и заболевания, возникающие в результате чрезмерного неспецифического ответа иммунной системы, такие как заболевания, вызванные респираторным дистресс-синдромом взрослых, септический шок, токсичность кислорода, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к сепсису, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к травме, реперфузионное повреждение тканей вследствие экстракорпоральное кровообращение, инфаркт миокарда, острый гломерулонефрит, васкулит, реактивный артрит, дерматоз с острыми воспалительными компонентами, инсульт, термическое повреждение, гемодиализ, цитаферез, некротический энтероколит и синдром, связанный с трансфузией гранулоцитов.

Амидные производные полизамещенных хинных кислот (PSQ)

Настоящее изобретение, таким образом относится к соединениям или смеси соединений, амидным производным PSQ, общей формулы (IA):

где

• R_1A и R_2A представляет, независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- С₇-С₃₀ алкиларил или арилалкильную группу, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и

• Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу, кофеоильную группу, малоильную группу, кофеоилмалоильную группу или малоилкофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой;

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру или гидрату.

В частности, настоящее изобретение относится к соединениям или смеси соединений, амидным производным PCQ, общей формулы (IA) как определено выше, где Q_1,Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу или кофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой.

Предпочтительно, настоящее изобретение относится к соединениям или смеси соединений, амидным производным PCQ, общей формулы (IA) как определено выше, где любые два радикала из Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, другие два представляют собой группу ОН.

Среди соединений формулы (IA) в соответствии с настоящим изобретением, могут быть упомянуты амидные производные следующих кислот:

- 5-O-кофеоилхинная кислота (Q₁=Q₃=Q₄=OH);

- 1,3-O-дикофеоилхинная кислота (Q₄=Q₅=OH);

- 1,4-O-дикофеоилхинная кислота (Q₃=Q₅=OH);

- 1,5-O-дикофеоилхинная кислота (О₃=O₄=ОН);

- 3,4-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₅=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду В;

- 3,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₄=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду А;

- 4,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₃=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду С;

- 1,3,4-О-трикофеоилхинная кислота (Q₅=OH);

- 1,3,5-О-трикофеоилхинная кислота (Q₄=OH);

- 1,4,5-О-трикофеоилхинная кислота (Q₃=OH);

- 3,4,5-О-трикофеоилхинная кислота (Q₁=OH); и

- 1,3,4,5-О-тетракофеоилхинная кислота.

В частности, среди предпочтительных соединений формулы (IA) настоящего изобретения, могут быть упомянуты амидные производные следующих кислот:

- 1,3-О-дикофеоилхинная кислота (Q₄=Q₅=OH);

- 1,4-О-дикофеоилхинная кислота (Q₃=Q₅=OH);

- 1,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₃=Q₄=OH);

- 3,4-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₅=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду В;

- 3,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₄=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду А; и

- 4,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₃=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду С.

Предпочтительно, соединения общей формулы (IA) в соответствии с настоящим изобретением характеризуются тем, что Q₁ представляет собой группу ОН. Так, среди предпочтительных соединений настоящего изобретения, могут быть упомянуты амидные производные следующих кислот:

- 3,4-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₅=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду В;

- 3,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₄=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду А; и

- 4,5-О-дикофеоилхинная кислота (Q₁=Q₃=OH), это амидное производное соответствует изохлоргенамиду С.

Конкретными предпочтительными соединениями общей формулы (IA) по настоящему изобретению являются те, которые характеризуются тем, что Q₁ и Q₄ представляют собой ОН группу и Q₃ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, таким образом соответствуя амидным производным 3,5-О-дикофеоилхинной кислоты (3,5-DCQ).

В предпочтительном воплощении амидные производные PSQ, в частности амидные производные PCQ, согласно изобретению отличаются тем, что R_1A представляет собой атом водорода. В конкретном варианте осуществления R_1A представляет собой атом водорода, a R_2A представляет собой бутильную группу или предпочтительно линейную С7-С30, в частности С7-С26, предпочтительно С7-С24, предпочтительно С7-С22, более предпочтительно С7-С20, в частности С7-С18 алкильную группу, в частности алкильную группу, выбранную из: гептил, октил, нонили, децил, ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил, пентадецил, гексадецил, гептадецил, октадецил, нонадецил, эйкозил, докозил, тетракозил, гексакозил, геранил, фарнезил, геранилгеранил, олеил, цитронеллил и скваленильная группы, предпочтительно алкильную группу, выбранную из октильной, додецильной или октадецильной групп.

В другом воплощении амидные производные PSQ, в частности амидные производные PCQ, согласно изобретению характеризуются тем, что R_1A представляет собой атом водорода и R_2A представляет собой С7-С10 арильную группу, в частности нафтильную или С7-С30 арилакильную группу, в частности фенил- (С1-С24) ал кил, более конкретно, фенилбутил.

Предпочтительно, соединения по настоящему изобретению являются соединениями общей формулы (II) или (III):

где n равно 3 или больше или равно 6, в частности, n равно 3, 7, 11 или 17.

Способ получения соединений по настоящему изобретению и соединения, полученные указанным способом

В данной области техники существуют способы получения амидных производных PCQ, известные квалифицированному специалисту. Эти соединения обычно получают химическим синтезом из хинной и кофеиновой кислот.

Иллюстративный способ получения амидных производных PCQ описан в европейской патентной заявке ЕР 2128125, в частности на схемах 1 и 2. В этом документе сначала хинную кислоту подвергают катализируемой кислотой реакции защиты ее карбоксильных и гидроксильных групп. Полученный хинид обрабатывают амином, чтобы способствовать превращению карбоксильной группы в положении 1 в амидную группу. Гидроксильные группы получающегося в результате амидного производного хинной кислоты затем подвергаются депротекции с помощью реакции снятия защиты, катализируемой кислотой. В конечном итоге амидные производные PCQ получают ацилированием гидроксильных групп амидных производных хинной кислоты с помощью хлорида аллил-кофейной кислоты, а затем реакцией депротекции аллильных групп в присутствии Rh(PPh₃)₃Cl/DABCO/EtOH или Pd(PPh₃)₄/морфолин/ТГФ.

Этот тип метода синтеза амидных производных PCQ дает смесь изохлорогенамидов А, В и С. Для получения одного региоизомера амидного производного PCQ, такого как изохлорогенамид А самостоятельно (амидные производные 3,5-DCQ), требуется дополнительная стадия очистки. Такую стадию очистки трудно выполнить, учитывая структурные сходства, и она приводит к значительно более низкому выходу.

Авторы изобретения обнаружили, что получение амидных производных PSQ может быть осуществлено за один этап путем полусинтеза из конкретного PSQ, что позволяет получать амидные производные этого PSQ в виде одиночного региоизомера.

В частности, авторы изобретения обнаружили, что изохлорогенамид А можно получить путем взаимодействия 3,5-DCQ-кислоты с амином.

Во втором аспекте настоящее изобретение также относится к способу получения соединения общей формулы (IA)

где R_1A, R_2A, Q₁, Q_3, Q₄ и Q₅ являются такими, как определено выше;

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера или гидрата,

отличающийся тем, что он содержит стадию а) во время которой PSQ взаимодействует с соединением формулы HNR_1AR_2A. В частности, указанный PSQ представляет собой PCQ, предпочтительно выбранный из 3-О-кофеоилхинной кислоты, 3,5-DCQ, 3,4-DCQ, 4,5-DCQ, 3,4,5-TCQ и ТетраСQ, предпочтительно PCQ представляет собой 3,5-DCQ, 3,4-DCQ, 4,5-DCQ, более предпочтительно PCQ представляет собой 3,5-DCQ.

Предпочтительно, Q₁ Q₃, Q₄ и Q₅ представляет, независимо друг от друга, ОН группу или кофеоильную группу, при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой. В частности, любые два радикала Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, другие два представляют собой ОН группу.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения соединения общей формулы (IA), где R_1A представляет собой атом водорода, более конкретно R_1A представляет собой атом водорода и R_2A представляет собой бутильную группу или предпочтительно линейную С₇-С₃₀, в частности С₇-С₂₆, более конкретно С₇-С₂₄, предпочтительно С₇-С₂₂, предпочтительно С₇-С₂₀, в частности C₇-C₁₈ алкильную группу, в частности, алкильную группу, выбранную из гептила, октила, нонила, децила, ундецила, додецила, тридецила, тетрадецила, пентадецила, гексадецила, гептадецила, октадецила, нонадецила, эйкозила, докозила, тетракозила, гексакозила, геранила, фарнезила, геранилгеранила, олеила, цитронеллила и скваленильной группы, предпочтительно алкильная группа, выбрана из октильной, додецицильной или октацильной групп; или C₇-C₁₈ арильную группу, в частности, арильную группу, выбранную из циклооктатетраеновой, бифенильной, нафталиновой, азуленовой, антраценовой, фенантреновой, аннулен-18 групп.

Преимущественно соединение формулы HNR1AR2A выбрано из алкиламинов, в частности бутан-1-амина или С7-С30, в частности С7-С26, более конкретно С7-С24, еще более конкретно С7-С20, предпочтительно С7-С18, алкиламинов.

Более конкретно, соединение формулы HNR1AR2A выбрано из одного из следующих соединений: октан-1-амин, лауриламин, 1-октадециламин, 4-фенилбутан-1-амин или 2-нафтиламин.

В предпочтительном воплощении, настоящее изобретение относится к способу получения соединения общей формулы (II) или (III):

где n представляет собой целое число, равное 3 или между 6 и 29, в частности, равное 3 или между 6 и 25, предпочтительно n представляет собой 3, 7, 11 или 17,

отличающийся тем, что он содержит стадию а) во время которой 3,5-DCQ взаимодействует с соединением общей формулы (V)

где n является таким как определено выше.

В другом предпочтительном воплощении, настоящее изобретение относится к способу получения одного из следующих соединений соответствующей формулы (IIa), (IIb), (IIe) и (IId):

Предпочтительно, реакция стадии а) проводится в присутствии инертного растворителя, такого как дихлорметан, N,N-диметилформамид или тетрагидрофуран, в частности при температуре от -15°С до температуры кипения растворителя.

В одном из вариантов осуществления изобретения стадии а) способа согласно изобретению необязательно предшествует стадия активации карбоксильной группы PSQ, в частности, PCQ, в частности активатором карбоксильной группы, таким как 1-(3-диметиламинопропил))-3-тилкарбодиимид в комбинации с гидратом 1-гидроксибензотриазола.

Способы по изобретению могут, например, быть описаны следующими схемами 1 и 2:

Способы получения соединений по изобретению могут необязательно включать дополнительные стадии защиты и/или депротекции, чтобы избежать побочных реакций, хорошо известных специалисту, или избежать образования нескольких региоизомеров соединений по изобретению.

Соединения, полученные способами согласно изобретению, также могут быть очищены способами, известными специалисту в данной области. Примеры включают способы очистки кристаллизацией, хроматографией или экстракцией.

Изобретение также относится к соединению, получаемому способами согласно изобретению, как описано выше.

Терапевтические применения

Авторы изобретения обнаружили, что соединения по изобретению обладают противовоспалительными свойствами.

В контексте настоящего изобретения соединения по изобретению можно применять для лечения воспаления или воспалительных заболеваний, в частности воспалительных заболеваний, возникающих в результате чрезмерного специфического ответа иммунной системы, таких как астма, псориаз, ринит, артроз и аутоиммунные заболевания, включая синдром Рейно, аутоиммунный тиреоидит, дерматит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, увеит, воспалительные заболевания кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), системную красную волчанку; и заболевания, возникающие в результате чрезмерного неспецифического ответа иммунной системы, такие как заболевания, вызванные респираторным дистресс-синдромом взрослых, септический шок, токсичность кислорода, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к сепсису, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к травме, реперфузионное повреждение тканей вследствие экстракорпорального кровообращения, инфаркт миокарда, острый гломерулонефрит, васкулит, реактивный артрит, дерматоз с острыми воспалительными компонентами, инсульт, термическое повреждение, гемодиализ, цитаферез, некротический энтероколит и синдром, связанный с переливанием гранулоцитов.

В контексте настоящего изобретения источник воспаления может быть физическим (тепло, холод, ионизирующее излучение, инфракрасное излучение, солнечное излучение), механическим (истирание), химическим (контакт с раздражителями или аллергенами) или биологическим (микробы, грибки) или воспаление может быть связано с окислительным стрессом.

В другом аспекте настоящее изобретение таким образом относится к соединению или смеси соединений общей формулы (IB),

Где R_1B, R_2B, R, Q_1, Q₃, Q₄ и Q₅ являются такими, как определено выше,

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру, или гидрату,

для применения при предотвращении и/или лечении воспаления или воспалительного заболевания.

Согласно другому аспекту изобретение также относится к соединению или смеси соединений общей формулы (IB) согласно изобретению для применения для предотвращения и/или лечения любого из воспалительных заболеваний, упомянутых выше.

Кроме того, изобретение относится к применению соединения или смеси соединений общей формулы (IB) по изобретению для изготовления лекарственного средства для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания, в частности одного из заболеваний, упомянутых выше.

Изобретение также относится к способу предотвращения или лечения воспаления или воспалительного заболевания, предпочтительно одного из заболеваний, упомянутых выше, содержащему введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (IB) по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению или смеси соединений общей формулы (IA)

где R_1A, R_2A, R, Q_1, Q₃, Q₄ и Q₅ являются такими, как определено выше,

или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомеру или гидрату,

для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение также относится к соединению или смесям соединений формулы (IA) согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания, в частности одного из заболеваний, упомянутых выше.

Настоящее изобретение, в частности, относится к соединению или смеси соединений формулы (IA) согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения псориаза.

Кроме того, изобретение относится к применению соединения или смеси соединений общей формулы (IA) по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства, в частности, для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания, в частности одного из заболеваний упомянутое выше. Изобретение, в частности, относится к применению соединения или смеси соединений общей формулы (IA) по изобретению для изготовления лекарственного средства для предотвращения и/или лечения псориаза.

Изобретение также относится к способу предотвращения или лечения, в частности воспаления или воспалительного заболевания, в частности одного из заболеваний, упомянутых выше, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (IA) по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом. Изобретение, в частности, относится к способу предотвращения и/или лечения псориаза, включающему введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (IA) по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.

Косметические или фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к косметической или фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента по меньшей мере одно соединение по изобретению или экстракт по изобретению и предпочтительно косметически или фармацевтически приемлемый эксципиент.

Оптимальные способы введения, дозировки и лекарственные формы фармацевтических или косметических композиций по изобретению могут быть определены в соответствии с критериями, обычно принимаемыми во внимание при разработке фармацевтического или косметического лечения, адаптированного для субъекта, такими как возраст или масса тела пациента, серьезность его или ее общего состояния, переносимость лечения, наблюдаемые побочные эффекты, тип кожи. В зависимости от желаемого вида введения фармацевтическая или косметическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически или косметически приемлемый эксципиент. Косметическая или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать по меньшей мере один адъювант, фармацевтически или косметически известный специалисту, выбранный из загустителей, консервантов, ароматизаторов, красителей, химических или минеральных фильтров, увлажняющих агентов, геотермальной воды и т.д.

Предпочтительно косметическая или фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно соединение общей формулы (IA) по изобретению в количестве от 0,01 до 10%, в частности от 0,05 до 5%, более конкретно от 0,1 до 2% по массе, в расчете на общую массу композиции.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента по меньшей мере одно соединение общей формулы (IA)

где R_1A, R_2A, R, Q_1, Q₃, Q₄ и Q₅ являются такими, как определено выше,

или его фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер или гидрат,

и предпочтительно фармацевтически приемлемый эксципиент.

Фармацевтическая композиция подходит, в частности, для перорального, назального, трансдермального, парентерального, местного, ректального и мукозального введения. Она может быть в сухой форме, такой как мягкая капсула, твердая капсула, таблетка, лиофилизат, порошок, гранула или пластырь, или в жидкой форме, такой как раствор, суспензия, спрей, крем или гель.

Фармацевтически приемлемый эксципиент известен специалисту в данной области и выбирается в соответствии со способом введения фармацевтической композиции. Например, фармацевтически приемлемый эксципиент может быть выбран из группы, состоящей из разбавителей, связующих веществ, дезинтеграторов, красителей, смазывающих веществ, солюбилизаторов, промоторов абсорбции, пленкообразующих агентов, желирующих агентов и их смесей.

Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из смягчающих средств, увлажняющих активных агентов, активаторов синтеза кератина, регуляторов кератина, кератолитиков, агентов, регулирующих кожный барьер (активаторов синтеза липидов кожи, агонисты рецептора, активируемого пролифератором пероксисом) (PPAR)), активаторы дифференцировки кератиноцитов (ретиноиды, Calcidone®, кальций), антибиотики, антибактериальные средства, противогрибковые препараты, противовирусные средства, регуляторы кожного жира, иммуномодуляторы, такие как такролимус, пимекролимус, оксазолины, консерванты, анти-раздражающие агенты, успокаивающие агенты, противосолнечные средства, солнцезащитные средства, антиоксиданты, факторы роста, целебные агенты или эвтрофные молекулы, лекарственные средства и противовоспалительные агенты.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения для предотвращения и/или лечения воспаления, в частности воспаления кожи. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения псориаза.

Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения воспаления, в частности воспаления кожи. В частности, изобретение относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственного средства для предотвращения и/или лечения псориаза.

Кроме того, изобретение относится к способу лечения и/или предотвращения воспаления, в частности воспаления кожи, у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. В частности, изобретение относится к способу предотвращения и/или лечения псориаза, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции в соответствии с изобретением, предназначенной для применения для предотвращения или замедления старения кожи, для заживления кожи и/или для стимулирования регенерации кожных тканей.

Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для предотвращения или замедления старения кожи, для ее заживления и/или для стимулирования регенерации кожных тканей.

Кроме того, изобретение относится к способу предотвращения или замедления старения кожи, для заживления кожи и/или для стимулирования регенерации кожных тканей у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.

Косметические композиции

Настоящее изобретение таким образом относится к косметической композиции, содержащей в качестве активного агента по меньшей мере одно соединение по изобретению или экстракт по изобретению и предпочтительно косметически приемлемый эксципиент.

Косметическая композиция по изобретению может дополнительно содержать другие косметически активные агенты, такие как другие антивозрастные агенты; или увлажняющие агенты; средства с успокаивающим или расслабляющим действием; агенты, стимулирующие микроциркуляцию кожи; регуляторы кожного жира для ухода за жирной кожей; очищающие агенты; агенты против свободных радикалов; противовоспалительные агенты; химические или минеральные солнцезащитные средства и т.д.

Косметически приемлемый эксципиент может быть выбран из полимеров, силиконовых соединений, поверхностно-активных веществ, реологических агентов, увлажнителей, пенетрантов, масляных компонентов, восков, эмульгаторов, пленкообразующих агентов, ароматизаторов, электролитов, регуляторов рН, антиоксидантов, консервантов, красителей, перламутровых агентов и пигментов, и их смеси.

Косметическая композиция согласно изобретению предпочтительно предназначена для местного применения. Она может представлять собой крем, молочко, лосьон, гель, сыворотку, спрей, пену, раствор, мазь, эмульсию, пластырь или маску.

Изобретение также относится к применению в качестве активного агента соединения формулы (IB) или формулы (IA) по изобретению, в косметической композиции или для производства косметической композиции, для лечения или предотвращения старения кожи, воспаления кожи (успокаивающий эффект) и/или для стимулирования заживления и регенерации кожных тканей.

Косметическая композиция согласно изобретению может, в частности, быть предназначена для предотвращения или замедления старения кожи.

Косметическая композиция согласно изобретению может, в частности, быть предназначена для предотвращения или лечения воспаления кожи.

Косметическая композиция согласно изобретению может, в частности, быть предназначена для оказания успокаивающего или расслабляющего воздействия на кожу.

Косметическая композиция по изобретению, в частности, может быть предназначена для ускорения заживления.

Косметическая композиция согласно изобретению может, в частности, быть предназначена для стимулирования регенерации кожных тканей.

Изобретение также относится к способу косметического ухода за кожей, направленному на предотвращение или лечение старения кожи и/или воспаления кожи, отличающемуся тем, что включает нанесение косметической композиции по изобретению, по меньшей мере, на часть кожи тела или лица.

Изобретение также относится к способу косметического ухода за кожей для получения успокаивающего или расслабляющего воздействия на кожу и/или для стимулирования регенерации кожных тканей, отличающемуся тем, что он включает нанесение косметической композиции по изобретению по меньшей мере на часть кожа тела или лица.

Предпочтительно в способе согласно изобретению косметическую композицию наносят субъекту, нуждающемуся в этом, особенно предполагая или после однократного или повторного воздействия на кожу окислительного стресса. Действительно, последний может генерировать избыток свободных радикалов, которые могут ускорить признаки старения кожи. Кроме того, борьба с различными патологиями или провоспалительными состояниями также генерирует активные формы кислорода.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Полусинтез амидных производных 3,5-DCQ из 3,5-DCQ (изохлорогеновая кислота А)

Синтез октил-изохлоргенамида А (2Е,2'Е)-((1R,2S,3R,5S)-2,5-дигидрокси-5-(октилкарбамоил)циклогексан-1,3-диил) 6ис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1657

К раствору 3,5-DCQ (300 мг; 0.581 ммоль) и 1-гидроксибензотриазола гидрат (118 мг; 0.871 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (2249 мкл; 29.0 ммоль) и дихлорметане (2243 мкл; 35.9 ммоль) добавили по каплям 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (123 мкл, 0.697 ммоль) при температуре 0°С.

Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут при 0°С и затем раствор октан-1-амина (241 мкл, 1.452 ммоль) в безводном дихлорметане (1000 мкл, 15.54 ммоль) добавили в течение 45 минут.

Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С затем в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем реакцию остановили добавлением 1М водного раствора HCl (30 мл). Органическую фазу затем экстрагировали 3 раза 30 мл EtOAc и промыли с помощью 50 мл 1М раствора HCl и солевым раствором (50 мл), высушили над MgSO₄, отфильтровали и эвапорировали под вакуумом с получением осадка.

Полученный осадок очистили с помощью препаративной ВЭЖХ (Vydac Denali С18 колонка, 50×250 мм, 10 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (МеОН) линейным градиентом 80-100% B в течение 15 минут при скорости потока 60 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 49% (180 mg);

- Молекулярная формула: C₃₃H₄₁NO₁₁;

- Молекулярный вес: 627.68 г/моль;

- ¹Н (400MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 0.87 (t, J=6.3Hz, 3Н), 1.17-1.37 (m, 10Н), 1.49 (t, J=6.5Hz, 2Н), 1.98-2.20 (m, 3Н), 2.31 (dd, J=15.1Hz, 3.3Hz, 1H), 3.17 (m, 2H), 3.92 (dd, J=9.7Hz, 3.3Hz, 1H), 5.46 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 6.30 (d, J=15.8Hz, 1H), 6.37 (d, J=15.8Hz, 1H), 6.77(d, J=1.0Hz, 1H), 6.79 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.90-7.00 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.60 (d, J=15.8Hz, 1H), 7.62 (d, J=15.8Hz, 1H). ¹³C (100MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 14.6, 23.8, 28.0, 30.5 (2x), 30.6, 33.1, 36.9, 39.7, 40.6, 71.8, 72.8, 73.9, 76.7, 115.3 (x2), 115.4, 115.8, 116.6 (2x), 123.1 (2x), 127.9, 128.1, 146.9, 147.0, 147.2, 147.3, 149.6, 149.8, 169.1 (2x), 177.8.

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.22

ЖХ/МС анализ провели на колонке Zorbax Eclipse (C₁₈, 3.0×100 мм, 1.8 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) в качестве элюента линейным градиентом 5-95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты затем в изократическом режиме при 100% B в течение 2 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=12.161 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]^- 626.3 (100).

Синтез бутил-изохлоргенамида А (2Е,2'Е)-((1R,2S,3R,5S)-5-(бутилкарбамоил)-2,5-дигидроксициклогексан-1,3-диил) бис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1658

Бутил-изохлоргенамид А получили как описано ранее, с использованием бутан-1-амина в качестве исходного амина.

Полученный осадок очистили с помощью препаративной ВЭЖХ (Vydac Denali С18 колонка, 50×250 мм, 10 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (МеОН) в изократическом режиме при 60% B в течение 20 минут при скорости потока 60 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 45% (148 мг);

- Молекулярная формула C₂₉H₃₃NO₁₁;

- Молекулярный вес: 571.57 г/моль;

- ¹Н (400MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 0.90 (t, J=7.3Hz, 3Н), 1.32 (m, 2Н), 1.37 (m, 2Н), 2.05 (m, 2Н), 2.16 (m, 1Н), 2.31 (dd, J=3.2Hz, 15.4Hz, 1Н), 3.18 (t, J=7.1Hz, 2H), 3.93 (dd, J=3.3Hz, 9.72Hz, 1H), 5.46 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 6.30 (d, J=15.9Hz, 1H), 6.37 (d, J=16Hz, 1H), 6.77 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.79 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.92-6.99 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.60 (d, J=15.9Hz, 1H), 7.62 (d, J=15.9Hz, 1H). ¹³C (100MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 14.2, 21.1, 32.7, 36.9, 39.7, 40.3, 71.8, 72.8, 73.9, 76.7, 115.3 (x2), 115.4, 115.8, 116.6 (2x), 123.1 (2x), 127.9, 128.1, 146.9, 147.0, 147.2, 147.3, 149.6, 149.7, 169.1 (2x) 177.8.

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.15

ЖХ/МС анализ провели на колонке Zorbax Eclipse (C₁₈, 3.0×100 мм, 1.8 мкм) с помощью растворителя А (H₂O+0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 to 95% of В в течение 15 минут, линейным градиентом от 95%-100% в течение 1 минуты затем в изократическом режиме при 100% B в течение 2 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=9.579 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 570.2 (100).

Синтез лаурил-изохлоргенамида А (2Е,2'Е)-((1R,2S,3R,5S)-5-(додецилкарбамоил)-2,5-дигидроксициклогексан-1,3-диил) бис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1648

Лаурил-изохлоргенамид А получили как описано ранее, с использованием лауриламина в качестве исходного амина.

Полученный осадок очистили с помощью HPLC (Luna С₁₈ Колонка, 5 мкм, 21.2×250 мм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) в изократическом режиме при 72% B в течение 20 минут при скорости потока 20 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 25% (101 мг);

- Молекулярная формула C₃₇H₄₉NO₁₁;

- Молекулярный вес: 683.79 г/моль;

- ¹Н (400MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 0.88 (t, J=6.3Hz, 3Н), 1.05-1.38 (m, 18Н), 1.49 (m, 2Н), 1.98-2.20 (m, 3Н), 2.31 (dd, J=15.1Hz, 3.3Hz, 1H), 3.17 (m, 2H), 3.92 (dd, J=9.7Hz, 3.3Hz, 1H), 5.46 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 6.30 (d, J=15.8Hz, 1H), 6.37 (d, J=15.8Hz, 1H), 6.77 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.79 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.90-7.00 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.60 (d, J=15.8Hz, 1H), 7.62 (d, J=15.8Hz, 1H). ¹³C (100MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 14.6, 23.9, 28.0, 30.5 (2x), 30.6 (2x), 30.8, 30.9 (2x), 33.2, 36.9, 39.7,40.5, 71.8, 72.8, 73.9, 76.7, 115.3 (x2), 115.4, 115.9, 116.6 (2x), 123.1 (2x), 127.9, 128.1, 146.9, 147.0, 147.2, 147.2, 149.7, 149.8, 169.1 (2x), 177.8.

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.27

ЖХ/МС анализ провели на колонке Zorbax Eclipse (C₁₈, 3.0×100 мм, 1.8 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 - 95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты затем в изократическом режиме при 100% B в течение 2 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=14.770 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 682.3 (100).

Синтез октадецил-изохлоргенамид A (2E,2'E)-((1R,2S,3R,5S)-2,5-дигидрокси-5-(октадецилкарбамоил)циклогексан-1,3-диил) бис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1656

Октадецил-изохлоргенамид А получили как описано ранее, с использованием 1-октадециламина в качестве исходного амина.

Полученный осадок растворили в 20 мл смеси МеОН/ДХМ (1/1 об/об) и 3 г Dowex 50WX8-100 добавили. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут, затем отфильтровали. Фильтрат эвапорировали под вакуумом и полученный продукт очистили с помощью ВЭЖХ (Luna С₁₈ Колонка, 5 мкм, 21.2×250 мм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) в изократическом режиме при 96% B в течение 5 минут, затем в изократическом режиме 100% B в течение 20 минут при скорости потока 20 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 44% (195 мг);

- Молекулярная формула C₄₃H₆₁NO₁₁;

- Молекулярный вес: 767.94 г/моль;

- ¹Н (250MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 0.89 (t, J=6.3Hz, 3Н), 1.14-1.40 (m, 30Н), 1.49 (m, 2Н), 1.98-2.20 (m, 3Н), 2.31 (dd, J=15.1Hz, 3.3Hz, 1Н), 3.17 (m, 2Н), 3.92 (dd, J=9.7Hz, 3.3Hz, 1Н), 5.46 (т, 1Н), 5.52 (m, 1Н), 6.30 (d, J=15.8Hz, 1Н), 6.37 (d, J=15.8Hz, 1H), 6.77 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.79 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.90-7.00 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.60 (d, J=15.8Hz, 1H), 7.62 (d, J=15.8Hz, 1H). ¹³C (67MHz, CD₃OD, 300K) δ (ppm) 14.6, 23.9, 28.0, 30.5 (2x), 30.6 (2x), 30.8, 30.9 (8x), 33.2, 37.0, 39.7,40.6,71.8, 72.8, 73.9,76.8, 115.3 (x2), 115.4, 115.9, 116.6 (2x), 123.1 (2x), 127.9, 128.1, 147.0 (2x), 147.2, 147.3, 149.7, 149.8, 169.1 (2x), 177.7.

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.27

ЖХ/МС анализ провели на колонке Zorbax Eclipse (C₁₈, 3.0×100 мм, 1.8 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 - 95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты, затем в изократическом режиме при 100% B в течение 9 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=19.020 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 766.4 (100).

Синтез фенилбутил-изохлоргенамида А: (2Е,2'Е)-((1R,2S,3R,5S)-2,5-дигидрокси-5-(4-фенилбутилкарбамоил)циклогексан-1,3-диил) бис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1961

Фенилбутил-изохлоргенамид А получили как описано ранее, с использованием 4-фенилбутан-1-амина в качестве исходного амина.

Полученный осадок очистили с помощью препаративной ВЭЖХ (Luna С18 колонка, 21.5×250 мм, 5 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (МеОН) в изократическом режиме при 70% B в течение 20 минут при скорости потока 15 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 28% (17.43 mg);

- Молекулярная формула C₃₅H₃₇NO₁₁;

- Молекулярный вес: 647.66 г/моль;

- ¹Н NMR (200 MHz, MeOD, 300K) δ (ppm) 1.42-1.77 (m, 4Н), 1.91-2.41 (m, 4Н), 2.51-2.67 (m, 2Н), 3.22 (s, 2Н), 3.93 (dd, J=9.5, 3.0 Hz, 1Н), 5.38-5.66 (m, 2Н), 6.36 (dd, J=15.8, 11.1 Hz, 2Н), 6.80 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.99 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.37-7.03 (m, 7H), 7.64 (d, J=15.8 Hz, 2H).

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.38

ЖХ/МС анализ провели на колонке Poroshell 120 (C₁₈, 3.0×150 мм, 2.7 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 - 95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты, затем в изократическом режиме при 100% B в течение 10 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=11.995 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 646.2

Синтез 2-нафтил-изохлоргенамида А:(2Е,2'Е)-((1R,2S,3R,5S)-2,5-дигидрокси-5-(нафтален-2-илкарбамоил)циклогексан-1,3-диил) бис(3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат) = РАТ1960

2-нафтил-изохлоргенамид А получили как описано ранее, с использованием 2-нафтиламина в качестве исходного амина.

Полученный осадок очистили с помощью препаративной ВЭЖХ (Luna С18 колонка, 21.5×250 мм, 5 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (МеОН) в изократическом режиме при 70% B в течение 20 минут при скорости потока 15 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 34% (21.09 mg);

- Молекулярная формула C₃₅H₃₁NO₁₁;

- Молекулярный вес: 641.62 г/моль;

- ¹Н (200 MHz, MeOD, 300K) δ (ррт) 1.95-2.56 (m, 4Н), 4.02 (d, J=5.9 Hz, 1Н), 5.48-5.64 (m, 2Н), 6.36 (dd, J=24.4, 15.9 Hz, 2Н), 6.65-7.17 (m, 6Н), 7.26-7.46 (m, 2Н), 7.50-7.89 (m, 6Н), 8.23 (s, 1Н).

- Rf (EtOAc/Су 8/2 + 1%АсОН) = 0.52

ЖХ/МС анализ провели на колонке Poroshell 120 (d₈, 3.0×150 мм, 2.7 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 - 95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты затем в изократическом режиме при 100% В в течение 10 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=12.272 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 640.2

Синтез октил-хлоргенамида: (E)-((1R,2R,3R,5S)-2,3,5-тригидрокси-5-(октилкарбамоил)циклогексил) 3-(3,4-дигидроксифенил)акрилат = РАТ1962

Октил-хлоргенамид получили как описано ранее, с использованием 1-октиламина в качестве исходного амина и 3-хлоргенной кислоты в качестве исходной кислоты.

Полученный осадок очистили с помощью препаративной ВЭЖХ (Luna С18 колонка, 21.5×250 мм, 5 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (МеОН) в изократическом режиме при 70% B в течение 20 минут при скорости потока 15 мл/минуту. Полученное соединение представляло собой белый осадок.

- Фактический выход: 16% (14.99 mg);

- Молекулярная формула C₂₄H₃₅NO₈;

- Молекулярный вес: 465.53 г/моль;

- ¹Н NMR (200 MHz, MeOD, 300K) δ (ppm) 0.78-1.04 (m, 3Н), 1.15-1.42 (m, 10Н), 1.43-1.59 (m, 2Н), 1.84-2.24 (m, 4Н), 3.08-3.27 (m, 2Н), 3.73 (dd, J=9.8, 3.0 Hz, 1Н), 4.25 (d, J=3.0 Hz, 1H), 5.30-5.54 (m, 1H), 6.31 (d, J=15.9 Hz, 1H), 6.80 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1H), 7.07 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J=15.9 Hz, 1H).

- Rf (EtOAc/Cy 8/2 + 1%AcOH) = 0.28

ЖХ/МС анализ провели на колонке Poroshell 120 (C₁₈, 3.0×150 мм, 2.7 мкм) с помощью растворителя А (H₂O + 0.1% НСООН) и растворителя В (ацетонитрил) линейным градиентом 5 - 95% B в течение 15 минут, линейным градиентом от 95% до 100% в течение 1 минуты, затем в изократическом режиме при 100% B в течение 10 минут при скорости потока 0.4 мл/мин. Rt=12.762 мин, m/z (ESI+APCI Режим детекции отрицательных ионов) [М-Н]- 464.2

Пример 2: Анализ эффектов соединений по настоящему изобретению на продукцию медиаторов воспаления IL-6, IL-8, TNF-α, лейкотриена В₄ и простагландина Е₂ клетками NHEKs в воспалительном состоянии.

Указанное исследование состояло из измерения противовоспалительных эффектов 6 соединений с помощью анализа продукции целевых медиаторов воспаления: интерлейкин 8 (IL-8), простагландин Е2 (PGE2), интерлейкин 6 (IL-6), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и лейкотриен В4 (LTB4).

Материалы и методы

Соединения

Исследованные 6 соединений описаны в Таблице 5 далее:

Культура клеток

Исследование проводилось на нормальных эпидермальных кератиноцитах человека (NHEK) (Lonza, СС-2507, происхождение: крайняя плоть) в монослойной культуре в среде Epilife (Invitrogen, M-EPI-500-A), содержащей смесь компонентов поддержки роста кератиноцитов человека (HKGS) (Invitrogen, S-001-K) добавляемой отдельно, за исключением гидрокортизона, обладающего противовоспалительными свойствами.

Определение аналитических концентраций 6 соединений с помощью исследования цитотоксичности

Чтобы определить оптимальную аналитическую концентрацию для каждого из соединений, был проведен предварительный эксперимент с NHEK. Исследование состояло в оценке жизнеспособности клеток с помощью MTS (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-5-(3-карбокси-метоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) (Promega, G3581) через 26 ч и 50 ч после обработки этими соединениями в 5 концентрациях (100 мкМ, 50 мкМ, 50 мкМ, 25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ) в трехкратных культурах (n=3). Клетки высевали в 24-луночный планшет за 24 часа до обработки при различных концентрациях испытуемых соединений.

0,008% SDS (VWR, 444464Т) использовали в качестве положительного контроля цитотоксичности для подтверждения эксперимента.

Индукция воспалительного состояния в культуре NHEK и применение соединений

Индукция воспалительного состояния и экспериментальная кинетика Для подсчета продукции IL-8 и PGE2 воспалительное состояние NHEK в культуре индуцировали обработкой РМА (форбол-миристат-ацетат/10 нг/мл/H₂O) в течение 24 часов. Индукция IL-6 была достигнута обработкой РМА (10 нг/мл/H₂O) в комбинации с ионофором кальция А23187 (2 мкМ/ДМСО) в среде, содержащей кальций в концентрации 0,8 мМ. Секреция TNF-α индуцировалась комбинацией РМА (10 нг/мл/H₂O) и ионофора кальция А23187 (2 мкм/ДМСО), применяемой в течение 24 часов (TNF-α) в среде, содержащей 0,06 мМ кальция. Используемыми референсными молекулами являются дексаметазон (10 мкм/H₂O) и индометацин (10 мкг/мл/этанол).

Схема индукции производства LTB4, бладающего очень быстрой кинетикой, была адаптирована. В этом случае воспалительное состояние индуцировалось в течение 2 ч путем применения арахидоновой кислоты (а.к./1 мкм/этанол) в сочетании с ионофором кальция А23187 (2 мкм/ДМСО). Нордигидрогваяретовую кислоту (NDGA) использовали в качестве референсной молекулы (2 мкм/этанол).

Эффект соединений изучали путем нанесения их на культуральную среду кератиноцитов за 2 ч до индукции воспалительного состояния, а также во время индукции (2 ч для LTB4, 24 ч для IL-8, PGE2, IL-6 и TNF-α).

Каждое состояние выполняли в трехкратных культурах, и супернатанты извлекали в конце различных обработок.

Схемы индукции для различных изученных медиаторов воспаления приведены на Фиг. 1.

Культуральные супернатанты собирали в конце каждого исследования кинетики. Их разделяли на ал и квоты и замораживали при -20°С до дня анализа.

Подсчет продукции различных медиаторов воспаления проводился с помощью специальных наборов, основанных на стандартной кривой, в соответствии с инструкциями, предоставленными поставщиками наборов, R&D Systems и Cayman Chemical.

Клетки, обработанные и не обработанные испытуемыми соединениями, наблюдали под оптическим микроскопом через 48 часов после следующей воспалительной обработки: 10 нг/мл РМА/H₂O + 2 мкМ кальциевого ионофора А23187/ДМСО.

Результат

Определение аналитической концентрации каждого из 6 соединений с помощью исследования цитотоксичности

Для оптимизации рабочих концентраций соединений было проведено исследование цитотоксичности для NHEK, исходя из 5 концентраций (100 мкМ, 50 мкМ, 25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ) каждого из 6 соединений, приготовленных в ДМСО.

Экспериментальные параметры были идентичны тем, которые использовались впоследствии для изучения воздействия на медиаторы воспаления, с точки зрения пассажей клеточной культуры, конфлюэнтности и времени контакта (26 ч для IL-6, IL-8, TNF-α, LTB4 и PGE2).

0,008% SDS использовали в качестве положительного контроля цитотоксичности для подтверждения эксперимента.

Результаты проиллюстрированы на фиг. 2 и 3 и выражены в процентах от условия «необработанный контроль (CTL)», а порог цитотоксичности был произвольно взят за 80% жизнеспособности.

На основании этих результатов для каждого из 6 соединений была выбрана концентрация 50 мкМ.

Подсчет продукции медиаторов, секоетируемых в культуральные супернатанты кеоатиноиитами в воспалительном состоянии

До индукции воспалительного состояния NHEK обрабатывали соединениями и референсными молекулами в течение 2 ч. Воспалительное состояние затем индуцировали в соответствии с условиями, описанными в разделе методологии, культуральные супернатанты собирали и количественно определяли различные медиаторы воспаления методом ELISA.

Подсчет продукции IL-8

Влияние соединений на продукцию IL-8 показано на Фиг. 4. Данные выражены относительно продукции IL-8 кератиноцитами в воспалительном состоянии (обработанном РМА), состояние которого было произвольно взято за 100%.

Результаты показывают, что обработка РМА действительно вызывает перепроизводство IL-8, а дексаметазон в дозе 10 мкм оказывает очень сильное ингибирующее влияние на продукцию IL-8, что подтверждает эксперимент.

Кроме того, каждое из 6 соединений очень значительно снижает продукцию IL-8 относительно индуцированного контрольного состояния (CTL). Соединения РАТ1657 и РАТ1648 особенно эффективны и даже превосходят референсную молекулу (дексаметазон), поскольку они ингибируют/снижают продукцию IL-8 до исходного уровня, измеренного в неиндуцированном состоянии (необработанные ЦТЛ).

Подсчет продукции PGE2

Влияние соединений на продукцию PGE2 представлено на Фиг. 5 и выражено в процентах от обработки РМА, взятой за 100%.

Продукция PGE2 действительно индуцируется после обработки РМА, и индометацин снижает эту продукцию PGE2 в культуральных супернатантах почти до неопределяемого уровня.

Что касается соединений, они все уменьшают производство PGE2. Соединения РАТ1648, РАТ1657 и, в меньшей степени, соединения РАТ1658 и РАТ967 очень значительно снижают уровень PGE2, присутствующий в супернатантах культуры.

Подсчет продукции IL-6

Влияние соединений на продукцию IL-6 NHEKs в воспалительном состоянии показано на фиг. 6 и выражается в процентах от лечения РМА в сочетании с ионофором кальция А23187 (в условиях с высоким содержанием кальция: 0,8 мМ Са2+).

Лечение с помощью РМА в комбинации с кальций-ионофором 0,8 мМ Са2+ действительно вызывает перепроизводство IL-6. Референсная молекула, а именно дексаметазон, ингибирует эту продукцию IL-6 очень значительным образом, что подтверждает правильность теста.

Еще раз, каждое из соединений очень значительно снижает выработку IL-6 у NHEK в воспалительном состоянии. Два соединения РАT1648 и РАТ1657 проявляют наибольшее снижение и являются более эффективными, чем сам дексаметазон.

Подсчет продукции TNF-α

Влияние соединений на продукцию TNF - α показано на Фиг. 7 относительно обработки РМА в сочетании с ионофором кальция А23187.

Обработка РМА в сочетании с ионофором кальция вызывает секрецию TNF-α в супернатантах культуры кератиноцитов. Дексаметазон в концентрации 10 мкм оказывает очень сильное ингибирующее влияние на продукцию TNF-α.

Все соединения действуют как ингибиторы продукции TNF-α, причем весьма значительным образом. И снова соединения РАТ1648 и РАТ1657 обладают наиболее выраженными эффектами и более эффективны, чем сам дексаметазон.

Подсчет продукции LTB₄

Влияние соединений на продукцию LTB4 показано на Фиг. 8 и выражены в процентах от обработки арахидоновой кислотой (а.к.) в сочетании с ионофором кальция А23187, взятым за 100%.

Обработка клеток арахидоновой кислотой в комбинации с кальций-ионофором вызывает секрецию LTB4. Референсная молекула, а именно NDGA, очень сильно ингибирует эту продукцию LTB4 в изученной кинетике.

Соединения РАТ1648, РАT1657 и, в меньшей степени, соединение РАT1658 также блокируют/снижают, в очень высокой степени, уровень LTB4.

Оценка выживаемости клеток

NHEK приводились или не приводились в контакт с тестируемыми соединениями. Через 2 часа клетки подвергались или не подвергались воспалительной обработке (10 нг/мл РМА/H₂O + 2 мкМ кальциевого ионофора A23187/DMSO).

Клетки наблюдали под оптическим микроскопом через 48 часов после воспалительной обработки.

Наблюдение культур в микроскоп после 48 ч инкубации представлено в Таблице 6 ниже:

Наблюдается, что референсная молекула (дексаметазон), а также соединения РАТ965, РАТ964 и РАТ967, оказывают незначительное влияние или вообще не влияют на выживаемость клеток. И наоборот, соединения РАT1658 и особенно РАT1657 и РАT1648 демонстрируют сильную клеточную защиту от воспаления.

Однако примечательно, что в присутствии соединений РАT1658, и особенно РАТ1657 и РАT1648, кератиноциты защищены от токсичности, вызванной воспалением.

Заключение

В целом, 6 протестированных соединений обладают замечательным противовоспалительным действием.

Согласно проанализированным маркерам, некоторые из них (РАT1648 и РАT1657) обладают защитным эффектом, превосходящим внутренний контроль, рассматриваемый в качестве абсолютных эталонов в этой области (дексаметазон и индометацин).

Кроме того, 3 соединения РАT1648, РАT1657 и РАT1658 проявляют основной защитный эффект на цитотоксичность, индуцированную в кератиноцитах в воспалительном состоянии в течение 48 часов. Эти наблюдения основаны на микроскопическом анализе клеток через 48 часов после воспалительной обработки.

Таким образом, эти 3 соединения обладают замечательным цитопротекторным и противовоспалительным потенциалом.

Пример 3: Изучение противовоспалительного эффекта соединения РАТ1657 у самок SKH-1 бесшерстных мышей, подверженных индукции кожного воспаления повторяющимся кожным нанесением раствора ТРА в ацетоне (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат)

Материалы и методы

Животные

Исследование выполнено на 18 самках безволосых мышей SKH-1 весом около 20-25 г, разделенных на 3 группы (n=6/в парах) при контролируемой температуре (24±2°С) и влажности (50±20%) и с 12-часовым обратным световым циклом (свет с 21:00 до 09:00) (еда и вода по потребности).

Соединения для тестирования

Испытуемые соединения были следующими:

- Мазь Excipial® (контроль)

- РАТ1657 (октил-изохл органам ид А), включенный при концентрации 1,33% или 2,67% по массе в мазь Excipial®

Группы лечения распределяются следующим образом:

- G1: индуцированное воспаление кожи + ежедневная обработка носителем (мазь Excipial®) (контроль),

- G2: индуцированное воспаление кожи + лечение с помощью РАT1657, включенным при концентрации 1,33% по массе в мазь Excipial® (РАT1657/1,33%),

- G3: индуцированное воспаление кожи + лечение с помощью РАT1657, включенным при концентрации 2,67% по массе в мазь Excipial® (РАT1657/2,67%).

Индукиия и поддержание воспаления кожи

Кожное воспаление индуцируется для каждой мыши ежедневным нанесением на кожный покров спины в зону А (фиг. 9) в течение 7 дней (с 1 по 7 день) 100 мкл ацетонового раствора ТРА в концентрации 0,2 мг/мл.

Затем его поддерживают путем кожного нанесения каждые 2 дня в течение 7 дней (от 8 до 14 дня) 100 мкл ацетонового раствора ТРА.

Ацетоновый раствор ТРА приводят в контакт с одной и той же зоной кожи для каждой мыши с помощью системы фиксации.

Лечение животных

Лечение началось через 7 дней после начала индукции воспаления кожи (8 день).

Для носителей, животных (G1) ежедневно обрабатывали путем кожного нанесения 0,125 г мази на спину мышей в непосредственной близости от зоны нанесения ацетонового раствора ТРА (площадь примерно 5 см2, соответствующая зонам А и В, показанным на Фиг. 9), в течение 7 дней с 8 по 14 день.

Для соединения РАТ1657 животных (G2 и G3) обрабатывали путем кожного нанесения 0,125 г мази на спину мышей в непосредственной близости от зоны нанесения ацетонового раствора ТРА (примерно 5 см2 площади, соответствующей зонам А и В, показанным на фиг. Фиг. 9), в дни 8, 11 и 14.

В дни, когда наносили ацетоновый раствор ТРА, мази наносили примерно через 1 час после нанесения раствора ацетона ТРА.

Мониторинг животных

- животных наблюдали ежедневно до и после лечения,

- Животных взвешивали один раз в неделю.

Макроскопическая визуальная оценка воспаления кожи

Макроскопическая визуальная оценка кожного воспаления проводится ежедневно для каждой мыши с 8 по 15 день путем количественного определения его по следующей шкале (Guenon-Масе et al., 2015):

0: нет или нет дальнейшего воспаления

1: мягкое

2: умеренное

3: тяжелое

4: очень тяжелое

Макроскопическая визуальная оценка кожного воспаления позволяет количественно оценить следующие параметры:

- степень воспаления кожи в зоне применения раствора ацетона ТРА и в зоне обработки мазью, соответствующей зоне А, на фиг. 9,

- степень воспаления кожи в зоне обработки мазью и вне зоны нанесения раствора ТПА в ацетоне, соответствующей зоне В, на фиг. 9,

- степень воспаления кожи на остальной части спины, соответствующая зоне С на фиг. 9,

- Общая макроскопическая оценка воспаления кожи (общая оценка трех зон А, В и С, показанных на фиг. 9).

Результат

Смертность животных

Во время эксперимента смертности не наблюдалось ни в одной группе лечения.

Поведение животных

Во время эксперимента не было обнаружено аномального поведения ни в одной из групп лечения. Никаких значительных различий в весе ни в одной группе лечения не наблюдалось в течение эксперимента.

Реакция на применение тестируемых продуктов

Никакой реакции не наблюдалось ни в одной группе, получавшей протестированные мази (контроль и РАТ1657) в ходе эксперимента.

Макроскопическая оценка воспаления кожи

Результаты измерений степени воспаления кожи в зоне нанесения раствора ацетона ТРА и зоне обработки (зона А, фиг. 9) в зависимости от используемой обработки (контроль и две концентрации РАТ1657) показаны на фиг. 10. Значительное снижение макроскопической визуальной оценки кожного воспаления наблюдалось для соединения РАТ1657 при двух испытанных дозах относительно контроля со дня 13 и далее.

Результаты измерений степени воспаления кожи в зоне лечения и вне зоны применения раствора ацетона ТРА (зона В, фиг. 9) в зависимости от используемой обработки (контроль и две концентрации РАТ1657) показаны на фиг. 11. Значительное снижение макроскопической визуальной оценки кожного воспаления наблюдалось для соединения РАТ1657 при двух испытанных дозах относительно контроля со дня 13 и далее.

Результаты измерений степени воспаления кожи в остальной части спины (зона С, фиг. 9) в зависимости от использованного лечения (контроль и две концентрации РАТ1657) показаны на фиг. 12. Наблюдалось значительное снижение степени воспаления для соединения РАТ1657 при двух испытанных дозах относительно к контролю со дня 10 и далее.

Результаты измерений общей степени воспаления кожи (зоны А, В и С, фиг. 9) в зависимости от использованного лечения (контроль и две концентрации РАТ1657) показаны на фиг. 13. Значительное снижение макроскопической визуальной оценки кожного воспаления наблюдалось для соединения РАТ1657 при двух испытанных дозах относительно контроля со дня 10 и далее.

Заключение

Соединение РАТ1657 в двух испытанных дозах, вводимых на кожу каждые 3 дня, в качестве лечебного средства у самок безволосых мышей SKH-1, подвергнутых индукции воспаления кожи, значительно снижало интенсивность последних с макроскопической точки зрения дозозависимым характером.

Пример 4: Изучение эффекта соединения РАТ1657 на лечение имиквимод-индуцированного псориаза у мышей Balb/c

Материалы и методы

Животные

Исследование выполнено на 40 самках мышей Balb/c весом примерно 18-20 г и рандомизированных по весу на 5 групп (n=8) в зависимости от лечения, при контролируемой температуре (24±2°С) и влажности (50±20%) и с 12-часовым обратным световым циклом (свет с 20:00 до 08:00) (еда и вода по потребности).

Соединения для тестирования

Испытуемые соединения были следующими:

- Excipial® нейтральная мазь (контроль)

- РАТ1657 (октил-изохлоргенамид А), включенный при концентрации 1,33% или 2,67% по массе в мазь Excipial®

- Aldara ® крем, содержащий 5% имиквимода, индуктор псориаза

- Крем Dermoval®, содержащий 0,05% пропионата клобетазола и используемый для местного лечения псориаза (референсный продукт)

Группы лечения распределяются следующим образом:

- Группа 1: отсутствие индукции псориаза, но присутствует кожное нанесение нейтральной мази с 1 по 10 день и лечение нейтральной мазью Excipial® с 7 по 10 день (отрицательный контроль) (ЕР/ЕР);

- Группа 2: индукция псориаза путем кожного нанесения крема Aldara®, содержащего имиквимод, с 1 по 10 день и лечения нейтральной мазью Excipial® с 7 по 10 день (положительный контроль) (ALD/EP);

- Группа 3: индукция псориаза путем кожного нанесения крема Aldara®, содержащего имиквимод, с 1 по 10 день и лечения нейтральной мазью, содержащей 1,33% соединения РАТ1657, с 7 по 10 день (ALD/PAT1657-1,33%);

- Группа 4: индукция псориаза путем кожного нанесения крема Aldara®, содержащего имиквимод, с 1 по 10 день и лечения нейтральной мазью, содержащей 2,67% соединения РАТ1657, с 7 по 10 день (ALD/PAT1657-2,67%);

- Группа 5: индукция псориаза путем кожного нанесения крема Aldara®, содержащего имиквимод, с 1 по 10 день и лечения кремом Dermoval® с 7 по 10 день (ALD/Dermoval®).

Индукция и поддержание псориаза

Чтобы выполнить индукцию псориаза, необходимо было удалить волосы со спины животных путем бритья и выщипывания, чтобы иметь прямой доступ к кожной ткани. Псориаз был индуцирован у всех мышей в группах от 2 до 5 ежедневным кожным нанесением в течение 10 дней, с 1 по 10 день, приблизительно 70 мг крема Aldara®. Крем наносили на бритые спины мышей шелковой кистью. Для мышей из группы 1 ежедневное кожное нанесение нейтральной мази Excipial® проводилось в тех же условиях: примерно 70 мг наносили в течение 10 дней, с 1 по 10 день, утром, используя шелковую кисть.

Лечение животных

Мази, содержащие соединение РАТ1657 в двух тестируемых дозах, нейтральную мазь Excipial® и крем Dermoval®, наносили кожными аппликациями в течение 4 дней, с 7 по 10 день, на спину мышей в области индукции псориаза. Для каждого нанесения приблизительно 100 мг мази или крема наносили шелковой кистью, по меньшей мере, через 4 часа после нанесения крема Aldara® или нейтральной мази Excipial® для индукции псориаза или без него.

Площадь и степень тяжести псориаза (PASI)

Площадь и степень тяжести псориаза (PASI) рассчитывали ежедневно в течение всего эксперимента с 1 по 11 день на основе следующих трех параметров:

- Наличие эритемы, то есть покраснения кожи, в области индукции псориаза, оценивается следующим образом: 0 = нет или нет дальнейшей эритемы; 1 = легкая эритема; 2 = умеренная эритема; 3 = тяжелая эритема; 4 = очень тяжелая эритема.

- Степень уплотнения, т.е. затвердевания и утолщения кожи в области индукции псориаза, оценивается следующим образом: 0 = нет или нет дальнейшей уплотнения; 1 = легкая индурация; 2 = умеренная индурация; 3 = сильная индурация; 4 = очень тяжелая индурация.

- Степень десквамации, то есть наличие бляшек на поверхности кожи, в области индукции псориаза, оценивается следующим образом: 0 = нет или нет дальнейшей десквамации; 1 = легкая десквамация; 2 = умеренная десквамация; 3 = сильная десквамация; 4 = очень сильная десквамация.

Площадь и степень тяжести псориаза являются суммой баллов по этим трем параметрам.

Статистический анализ

Степень присутствия эритемы, степени индурации и десквамации, а также по площади и степени тяжести псориаза (PASI) были проанализированы в конце эксперимента. Непараметрический дисперсионный анализ (ANOVA) был выполнен с использованием теста Крускала-Уоллиса, а затем, в случае значимости, теста Манна-Уитни для сравнения обработанных групп с отрицательным контролем ЕР/ЕР, положительным контролем ALD/EP и ALD/Dermoval®. Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения Statview®5 (SAS, Institute Inc., США), и различия считали значимыми для значений р<0,05.

Результат

Смертность животных

Во время эксперимента не было отмечено смертности в четырех группах лечения.

Поведение животных

Во время эксперимента не было обнаружено ненормального поведения животных в четырех группах лечения.

Площадь и степень тяжести псориаза (PASI)

Наличие эритемы в области индукции псориаза

В период поддержания и лечения псориаза между 8 и 11 днями наблюдались следующие существенные различия:

- На 8-й день средние показатели наличия эритемы в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001; р=0,007 и р=0,007 соответственно).

- На 9-й день средние показатели наличия эритемы в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,002; р=0,002 и р=0,004 соответственно).

- На 10-й день средние показатели присутствия эритемы в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001 во всех случаях). Средний балл по наличию эритемы в области индукции псориаза у мышей в группе ALD/PAT1657-1,33% был значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,037), и у мышей в ALD/PAT1657-2,67% группе показал тенденцию быть значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,079).

- На 11-й день средние показатели наличия эритемы в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001 во всех случаях). Средние показатели наличия эритемы в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33% и ALD/PAT1657-2,67% были значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,001 и р=0,014 соответственно).

Степень индурации в области индукции псориаза

В период поддержания и лечения псориаза между 8 и 11 днями наблюдались следующие существенные различия:

- На 8-й день средние показатели степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001; р=0,004 и р=0,001 соответственно).

- На 9-й день средние показатели степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/ ЕР группе (р=0,001; р=0,001 и р=0,001 соответственно). Средний показатель степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группе ALD/PAT1657-1,33% был значительно выше, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,015).

- На 10-й день средние показатели степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001 во всех случаях). Средние показатели степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33% и ALD/PAT1657-2,67% были значительно выше, чем у мышей группы ALD/Dermoval® (р=0,025) в обоих случаях.

- На 11-й день средние показатели степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в ALD/EP группе (р=0,001 во всех случаях). Средний показатель степени индукции в области индукции псориаза у мышей в группе ALD/PAT1657-1,33% показал тенденцию быть значительно выше, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,063).

Степень десквамации в области индукции псориаза

В период поддержания и лечения псориаза между 8 и 11 днями наблюдались следующие существенные различия:

- На 8-й день средние оценки степени десквамации в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/ЕР (р=0,007; р=0,006 и р=0,013 соответственно).

- На 9-й и 10-й день средние показатели степени десквамации в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей, в группе ALD/EP (р=0,001 во всех случаях).

- На 11-й день средние оценки степени десквамации в области индукции псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/EP (р=0,001 во всех случаях). Средний балл по степени десквамации в области индукции псориаза у мышей в группе ALD/PAT1657-1,33% был значительно выше, чем у мышей в группе ALD/Dermoval®, и у мышей в группе ALD/PAT1657-2,67%, как правило, была значительно выше, чем у мышей в группе ALD/Dermoval® (р=0,059).

Индекс (показатель) площади и степени тяжести псориаза (PASI)

Индекс площади и тяжести псориаза (PASI) представляет собой сумму баллов по наличию эритемы, степени индурации и степени десквамации в областях индукции и лечения псориаза. На Фиг. 14 показаны средние показатели площади и степени тяжести псориаза для мышей в 5 группах лечения во время эксперимента.

Тест Крускала-Уоллиса показывает, что не было значительных различий между средней площадью псориаза и показателями тяжести для мышей в 5 группах лечения до начала индукции псориаза в 1-й день.

В течение периода индукции псориаза и до начала лечения между 2 и 7 днями, средние индексы площади и тяжести псориаза мышей у ALD/EP, ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval ® групп были значительно выше, чем у мышей в группе ЕР/ЕР, показанной на фиг. 14 по кривой с крестами, сливающимися с осью x (р=0,009; р=0,009; р=0,003 и р=0,009 соответственно для дня 2, и р=0,001 во всех случаях от 3 до 7 дня).

В период поддержания и лечения псориаза между 8 и 11 днями наблюдались следующие существенные различия:

- На 8-й день средние показатели площади и тяжести псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/EP, представленной в Фиг. 14 посредством кривой с кружками (р=0,001; р=0,001 и р=0,001 соответственно).

- На 9-й, 10-й и 11-й день средние показатели площади и тяжести псориаза у мышей в группах ALD/PAT1657-1,33%, ALD/PAT1657-2,67% и ALD/Dermoval® были значительно ниже, чем у мышей в группе ALD/EP представлена в Фиг. 14 кривой с кружками (р=0,001 во всех случаях).

Заключение

Соединение РАТ1657 в двух испытанных дозах показало значительное влияние на лечение псориаза. Соединение РАТ1657 значительно уменьшило, и по сравнению с кремом Dermoval®, наличие эритемы в области индукции псориаза, степень индурации в области индукции псориаза и степень десквамации в области индукции псориаза, таким образом, значительно уменьшая псориаз Индекс площади и серьезности.

Пример 5: Характеризация соединения РАТ1657 с точки зрения преимуществ для кожи.

Исследование состояло в измерении влияния соединения РАТ1657 методом qRT-PCR на экспрессию 94 генов, участвующих в биологии кожи, ремоделировании соединительной ткани и старении.

Протокол состоял в применении соединения РАT1657 в течение 24 ч в культуральной среде нормальных дермальных фибробластов человека (NHDF) в монослое и анализе различных популяций РНК для идентификации дифференциально экспрессируемых генов с помощью qRT - PCR в реальном времени.

Материалы и методы

Исследование проводилось на нормальных дермальных фибробластах человека (NHDF) (АТСС, CRL-2522, происхождение: крайняя плоть) при примерно 40% их пролиферативного потенциала и выращенных в монослое в среде DMEM (Invitrogen, 31885-049), содержащей антибиотики (пенициллин/стрептомицин, Invitrogen, 15140-122), но не содержащей сыворотки. Клетки держали во влажной атмосфере при 37°С, содержащей 5% CO2.

Предварительное исследование цитотоксичности определило рабочую концентрацию 4 мкМ (полученную в ДМСО) для соединения РАT1657 для исследования экспрессии генов.

Соединение РАT1657 применяли в культуральной среде NHDF в течение 24 часов (n=3). Контроли, обработанные растворителем ДМСО (1% для NHDF), в котором были получены активные агенты, также анализировали. В конце обработок, все популяции РНК были извлечены, их целостность была проанализирована с помощью капиллярного электрофореза, а различия в экспрессии генов были проанализированы с помощью qRT-ПЦР с использованием 96-луночных микрофлюидных карт TaqMan (изготовленных по заказу Applied Biosystems), нацеленных на ключевые функции дермы и эпидермиса. Технические подробности реализации настоящего абзаца поясняются в разделе «Материалы и методы» примера 1 заявки на патент FR1650745 и, более конкретно, в подразделе «Анализ изменений экспрессии генов» (стр. 26, строка 22 - стр. 28, строка 9).

Изменения экспрессии генов, вызванные активными агентами, выражаются в виде относительного количества (RQ) на основе соответствующих контролей растворителя ДМСО.

Результаты

Соединение РАТ1657 индуцирует много замечательных индукций.

Результаты суммированы в виде таблицы (таблица 7), показывающей, что гены, представляющие полезный косметический эффект, значительно отличаются при использовании соединения РАТ1657 в течение 24 часов для нормальных дермальных фибробластов человека (NHDF).

Эффект заживления:

Ускоренному заживлению особенно способствуют миграция фибробластов в место поражения кожи, стимуляция ангиогенеза и отложение коллагена. Соединение РАТ1657 увеличивает экспрессию генов CCL5 (28,13 ×) и VEGFA (8,3 ×), кодирующих соответственно хемокин и медиатор ангиогенеза, которые играют роль в заживлении кожи. Было показано, что этот хемокин играет важную роль в процессе заживления кожи. Он участвует в миграции дермальных стволовых клеток (ДСК) в место поражения кожи. Этот процесс важен для реэпителизации, репопуляции фибробластов в дерме и ангиогенеза (Kroeze et al., 2009).

Индуцируется несколько генов, кодирующих белки, участвующие в ремоделировании внеклеточного матрикса, такие как ММР1 (6,9 ×) и ММР3 (3,1 ×). Металлопротеиназы (ММР) играют роль в процессе восстановления раны кожи посредством ремоделирования внеклеточного матрикса (Stevens et al., 2012). Металлопротеиназа 1 (ММР1) инициирует расщепление коллагеновых фибрилл I и III типа в коже. Этот процесс деградации коллагена затем продолжается ММР3 (Krieg et al., 2011).

Следовательно, соединение РАТ1657 может способствовать заживлению, ускоряя реэпителизацию кератиноцитов и ангиогенез и, таким образом, способствуя закрытию раны.

Регенерирующий эффект:

Гены POU5F1 и NANOG и KLF4 являются маркерами кожных стволовых клеток (5,1, 4,7 и 1,9 соответственно). Они участвуют в процессе перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные стволовые клетки. Последние важны для поддержания дермального гомеостаза, восстановления повреждений и регенерации тканей (Jerabek et al., 2014).

Антивозрастной эффект:

Многие гены, вовлеченные в реакцию окислительного стресса, также сверхэкспрессируются: SOD2 (4,7х), RORA (4,4х), TXNRD1 (2,8х), FTL (2,1х), MTNR1A, NOX1, RBP2 и GSS. Супероксиддисмутаза 2, кодируемая геном SOD2, представляет собой митохондриальный белок, участвующий в первой линии защиты от АФК. Он превращает супероксидный анион в гидропероксид, который в свою очередь превращается в кислород и воду с помощью каталазы и пероксиредоксинов (Weyemi et al., 2012).

Гены, кодирующие белки, участвующие в механизмах репарации ДНК, поврежденной клеточным стрессом, также усиливают экспрессию: DDIT3, GADD45A и SIRT1.

Сверхэкспрессия некоторых из этих генов показывает способность соединения РАT1657 снижать эффекты прооксидантного стресса, генерирующего избыток свободных радикалов, таких как ультрафиолетовые лучи, ускоряющие признаки старения кожи, или бороться с различными провоспалительными патологиями кожи или условиями, которые также генерируют активные формы кислорода.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

et al.: PNAS, Vol. 58, NO. 25, PP. 16093-16098, December 2002.

Fitzpatrick, et al.: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 299, NO. 3, PP. 915-920, December 2001.

Gianfranco Peluso et al.; Journal of Natural Products, Vol. 58, NO. 5, pp. 639-646, May 1995 (Abstract).

Jerabek et al.: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms, Vol. 1839, Issue 3, PP. 138-154, March 2014.

Krieg et al.: Experimental Dermatology, Vol. 20, NO. 8, PP. 689-695, August 2011.

Lee, SA et al.: Pharmacology, Vol. 90, Issue 3-4, PP. 183-192, August 2012.

Kroeze et al.: Journal of Investigative Dermatology, Vol. 129, NO. 6, PP. 1569-1581, June 2009.

Otterbein et al.: American Journal of Pathology, Vol. 163, NO. 6, PP. 2555-2563, December 2003.

Stevens et al.: Molecular Biology of the Cell, Vol. 23, NO. 6, PP. 1068-1079, March 2012.

Stocker et al.: PNAS, Vol. 84, PP. 5918-5922, August 1987.

Xinyu Wang et al.: European Journal of Pharmacology, Vol. 635, PP. 16-22, March 2010.

et al.: Science Translational Medicine, Vol. 7, Issue 289, PP. 289ra85, May 2015.

Weyemi et al.: Aging, Vol. 4, NO. 2, PP. 116-118, February 2012.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (IA) или их фармацевтически приемлемым стереоизомерам, которые обладают противовоспалительными свойствами. В формуле (IA) R_1A и R_2A представляют независимо друг от друга Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода, бутильную группу, С₇-С₃₀ алкильную группу, бутильную или С₇-C₂₄ алкильную группу, ковалентно связанную с С₆-С₁₈ арильной группой, или C₆-C₁₈ арильную группу, ковалентно связанную с бутильной или С₇-С₂₄ алкильной группой, или С₇-С₁₈ арильную группу; Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют независимо друг от друга ОН группу или кофеоильную группу формулы (VI), при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой, и при условии, что соединения, в которых либо Q₃, либо Q₅ представляет собой кофеоильную группу, a Q₁, Q₄ и другой из Q₃ или Q₅ представляют собой ОН группу, исключены. Изобретение относится также к способу их получения, к соединениям, полученным указанным способом, применению соединений общей формулы (IA) для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания, фармацевтической композиции для применения при лечении и/или предотвращении воспаления, в частности воспаления кожи, или для стимулирования заживления, а также к косметической композиции для применения при лечении и/или предотвращении старения кожи, для получения успокаивающего действия на кожу и для стимулирования регенерации кожных тканей, которые содержат соединения общей формулы (IA). 7 н. и 10 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 табл., 5 пр.

1. Соединение общей формулы (IA)

,

где R_1A и R_2A представляют независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- бутильную или С₇-C₂₄ алкильную группу, ковалентно связанную с С₆-С₁₈ арильной группой, или C₆-C₁₈ арильную группу, ковалентно связанную с бутильной или С₇-С₂₄ алкильной группой, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют независимо друг от друга ОН группу или кофеоильную группу:

,

при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или их фармацевтически приемлемый стереоизомер,

при условии, что соединения, в которых либо Q₃, либо Q₅ представляет собой кофеоильную группу, a Q₁, Q₄ и другой из Q₃ или Q₅ представляют собой ОН группу, исключены.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что любые два радикала Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, другие два представляют собой ОН группу.

3. Соединение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что Q₁ представляет собой ОН группу, более конкретно Q₁ и Q₄ представляют собой ОН группу.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что R_1A представляет собой атом водорода, более конкретно R_1A представляет собой атом водорода и R_2A представляет собой бутильную группу или С₇-С₃₀ алкильную группу.

5. Соединение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что Q₁ и Q₄ представляют собой группу ОН, Q₃ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, R_1A представляет собой атом водорода и R_2A представляет собой бутил, октил, додецил, октадецил, фенилбутил или нафтильную группу.

6. Способ получения соединения общей формулы (IA)

,

где R_1A и R_2A представляют независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- C₇-C₃₀ алкильную группу,

- бутильную или С₇-С₂₄ алкильную группу, ковалентно связанную с С₆-C₁₈ арильной группой, или C₆-C₁₈ арильную группу, ковалентно связанную с бутильной или С₇-С₂₄ алкильной группой, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют независимо друг от друга ОН группу или кофеоильную группу:

,

при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или его фармацевтически приемлемого стереоизомера, при условии, что соединения, в которых либо Q₃, либо Q₅ представляет собой кофеоильную группу, а Q₁, Q₄ и другой из Q₃ или Q₅ представляют собой ОН группу, исключены,

отличающийся тем, что он содержит стадию а), на которой поликофеоилхинная кислота, выбранная из 3-О-кофеоилхинной кислоты, 3,5-дикофеоилхинной, 3,4-дикофеоилхинной, 4,5-дикофеоилхинной, 3,4,5-трикофеоилхинной и тетракофеоилхинной кислоты, взаимодействует с соединением формулы HNR_1AR_2A.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что любые два радикала Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют собой кофеоильную группу, другие два представляют собой ОН группу.

8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что поликофеоилхинная кислота представляет собой 3,5-ди-О-кофеоилхинную кислоту.

9. Способ по любому из пп. 6-8, отличающийся тем, что R_1A представляет собой атом водорода, более конкретно R_1A представляет собой атом водорода и R_2A представляет собой бутильную группу, С₇-С₃₀ алкильную группу, С₇-С₁₀ арильную группу или С₇-С₃₀ арилалкильную группу, например фенил(С₁-С₂₄)алкил.

10. Способ по любому из пп. 6-9, отличающийся тем, что соединение формулы HNR_1AR_2A выбрано из следующих соединений: октан-1-амин, бутан-1-амин, лауриламин, 1-октадециламин, 4-фенилбутан-1-амин или 2-нафтиламин.

11. Способ по любому из пп. 6-10, отличающийся тем, что стадии а) предшествует стадия активации карбоксильной группы полизамещенной хинной кислоты с помощью активатора карбоксильной группы, в частности с помощью активатора карбоксильной группы, выбранного из активаторов карбодиимидного семейства, например дициклогексилкарбодиимида (DCC), диизопропилкарбодиимида (DIC), N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDCI), отдельно или в сочетании со спиртами, позволяющими транзиентное образование активированных сложных эфиров, таких как, например, 1-гидроксибензотриазол (НОВТ), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), 1-гидроксисукцинимид (HOSu) или (гидроксиимино)цианоацетата этил, или из семейства активаторов солей фосфония, урония и/или гуанидиния, например (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфата (ВОР), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфата (РуВОР), (1-циано-2-этоксокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфата (COMU), N,N,N',N'-тетраметил-O-(1Н-бензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфата (HBTU), (O-(6-хлор-1-гидроцибензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторбората) (TCTU), (2-(7-аза-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата) (HATU), и более конкретно активатора карбоксильной группы, выбранного из диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола (НОВТ).

12. Соединение, полученное способом по любому из пп. 9-11.

13. Применение соединения общей формулы (IA)

,

где R_1A и R_2A представляют независимо друг от друга:

- Н, при условии, что R_1A и R_2A оба не являются атомом водорода,

- бутильную группу,

- С₇-С₃₀ алкильную группу,

- бутильную или С₇-С₂₄ алкильную группу, ковалентно связанную с C₆-С₁₈ арильной группой, или C₆-C₁₈ арильную группу, ковалентно связанную с бутильной или С₇-С₂₄ алкильной группой, или

- С₇-С₁₈ арильную группу,

и Q₁, Q₃, Q₄ и Q₅ представляют независимо друг от друга ОН группу или кофеоильную группу:

,

при условии, что по меньшей мере один из этих радикалов не является ОН группой,

или их фармацевтически приемлемого стереоизомера, при условии, что соединения, в которых либо Q₃, либо Q₅ представляет собой кофеоильную группу, а Q₁, Q₄ и другой из Q₃ или Q5 представляют собой ОН группу, исключены,

для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания.

14. Применение соединения по любому из пп. 1-5 или 12 для предотвращения и/или лечения воспаления или воспалительного заболевания.

15. Применение по п. 13 или 14, отличающееся тем, что воспалительное заболевание выбрано из воспалительных заболеваний, возникающих в результате чрезмерного специфического ответа иммунной системы, например астмы, псориаза, ринита, артроза и аутоиммунных заболеваний, включая синдром Рейно, аутоиммунный тиреоидит, дерматит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, увеит, воспалительные заболевания кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), системную красную волчанку; и заболеваний, возникающих в результате чрезмерного неспецифического ответа иммунной системы, таких как заболевания, вызванные респираторным дистресс-синдромом взрослых, септический шок, токсичность кислорода, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к сепсису, синдром полиорганной дисфункции, вторичный по отношению к травме, реперфузионное повреждение тканей вследствие экстракорпорального кровообращения, инфаркт миокарда, острый гломерулонефрит, васкулит, реактивный артрит, дерматоз с острыми воспалительными компонентами, инсульт, термическое повреждение, гемодиализ, цитаферез, некротический энтероколит и синдром, связанный с переливанием гранулоцитов.

16. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение по любому из пп. 1-5 или 12, для применения при лечении и/или предотвращении воспаления, в частности воспаления кожи, или для стимулирования заживления.

17. Косметическая композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение по любому из пп. 1-5 или 12, для применения при лечении и/или предотвращении старения кожи, для получения успокаивающего действия на кожу и для стимулирования регенерации кожных тканей.