ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 61/990111, которая подана 8 мая 2014 года, озаглавлена RAPID IMMUNOHISTOCHEMISTRY ASSAY, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме для всех целей.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к композициям, способам и наборам для прямого иммуногистохимического окрашивания ткани, а также к их применению.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Часто во время хирургического вмешательства биоптаты тканей могут быть удалены у пациента и отправлены из операционного зала в патологическую лабораторию для анализа, например, посредством диагностирования замороженного тканевого среза. Способы диагностирования замороженных тканевых срезов могут состоять из заморозки ткани в патологической лаборатории, изготовления срезов замороженной ткани и выполнения стандартного окрашивания гематоксилином и эозином (ГЭ). Окрашивание ГЭ представляет собой способ общего назначения, используемый для того, чтобы помогать медицинскому патологу диагностировать патологии тканей. Однако окрашивание ГЭ имеет множество ограничений, в том числе, например, неспецифичное окрашивание ткани, а также вероятность не идентифицировать конкретные белки в ткани. Идентификация конкретных белков в ткани, например, посредством использования процедуры, иногда обозначаемой как иммуногистохимия (ИГХ), может помогать патологу во время операции диагностировать многие патологии тканей. Примеры могут включать биопсию сторожевых лимфатических узлов (для потенциальных метастатических карцином и меланом), недифференцированных опухолей (потенциальных карцином, лимфом и меланом) и биопсий краевых зон (поиск на краях иссеченной ткани, чтобы проверить, что удалена вся опухоль).
[0004] Иммуногистохимическое окрашивание тканевых срезов представляет собой надежный способ оценки присутствия или отсутствия и изменения белков в гетерогенной ткани. В целом, в ИГХ способах используют антитело для того, чтобы зондировать и визуализировать клеточные антигены in situ. Часто из-за диффузного распределения белков в ткани необходимо усиление сигнала для того, чтобы визуализировать клеточные антигены. Способы усиления сигнала включают, например, использование вторичного антитела, которое связывается с первичным антителом, специфичным к клеточному антигену, и системы биотин-авидин. Хромогенные или флуоресцентные частицы на вторичном антителе или биотин-авидиновой системе усиления сигнала используют для того, чтобы обнаруживать присутствие клеточного антигена. ИГХ способ выделяется благодаря тому, что он избегает нежелательных эффектов дезагрегирования и делает возможной оценку отдельных клеток в контексте морфологии. Кроме того, целевой белок не изменяют в процессе заморозки и, таким образом, ИГХ имеет потенциал в качестве инструмента для патологического анализа иссеченной ткани во время операции.
[0005] Однако существующие ИГХ способы могут требовать от 60 до 120 минут для получения результатов. Внутриоперационные руководства, такие как те, которые предоставляет College of American Pathologists, обычно рекомендуют сообщать патологические данные хирургу в течение приблизительно 20 минут. Таким образом, существующие ИГХ способы требуют слишком много времени, чтобы их можно было использовать в качестве инструмента во время операции. Кроме того, существующие ИГХ способы могут нести артефакты, обусловленные используемым способом усиления сигнала, например, неспецифичное связывание вторичного антитела или присутствие эндогенного биотина. Следовательно, существует необходимость в усовершенствованных ИГХ способах.
[0006] ИГХ способы также можно использовать для ретроспективного анализа ткани. Большинство патологических образцов получают не в виде замороженных тканей, а фиксируют формалином и погружают в парафин (FFPE) для того, чтобы сделать возможным архивное хранение и гистологический анализ в последующее время. Поскольку погруженные в парафин образцы широко доступны для ретроспективных исследований, быстрые и надежные способы необходимы для количественного обнаружения белков в таких образцах.
[0007] Композиции и способы для количественного определения белка в замороженных и погруженных в парафин тканях, в частности, необходимы для исследования экспрессии белка в опухолевых тканях. Например, уровни экспрессии определенных рецепторов или ферментов могут показывать вероятность успеха конкретного лечения. Таким образом, также в данной области существует потребность в чувствительных и количественных ИГХ способах, способных быстро обнаруживать антиген, такой как опухолевый антиген.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В настоящем описании изобретение относится к способам, композициям и наборам для обнаружения присутствия или отсутствия целевого анализируемого вещества в образце ткани.
[0009] В настоящем описании изобретение относится к способам обнаружения целевого анализируемого вещества в ткани, которые включают:
[0010] приведение ткани, содержащей целевое анализируемое вещество, в контакт с конъюгатами полимерного фермента/антитела, содержащими конъюгат полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов и антитело, которое распознает целевое анализируемое вещество, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и конъюгат полимерного фермента/антитела; по существу удаление конъюгатов полимерного фермента/антитела, которые не образуют комплекс; и приведение ткани в контакт с субстратом множества молекул ферментов, таким образом обнаруживая целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой замороженную ткань.
[0011] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, способ дополнительно включает стадию блокирования перед стадией приведения в контакт ткани, которая содержит целевое анализируемое вещество, с конъюгатами полимерного фермента/антитела, которые содержат конъюгат полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов и антитело, которое распознает целевое анализируемое вещество, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и конъюгат полимерного фермента/антитела, в котором стадия блокирования включает приведение в контакт ткани с блокирующим средством. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой замороженную ткань. В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит снятое молоко, BSA, желатин кожи холодолюбивых рыб, казеин или животную сыворотку.
[0012] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, ткань фиксируют в фиксирующем растворе, который содержит альдегид.
[0013] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, фиксирующий раствор содержит формалин.
[0014] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, ткань погружают в парафин.
[0015] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, ткань представляет собой тканевой срез, клинический мазок или культивированные клетки или ткань. В некоторых вариантах осуществления тканевой срез выбирают из группы, состоящей из тканевых срезов головного мозга, надпочечников, ободочной кишки, тонкой кишки, желудка, сердца, печени, кожи, почки, легкого, поджелудочной железы, яичка, яичника, предстательной железы, матки, щитовидной железы и селезенки млекопитающего.
[0016] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, молекулу фермента выбирают из группы, состоящей из: бета-D-галактозидазы, глюкозооксидазы, пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы, бета-лактамазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, уреазы, уриказы, супероксиддисмутазы, люциферазы, пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, оксидазы галактозы, ацетилхолинэстеразы, энтерокиназы, тирозиназы и ксантиноксидазы.
[0017] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, конъюгат полимерного фермента/антитела содержит по меньшей мере 6 молекул ферментов на конъюгат полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит от приблизительно 6 до приблизительно 80 молекулами ферментов на конъюгат полимерного фермента/антитела.
[0018] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, стадию приведения в контакт ткани, которая содержит целевое анализируемое вещество, с конъюгатами полимерного фермента/антитела, которые содержат конъюгат полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов и антитело, которое распознает целевое анализируемое вещество, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и конъюгат полимерного фермента/антитела, осуществляют при температуре инкубации от приблизительно 15°C до приблизительно 37°C.
[0019] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления, стадию приведения в контакт ткани, которая содержит целевое анализируемое вещество, с конъюгатами полимерного фермента/антитела, которые содержат конъюгат полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов и антитело, которое распознает целевое анализируемое вещество, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и конъюгат полимерного фермента/антитела, осуществляют в течение периода инкубации от приблизительно 3 минутами до приблизительно 30 минутами. В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет от приблизительно 5 минутами до приблизительно 15 минутами.
[0020] В настоящем описании изобретение относится к способам получения конъюгата полимерного фермента/антитела, которые включают: конъюгирование полимерного фермента, который содержит множество молекул ферментов, с антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой терапевтическое антитело.
[0021] В настоящем описании изобретение относится к способы лечения индивидуума, который имеет заболевание, с использованием средства, который включает обнаружение присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов, конъюгированных с антителом, которое распознает целевое анализируемое вещество, в соответствии с (или применительно к) каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой терапевтическое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфично связывает целевое анализируемое вещество, и терапевтическое антитело представляют собой одно и то же.
[0022] В настоящем описании изобретение относится к конъюгату полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов и терапевтическое антитело. Изобретение также относится к наборам, которые содержат конъюгаты полимерного фермента/антитела в соответствии с каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит субстрат множества молекул ферментов. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по использованию в соответствии с каким-либо из вышеприведенных вариантов осуществления.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПО ССЫЛКЕ
[0023] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана для включения по ссылке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0024] Новые признаки по изобретению приведены в подробностях в приложенной формуле изобретения. Более полного понимания признаков и преимуществ настоящего изобретения можно достичь посредством отсылки к следующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используют принципы изобретения, и к сопроводительным рисункам, на которых:
[0025] На фиг. 1 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека с использованием конъюгата полимерной пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18. На фиг. 1A изображены результаты (100×) прямого иммуногистохимического окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека. Лимфатический узел содержит метастатическую протоковую карциному груди. Клетки метастатической карциномы непосредственно окрашивают моноклональными антителами мыши против низкомолекулярного кератина человека, меченными полимером пероксидазы хрена (CK8/18, клон C94); и время инкубации для прямого иммуногистохимического окрашивания составляло 3 минуты при комнатной температуре. На фиг. 1B представлено 200× увеличение ткани. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0026] На фиг. 2 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека с использованием конъюгата полимерной пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18. На фиг. 2A изображены результаты (100×) прямого иммуногистохимического окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека. Лимфатический узел содержит метастатическую протоковую карциному груди. Клетки метастатической карциномы окрашивают непосредственно моноклональными антителами мыши против низкомолекулярного кератина человека Novodiax, меченными полимером пероксидазы хрена (CK8/18, клон C94); и время инкубации для прямого иммуногистохимического окрашивания составляло 5 минут при комнатной температуре. На фиг. 2B представлено 200× увеличение ткани. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0027] На фиг. 3 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека с использованием конъюгата полимерной пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18. На фиг. 3A изображены результаты (100×) прямого иммуногистохимического окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека. Лимфатический узел содержит метастатическую протоковую карциному груди. Клетки метастатической карциномы окрашивают непосредственно моноклональными антителами мыши против низкомолекулярного кератина человека, меченными полимером пероксидазы хрена (CK8/18, клон C94); и время инкубации для прямого иммуногистохимического окрашивания составляло 8 минут при комнатной температуре. На фиг. 3B представлено 200× увеличение ткани. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0028] На фиг. 4 представлены репрезентативные изображения ГЭ окрашивания. На фиг. 4A изображен окрашенный ГЭ препарат замороженного тканевого среза, 10× увеличение. Ткань представляет собой подмышечный лимфатический узел, который содержит метастатическую протоковую карциному груди. Большинство лимфоидной ткани заменено на опухоль. На фиг. 4B изображен окрашенный ГЭ препарат замороженного тканевого среза, 10× увеличение. Ткань представляет собой подмышечный лимфатический узел, который содержит метастатическую протоковую карциному груди. Большинство лимфоидной ткани заменено опухолью.
[0029] На фиг. 5 представлено репрезентативное изображение прямого ИГХ окрашивания препарата фиксированной формалином ткани с использованием полимерной пероксидазы хрена, конъюгированной с антителами мыши против цитокератина человека 8/18 Novodiax, которые фотографировали на цифровую камеру при увеличении микроскопа 100×. Исследованная ткань представляет собой нормальную предстательную железу. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0030] На фиг. 6 изображена репрезентативная цифровая микрофотография (увеличение 100×) прямого ИГХ окрашивания с использованием полимерной пероксидазы хрена, конъюгированной со специфичными антителами мыши Novodiax против предстательной железы человека (PSA), на нормальной ткани предстательной железы. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0031] На фиг. 7 изображены репрезентативные результаты прямого ИГХ окрашивания с использованием полимерной пероксидазы хрена, конъюгированной с антителами мыши Novodiax против IgG человека, на лимфоидной ткани человека. Увеличение микроскопа составляет 400×. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0032] На фиг. 8 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания замороженной ткани лимфатического узла человека с использованием конъюгата полимерной пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18. На фиг. 8A изображены результаты (20×) прямого иммуногистохимического окрашивания фиксированной формалином ткани предстательной железы человека. Эпителиальные клетки предстательной железы окрашивают непосредственно моноклональными антителами мыши Novodiax против низкомолекулярного кератина человека, меченными полимером пероксидазы хрена (CK8/18, клон C94); и время инкубации для прямого иммуногистохимического окрашивания составляло 3 минуты при 37°C. На фиг. 8B изображены результаты (40×) прямого иммуногистохимического окрашивания фиксированной формалином ткани предстательной железы человека. Эпителиальные клетки предстательной железы окрашивают непосредственно моноклональными антителами мыши Novodiax против низкомолекулярного кератина человека, меченными полимером пероксидазы хрена (CK8/18, клон C94); и время инкубации для прямого иммуногистохимического окрашивания составляло 3 минуты при 37°C.
[0033] На фиг. 9 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания тканевых срезов с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18. Проиллюстрированы FFPE тканевой срез предстательной железы (фиг. 9A) и замороженный тканевой срез лимфатического узла человека (фиг. 9B). Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0034] На фиг. 10 представлено репрезентативное изображение прямого ИГХ окрашивания тканевой срез миндалины человека с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ki-67. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0035] На фиг. 11 представлено репрезентативное изображение прямого ИГХ окрашивания замороженного тканевого среза миндалины человека с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck5. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0036] На фиг. 12 представлено репрезентативное изображение прямого ИГХ окрашивания тканевого среза меланомы с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Mart-1 клона A103. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0037] На фиг. 13 представлено репрезентативное изображение прямого ИГХ окрашивания тканевого среза миндалины с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против CD45 клона 3A4. Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0038] На фиг. 14 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания тканевых срезов с использованием терапевтического антитела, конъюгированного с полимером пероксидазы хрена. Проиллюстрированы образцы тканей миндалины (фиг. 14A), предстательной железы (фиг. 14B), желудка (фиг. 14C) и почки (фиг. 14D). Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
[0039] На фиг. 15 представлены репрезентативные изображения прямого ИГХ окрашивания образцов тканей с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против ROR2. Проиллюстрированы тканевые срезы меланомы (фиг. 15A и 15B), гепатоцеллюлярной карциномы (фиг. 15C и 15D), нейроэндокринной опухоли (фиг. 15E и 15F), легкой карциномы (фиг. 15G) и светлоклеточной карциномы почки (фиг. 15H). Образцовые окрашенные области обозначены стрелкой.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0040] Некоторые аспекты изобретения описаны далее со ссылкой на примеры применения для иллюстрации. Следует понимать, что множество конкретных деталей, зависимостей и способов изложены для того, чтобы обеспечить полное понимание изобретения. Однако средний специалист в релевантной области легко поймет, что изобретение можно реализовать без одной или нескольких конкретных деталей или с использованием других способов. Настоящее изобретение не ограничено проиллюстрированным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в других порядках и/или одновременно с другими действиями или событиями.
[0041] Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события необходимы для выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением.
[0042] Терминология, используемая в настоящем описании, служит лишь цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена в качестве ограничения изобретения. В настоящем описании в рамках изобретения, формы единственного числа включают также формы множественного числа при условии, что из контекста явно не следует иное. Кроме того, в той мере, в которой термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты используют в подробном описании и/или в формуле изобретения, эти термины являются включительными наподобие термина «содержащий».
[0043] Термин «приблизительно» обозначает в пределах приемлемого диапазона ошибок для конкретного значения, как определяет специалист в данной области, который будет зависеть частично от того, как значение измеряют или определяют, т.е. от ограничений измерительной системы. Например, «приблизительно» может обозначать в пределах 1 или больше чем 1 стандартного отклонения, исходя из практики в данной области. Альтернативно, «приблизительно» может обозначать диапазон вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5%, и более предпочтительно вплоть до 1% от данного значения. Альтернативно, в частности в отношении биологических систем или процесс, термин «приблизительно» может обозначать в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5 крат и более предпочтительно в пределах 2 крат от значения. Когда конкретные значения описаны в заявке и формуле изобретения, если не указано иное, значение термина «приблизительно» следует принимать в пределах приемлемого диапазона ошибок для конкретного значения.
I. Иммуногистохимический анализ
[0044] В целом, настоящее изобретение относится к композициям, способам и наборам для обнаружения присутствия или отсутствия целевого анализируемого вещества в образце ткани. В целом, способ включает: (a) приведение в контакт образца ткани, который содержит целевое анализируемое вещество, с конъюгатами полимерного фермента/антитела для того, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и по меньшей мере один из конъюгатов полимерного фермента/антитела, при температуре инкубации между приблизительно 15°C и приблизительно 45°C в течение периода инкубации между приблизительно 3 минутами и приблизительно 1 часом, в котором антитело способно специфично связываться с целевым анализируемым веществом; (b) удаление конъюгатов полимерного фермента/антитела, которые не образуют комплекс; (c) приведение в контакт образца ткани с субстратом фермента, таким образом обнаруживая целевое анализируемое вещество.
[0045] В одном из аспектов композиции, способы и наборы по изобретению используют для быстрого обнаружения целевых анализируемых веществ, таких как антигены, в образце ткани, таком как FFPE тканевой срез или замороженный тканевой срез. В одном из аспектов композиции, способы и наборы по изобретению используют для чувствительного обнаружения целевых анализируемых веществ, таких как антигены, в образце ткани, таком как FFPE тканевой срез или замороженный тканевой срез. В некоторых вариантах осуществления индивидуума, имеющего заболевание, выбирают для лечения, где обнаружение целевого анализируемого вещества способами, описанными в настоящем описании, используют в качестве основы для того, чтобы выбирать индивидуума для лечения.
A. Образцы тканей
[0046] В целом, композиции и способы в настоящем описании по изобретению используют для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество в образце ткани, полученном от пациента. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы в настоящем описании по изобретению используют для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество в ткани, полученной от пациента, в которой целевой анализируемое вещество представляет собой опухолевый антиген.
[0047] Под «лицом» или «пациентом» в настоящем описании понимают любого отдельного пациента, для которого терапия является желательной, в том числе людей, крупный рогатый скот, собак, мышей, крыс, морских свинок, кроликов, кур, насекомых и так далее. Также в качестве пациента может быть рассмотрен любой пациент, участвующий в клиническом исследовании, который не проявляет каких-либо клинических признаков заболевания, или пациент, участвующий в эпидемиологическом исследовании, или пациент, используемый в качестве контроля.
[0048] Под «образцом ткани» в настоящем описании понимают совокупность схожих клеток, полученных из ткани лица или пациента, предпочтительно содержащих ядросодержащие клетки с хромосомным материалом. Четыре основные ткани человека представляют собой (1) эпителий; (2) соединительные ткани, в том числе кровеносные сосуды, кость и хрящ; (3) мышечную ткань; и (4) нервную ткань. Источник образца ткани может представлять собой солидную ткань, как из свежего, замороженного и/или консервированного органа или образца ткани или биоптат или аспират или кровь или какие-либо составляющие крови или текучие вещества организма, такие как цереброспинальная жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость, или клетки из любого момента гестации или развития пациента. Образце ткани также может представлять собой первичные или культивированные клетки или клеточные линии или тканевые культуры. Образец ткани может содержать соединения, которые в природе не смешаны с тканью естественным образом, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец ткани представляет собой «не гематологическую ткань» (т.е. не кровь или ткань костного мозга).
[0049] Способы по изобретению можно применять к ткани любого типа, включая, например, злокачественную ткань. Хотя замороженная опухолевая ткань не является широкодоступной, парафиновые блоки получают обычным образом из опухолей после хирургического вмешательства, что делает возможными, например, крупномасштабные ретроспективные исследования экспрессии тимидилатсинтазы и ответа на химиотерапию, подлежащую осуществлению. Кроме того, способ можно применять к опухоли любого типа из широкого диапазона и к неограниченному диапазону продуктов генов. Способы по изобретению можно использовать для получения индивидуальных «профилей экспрессии генов» опухолями, в соответствии с чем уровни экспрессии можно определять в образцах индивидуальных пациентов для одного или нескольких продуктов гена, например, для диапазона продуктов генов, о которых известно, что они влияют на клинический исход и ответ на различные химиотерапевтические средства.
[0050] В некоторых вариантах осуществления ткань содержит клетки злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления ткань содержит клетку в пространственной близости к клетке злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления ткань содержит клетку злокачественной опухоли и клетку в пространственной близости к клетке злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления ткань содержит клетку в тесной пространственной близости к клетке злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления ткань содержит нормальную клетку в тесной пространственной близости к клетке злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления ткань содержит смесь клеток злокачественной опухоли и нормальных клеток в пространственной близости к клеткам злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит низкую процентную долю клеток злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит меньше чем 30%, 20%, 15%, 10% или 5% клеток злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит между приблизительно 5% и приблизительно 30% клеток злокачественной опухоли.
[0051] В некоторых вариантах осуществления образец ткани содержит тканевой срез.
[0052] Под «срезом» образца ткани в настоящем описании понимают одну часть или кусок образца ткани, например, тонкий срез ткани или клеток, вырезанный из образца ткани. Понятно, что можно получать множество срезов образцов тканей и подвергать их анализу в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления выбранная часть или срез ткани содержит гомогенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления выбранная часть или срез ткани содержит гетерогенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления выбранная часть содержит участок ткани, например, просвет в качестве неограничивающего примера. Выбранная часть может быть размером всего с одну клетку или две клетки или может представлять многие тысячи клеток, например. В большинстве случаев важна совокупность клеток, и хотя изобретение описано для использования в обнаружении клеточных компонентов, способ также можно использовать для обнаружения неклеточных компонентов организма (например, растворимых компонентов в крови, в качестве неограничивающего примера).
[0053] Можно использовать любой образец ткани от пациента. Примеры образцов тканей, которые можно использовать, включают, но не ограничиваясь этим, грудь, предстательную железу, яичник, ободочную кишку, легкое, эндометрий, желудок, слюнную железу или поджелудочную железу. Образцы ткани можно получать с помощью множества процедур, включая в качестве неограничивающих примеров хирургическое иссечение, аспирацию или биопсию. Ткань может быть свежей или замороженной.
[0054] В некоторых вариантах осуществления ткань является старой. Под «старой» в настоящем описании понимают ткань, которую хранили в течение определенного периода времени, например, периода времени, в течение которого хранят замороженный или FFPE. В некоторых вариантах осуществления образец ткани представляет собой замороженный образце ткани. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой замороженную ткань. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой ткань, погруженную в парафин. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой фиксированную формалином погруженную в парафин ткань.
[0055] В некоторых вариантах осуществления образец ткани представляет собой тканевой срез, клинический мазок или культивированные клетки или ткань. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой тканевой срез, который в толщину больше приблизительно 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой тканевой срез, который составляет приблизительно 5 мкм в толщину. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой тканевой срез, который меньше приблизительно 5 мкм в толщину. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой тканевой срез, который составляет от приблизительно 1,5 мкм в толщину до приблизительно 5,5 мкм в толщину. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой тканевой срез, который составляет от приблизительно 4,5 мкм в толщину до приблизительно 7,5 мкм в толщину.
[0056] В некоторых вариантах осуществления тканевой срез выбирают из группы, состоящей из тканевых срезов головного мозга, надпочечников, ободочной кишки, тонкой кишки, желудка, сердца, печени, кожи, почки, легкого, поджелудочной железы, яичка, яичника, предстательной железы, матки, щитовидной железы и селезенки млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления тканевой срез происходит из солидной опухоли.
Получение образцов тканей
[0057] Способ получения блоков ткани из этих раздельных образцов успешно использовали в предыдущих ИГХ исследованиях различных прогностических факторов и/или они хорошо известны специалистам в данной области.
[0058] В кратком изложении, какой-либо интактный орган или ткань можно резать на достаточно мелкие куски и инкубировать в различных фиксаторам (например, формалине, спирте и т.д.) в течение различных периодов времени до «фиксации» ткани. Образцы могут представлять собой практически любую интактную ткань, удаленную хирургически из организма. Образцы можно резать на обоснованно мелкие куски, которые помещаются в оборудовании, обычно используемом в гистопатологических лабораториях. Размер резанных кусков типично варьирует от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров.
[0059] В некоторых вариантах осуществления замороженные срезы можно получать посредством регидратации 50 мг замороженной «измельченной» ткани при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере (PBS) в небольшой пластмассовой капсуле; осаждения частиц посредством центрифугирования; ресуспендирования частиц в вязкой заливочной среде (OCT); переворачивания капсулы и/или осаждения снова посредством центрифугирования; мгновенного замораживания в изопентане при -70°C; разрезания пластмассовой капсулы и/или удаления замороженного цилиндра ткани; закрепления цилиндра ткани в патроне криостатного микротома; и/или нарезания 25-50 последовательных срезов.
[0060] Перманентные срезы можно получать с помощью схожего способа, включающего регидратацию 50 мг образца в пластмассовой микроцентрифужной пробирке; осаждение; ресуспендирование в 10% формалине для четырехчасовой фиксации; промывание/осаждение; ресуспендирование в теплом 2,5% агаре; осаждение; охлаждение в воде со льдом для затвердевания агара; удаления блока ткани/агара из пробирки; пропитывания и/или заливки блока парафином; и/или нарезания вплоть до 50 последовательных перманентных срезов.
[0061] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении можно использовать стандартные замороженные образцы, такие как те, которые заливают OCT и которые не измельчают, например, в том числе те, которые используют в стандартных больничных лабораториях замороженных срезов.
[0062] Образцы тканей часто фиксируют с использованием фиксатора. Обычно используют альдегидные фиксаторы, такие как формалин (формальдегид) и глутаральдегид. Также подходят образцы тканей, фиксированные с использованием других способов фиксации, таких как погружение в спирт. См. Battifora and Kopinski, J., Histochem. Cytochem., 34:1095 (1986). Используемые образцы также можно заливать парафином.
[0063] В некоторых вариантах осуществления образец ткани фиксируют в растворе, который содержит альдегид.
[0064] В некоторых вариантах осуществления образец ткани фиксируют в растворе, который содержит формалин.
[0065] В некоторых вариантах осуществления образец ткани погружают в парафин.
[0066] В некоторых вариантах осуществления образец ткани фиксируют и заливают парафином или тому подобное.
[0067] В некоторых вариантах осуществления образцы фиксируют формалином и погружают в парафин.
[0068] В некоторых вариантах осуществления фиксированный формалином погруженный в парафин блок ткани (FFPET) окрашивают гематоксилином и эозином перед выбором одной или нескольких частей для анализа, чтобы выбирать конкретный участок(участки) для образца сердцевины FFPET.
[0069] Образец ткани можно фиксировать (т.е. консервировать) стандартным способом. См. например, « Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology», 3-е издание (1960), под редакцией Lee G. Luna, HT (ASCP), The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994), под редакцией Ulreka V. Mikel, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C. Специалист в данной области примет во внимание, что выбор фиксатора определяют, исходя из цели, для которой ткань подлежит гистологическому окрашиванию или анализу иным образом. Специалист в данной области также примет во внимание, что длительность фиксации зависит от размера образца ткани и используемого фиксатора. В качестве примера, нейтральный забуференный формалин, Буэна или параформальдегид можно использовать для того, чтобы фиксировать образец ткани.
[0070] В целом, образец ткани сначала фиксируют и затем дегидратируют через возрастающий ряд спиртов, инфильтрируют и заливают парафином или другими средами для срезов с тем, чтобы образец ткани можно было резать. Альтернативно, можно получать тканевые срезы и фиксировать полученные срезы. В качестве примера, образец ткани можно заливать и обрабатывать в парафине посредством стандартных способов. См., например, «Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology», выше. Примеры парафина, который можно использовать, включают, но не ограничиваясь этим, Paraplast, Broloid и Tissuemay. Когда образец ткани залит, образец можно нарезать с помощью микротома или тому подобного. См., например, «Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology», выше. В качестве примера этой процедуры, срезы могут находиться в диапазоне от приблизительно трех микрометров до приблизительно пяти микрометров в толщину. Когда нарезаны, срезы можно прикреплять предметным стеклам несколькими стандартными способами. Примеры клея для предметных стекол включают, но не ограничиваясь этим, силан, желатин, поли-L-лизин и т.п. В качестве примера, погруженные в парафин срезы можно прикреплять к положительно заряженным предметным стеклам и/или предметным стеклам, покрытым поли-L-лизином.
Депарафинизация образцов
[0071] Если парафин использовали в качестве заливочного материала, тканевые срезы в целом депарафинизируют и регидратируют с использованием воды. В некоторых вариантах осуществления ткань депарафинизируют перед ИГХ.
[0072] При депарафинизации удаляют основную массу парафина из погруженного в парафин образца. Известно множество способов депарафинизации, и в настоящем изобретении можно использовать любой подходящий способ. В предпочтительном способе по изобретению используют промывание органическим растворителем для того, чтобы растворять парафин. Такие растворители способы эффективно удалять парафин из образца ткани, не оказывая нежелательного влияния на лиганды в ткани. Подходящие растворители можно выбирать из образцовых растворителей, таких как бензол, толуол, этилбензол, ксилолы и их смеси. Ксилол представляет собой предпочтительный растворитель для использования в способах по изобретению. Растворители по отдельности или в комбинации в способах по изобретению предпочтительно имеют высокую степень чистоты, обычно больше приблизительно 99%.
[0073] Парафин обычно удаляют посредством промывания органическим растворителем при энергичном перемешивании, после чего следует центрифугирование. Образцы центрифугируют на скорости, достаточной для того, чтобы вызывать осаждение ткани в пробирке, обычно на от приблизительно 10000 до приблизительно 20000 ×g. После центрифугирования, супернатант из органического растворителя выбрасывают. Специалист в области гистологии примет во внимание, что необходимый объем используемого органического растворителя и число промываний будет зависеть от размера образца и количества парафина, подлежащего удалению. Чем больше количество парафина подлежит удалению, тем больше промываний будет необходимо. Обычно образец промывают от 1 до приблизительно 10 раз и предпочтительно от приблизительно двух и до приблизительно четырех раз. Обычный объем органического растворителя составляет приблизительно 500 мкл для 10 мкм образца ткани.
[0074] Другие способы депарафинизации, известные специалисту в данной области, также можно использовать в способах по изобретению, в том числе, например, прямое плавление.
[0075] В дополнительных вариантах осуществления можно использовать цитрусовые алифатические углеводороды (например, на основе D-лимонена), в том числе другие образцовые проприетарные составы, используемые для депарафинизации (например, HEMO-DE® (PMP Medical Industries, Inc., Irving, TX); CLEAR-RITE® (Microm International; Walldorf, Germany); EZ-DEWAX™ (BioGenex, San Ramon, CA)), например. EZ-DEWAX™ известен в качестве средства для депарафинизации и регидратации.
[0076] Тканевые срезы можно депарафинизировать несколькими стандартными способами. Например, можно использовать ксилолы и постепенно снижающийся ряд спиртов. См., например, «Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology», выше. Альтернативно, можно использовать коммерчески доступные депарафинизирующие неорганические средства, такие как Hemo-De® (CMS, Houston, Texas).
Регидратация
[0077] После депарафинизации образцы можно регидратировать. Предпочтительный способ регидратации представляет собой ступенчатое промывание водными растворами низших спиртов понижающейся концентрации. Этанол представляет собой предпочтительный низший спирт для регидратации. Другие спирты также могут быть пригодны для использования в изобретении, в том числе метанол, изопропанол и другие схожие спирты в диапазоне C1-C5. Образец альтернативно энергично смешивают со спиртовыми растворами и центрифугируют. В предпочтительном варианте осуществления диапазон концентраций спирта снижают ступенчато от приблизительно 100% до приблизительно 70% в воде за от приблизительно трех до пяти дифференциальных стадий, где изменение концентрации раствора на каждой стадии обычно составляет меньше приблизительно 10% (например, образцовая последовательность: 100%, 95%, 90%, 80%, 70%). В некоторых вариантах осуществления депарафинизацию и регидратацию осуществляют одновременно с использованием реактива, такого как EZ-DEWAX™ (BioGenex, San Ramon, CA), например.
Предварительная обработка
[0078] В некоторых вариантах осуществления изобретения, образцы можно предварительно обрабатывать, например, для того, чтобы содействовать непосредственно или опосредованно способам по изобретению. В некоторых вариантах осуществления предварительная обработка ткани повышает доступность целевого анализируемого вещества для связывания антителом. Можно использовать предварительную обработку для того, чтобы делать мишени доступными (индуцированное теплом извлечение эпитопов или опосредованное протеолитическими ферментами). Цитратные буферы, основание Tris и EDTA base можно использовать в качестве образцовых реактивов, индуцируемых теплом. Также в определенных аспектах изобретения можно использовать пепсин, протеиназу K, трипсин, протеазу и все подтипы, например, при использовании многих доступных проприетарных составов.
B. Целевые анализируемые вещества
[0079] Композиции и способы по изобретению используют для того, чтобы обнаруживать одно или несколько целевых анализируемых веществ в образце ткани.
[0080] Под «целевым анализируемым веществом» или «анализируемым веществом» или «мишенью» или грамматическими эквивалентами в настоящем описании понимают какую-либо молекулу, соединение или частицу, подлежащие обнаружению.
[0081] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой биологический маркер для диагностирования недифференцированного новообразования/неизвестных первичных опухолей, такой как эпителиальные маркеры (цитокератины и EMA), миоэпителиальные маркеры (p63, S100, кальпонин, SMA, SMMH-1, CK14, маспин), мезенхимальные маркеры (виментин, SMA, MSA, десмин, MyoD1, миогенин, NF, S100, P63, CD10, кальпонин, миоглобин, MDM2, CDK4, FLI-1, CD117, DOG1, CD31, CD34, фактор XIIIa, CD99), меланоцитарные маркеры (S100, HMB-45, MART-1, тирозиназа, MiTF), мезотелиальные маркеры (кальретинин, CK5/6, WT1, D2-40, HBME-1, мезотелин, тромбомодулин), нейроэндокринные маркеры (хромогранин, синаптофизин, CD56, PGP9.5, NSE, инсулин, PTH, кальцитонин, тироглобулин, пролактин), опухолевые маркеры половых клеток (PLAP, OCT4, CD117 или c-kit, SALL4, CD30, альфа-фетопротеин, бета-hCG, глипикан-3, ингибин-альфа, кальретинин, EMA, CAM5.2), маркеры B-клеток (CD79a и PAX5) и гематопоэтические маркеры (CD1a, CD2, CD3, CD5, CD10, CD38, CD21, CD35, CD15, CD30, CD79a, CD43, CD138, CD68, Bcl-2, Bcl-6, циклин D1, MUM1, S100, MPO).
[0082] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой биологический маркер для идентификации источника опухоли, такого как кальцитонин и CEA для медуллярная карцинома щитовидной железы; инсулин, глюкагон и соматостатин для эндокринных новообразований поджелудочной железы; CK20 для карциномы из клеток Меркеля; HMB-45, MART-1 и SMA для ангиомиолипомы; S100, HMB-45, MART-1, SOX10 и виментин для меланомы; CD117 и DOG-1 для стромальных опухолей ЖКТ и вне ЖКТ; CD5 и p63 для карциномы тимуса; CK20, CDX-2, бета-катенин и виллин для карциномы толстой кишки; андрогенные рецепторы и GCDFP-15 для карциномы слюнных протоков; GCDFP-15, ER, PR, маммаглобин для карциномы груди; TTF1, напсин A и сурфактант A для аденокарциномы легких; TTF1, тироглобулин, PAX8 для папиллярной и фолликулярной карциномы щитовидной железы; CD1a и S100 для гистиоцитоза из клеток лангерганса; PSA, PSAP и P504S для аденокарциномы простаты; CK, EMA, S100 для хордомы; P504S/KIM-1/RCCMa для папиллярной RCC; RCCMa, KIM-1, PAX8, pVHL для светлоклеточной RCC; MIB1 (Ki-67) для гиалинизирующей трабекулярной аденомы щитовидной железы; OCT4/CD117/PLAP/D2-40 для семиномы; CK, десмин для десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли (DPSRCT); глипикан-3, Hep Par1 для гепатоцеллюлярной карциномы; альфа-фетопротеин/глипикан-3/PLAP/SALL4 для карциномы желточного мешка; OCT4/CD30/SOX2/SALL4/PLAP для эмбриональной карциномы; DM2, CDK4 для жировой ткани/липосаркомы; миогенин, десмин, myoD1 для рабдомиосаркомы; SAM, MSA, десмин для лейомиосаркомы/гладкомышечной опухоли; p16, HPV in situ для цервикальной и эндоцервикальной карциномы; ER, WT1, PAX8 для серозной карциномы яичника; CD10, ER для эндометриальной стромальной саркомы; маспин, VHL для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDA); CD2, CD3 для T-клеток; CD20, PAX5, CD69a для B-клеток; CD43, CD34, CD33, MPO для миелоидных клеток; CD117, триптаза для тучных клеток; и CD21, CD35 для фолликулярных дендритных клеток.
[0083] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой биологический маркер для детализированной классификации внутри категории заболеваний, такой как CD3, CD20, CD79a, PAX5, CD45rb, CD15, CD30, ALK-1, CD138, CD56, иммуноглобулины, HHV8, EMA, TdT, CD34, CD117 и MPO для лимфом/лейкозов.
[0084] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой биологический маркер для дополняющего диагноза, такие как ER, PR, HER2, EGFR и CD117 (c-kit).
[0085] В некоторых вариантах осуществления мишень содержит белок, углевод, липид и/или нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит белок и/или его характеристическую часть, такую как опухолевый маркер, интегрин, рецептор клеточной поверхности, трансмембранный белок, внутриклеточный белок, ионный канал, мембранный транспортный белок, фермент, антитело, химерный белок, гликопротеин и т.д. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит углевод и/или его характеристическую часть, такую как гликопротеин, сахар (например, моносахарид, дисахарид, полисахарид), гликокаликс (т.е. богатую углеводами периферическую зону внешней поверхности большинства эукариотических клеток) и т.д. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит липид и/или его характеристическую часть, такую как масло, жирная кислота, глицерид, гормон, стероид (например, холестерин, желчная кислота), витамин (например витамин E), фосфолипид, сфинголипид, липопротеин и т. д.
[0086] В данной области известно множество маркеров. Типичные маркеры включают белки клеточной поверхности, например, рецепторы. Образцовые рецепторы включают, но не ограничиваясь этим, рецептор трансферрина; LDL рецептор; рецепторы факторов роста, такие как члены семейства рецепторов эпидермального фактора роста (например, EGFR, Her2, Her3, Her4) или рецепторы фактора роста эндотелия сосудов, рецепторы цитокинов, молекулы клеточной адгезии, интегрины, селектины и молекулы CD. Маркер может представлять собой молекулу, которая присутствует исключительно или в более высоких количествах на злокачественной клетке, например, опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления маркер или целевое анализируемое вещество присутствует в более высоком количестве, чем маркер или целевое анализируемое вещество в контроле.
[0087] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество выбирают из: биологического маркера для диагностирования недифференцированного новообразования и/или неизвестных первичных опухолей, выбранного из эпителиальных маркеров (цитокератины и EMA), миоэпителиальных маркеров (p63, S100, кальпонина, SMA, SMMH-1, CK14, маспина), мезенхимальных маркеров (виментин, SMA, MSA, десмин, MyoD1, миогенин, NF, S100, P63, CD10, кальпонин, миоглобин, MDM2, CDK4, FLI-1, CD117, DOG1, CD31, CD34, фактор XIIIa, CD99), меланоцитарных маркеров (S100, HMB-45, MART-1, ТИРОЗИНАЗА, MiTF), мезотелиальных маркеров (кальретинин, CK5/6, WT1, D2-40, HEME-1, мезотелин, тромбомодулин), нейроэндокринных маркеров (хромогранин, синаптофизин, CD56, PGP9.5, NSE, инсулин, PTH, кальцитонин, тироглобулин, пролактин), опухолевых маркеров половых клеток (PLAP, OCT4, CD117 или c-kit, SALL4, CD30, альфафетопротеин, бета-hCG, глипикан-3, ингибин-альфа, кальретинин, EMA, CAM5.2) и гематопоэтических маркеров (CD1a, CD2, CD3, CD5, CD10, CD38, CD21, CD35, CD15, CD30, CD79a, CD43, CD138, CD68, Bcl-2, Bcl-6, циклин D1, MUMI, S100, MPO); биологического маркера для идентификации источника опухоли, выбранного из: кальцитонина и CEA для медуллярной карциномы щитовидной железы; инсулина, глюкагона и соматостатина для эндокринных новообразований поджелудочной железы; CK20 для карциномы из клеток Меркеля; HMB-4S, MART-1 и SMA для ангиомиолипомы; S100, HMB-45, MART-1, SOX10 и виментина для меланомы; CD117 и DOG-1 для стромальных опухолей ЖКТ и вне ЖКТ; CD5 и p63 для карциномы тимуса; CK20, CDX-2, бета-катенина и виллина для карциномы толстой кишки; андрогенного рецептора и GCDFP-15 для карциномы слюнных протоков; GCDFP-15, ER, PR, маммаглобина для карциномы груди; TTF1, напсина A и сурфактанта A для аденокарциномы легких; TTF1, тироглобулина, PAX8 для папиллярной и фолликулярной карциномы щитовидной железы; CD1a и S100 для гистиоцитоза из клеток лангерганса; PSA, PSAP и P504S для аденокарциномы простаты; CK, EMA, S100 для хордомы; P504S/KIM-1/RCCMa для папиллярной RCC; RCCMa, KIM-1, PAX8, pVHL для светлоклеточной RCC; MIBI (Ki-67) для гиалинизирующей трабекулярной аденомы щитовидной железы; OCT4/CD117/PLAP/D2-40 для семиномы; CK, десмина для десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли (DPSRCT); глипикана-3, Hep Parl для гепатоцеллюлярной карциномы; альфа-фетопротеина/глипикана-3/PLAP/SALL4 для карциномы желточного мешка; OCT4/CD30/SOX2/SALL4/PLAP для эмбриональной карциномы; DM2, CDK4 для жировой ткани/липосаркомы; миогенина, десмина, myoDI для рабдомиосаркомы; SAM, MSA, десмина для лейомиосаркомы/гладкомышечной опухоли; p16, HPV in situ для цервикальной и эндоцервикальной карциномы; ER, WT1, PAX8 для серозной карциномы яичника; CD10, ER для эндометриальной стромальной саркомы; маспина, VHL для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDA); CD2, CD3 для T-клеток; CD20, PAX5, CD69a для B-клеток; CD43, CD34, CD33, MPO для миелоидных клеток; CD117, триптазы для тучных клеток; или CD21, CD35 для фолликулярных дендритных клеток; биологического маркера для детальной классификации в пределах категории заболеваний, выбранного из CD3, CD20, CD79a, PAX5, CD45rb, CD15, CD30, ALK-1, CD138, CD56, иммуноглобулинов, HHV8, EMA, TdT, CD34, CD117 и MPO; или биологического маркера для дополняющего диагноза, выбранного из ER, PR, HER2, EGFR и CD117 (c-kit).
Опухолевые антигены
[0088] В определенных конкретных вариантах осуществления мишень представляет собой опухолевый маркер. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который присутствует в опухоли, который не присутствует в нормальных органах, тканях и/или клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который связан с опухолью и не связан с нормальными органами, тканями и/или клетками. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который находится на клеточной поверхности опухоли и не находится на клеточной поверхности нормальных органов, тканей и/или клеток. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который больше распространен в опухоли, чем в нормальных органах, тканях и/или клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который более распространенно связан с опухолью, чем с нормальными органами, тканями и/или клетками. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который более распространен в озлокачествленных клетках злокачественной опухоли, чем в нормальных клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер представляет собой антиген, который более распространенно связан с озлокачествленными клетками злокачественной опухоли, чем с нормальными клетками. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер присутствует на более высоком уровне, чем опухолевый маркер, который находят в контроле. В некоторых вариантах осуществления опухолевый маркер присутствует на более высоком уровне, чем опухолевый маркер, который находят на не злокачественной ткани.
[0089] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество содержит опухолевый антиген.
[0090] Под «опухолевым антигеном» в настоящем описании понимают антигенное вещество, продуцируемое в опухолевых клетках, т.е. оно запускает иммунный ответ у хозяина. Нормальные белки в организме не являются антигенными по причине аутотолератности, процесса, в котором аутореактивные цитотоксические T-лимфоциты (CTL) и B-лимфоциты, продуцирующие аутоантитела, отбраковываются «централизованно» в первичной лимфатической ткани (BM) и «на периферии» во вторичной лимфатической ткани (главным образом, в тимусе для T-клеток и селезенке/лимфатических узлах для B-клеток). Таким образом какой-либо белок, котонный не представлен иммунной системе, запускает иммунный ответ. Это может включать нормальные белки, которые хорошо изолированы от иммунной системы, белки, которые обычно продуцируются в чрезвычайно малых количествах, белки, которые обычно продуцируются только на определенных этапах развития, или белки, структура которых модифицирована из-за мутации.
[0091] В некоторых вариантах осуществления мишень предпочтительно экспрессируют опухолевые ткани и/или клетки по сравнению с нормальными тканями и/или клетками. В некоторых вариантах осуществления опухолевая ткань экспрессирует мишень на более высоком уровне, чем нормальная ткань. В некоторых вариантах осуществления мишень экспрессирована на более высоком уровне, чем контроль.
[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения, маркер представляет собой опухолевый маркер. Маркер может представлять собой полипептид, который делящиеся клетки экспрессируют на более высоком уровне, чем неделящиеся клетки. Например, Her-2/neu (также известный как ErbB-2) является членом семейства рецепторов EGF и экспрессирован на клеточной поверхности опухолей, ассоциированных со злокачественной опухолью молочной железы. Другим примером является пептид, известный как F3, который представляет собой подходящий агент нацеленного воздействия для того, чтобы направлять наночастицы в нуклеолин. См. Porkka et al., Proc Natl Acad Sci, 99:7444 (2002); и Christian et al., J Cell Biol, 163:871 (2003). Показано, что направленные частицы, которые содержат наночастицу и аптамер A10 (который специфически связывается с PSMA), способны специфично и эффективно доставлять доцетаксел в злокачественную опухоль предстательной железы.
[0093] Антитела или другие лекарственные средства, которые направлены на эти опухолевые мишени, специфично вмешиваются и регулируют пути передачи сигнала биологического поведения опухолевых клеток, непосредственно регулируют или блокируют путь передачи сигнала для того, чтобы ингибировать рост опухолевых клеток или индуцировать апоптоз. На сегодняшний день одобрены дюжины направленных лекарственных средств для клинических исследований и лечения солидных опухолей или гематологических злокачественных новообразований, и существует множество направленных лекарственных средств для гематологических злокачественных новообразований.
[0094] В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген (или опухолевую мишень) выбирают из группы, состоящей из: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79 и CD137.
[0095] В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген (или опухолевую мишень) выбирают из группы, состоящей из: 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, ангиопоэтина 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, эмбрионального опухолевого антигена, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, фибронектина, фолатного рецептора, ганглиозида GM3, GD2, индуцируемого глюкокортикоидами рецептора фактора некроза опухоли (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, интегрина αν, интегрина ανβ, KIR, LAG-3, Y антигена Льюиса, мезотелина, c-MET, MN карбоангидразы IX, MUC1, MUC16, нектин-4, NKGD2, NOTCH,OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, синдекана-1, TACI, TAG-72, тенасцина, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 и их вариантов. Варианты опухолевого антигена охватывают различных мутантов или полиморфизмы, известные в данной области и/или встречающиеся в природе.
[0096] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество экспрессируется на низком уровне. В некоторых вариантах осуществления число копий целевого анализируемого вещества составляет от приблизительно 1×103 до 1×104 на клетку, например, ROR1 и ROR2. См. S. Baskar et al., Unique cell surface expression of receptor tyrosine kinase ROR1 in human B-cell chronic lymphocytic leukemia, Clin Cancer Res 2008:14(2) 396, V. Walkamm et al., Live Imaging of Xwnt5A-ROR2 complexes, PLOS one 2014, том 9 (10) 1-9.
C. Конъюгаты полимерного фермента/антитела
[0097] В другом аспекте настоящее изобретение относится к конъюгатам полимерного фермента/антитела, в которых антитело способно специфично связываться с целевым анализируемым веществом.
Антитела
[0098] В целом, конъюгаты содержат антитело или его функциональный фрагмент.
[0099] Под «иммуноглобулином» или «антителом» в настоящем описании понимают полноразмерную (т.е. встречающуюся в природе или сформированную посредством нормальных процессов рекомбинации фрагментов генов иммуноглобулинов) молекулу иммуноглобулина (например, антитело IgG) или иммунологически активную (т.е. специфично связывающую) часть молекулы иммуноглобулина, такую как фрагмент антитела. Антитело или фрагмент антитела можно конъюгировать или иным образом получать производные в пределах объема заявленного объекта изобретения. Такие антитела включают IgG1, IgG2a, IgG3, IgG4 (и подвиды IgG4), а также изотипы IgA.
[0100] Термин «антитело» в настоящем описании используют в самом широком смысле, который охватывает различные структуры антител, включая в качестве неограничивающих примеров моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную антигенсвязывающую активность и содержат Fc-область или участок, эквивалентный Fc-области иммуноглобулина. Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения антитела, которое обладает структурой, по существу схожей со структурой нативного антитела или имеющей тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в настоящем описании.
[0101] Под «нативным антителом» в настоящем описании понимают встречающиеся в природе молекулы иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно в 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидной связью. От N- к C-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, после чего следует три константных домена (CH1, CH2 и CH3), также называемых константной областью тяжелой цепи. Аналогичным образом, от N- к C-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, после чего следует константный легкий (CL) домен, также называемый константной областью легкой цепи. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.
[0102] Под «фрагментом антитела» в настоящем описании понимают молекулу, отличную от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваясь этим, Fv, Fab, Fabʹ, Fabʹ-SH, F(abʹ)2, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv), однодоменные антитела и полиспецифические антитела, формируемые из фрагментов антител. Обзор определенных фрагментов антител см. в Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Обзор фрагментов scFv см., например, в Pliickthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, под редакцией Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, стр. 269-315 (1994); также см. WO 93/16185; и патенты США №№ 5571894 и 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(abʹ)2, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора спасения и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, см. патент США № 5869046. Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя участками связывания антигена, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. См., например, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med, 9, 129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci, 90, 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al., Nat Med, 9, 129-134 (2003). Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, которые содержат весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент США № 6248516 B l). Фрагменты антител можно выполнять с помощью различных способов, включая в качестве неограничивающих примеров протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение посредством рекомбинантных клеток-хозяев (например, E. coli или фаг), как описано в настоящем описании.
[0103] Под «антигенсвязывающим доменом» в настоящем описании понимают часть антитела, которая содержит область, которая специфически связывается с антигеном и является комплементарной части или всему антигену. Антигенсвязывающий домен можно предоставлять с помощью, например, одного или нескольких вариабельных доменов антител (также называемых вариабельными областями антител). В частности, антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела.
[0104] Под «вариабельной областью» или «вариабельным доменом» в настоящем описании понимают домен тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела в целом имеют схожие структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). См., например, Kindt et al., Kuby Immunology, 6-е издание, W.H. Freeman and Co., стр. 91 (2007). Одного VH или VL домена может быть достаточно для того, чтобы обеспечить антигенсвязывающую специфичность.
[0105] Под «гипервариабельной областью» или «HVR» в настоящем описании понимают каждый из участков вариабельного домена антитела, который имеет гипервариабельную последовательность и/или образует структурно определенные петли, «гипервариабельные петли». В целом, нативные четырехцепные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR в целом содержит аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из определяющих комплементарность областей (CDR), последние обладают наивысшей вариабельностью последовательностей и/или участвуют в распознавании антигена. За исключением CDR1 в VH, CDR в целом содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. Гипервариабельные области (HVR) также обозначают как «определяющие комплементарность области» (CDR) и эти термины используют в настоящем описании взаимозаменяемо по отношению к частям вариабельной области, которая формирует антигенсвязывающие области. Этот конкретный участок описан у Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) и у Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), где определения включают перекрытия или поднаборы аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, применение любого определения, чтобы указать на CDR антитела или его варианты, предусмотрено в пределах объема термина, как определено и используют в настоящем описании. Точные номера остатков, которые охватывают конкретную CDR, будут варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области могут обычным образом определять, какие остатки содержат конкретный CDR с учетом аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
[0106] Антитело по настоящему изобретению может представлять собой химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека или слитный белок антитела.
[0107] Под «химерным антителом» в настоящем описании понимают рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей антитела, в том числе определяющие комплементарность области (CDR) антитела, полученные из одной частицы, предпочтительно антитела грызуна, более предпочтительно мышиного антитела, тогда как константные домены молекулы антитела получают из антитела человека. Для ветеринарного применения константные домены химерного антитела можно извлекать из таковых от других видов, таких как человекообразная обезьяна, кошка или собака.
[0108] Под «гуманизированным антителом» в настоящем описании понимают рекомбинантный белок, в котором CDR из антитела от одного вида, например, из антитела грызуна, переносят из тяжелых и легких вариабельных цепей антитела грызуна в тяжелые и легкие вариабельные домены человека. Константные домены молекулы антитела получают из антитела человека. В некоторых вариантах осуществления конкретные остатки каркасной области гуманизированного антитела, в частности, те, которые касаются последовательностей CDR или близки к ним, можно модифицировать, например, заменять на соответствующие остатки от исходного грызуна, человекообразной обезьяны или другого антитела.
[0109] Под «антителом человека» в настоящем описании понимают антитело, полученное, например, от трансгенных мышей, которые «сконструированы» для того, чтобы продуцировать конкретные антитела человека в ответ на антигенный стимул. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепи человека вводят в линии мышей, которые получены от линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые нарушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфичные к антигенам человека, и мышей можно использовать для того, чтобы получать гибридомы, секретирующие антитело человека. Способы получения антитела человека от трансгенных мышей описаны у Green et al., Nature Genet 7: 13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) и Taylor et al., Int Immun. 6:579 (1994). Антитело полностью человека также можно сконструировать с помощью генетических способов или способов хромосомной трансфекции, а также технологии фагового дисплея, все они известны в данной области. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) для получения антител человека и их фрагментов in vitro, из репертуаров генов вариабельных доменов иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров. В этом способе гены вариабельных доменов антител клонируют с сохранением рамки считывания в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага и представляют в виде функциональных фрагментов антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома, отбора на основании функциональных свойств антитела также ведет к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах, их обзор см., например, в Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Антитела человека также можно создавать с помощью B-клеток, активированных in vitro. См. патенты США №№ 5567610 и 5229275, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
[0110] Под «слитным белком антитела» в настоящем описании понимают рекомбинантно получаемую антигенсвязывающую молекулу, в которой соединены два или более одинаковых или различных природных антитела, одноцепочечных антитела или сегмента фрагментов антител с одинаковыми или различными специфичностями. Слитный белок содержит по меньшей мере один специфичный сайт связывания. Валентность слитного белка показывает общее число связывающий плеч или сайтов, которые слитный белок имеет для антигена(антигенов) или эпитопа(эпитопов); т.е. одновалентный, двухвалентный, трехвалентный или поливалентный. Поливалентность слитного белка антитела обозначает, что он может иметь преимущество множества взаимодействий при связывании с антигеном, таким образом увеличивая авидность связывания с антигеном или с различными антигенами. Специфичность показывает, сколько различных типов антигена или эпитопа слитный белок антитела способен связать; т.е. моноспецифический, биспецифический, триспецифический, полиспецифический. Используя эти определения, природное антитело, например, IgG, является двухвалентным, поскольку оно имеет два связывающих плеча, но является моноспецифическим, поскольку оно связывается с одним типом антигена или эпитопа. Моноспецифический поливалентный слитный белок имеет больше чем один сайт связывания для одного и того же антигена или эпитопа. Например, моноспецифическое диатело представляет собой слитный белок с двумя сайтами связывания, реактивными в отношении одного и того же антигена. Слитный белок может содержать поливалентную или полиспецифическую комбинацию различных компонентов антител или множество копий одного и того же антительного компонента. Слитный белок дополнительно может содержать терапевтическое средство.
[0111] В некоторых вариантах осуществления антитело выбирают на основании его специфичности к антигену, экспрессируемому на клетке-мишени или сайте-мишени, представляющих интерес, в образце ткани. Идентифицирован широкий спектр опухолеспецифичных антигенов или других антигенов, специфичных для определенных заболеваний, и антитела к этим антигенам использованы и предложены для использования в лечении таких опухолей или других заболеваний. Антитела, которые известны в данной области, можно использовать в соединениях по изобретению, в частности, для лечения заболевания, с которым ассоциирован целевой антиген. Примеры целевых антигенов (и ассоциированных с ними заболеваний), на которые можно направлять конъюгат антитело-линкер-лекарственное средство по изобретению, включают: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79, CD137, 4-1BB, 5T4,AGS-5,AGS-16, ангиопоэтин 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, эмбриональный опухолевый антиген, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, фибронектин, фолатный рецептор, ганглиозид GM3, GD2, индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухоли (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, интегрин αν, интегрин ανβ, KIR, LAG-3, Y Льюиса, мезотелин, c-MET, MN карбоангидразу IX, MUC1, MUC16, нектин-4, NKGD2, NOTCH,OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, синдекан-1, TACI, TAG-72, тенасцин, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3.
[0112] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело к ROR2, к Ck8/18, к Ki-67, к Ck5, к Mart-1, к S100 или к CD45.
[0113] В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит Fab, Fabʹ, F(abʹ)2, однодоменное антитело, димер T и Abs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, линейное антитело, миниантитело, диатело, фрагмент биспецифического антитела, битело, тритело, одноцепочечное диател, каппа-тело (лямбда-тело), BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART или аналог антитела, который содержит одну или несколько CDR.
[0114] В некоторых вариантах осуществления конъюгаты содержат первичное антитело.
[0115] Под «первичным антителом» в настоящем описании понимают антитело, которое специфично связывается с целевым белковым антигеном в образце ткани. Первичное антитело в целом представляет собой первое антитело, используемое в иммуногистохимической (ИГХ) процедуре. В некоторых вариантах осуществления первичное антитело представляет собой только антитело, используемое в ИГХ процедуре.
[0116] В некоторых вариантах осуществления конъюгаты содержат вторичное антитело.
[0117] Под «вторичным антителом» в настоящем описании понимают антитело, которое специфично связывается с первичным антителом, тем самым формируя мостик между первичным антителом и последующим реактивом, если уместно. Вторичное антитело в целом представляет собой второе антитело, используемое в иммуногистохимической процедуре.
[0118] В некоторых вариантах осуществления антитело распознает целевое анализируемое вещество через прямое связывание. В некоторых вариантах осуществления антитело распознает целевое анализируемое вещество через непрямое связывание. В некоторых вариантах осуществления антитело специфично связывается с целевым анализируемым веществом через прямое связывание. В некоторых вариантах осуществления антитело специфично связывается с целевым анализируемым веществом через непрямое связывание.
[0119] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антитела составляет приблизительно от 10-7 до 10-13 (Kd).
Ферменты
[0120] В целом, конъюгат антитела содержит множество молекул ферментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит множество молекул ферментов, где множество молекул ферментов содержит фермент одного и того же типа (например, все молекулы ферментов в конъюгате антитела представляют собой пероксидазу хрена).
[0121] Фермент в целом катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерять с использованием различных способов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерять спектрофотометрически. Альтернативно, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Хемилюминесцентный субстрат становится электронно возбужденным посредством химической реакции и затем может испускать свет, который можно измерять (с использованием, например, хемилюминометра), или передавать энергию флуоресцентному акцептору. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза; патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов (например, глюкозооксидаза, оксидаза галактозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы получения конъюгатов ферментов и антител описаны у Oʹ Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, в Methods in Enzym (под редакцией J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Примеры комбинаций фермент-субстрат включают, например: (i) пероксидаза хрена (HRP) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественник красителя [например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина гидрохлорид (TMB)]; (ii) щелочная фосфатаза (AP) с п-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и (iii) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидаза) или флуорогенным субстратом (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидаза).
[0122] В некоторых вариантах осуществления фермент выбирают из группы, состоящей из: бета-D-галактозидазы, глюкозооксидазы, пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы, бета-лактамазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, уреазы, уриказы, супероксиддисмутазы, люциферазы, пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, оксидазы галактозы, ацетилхолинэстеразы, энтерокиназы, тирозиназы и ксантиноксидазы.
Полимерные ферменты
[0123] В целом, конъюгат антитела содержит полимерный фермент, который содержит множество молекул ферментов.
[0124] В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента ковалентно связаны. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через сшивающий реактив. В некоторых вариантах осуществления фермент содержит белковый компонент. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через белковый компонент. В некоторых вариантах осуществления молекула фермента содержит полисахаридный компонент. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через полисахаридный компонент. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через полисахаридный и белковый компонент. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов полимерного фермента связаны нековалентно. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов содержит мультимерный фермент. В некоторых вариантах осуществления множество молекул ферментов содержит агрегат ферментов.
[0125] В целом, процедуру полимеризации осуществляют в условиях, которые делают возможным управляемое и воспроизводимое формирование полимерного фермента предварительно выбранного размера. Концентрация фермента, pH буфера, стехиометрия свободных функциональных групп по отношению к сшивающему реактиву, температура и время реакции являются важными факторами для достижения этого контролируемого процесса.
[0126] В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент содержит от приблизительно 5 до приблизительно 500 молекул ферментов. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 молекул ферментов. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент содержит меньше приблизительно 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 молекул ферментов.
[0127] В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через сшивающий реактив. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны через сшивающий реактив нулевой длины. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны линейным образом. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны разветвленным образом. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны смешанным линейным и разветвленным образом. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны для того, чтобы формировать линейную структуру. В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента ковалентно связаны для того, чтобы формировать глобулярную структуру.
[0128] В некоторых вариантах осуществления популяция полимерных ферментов, содержащая множество полимерных ферментов, содержит распределение размеров полимерных ферментов, которое отличается определенным числом молекул ферментов на полимерный фермент. В некоторых вариантах осуществления популяция полимерных ферментов, содержащая множество полимерных ферментов, содержит распределение геометрических форм полимерных ферментов, которое отличается определенной структурой полимерного фермента.
[0129] В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент имеет молекулярную массу от приблизительно 500 кДа до приблизительно 5 мегадальтонов (МДа). В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 500 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент имеет молекулярную масса меньше чем или приблизительно 5 МДа. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 750 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3 или 4 МДа.
[0130] В некоторых вариантах осуществления полимерные ферменты формируют перед конъюгацией с антителами.
Конъюгаты фермент/антитело
[0131] В целом, фермент конъюгируют с антителом. В некоторых вариантах осуществления больше чем одну молекулу фермента конъюгируют с антителом. В некоторых вариантах осуществления молекулу фермента конъюгируют больше чем с одним антителом. В некоторых вариантах осуществления больше чем одно антитело конъюгируют с молекулой фермента. В некоторых вариантах осуществления больше чем одну молекулу фермента конъюгируют с больше чем одним антителом. В некоторых вариантах осуществления больше чем одно антитело конъюгируют с больше чем одним ферментом.
[0132] Под «конъюгированным» или «прикрепленным» или «связанным» в настоящем описании понимают ковалентное или нековалентное, а также прямое или непрямое объединение связывающего средства (такого как антитело) и полимера (такого как ферментативные полимеры) или молекулы фермента.
[0133] Конъюгаты антител, рассмотренные в настоящем изобретении, включат те, которые используют in vitro, где антитело связывают со вторичным связывающим лигандом и/или с ферментом (ферментативная метка), который будет генерировать контролируемый продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу (хрена) и/или глюкозооксидазу. Предпочтительные вторичные связывающие лиганды представляют собой соединения биотина и/или авидина и стрептавидина. Использование таких меток хорошо известно специалистам в данной области и описано, например, в патентах США №№ 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149; и 4366241; каждый включен в настоящий документ посредством ссылки.
[0134] Молекулы, содержащие азидогруппы, также можно использовать для того, чтобы формировать ковалентные связи с белками через реакционноспособные промежуточные соединения нитренов, которые получают с помощью ультрафиолетового света низкой интенсивности (Potter & Haley, 1983). В частности, 2- и 8-азидо аналоги пуриновых нуклеотидов использовали в качестве сайт-специфических фотозондов для того, чтобы в неочищенных клеточных экстрактах идентифицировать белки, которые связывают нуклеотиды (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- и 8-азидо нуклеотиды также использовали для картирования нуклеотидсвязывающих доменов очищенных белков (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; и Dholakia et al., 1989), и их можно использовать в качестве антителосвязывающих средств.
[0135] В данной области известно несколько способов для прикрепления или конъюгации антитела с его конъюгатным фрагментом. Некоторые способы прикрепления включают использование металло-хелатного комплекса с использованием, например, органического хелатирующего средства, такого как ангидрид диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусная кислота; N-хлор-п-толуолсульфонамид; и/или тетрахлор-3α-6α-дифенилгликоурил-3, прикрепленный к антителу (патенты США №№ 4472509 и 4938948, каждый включен в настоящий документ посредством ссылки). Моноклональные антитела также могут вступать в реакцию с ферментом в присутствии связывающего средства, такого как глутаральдегид или перйодат. Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии этих связывающих средств или посредством реакции с изотиоцианатом. В патенте США № 4938948 визуализации опухолей молочной железы достигают, например, с использованием моноклональных антител, и поддающиеся обнаружению визуализирующие фрагменты связывают с антителом с использованием линкеров, таких как метил-п-гидроксибензимидат или N-сукцинимидил-3-(4-гидроксифенил)пропионат.
[0136] В других вариантах осуществления предусмотрено получение производных иммуноглобулинов посредством избирательного введения сульфгидрильных групп в Fc-область иммуноглобулина с использованием условий реакции, которые не изменяют антигенсвязывающий участок антитела. Раскрыто, что конъюгаты антител, получаемые в соответствии с этим способом, проявляют усовершенствованную живучесть, специфичность и чувствительность (патент США № 5196066, включен в настоящее описание посредством ссылки). Сайт-специфическое прикрепление эффекторных или репортерных молекул, в где репортерную или эффектоную молекулу конъюгируют с углеводным остатком в Fc-области, также раскрыто в литературе (OʹShannessy et al., 1987).
Конъюгаты полимерного фермента/антитела
[0137] В целом, полимерный фермент, который содержит множество молекул ферментов, конъюгируют с антителом. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты полимерного фермента/антитела получают в соответствии с такими способами, как раскрыто в патенте США № 4657853, который включен по ссылке в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления способ включает последовательные стадии: (a) ковалентное связывание по меньшей мере двух молекул ферментов для получения полимерного фермента; и (b) ковалентное связывание полимерного фермента с антителом или его фрагментом.
[0138] В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют со специфичным сайтом на антителе или его фрагменте. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют с одним или несколькими специфичными сайтами на антителе или его фрагменте. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют со случайным сайтом на антителе или его фрагменте. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют с одним или несколькими случайными сайтами на антителе или его фрагменте. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют с антителом или его фрагментом через свойственную или экзогенную химическую характеристику аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент конъюгируют с антителом или его фрагментом через свойственную или экзогенную химическую характеристику аминокислотного остатка.
[0139] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит один или несколько полимерных ферментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10, 15 или 20 полимерных ферментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит между 1 и 20 полимерными ферментами.
[0140] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит от приблизительно 6 до приблизительно 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 или больше молекулами ферментов на конъюгат.
[0141] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит по меньшей мере от 6 до 24, от 6 до 26, от 6 до 28, от 6 до 30, от 6 до 40, от 6 до 50, от 6 до 60, от 6 до 70, от 6 до 80, от 6 до 90 или от 6 до 100 молекулами ферментов на конъюгат.
[0142] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200, но не больше чем 250, 300, 350, 400 или 500 молекул ферментов на конъюгат.
[0143] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет молекулярную массу от приблизительно 400 кДа до приблизительно 500 кДа, 600 кДа, 700 кДа, 800 кДа, 900 кДа, 1000 кДа, 2000 кДа, 3000 кДа, 4000 кДа, 5000 кДа, 6000 кДа, 7000 кДа, 8000 кДа, 9000 кДа или 10000 кДа.
[0144] В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет молекулярную массу от приблизительно 470 кДа до приблизительно 4,7 МДа.
[0145] В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит больше чем одно антитело. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит множество полимерных ферментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит множество полимерных ферментов, в которых каждый из полимерных ферментов содержит приблизительно то же число молекул ферментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит множество полимерных ферментов, в которых множество полимерных ферментов проявляет определенное распределение числа молекул ферментов каждого полимерного фермента. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела содержит множество полимерных ферментов, в которых множество полимерных ферментов проявляет различия в геометрической форме полимерных ферментов.
[0146] В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела имеет соотношение (антитело к ферменту) больше чем 1:8. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела имеет соотношение (антитело к ферменту) больше чем 1:6. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела имеет соотношение (антитело к ферменту) приблизительно 1:6, 1:8, 1:15, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:75, 1:100, 1:125, 1:150, 1:200.
[0147] В некоторых вариантах осуществления число полимерных ферментов, конъюгированных в конъюгате полимерного фермента/антитела, корректируют для того, чтобы сделать возможным повышенное проникновение в ткань и обнаружение целевого анализируемого вещества. В некоторых вариантах осуществления массовое соотношение конъюгата полимерного фермента/антитела корректируют для того, чтобы сделать возможным повышенное проникновение в ткань и обнаружение целевого анализируемого вещества. В некоторых вариантах осуществления число ферментов на полимерный фермент, конъюгированный в конъюгат полимерного фермента/антитела, делает возможным повышенное проникновение в ткань и обнаружение целевого анализируемого вещества. В некоторых вариантах осуществления размер полимерного фермента, конъюгированного в конъюгат полимерного фермента/антитела, делает возможным повышенное проникновение в ткань и обнаружение целевого анализируемого вещества.
[0148] В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела представляет собой конъюгат, как доступно в Novodiax, Inc. (Hayward, CA), №№ по каталогу K29301-1/8, Q31001, Q31002, Q31003, Q31004, Q31005, D28001, D28002, D28003, D28004, D28005 или D28006.
Ферментативный субстрат
[0149] В целом, раствор, содержащий специфичный субстрат фермента, инкубируют с конъюгатом полимерного фермента/антитела для того, чтобы сделать возможным обнаружение. В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий специфичный субстрат фермента, получают из стокового раствора указанного специфичного субстрата фермента.
[0150] В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий специфичный субстрат фермента, и/или стоковый раствор специфичного субстрата фермента, не содержит примесей. В некоторых вариантах осуществления раствор (например, буфер), используемый для того, чтобы получать раствор, содержащий специфичный субстрат фермента, и/или стоковый раствор специфичного субстрата фермента, не содержит примесей. В некоторых вариантах осуществления примеси будут ингибировать каталитическую реакцию фермента.
[0151] В некоторых вариантах осуществления специфичный субстрат фермента является по существу чистым. В некоторых вариантах осуществления чистота специфичного субстрата фермента составляет 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 99,9% чистоты.
[0152] В некоторых вариантах осуществления раствор, который содержит специфичный субстрат фермента, получают непосредственно перед инкубацией с конъюгатом полимерного фермента/антитела.
[0153] В некоторых вариантах осуществления молекулы ферментов полимерного фермента катализируют субстрат больше чем одного типа.
[0154] В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой пероксидазу хрена, а субстрат представляет собой DAB (3,3ʹ-диаминобензидинхромоген). В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой пероксидазу хрена и субстрат представляет собой AEC (3-амино-9-этилкарбазол). В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой пероксидазу хрена и субстрат представляет собой AMEC Red. В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой пероксидазу хрена и субстрат представляет собой TMB (3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидин). В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой щелочную фосфатазу и субстрат представляет собой Fast Red (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой щелочную фосфатазу и субстрат представляет собой BCIP/NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий).
E. Способы иммунообнаружения
[0155] Доступно два основных способа ИГХ: непрямой и прямой анализ.
[0156] В типичном непрямом анализе неконъюгированное первичное антитело связывается с антигеном и затем меченное вторичное антитело связывается с первичным антителом. Вторичное антитело конъюгируют с ферментативной меткой, хромогенным или флуорогенным субстратом для того, чтобы сделать возможным визуализацию антигена. Усиление сигнала происходит благодаря тому, что несколько вторичных антител могут вступать в реакцию с различными эпитопами на первичном антителе.
[0157] В типичном прямом анализе связывание антитела с целевым антигеном определяют непосредственно. В этом прямом анализе используют меченый реактив, такой как флуоресцентная метка или меченное ферментом первичное антитело, которые можно визуализировать без дополнительного взаимодействия с антителом.
Прямой анализ
[0158] В одном из аспектов, настоящее изобретение относится к композициям и способам для прямого ИГХ анализа. В этом прямом анализе используют конъюгаты полимерного фермента/антитела, которые содержат первичные антитела.
[0159] В некоторых вариантах осуществления прямой анализ используют для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество в ткани. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимерного фермента/антитела используют для непосредственного обнаружения целевого анализируемого вещества в ткани. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ используют для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество в ткани, где способ включает использование конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ используют для того, чтобы определять уровень целевого анализируемого вещества в ткани, где способ включает использование конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ используют для того, чтобы определять присутствие целевого анализируемого вещества в ткани, где способ включает использование конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ используют для того, чтобы определять отсутствие поддающегося обнаружению присутствия целевого анализируемого вещества в ткани, где способ включает использование конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления прямой анализ используют для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество в образце ткани (например, тканевом срезе), предпочтительно FFPE срезе или замороженном тканевом срезе.
[0160] Помимо процедур получения образцов, рассмотренных выше, может быть желательна дополнительная обработка тканевого среза до, во время или после ИГХ. Например, можно осуществлять способы извлечения эпитопов, такие как нагрев образца ткани в цитратном буфере. См., например, Leong et al. Appl Immunohistochem 4(3):201 (1996). После необязательной стадии блокирования, тканевой срез подвергают воздействию первичного антитела (например, конъюгата полимерного фермента/антитела) в течение достаточного периода времени («время инкубации») и при подходящих условиях так, что первичное антитело связывается с целевым белковым антигеном в образце ткани. В некоторых вариантах осуществления ткань инкубируют с первичным конъюгатом полимерного фермента/антитела в течение достаточного периода времени и при подходящих условиях так, что первичный конъюгат полимерного фермента/антитела связывается с целевым белковым антигеном в ткани. В некоторых вариантах осуществления ткань инкубируют с набором первичных конъюгатов полимерного фермента/антитела (например, больше одного), где набор конъюгатов полимерного фермента/антитела содержит по меньшей мере один конъюгат полимерного фермента/антитела с отличающейся специфичностью связывания целевого анализируемого вещества, чем у другого конъюгата полимерного фермента/антитела в наборе, в течение достаточного периода времени и при подходящих условиях так, что первичные конъюгаты полимерного фермента/антитела связываются с целевыми белковыми антигенами в ткани. Подходящие условия для достижения этого можно определять посредством стандартных экспериментов. Степень связывания антитела с образцом определяют с использованием какого-либо одной из поддающихся обнаружению меток, рассмотренных выше. Предпочтительно, метка представляет собой ферментативную метку (например, HRP), которая катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, такого как 3,3ʹ-диаминобензидинхромоген. Более предпочтительно, метка представляет собой полимерный фермент (например, полимерную пероксидазу хрена или полимер пероксидазы хрена), который катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, такого как 3,3ʹ-диаминобензидинхромоген.
[0161] В некоторых вариантах осуществления ИГХ способ, описанный в настоящем описании, осуществляют высокопропускным образом. В некоторых вариантах осуществления ИГХ способ с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, описанного в настоящем описании, осуществляют высокопропускным образом. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ, описанный в настоящем описании, осуществляют высокопропускным образом. В некоторых вариантах осуществления прямой ИГХ способ с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, описанного в настоящем описании, осуществляют высокопропускным образом.
Формирование комплексов целевое анализируемое вещество/антитело
[0162] В целом, образец ткани (например, тканевой срез), содержащий целевое анализируемое вещество, находится в контакте с конъюгатом полимерного фермента/антитела для того, чтобы формировать комплекс, который содержит целевое анализируемое вещество и по меньшей мере один из конъюгатов антител, при температуре инкубации между приблизительно 15°C и приблизительно 50°C в течение периода инкубации между приблизительно 3 минутами и приблизительно 1 часом, и конъюгат антитела представляет собой первичное антитело, которое способно специфично связываться с целевым анализируемым веществом.
[0163] В некоторых вариантах осуществления ткань, которая содержит ряд целевых анализируемых веществ (например, анализируемое вещество A и анализируемое вещество B), находится в контакте с набором конъюгатов полимерного фермента/антитела (например, комплекс полимерный фермент/антитело, который специфично связывается с анализируемым веществом A, и комплекс полимерный фермент/антитело, который специфично связывается с анализируемым веществом B), чтобы формировать ряд комплексов, содержащих целевое анализируемое вещество и по меньшей мере один из конъюгатов антител, при температуре инкубации между приблизительно 15°C и приблизительно 50°C в течение периода инкубации между приблизительно 3 минутами и приблизительно 1 часом, и конъюгаты антител представляют собой первичные антитела, способны специфично связывать соответствующие им целевые анализируемые вещества.
[0164] В некоторых вариантах осуществления ИГХ окрашивание осуществляют с использованием буфера, который содержит фосфат, трис, MOPS, MES, HEPES или бикарбонат, и необязательно буфер содержит один или несколько компонентов, выбранных из: тиомерсала, proclin 300, марганца, кальция, железа, магния, цинка, полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 400 до 40000 Да, этиленгликоля, глицерина, бычьего сывороточного альбумина, сывороточного альбумина лошади, сывороточного альбумина козы, сывороточного альбумина кролика, трегалозы, сахарозы, желатина, Tween 20, Tween 30, декстрансульфата с молекулярной массой от 300 до 30000 Да или DEAE декстрана с молекулярной массой от 500 до 25000 Да. Количество каждого компонента, если он включен, представляет собой количество, обычно используемое в данной области. Оптимизация буферов для увеличения связывания антитела с целевым антигеном, а также способы их использования хорошо известны в данной области.
[0165] В некоторых вариантах осуществления ИГХ окрашивание осуществляют с использованием буфера, такого как буфер PBS или TBS, необязательно с бычьим сывороточным альбумином (BSA) и/или полиэтиленгликолем («PEG»), такими как PEG с молекулярной массой 200 300 400, 600, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 10000, или 20000, предпочтительно PEG 400, 1500 или 6000. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой коммерциализированный буфер из Novodiax, Inc. (Hayward, CA), например, № C30001 в каталоге продукции.
[0166] В некоторых вариантах осуществления температура инкубации составляет от приблизительно 15°C до приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 30°C или от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C.
[0167] В некоторых вариантах осуществления температура инкубации составляет приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0168] В некоторых вариантах осуществления температура инкубации составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0169] В некоторых вариантах осуществления температура инкубации составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0170] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет от приблизительно 3 минут до приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 5 минут до приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 10 минут до приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 15 минут до приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 20 минут до приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 25 минут до приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 30 минут до приблизительно 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0171] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0172] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет менее приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0173] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет более приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
Стадия промывания
[0174] После инкубации образец ткани обычно промывают в буфере для промывания, таком как буфер PBS, TBS, MOPS, MES, HEPES или бикарбонатный буфер, и необязательно содержащем детергент, такой как Tween (например, 0,01-0,2%). Один образцовый буфер представляет собой 10 мМ PBS с 0,05% Tween 20.
[0175] Стадию промывания осуществляют от 2 до 6 раз, предпочтительно 3, 4 или 5 раз, в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 минут или больше на стадию промывания.
[0176] В некоторых вариантах осуществления температура промывания составляет от приблизительно 15°C до приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 30°C или от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C.
[0177] В некоторых вариантах осуществления температура промывания составляет приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0178] В некоторых вариантах осуществления температура промывания составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0179] В некоторых вариантах осуществления температура промывания составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0180] В некоторых вариантах осуществления период промывания составляет от приблизительно 3 минут до приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 5 минут до приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 10 минут до приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 15 минут до приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 20 минут до приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 25 минут до приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минутами или между приблизительно 30 минут до приблизительно 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0181] В некоторых вариантах осуществления период промывания составляет приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0182] В некоторых вариантах осуществления период промывания составляет менее приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0183] В некоторых вариантах осуществления период промывания составляет более приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0184] В некоторых вариантах осуществления стадию промывания осуществляют от 2 до 6 раз, в течение периода в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 минут или больше на стадию промывания, где температура промывания составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0185] В некоторых вариантах осуществления стадию промывания осуществляют от 2 до 6 раз в течение периода приблизительно в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 минут или больше на стадию промывания, где температура промывания составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0186] В некоторых вариантах осуществления число стадий промывания для способа, включающего использование конъюгата полимерного фермента/антитела, уменьшают по сравнению со способом с использованием антитела, конъюгированного с одной молекулой фермента. В некоторых вариантах осуществления длительность стадий промывания для способа, включающего использование конъюгата полимерного фермента/антитела, уменьшают по сравнению со способом с использованием антитела, конъюгированного с одной молекулой фермента. В некоторых вариантах осуществления число стадий промывания и длительность стадий промывания для способа, включающего использование конъюгата полимерного фермента/антитела, уменьшают по сравнению со способом с использованием антитела, конъюгированного с одной молекулой фермента. В некоторых вариантах осуществления строгость раствора для промывания для способа, включающего использование конъюгата полимерного фермента/антитела, больше, чем строгость раствора для промывания, используемого в способе с использованием антитела, конъюгированного с одной молекулой фермента. В некоторых вариантах осуществления строгость раствора для промывания для способа, включающего использование конъюгата полимерного фермента/антитела, меньше, чем строгость раствора для промывания, используемого в способе с использованием антитела, конъюгированного с одной молекулой фермента.
Стадия блокирования
[0187] В некоторых вариантах осуществления процесс ИГХ окрашивания дополнительно включает стадию блокирования перед инкубированием конъюгата антитела с тканью, где указанная стадия блокирования включает приведение в контакт указанной ткани с блокирующим средством.
[0188] В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит снятое молоко, BSA, желатин кожи холодолюбивых рыб, казеин или сыворотку животного.
[0189] В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит буфер, такой как TBS или PBS с BSA.
[0190] В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит буферную систему, выбранную из PBS, TBS, MOPS, MES, HEPES и бикарбоната, необязательно с 0,5-6% бычьего сывороточного альбумина, сывороточного альбумина лошади, сывороточного альбумина козы, сывороточного альбумина кролика или желатина и 0,001-0,05% Tween 20.
[0191] В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% снятого молока.
[0192] В некоторых вариантах осуществления блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% BSA.
[0193] В некоторых вариантах осуществления температура блокирования составляет от приблизительно 15°C до приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 30°C или от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C.
[0194] В некоторых вариантах осуществления температура блокирования составляет приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0195] В некоторых вариантах осуществления температура блокирования составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0196] В некоторых вариантах осуществления температура блокирования составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0197] В некоторых вариантах осуществления период блокирования составляет от приблизительно 3 минут до приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 5 минут до приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от 10 минут до приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 15 минут до приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 20 минут до приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут, от приблизительно 25 минут до приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут или от приблизительно 30 минут до приблизительно 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0198] В некоторых вариантах осуществления период блокирования составляет приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0199] В некоторых вариантах осуществления период блокирования составляет менее приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0200] В некоторых вариантах осуществления период блокирования составляет более приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0201] В некоторых вариантах осуществления стадию блокирования осуществляют 1, 2, 3, 4 или 5 раз.
[0202] В некоторых вариантах осуществления стадию блокирования осуществляют 1, 2 или 3 раза, где блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% или 7% снятого молока и где период блокирования составляет меньше приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0203] В некоторых вариантах осуществления стадию блокирования осуществляют 1, 2 или 3 раза, где блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% или 7% снятого молока и где период блокирования составляет больше приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0204] В некоторых вариантах осуществления стадию блокирования осуществляют 1, 2 или 3 раза, где блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% или 7% BSA и где период блокирования составляет менее приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0205] В некоторых вариантах осуществления стадию блокирования осуществляют 1, 2 или 3 раза, где блокирующее средство содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% или 7% BSA и где период блокирования составляет более приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0206] В некоторых вариантах осуществления ткань также может быть морфологически окрашенной. В некоторых вариантах осуществления ткань можно контрастно окрашивать для того, чтобы сделать возможным идентификацию клетки или клеточного компонента.
[0207] В некоторых вариантах осуществления образец ткани можно контрастно окрашивать гематоксилином и дегидратировать для длительного хранения, используя известные в данной области способы. В некоторых вариантах осуществления образец ткани можно окрашивать ГЭ.
Стадия обнаружения
[0208] После стадии промывания, в образец ткани добавляют средство для обнаружения, содержащее субстрат фермента, например, DAB для HRP или Fast Red для AP.
[0209] В некоторых вариантах осуществления реактив для обнаружения содержит буфер, такой как буфер PBS или TBS, необязательно с BSA и/или полиэтиленгликолем.
[0210] В некоторых вариантах осуществления окрашивание осуществляют с использованием буфера, который содержит фосфат, трис, MOPS, MES, HEPES или бикарбонат и необязательно содержит тиомерсал, proclin 300, марганец, кальций, железо, магний, цинк, полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 400 до 40000 Да, этиленгликоль, глицерин, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин лошади, сывороточный альбумин козы, сывороточный альбумин кролика, трегалозу, сахарозу, желатин, Tween 20, Tween 30, декстрансульфат с молекулярной массой от 300 до 30000 Да или DEAE декстран с молекулярной массой от 500 до 25000.
[0211] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет от приблизительно 15°C до приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 30°C или от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C.
[0212] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0213] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0214] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C.
[0215] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет от приблизительно 3 минут до приблизительно 30 минут, от приблизительно 5 минут до приблизительно 15 минут или от приблизительно 3 минут до приблизительно 5 минут.
[0216] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0217] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет менее приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0218] В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет более приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0219] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C и период инкубации составляет приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0220] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C и период инкубации составляет менее приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0221] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C и период инкубации составляет менее приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0222] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет менее приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C и период инкубации составляет более приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0223] В некоторых вариантах осуществления температура обнаружения составляет более приблизительно 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C или 50°C и период инкубации составляет более приблизительно 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут.
[0224] После инкубации образец ткани промывают один или несколько раз водой, такой как водопроводная вода.
[0225] В некоторых вариантах осуществления ферментативную реакцию обнаруживают с использованием спектрофотометра. В некоторых вариантах осуществления ферментативную реакцию обнаруживают с использованием хемилюминометра. В некоторых вариантах осуществления ферментативную реакцию обнаруживают с использованием детектора флуоресценции. В некоторых вариантах осуществления ферментативную реакцию обнаруживают с использованием колориметрического детектора сигнала. В некоторых вариантах осуществления ферментативную реакцию обнаруживают с использованием светового микроскопа или флуоресцентного микроскопа.
[0226] В некоторых вариантах осуществления определяют количество целевого анализируемого вещества. В некоторых вариантах осуществления определяют относительное количество целевого анализируемого вещества. В некоторых вариантах осуществления определяют количество целевого анализируемого вещества относительно стандарта. В некоторых вариантах осуществления определяют количество целевого анализируемого вещества относительно калибровочной кривой.
D. Морфологическое окрашивание
[0227] После получения тканевого среза, срез, закрепленный на предметном стекле, можно окрашивать морфологическим красителем для оценки. В целом, срез окрашивают одним или несколькими красителями, каждый из которых отчетливо окрашивает различные клеточные компоненты. В некоторых вариантах осуществления ксантиновый краситель или его функциональный эквивалент и/или тиазиновый краситель или его функциональный эквивалент используют для того, чтобы подчеркивать и делать различимым ядро, цитоплазму, и «гранулярные» структуры внутри каждого тканевого среза. Такие красители коммерчески доступны и часто продаются в виде наборов. В качестве примера, набор красителей HEMA 3® (CMS, Houston, Texas) содержит ксантиновый краситель и тиазиновый краситель. В некоторых вариантах осуществления также можно использовать метиленовый синий. Примеры других морфологических красителей, которые можно использовать в данном способе включают, но не ограничиваясь этим, красители, которые обладают незначительной аутофлуоресценцией при той же длине волны, что и другая флуоресцентная метка. Специалист в данной области примет во внимание, что окрашивание можно оптимизировать для данной ткани посредством увеличения или уменьшения длительности времени, в течение которого препараты остаются в красителе.
[0228] После окрашивания тканевой срез можно анализировать стандартными способами микроскопии. В целом, патолог или тому подобное оценивает ткань на присутствие анормальных или нормальных клеток или клеток конкретного типа и предоставляет очаг типов клеток, представляющих интерес. Таким образом, например, в исследовании, коррелирующим амплификацию HER2/neu в злокачественной опухоли молочной железы, a патолог или тому подобное будет просматривать препараты и идентифицировать нормальные клетки груди и анормальных клетки груди.
[0229] В некоторых вариантах осуществления на ткани осуществляют морфологическое окрашивание и окрашивание конъюгатом полимерного фермента/антитела.
II. Способы диагностирования
[0230] Настоящая заявка в одном из аспектов предусматривает композиции, способы и наборы для диагностирования (например, дополняющего диагностирования). В целом, способ диагностирования включает обнаружение присутствия или отсутствия (т.е. отсутствия поддающегося измерению уровня) целевого анализируемого вещества у индивидуума через способ, который включает использование конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления полимерный конъюгат фермент/антитело содержит терапевтическое антитело. Посредством обнаружения связывания терапевтического антитела с целевым анализируемым веществом у индивидуума способ позволяет выбирать индивидуумов, которые конкретно подходят для лечения с использованием терапевтического антитела.
[0231] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, который имеет заболевание (такое как злокачественная опухоль), которое отличается анормальным уровнем целевого анализируемого вещества, который включает: 1) обнаружение уровня или присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов, конъюгированных с антителом, которое распознает целевое анализируемое вещество; и 2) введение индивидууму эффективного количества средства, которое направлено на целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывается с целевым анализируемым веществом. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой то же антитело, которое содержится в конъюгате полимерного фермента и антитела. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль и целевое анализируемое вещество представляет собой опухолевый антиген.
[0232] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ оценки пригодности индивидуума, обладающего заболеванием (таким как злокачественная опухоль), которое отличается анормальным уровнем целевого анализируемого вещества, для лечения с использованием средства, которое направлено на целевое анализируемое вещество, который включает: обнаружение уровня присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов, конъюгированных с антителом, которое распознает целевое анализируемое вещество, где уровень или присутствие целевого анализируемого вещества используют в качестве основы для оценки пригодности лечения. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывается с целевым анализируемым веществом. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой то же антитело, которое содержится в конъюгате полимерного фермента и антитела. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает рекомендации для клинициста в отношении лечения. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль и целевое анализируемое вещество представляет собой опухолевый антиген.
[0233] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ выбора (включая идентификацию) индивидуума, который имеет заболевание (такое как злокачественная опухоль), которое отличается анормальным уровнем целевого анализируемого вещества, для лечения с использованием средства, которое направлено на целевое анализируемое вещество, который включает: обнаружение присутствия уровня целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, который содержит множество молекул ферментов, конъюгированных с антителом, которое распознает целевое анализируемое вещество, где уровень или присутствие целевого анализируемого вещества используют в качестве основы для выбора (включая идентификацию) индивидуума для лечения. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывается с целевым анализируемым веществом. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой то же антитело, которое содержится в конъюгате полимерного фермента и антитела. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает рекомендации для клинициста в отношении лечения. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль, а целевое анализируемое вещество представляет собой опухолевый антиген.
[0234] В некоторых вариантах осуществления обнаружение целевого антигена осуществляют через ИГХ. В некоторых вариантах осуществления обнаружение целевого антигена осуществляют через прямое ИГХ. В некоторых вариантах осуществления средство связывается непосредственно с целевым анализируемым веществом. В некоторых вариантах осуществления средство связывается опосредованно с целевым анализируемым веществом. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой средство, основанное на низкомолекулярном соединении, нуклеотиде или аминокислоте. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с тем же эпитопом целевого анализируемого вещества, что и антитело из конъюгата полимерного фермента/антитела, используемое для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с тем же эпитопом целевого анализируемого вещества с той же аффинностью связывания, что и антитело из конъюгата полимерного фермента/антитела, используемого для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления антитело может связывать другой эпитоп, нежели антитело из конъюгата полимерного фермента/антитела, используемого для того, чтобы обнаруживать целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления присутствие целевого анализируемого вещества обнаруживают на целевой ткани. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек.
[0235] В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек.
[0236] В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой биологический маркер для дополняющего диагностирования, такой как ER, PR, HER2, EGFR, CD117 (c-kit).
[0237] В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело специфично к сопряженному с G-белком рецептору или ионному каналу. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело специфично к 1-40-β-амилоиду, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, антигену аденокарциномы, AGS-22M6, альфа-фетопротеину, ангиопоэтину 2, ангиопоэтину 3, AOC3 (VAP-1), B7-H3, сибирской язве Bacillus anthracis, BAFF, бета-амилоиду, клетке B-лимфомы, антигену C242, C5, CA-125, карбоангидразе 9 (CA-IX), миозину сердца, CCL11 (эотаксин-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (базиджин), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD25 (α-цепь рецептора IL-2), CD27, CD28, CD3, CD3ε, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38 (гидролаза циклической ADP рибозы), CD4, CD40, CD41 (интегрин альфа-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CEA-связанному антигену, CFD, ch4D5, CLDN18.2, Clostridium difficile, фактору агглютинации A, CSF2, CTLA-4, DLL4, DR5, EGFL7, EGFR, эндотоксину, EpCAM, CD3, эписиалину, ERBB3, FAP, фибрину II, бета цепи, внешнему домену B фибронектина, фолатному рецептору 1, рецептору Frizzled, ганглиозиду GD2, ганглиозиду GD3, α-цепи рецептора GMCSF, GPNMB, гемагглютинину, HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HHGFR, HNGF, Hsp90, рецепторной киназе рассеивающего фактора человека, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, рецептору IGF-1, IGF-I, IGHE, IL 20, IL-1, IL-12, IL-23, IL-17A, IL-1β, IL-22, IL23, IL-4, IL-5, IL-6, рецептору IL-6, IL9, ILGF2, интегрину α4β7, интегрину α5β1, интегрину α7β7, интегрину αIIbβ3, интегрину αvβ3, рецептору интерферона, рецептору интерферона α/β, белку, индуцируемому интерфероном γ, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, Y антигену Льюиса, LFA-1 (CD11a), липотейхоевой кислоте, LOXL2, L-селектину (CD62L), LTA, MCP-1, мезотелину, MS4A1, MUC1, CanAg муцина, миостатину, NARP-1, NCA-90 (антиген гранулоцитов), NGF, N-гликолилнейраминовой кислоте, NOGO-A, рецептору Notch, NRP1, OX-40, OXLDL, PCSK9, PD-1, PD-L1, PDCD1, PDCD1, PDGF-R α, совместному переносчику фосфата натрия, фосфатидилсерину, RANKL, RHD, резус-фактору, RON, RTN4, склеростину, SDC1, селектину P, SLAMF7, SOST, сфингозин-1-фосфату, TAG-72, T-клеточному рецептору, TEM1, тенасцину C, TFPI, TGF β1, TGF β2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевому антигену CTAA16,88, опухолеспецифичному гликозилированию MUC1, рецептору TWEAK, TYRP1 (гликопротеин 75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, виментину или VWF.
[0238] Также в настоящем описании изобретение относится к способам оценки того, будет ли индивидуум, имеющий заболевание, подходяще отвечать на лечение, которые включают определение присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела.
[0239] Кроме того, в настоящем описании изобретение относится к способам выбора (включая идентификацию) индивидуума, имеющего заболевание, который подходяще отвечает на лечение, которые включают: (a) обнаружение присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела; и (b) введение эффективного количества средства, которое направлено на целевое анализируемое вещество.
[0240] Также в настоящем описании изобретение относится к способам корректировки терапевтического лечения индивидуума, имеющего заболевание, который получает эффективное количество средства, которое направлено на целевое анализируемое вещество, способ включает обнаружение присутствия целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела в образце, выделенном у индивидуума, и корректировку терапевтического лечения на основании оценки. В некоторых вариантах осуществления корректируют количество средства. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
[0241] В некоторых вариантах осуществления какого-либо из способов, описанных в настоящем описании, способы являются предиктивными и/или ведут к поддающемуся измерению уменьшению размеру опухоли или признака заболевания или прогрессии заболевания, полному ответ, частичному ответу, стабильному заболеванию, увеличению или удлинению выживаемости без прогрессии или увеличению или удлинению общей выживаемости. В некоторых вариантах осуществления какого-либо из приведенных выше способов, индивидуум подходяще отвечает на средство, которое направлено на целевое анализируемое вещество, если индивидуум имеет поддающееся обнаружению присутствие целевого анализируемого вещества, как измеряют с помощью конъюгата полимерного фермента/антитела и как свидетельствует поддающееся измерению снижение размера опухоли или признака заболевания или прогрессии заболевания, полный ответ, частичный ответ, стабильное заболевание, увеличение или удлинение выживаемости без прогрессии, увеличение или удлинение общей выживаемости.
[0242] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу пролонгации выживаемости без прогрессии злокачественной опухоли у индивидуума, который включает выбор индивидуума для лечения на основании присутствия целевого анализируемого вещества, как измеряют с помощью конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления способ пролонгирует время до прогрессии заболевания по меньшей мере на любое из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель.
[0243] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу пролонгации выживаемости индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, который включает выбор индивидуума для лечения на основании присутствия целевого анализируемого вещества, как измеряют с помощью конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления способ пролонгирует выживаемость индивидуума по меньшей мере на любое из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 или 24 месяцев.
[0244] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу снижения AE и SAE у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, который включает выбор индивидуума для лечения на основании присутствия целевого анализируемого вещества, как измеряют с помощью конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании, способ является предиктивным и/или ведет к объективному ответу (такому как частичный ответ или полный ответ).
[0245] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании, способ является предиктивным и/или ведет к улучшенному качеству жизни.
[0246] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу определения процентной доли индивидуумов в популяции, которые имеют поддающееся измерению присутствие целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления экспрессию целевого анализируемого вещества определяют с использованием ИГХ. В некоторых вариантах осуществления экспрессию целевого анализируемого вещества определяют с использованием прямого ИГХ. В некоторых вариантах осуществления экспрессию целевого анализируемого вещества определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления экспрессию целевого анализируемого вещества определяют с использованием прямого ИГХ с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления целевое анализируемое вещество представляет собой опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек.
[0247] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу определения распределения в тканях целевого анализируемого вещества у индивидуума с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления распределение в тканях целевого анализируемого вещества у индивидуума определяют для ткани больше чем одного типа. В некоторых вариантах осуществления распределение в тканях целевого анализируемого вещества определяют для определенного типа ткани от одного или нескольких индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления распределение в тканях целевого анализируемого вещества определяют для ткани больше чем одного типа от одного или нескольких индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления распределение в тканях целевого анализируемого вещества определяют с использованием ИГХ. В некоторых вариантах осуществления распределение в тканях целевого анализируемого вещества определяют с использованием прямого ИГХ. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек.
[0248] В некоторых вариантах осуществления способы, включающие использование конъюгата полимерного фермента/антитела для определения присутствия целевого анализируемого вещества на ткани, также могут стратифицировать присутствие целевого анализируемого вещества на ткани. В некоторых вариантах осуществления ткань является положительной по целевому анализируемому веществу. В некоторых вариантах осуществления ткань является слабоположительной по целевому анализируемому веществу. В некоторых вариантах осуществления ткань является отрицательной по целевому анализируемому веществу.
[0249] В некоторых вариантах осуществления способы, включающие использование конъюгата полимерного фермента/антитела для определения присутствия целевого антигена также могут обнаруживать уровень целевого антигена. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого анализируемого вещества у индивидуума, как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, сравнивают с уровнем целевого анализируемого вещества в контрольном образце, также как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого анализируемого вещества у индивидуума, как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, сравнивают с уровнем целевого анализируемого вещества во множестве контрольных образцов, каждый как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления множество контрольных образцов используют для того, чтобы генерировать статистику, которую используют для того, чтобы классифицировать уровень целевого анализируемого вещества у индивидуума со злокачественной опухолью.
[0250] Уровень целевого анализируемого вещества, как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, также можно использовать для определения любого из следующего: (a) возможная или вероятная пригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (b) возможная или вероятная непригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (c) восприимчивость к лечению; (d) возможная или вероятная пригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (e) возможная или вероятная непригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (f) корректировка дозировки; (g) предсказание вероятности клинической пользы. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого анализируемого вещества, как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, также можно использовать для помощи в оценке любого из следующего: (a) возможная или вероятная пригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (b) возможная или вероятная непригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (c) восприимчивость к лечению; (d) возможная или вероятная пригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (e) возможная или вероятная непригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (f) корректировка дозировки; (g) предсказание вероятности клинической пользы.
[0251] в настоящем описании в рамках изобретения, «основанный на» или «на основании» включает оценку, определение или измерения характеристик индивидуума, как описано в настоящем описании (и предпочтительно выбор индивидуума, подходящего для получения лечения). Когда присутствие или уровень целевого анализируемого вещества, как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, используют в качестве основы для выбора, оценки (или помощи в оценке), измерения или определения для способов лечения, как описано в настоящем описании, уровень целевого анализируемого вещества измеряют до и/или во время лечения, и получаемые значения может использовать клиницист при оценке любого из следующего: (a) возможная или вероятная пригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (b) возможная или вероятная непригодность индивидуума к изначальному получению лечения; (c) восприимчивость к лечению; (d) возможная или вероятная пригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (e) возможная или вероятная непригодность индивидуума к продолжению получения лечения; (f) корректировка дозы; или (g) предсказание вероятности клинической пользы.
[0252] В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является женщина. В некоторых вариантах осуществления индивидуум индивидуумом является мужчина. В некоторых вариантах осуществления индивидуум моложе приблизительно 65 лет. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет возраст по меньшей мере приблизительно 65 лет, по меньшей мере приблизительно 70 лет или по меньшей мере приблизительно 75 лет. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет один или несколько симптомов хронического стресса, включая физический и физиологических стресс, связанный со злокачественной опухолью, такие как беспокойств, депрессия, головная боль, боль, утомление, бессонница, анорексия, тошнота, недоедание или какое-либо их сочетание. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет запущенную стадию злокачественной опухоли, такую как любая из стадии T2, T3, T4, N1, N2, N3 или M1 злокачественной опухоли на основании системы определения стадии TNM. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет большую опухолевую массу, например, большой размер опухоли и/или большое число клеток злокачественной опухоли в ложе опухоли. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет пальпируемые лимфатические узлы или имеет клетки злокачественной опухоли, распространенные по прилежащим лимфатическим узлам. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет отдаленные метастазы опухоли.
[0253] В некоторых вариантах осуществления какого-либо из способов злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли матки, злокачественной опухоли почки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли эндометрия, злокачественной опухоли головы и шеи, злокачественной опухоли поджелудочной железы и меланомы. В некоторых вариантах осуществления злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли легких и злокачественной опухоли поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой трижды негативную злокачественную опухоль молочной железы (TNBC). В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой немелкоклеточный рак легких (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDAC). В некоторых вариантах осуществления злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли коры надпочечников, злокачественной опухоли желчных протоков, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли эндометрия, злокачественной опухоли пищевода, глиобластомы, злокачественной опухоли головы и шеи, хромофобной злокачественной опухоли почки, светлоклеточной карциномы почки, папиллярно-клеточной карциномы почки, злокачественной опухоли печени, высокодифференцированной глиомы, аденокарциномы легких, плоскоклеточной карциномы легких, меланомы, мезотелиомы, меланомы глаза, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли поджелудочной железы, феохромоцитомы и параганглиомы, злокачественной опухоли предстательной железы, саркомы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли яичек, злокачественной опухоли щитовидной железы и карциносаркомы матки.
[0254] В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой солидную эпителиальную опухоль или саркому. В некоторых вариантах осуществления злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из карциномы коры надпочечников, саркомы Капоши, злокачественной опухоли ануса, карциноидной опухоли желудочно-кишечного тракта, базально-клеточной карциномы, злокачественной опухоли желчных протоков, злокачественной опухоли мочевого пузыря (такой как переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря, плоскоклеточная карцинома мочевого пузыря и аденокарцинома мочевого пузыря), злокачественной опухоли (такой как саркома Юинга, остеосаркома, хондросаркома и озлокачествленная фиброзная гистиоцитома), злокачественной опухоли молочной железы (такой как протоковая карцинома, дольковая карцинома, фиброаденома), бронхиальной опухоли, карциномы неизвестного происхождения, злокачественной опухоли шейки матки, хордомы, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли прямой кишки, злокачественной опухоли эндометрия, злокачественной опухоли пищевода (включая плоскоклеточную карциному пищевода и аденокарциному пищевода), внутриглазной меланомы, злокачественной опухоли яичников (такой как эпителиальная злокачественная опухоль яичников, злокачественная опухоль фаллопиевых труб и перитонеальная злокачественная опухоль), злокачественной опухоли желчного пузыря, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли головы и шеи (такой как гипофарингеальная злокачественная опухоль, ларингеальная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль губы и полости рта, метастатическая плоскоклеточная злокачественная опухоль шеи со скрытым первичным лечением, назофарингеальная злокачественная опухоль, орофарингеальная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль околоносовых синусов и носовой полости, злокачественная опухоль слюнных желез и оральные осложнения химиотерапии и облучения головы/шеи), опухоли сердца (такой как рабдомиома, миксома, фиброма, фибросаркома и ангиосаркома), гепатоклеточной (печень) злокачественной опухоли, злокачественной опухоли почки (такой как злокачественная опухоль клеток почки, переходно-клеточная злокачественная опухоль почечной лоханки и мочеточника, и опухоль Вильмса), злокачественной опухоли легких (такой как немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), злокачественной опухоли кожи (такой как базально-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, нейроэндокринная карцинома кожи, меланома и карцинома из клеток Меркеля), злокачественной опухоли поджелудочной железы, феохромоцитомы, злокачественной опухоли паращитовидной железы, пенильной злокачественной опухоли, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, саркомы матки (такой как лейомиосаркома и эндометриальная стромальная саркома), злокачественной опухоли тонкой кишки (такой как аденокарцинома тонкой кишки и саркома тонкой кишки и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта), саркомы мягких тканей (такой как саркома мягких тканей взрослых и саркома мягких тканей детей), злокачественной опухоли щитовидной железы (такой как папиллярная, фолликулярная, медуллярная и анапластическая злокачественная опухоль щитовидной железы), злокачественной опухоли уретры (в том числе переходно-клеточная карцинома уретры, плоскоклеточная карцинома уретры и аденокарцинома уретры), вагинальной злокачественной опухоли (такой как вагинальная плоскоклеточная карцинома и вагинальная аденокарцинома) и злокачественной опухоли вульвы.
[0255] В некоторых вариантах осуществления способов, способ представляет собой терапию первой линии.
[0256] В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль находится на запущенной стадии (такой как стадия III или стадия IV). В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую злокачественную опухоль.
[0257] Классификацию или ранжирование уровня целевого анализируемого вещества (т.е. высокий или низкий), как определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, можно определять относительно статистического распределения контрольных уровней. В некоторых вариантах осуществления классификацию или ранжирование выполняют относительно контрольного образца, такого как нормальная ткань. В определенном варианте осуществления уровень целевого анализируемого вещества классифицируют или ранжируют относительно статистического распределения контрольных уровней. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого анализируемого вещества классифицируют или ранжируют относительно уровня из контрольного образца, полученного от индивидуума.
[0258] Контрольные образцы можно получать с использованием одних и тех же источников и способов, что и неконтрольные образцы. В некоторых вариантах осуществления контрольный образец получают у другого индивидуума (например, у индивидуума, не имеющего злокачественную опухоль, индивидуума, имеющего доброкачественную или меньше запущенную форму заболевания, соответствующего злокачественной опухоли, и/или индивидуума, имеющего схожие этнические, возрастные и половые признаки). В некоторых вариантах осуществления, когда образец представляет собой образец опухолевой ткани, контрольный образец может представлять собой не злокачественный опухолевый образец от того же индивидуума. В некоторых вариантах осуществления множество контрольных образцов (например, от различных индивидуумов) используют для того, чтобы определять диапазон уровней целевого анализируемого вещества в конкретной ткани, органе или популяции клеток.
[0259] В некоторых вариантах осуществления способы биоинформатики используют для определения и классификации уровней целевого анализируемого вещества.
[0260] В некоторых вариантах осуществления уровень целевого анализируемого вещества определяют с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела, например, посредством прямой иммуногистохимии. Например, критерии для низких или высоких уровней можно создавать на основании числа положительно окрашенных клеток и/или интенсивности окрашивания, например, с использованием антитела, которое специфично распознает целевое анализируемое вещество. В некоторых вариантах осуществления уровень низок, если меньше приблизительно 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% клеток имеют положительное окрашивание. В некоторых вариантах осуществления уровень низок, если окрашивание на 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% менее интенсивно, чем окрашивание положительного контроля. В некоторых вариантах осуществления уровень высок, если больше приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% клеток имеют положительное окрашивание.
[0261] В некоторых вариантах осуществления уровень высок, если окрашивание конъюгата полимерного фермента/антитела настолько же интенсивно, как окрашивание положительного контроля. В некоторых вариантах осуществления уровень высок, если окрашивание конъюгата полимерного фермента/антитела составляет 80%, 85% или 90% от интенсивности окрашивания положительного контроля конъюгата полимерного фермента/антитела.
[0262] В некоторых вариантах осуществления сильное окрашивание, умеренное окрашивание и слабое окрашивание представляют собой калиброванные уровни окрашивания конъюгата полимерного фермента/антитела, где устанавливают определенный диапазон и интенсивность окрашивания разделяют на интервалы в пределах диапазона. В некоторых вариантах осуществления сильное окрашивание представляет собой окрашивание конъюгата полимерного фермента/антитела выше 75-й процентиль диапазона интенсивности, умеренное окрашивание представляет собой окрашивание конъюгата полимерного фермента/антитела от 25-го до 75-го процентиля диапазона интенсивности и слабое окрашивание представляет собой окрашивание конъюгата полимерного фермента/антитела ниже 25-го процентиля диапазона интенсивности. В некоторых аспектах специалист в данной области, знакомый с конкретным способом окрашивания, корректирует размер интервала и определяет категории окрашивания.
[0263] В некоторых вариантах осуществления оценку и исследование уровня целевого анализируемого вещества, как в образце, пациенте и т.д., как определяют с помощью конъюгата полимерного фермента/антитела, осуществляют один или несколько опытных клиницистов, т.е. те, кто имеют опыт в отношении паттернов экспрессии целевого анализируемого вещества и окрашивания целевого анализируемого вещества с использованием конъюгата полимерного фермента/антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления клиницисту(клиницистам) не известны клинические характеристики и исход для образцов, пациентов и т.д., которые оценивают и исследуют.
[0264] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, осуществляют в клинике. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, осуществляют за пределами клиник. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, осуществляют в диагностической лаборатории.
III. Наборы
[0265] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к наборам, которые содержат одну или несколько композиций по изобретению и направления для использования композиций и/или осуществления раскрытых способов.
[0266] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам для иммунообнаружения для использования в способах иммунообнаружения, описанных выше. Поскольку антитела в целом используют для того, чтобы обнаруживать белки, полипептиды и/или пептиды дикого и/или мутантного типа, в набор предпочтительно включают антитела. Наборы для иммунообнаружения, таким образом, содержат, в подходящих контейнерных средствах, первичное антитело, которое связывается с белком, полипептидом и/или пептидом дикого и/или мутантного типа, и/или необязательно реактив для иммунообнаружения и/или, кроме того, необязательно белок, полипептид и/или пептид дикого и/или мутантного типа.
[0267] Реактивы для иммунообнаружения из набора могут принимать любую одну из множества форм, включая те поддающиеся обнаружению метки, которые ассоциированы и/или связанны с данным первичным антителом, предпочтительно в виде конъюгатов полимерного фермента/антитела.
[0268] Наборы дополнительно могут содержать подходящую аликвоту композиции белка, полипептида и/или полипептида дикого и/или мутантного типа, меченного или и/или не меченного, которые можно использовать для того, чтобы получать калибровочную кривую для анализа обнаружения. Наборы могут содержать конъюгаты антитело-метка или в полностью конъюгированной форме, в форме промежуточных соединений и/или в виде отдельных частиц, подлежащих конъюгации пользователем набора. Компоненты наборов можно упаковывать в водных средах и/или в лиофилизированной форме.
[0269] Контейнерные средства из наборов в целом включают по меньшей мере один сосуд, тестовую пробирку, колбу, бутылку, шприц и/или другое контейнерное средство, в которое можно помещать антитело и/или предпочтительно помещать подходящую аликвоту. Наборы по настоящему изобретению также типично включают средство, чтобы вмещать антитело, антиген и/или какие-либо другие контейнеры для реактивов, надежно герметизированные для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать литые и/или выдутые пластмассовые контейнеры, в которых держат желаемые сосуды.
[0270] Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничиваясь этим, сосуды, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, Mylar или пластмассовые мешки) и т.п. Наборы необязательно могут предусматривать дополнительные компоненты, такие как буферы и пояснительную информацию. Настоящая заявка, таким образом, также предусматривает промышленные изделия, которые включают сосуды (такие как герметизированные сосуды), бутылки, банки, гибкую упаковку и т.п.
[0271] Например, в одном из вариантов осуществления изобретения набор будет оценивать исчерпывающие панели молекул (например, клинически релевантных прогностических и предиктивных факторов в злокачественной опухоли) в широких клинических и исследовательских условиях.
[0272] В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по использованию в соответствии с каким-либо из способов, описанных в настоящем описании. Набор может содержать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, типично представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в набор), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции, расположенные на магнитном или оптическом запоминающем диске) также приемлемы.
[0273] Например, в некоторых вариантах осуществления набор содержит a) конъюгат полимерного фермента/антитела. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) конъюгат полимерного фермента/антитела и b) инструкции по использованию. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) конъюгат полимерного фермента/антитела и b) субстрат полимерного фермента. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) конъюгат полимерного фермента/антитела, b) субстрат полимерного фермента и c) инструкции по использованию. В некоторых вариантах осуществления полимерный фермент представляет собой полимер пероксидазы хрена. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой терапевтическое антитело.
[0274] Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представлены и описаны в настоящем описании, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Многие вариации, изменения и замены придут на ум специалистам в данной области, не отступая от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы в вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, можно использовать при практическом осуществлении изобретения. Подразумевают, что следующая формула изобретения определяет объем изобретения и что способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и ее эквивалентов тем самым охвачены.
ПРИМЕРЫ
[0275] Настоящее изобретение дополнительно снабжено, но не ограничено следующими примерами, которые иллюстрируют получение соединений по изобретению.
Пример 1. Протокол прямой ИГХ на замороженных препаратах ткани.
[0276] Этот пример демонстрирует протокол для осуществления прямой ИГХ на тканевом срезе, полученном из замороженного образца ткани.
[0277] Тканевые срезы получают, как описано в следующем образцовом способе. Блок свежей рассеченной ткани (толщиной <5 мм) помещают на отливку основы предварительно меченой ткани. Весь блок ткани покрывают низкотемпературными заливочными средами (например, OCT). Отливку основы, содержащую блок ткани, медленно помещают в жидкий азот, погружая весь блок ткани в жидкий азот, чтобы гарантировать, что блок полностью заморожен. Замороженный блок ткани переносят в замораживающий криотом (например, -20°C). Делают срезы замороженного блока ткани желаемой толщины (типично 5-10 мкм), используя криотом. Тканевой срез помещают на предметное стекло, подходящее для иммуногистохимии (например, Superfrost® Plus, VWR).
[0278] Осуществляют иммунологическое окрашивание тканевых срезов, как описано в следующем образцовом способе. Тканевой срез фиксируют фиксатором, содержащим 75% метанола, 5% ледяной кислой кислоты и 20% 37% формальдегида, в течение от 1 до 2 минут. Затем предметное стекло с тканевым срезом блокируют с использованием блокирующего буфера, например, 5% снятого молока или 2% BSA, в течение 2 минут. После блокирования препарат промывают в 10 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS) при нейтральном pH в течение 10 секунд; препарат промывают 3 раза. Конъюгат полимера пероксидазы хрена/антитела, разбавленный в 1% BSA, наносят на препарат, чтобы покрыть всю область тканевого среза, и инкубируют в течение от 3 до 5 минут при комнатной температуре. После инкубации, препарат промывают в PBS буфере 3 раза в течение 10 секунд каждый раз. DAB раствор наносят на препарат, чтобы покрыть всю площадь тканевого среза, и инкубируют в течение от 1 до 3 минут. Реакции останавливают посредством промывания водопроводной водой. Осуществляют контрастное окрашивание препарата гематоксилином в течение 10 секунд и затем промывают водой. Затем препарат ненадолго погружают в кислый спирт (0,25% раствор кислого спирта, получаемый объединением 11 мл концентрированной соляной кислоты и 4400 мл 80% этанола); препарат погружают от 1 до 3 раз. Затем препарат ненадолго погружают в карбонат лития (раствор карбоната лития, получаемый объединением 2,3 г карбоната лития и 200 мл 80% этанола) в течение 15 секунд и затем промывают водопроводной водой в течение 10 секунд. Затем препарат погружают в 100% этанол три раза на 10 секунд каждый, чтобы дегидратировать тканевой срез. После дегидратации препарат очищают посредством погружения в ксилол три раза на 10 секунд каждый.
Пример 2. Депарафинизация и регидратация препарата ткани.
[0279] Этот пример демонстрирует протокол для осуществления прямой ИГХ на тканевом срезе после депарафинизации, регидратации и извлечения эпитопов тканевого среза.
[0280] Предметное стекло с тканевым срезом погружают в ксилол на 5 минут. Погружение в ксилол повторяют с использованием чистого ксилола еще два раза в течение 5 минут каждый. Затем препарат погружают в следующий ряд растворов этанола: 100% этанол в течение 3 минут; 100% этанол в течение 3 минут; 95% этанол в течение 3 минут; и 75% этанол в течение 3 минут. Затем препарат промывают в водопроводной воде посредством погружения препарата в чистую водопроводную воду на три минуты; повторяют два дополнительных раза.
[0281] После регидратации тканевого среза, белковые эпитопы обнажают с использованием трипсина. Сначала получают 0,1% раствор трипсина в 0,1% хлориде кальция с использованием дистиллированной воды. pH раствора трипсина корректируют до 7,2 с использованием 1М гидроксида натрия. Увлажняющую камеру, 0,1% раствор трипсина и предметное стекло с тканевым срезом в дистиллированной воде предварительно нагревают при 37°C. Затем предметное стекло с тканевым срезом инкубируют в 0,1% растворе трипсина в течение 20 минут. Затем предметное стекло оставляют остывать в течение 10 минут при комнатной температуре. После 10 минут препарат промывают в водопроводной воде посредством погружения препарата в чистую водопроводную воду на 2 минуты; повторяют ода дополнительных раза. Затем препарат блокируют в 3% растворе пероксида водорода в течение 2 минут. Затем препарат промывают в PBS с 0,05% Tween 20 посредством погружения препарата на 2 минут; повторяют ода дополнительных раза. Впоследствии препарат блокируют в 1% BSA в течение 30 минут.
[0282] После блокирования осуществляют иммунологическое окрашивание тканевого среза с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена/антитела. Раствор, который содержит конъюгат полимера пероксидазы хрена/антитела, наносят на препарат, чтобы покрыть всю площадь тканевого среза, и инкубируют в течение от 5 до 30 минут при комнатной температуре. После инкубации препарат промывают в буфере PBS Tween 20 3 раза в течение двух минут каждый раз.
[0283] DAB раствор, который содержит 30 мкл хромогена/1 мл разбавителя, наносят на препарат, чтобы покрыть всю площадь тканевого среза, и инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают посредством промывания в водопроводной воде. Осуществляют контрастное окрашивание препарата гематоксилином в течение 10 секунд и затем промывают водой. Затем препарат погружают в 0,1% карбонат натрия pH8 (раствор для окрашивания в синий) на 15 секунд. Впоследствии тканевой срез на предметном стекле дегидратируют посредством погружения предметного стекла в следующий раствор: 95% этанол в течение 3 минут; 100% этанол в течение 3 минут; и 100% этанол в течение 3 минут. За этим следуют промывания в ксилоле 2,5 минуты. Затем очищают препарат посредством погружения препарата в ксилол два раза на 10 секунд каждый раз.
Пример 3. Прямая ИГХ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18.
[0284] Этот пример демонстрирует обнаружение Ck8/18 в образцах тканей с использованием прямого ИГХ окрашивания конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck8/18.
[0285] Получали FFPE тканевой срез предстательной железы и замороженный тканевой срез лимфатического узла человека и осуществляли их окрашивание с использованием способов, описанных в примере 1 и 2. FFPE тканевой срез предстательной железы обрабатывали с использованием трипсина, чтобы извлечь белковые эпитопы, и полимер пероксидазы хрена, конъюгированный с моноклональным антителом мыши против Ck8/18, инкубировали с образцом ткани в течение 5 минут при 37°C. Замороженный тканевой срез лимфатического узла человека инкубировали с полимером пероксидазы хрена, конъюгированным с моноклональным антителом мыши против Ck8/18, в течение 3 минут при комнатной температуре.
[0286] Репрезентативные изображения окрашенной злокачественной ткани предоставлены для FFPE тканевого среза предстательной железы (фиг. 9A) и замороженного тканевого среза лимфатического узла человека (фиг. 9B).
Пример 4. Прямая ИГХ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ki-67.
[0287] Этот пример демонстрирует обнаружение Ki-67 в образце ткани с использованием прямого ИГХ окрашивания конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против Ki-67.
[0288] Тканевой срез миндалины человека получали и осуществляли его иммунологическое окрашивание с использованием способов, описанных в примере 1 и 2. Дополнительно, тканевой срез окрашивали с использованием Q-stain.
[0289] Репрезентативное изображение ткани, окрашенной против Ki-67, предоставлено для тканевого среза миндалины человека (фиг. 10).
Пример 5. Прямая ИГХ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck5.
[0290] Этот пример демонстрирует обнаружение Ck5 в образце ткани миндалины человека с использованием прямого ИГХ окрашивания конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck5.
[0291] Получали замороженный тканевой срез миндалины человека и осуществляли его иммунологическое окрашивание с использованием способов, описанных в примере 1 и 2. Замороженный тканевой срез миндалины человека инкубировали с конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против Ck5 в течение 10 минут при комнатной температуре.
[0292] Репрезентативное изображение ткани, окрашенной против Ck5, предоставлено для тканевого среза миндалины человека (фиг. 11).
Пример 6. Прямая ИГХ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против Mart-1.
[0293] Этот пример демонстрирует обнаружение Mart-1 в образце ткани меланомы с использованием прямого ИГХ окрашивания конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против Mart-1 клона A103.
[0294] Получали тканевой срез меланомы и осуществляли его окрашивание с использованием способов, описанных в примере 1 и 2.
[0295] Репрезентативное изображение ткани, окрашенной против Mart-1, предоставлено для тканевого среза меланомы (фиг. 12).
Пример 7. Прямая ИГХ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против CD45.
[0296] Этот пример демонстрирует обнаружение CD45 в образце ткани миндалины с использованием прямого ИГХ окрашивания конъюгатом полимера пероксидазы хрена и антитела против CD45 клона 3A4.
[0297] Получали тканевой срез миндалины и осуществляли его иммунологическое окрашивание с использованием способов, описанных в примере 1 и 2.
[0298] Репрезентативное изображение ткани, окрашенной против CD45, предоставлено для тканевого среза миндалины (фиг. 13).
Пример 8. Способ и результаты прямой ИГХ с использованием терапевтического антитела.
[0299] Этот пример демонстрирует способ прямого ИГХ окрашивания различных образцов тканей с использованием терапевтического антитела, конъюгированного с полимером пероксидазы хрена.
[0300] Получали терапевтическое антитело человека, которое специфично связывает ROR2. Терапевтическое антитело метили полимером пероксидазы хрена, чтобы получать конъюгат полимера пероксидазы хрена и терапевтического антитела.
[0301] Получали тканевые срезы и осуществляли их иммунологическое окрашивание с использованием способов, описанных здесь, таких как те, которые описаны в примере 1 и 2.
[0302] Изображения иммунологического окрашивания оценивали от 0 до 4, где 4 обозначает самое сильное, 3-4 обозначает положительное, 1-2 обозначает слабоположительное и 0 обозначает отрицательное.
[0303] Рабочие условия конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против ROR2 оптимизировали на основании тканевых срезов, для которых известно, что они экспрессируют или в них отсутствует экспрессия ROR2. Результаты классификации окрашивания известных положительных и отрицательных тканевых срезов приведены в таблице 1. Идентификация ткани, экспрессирующей ROR2, с использованием представленного способа, коррелировала с известной экспрессией ROR2 в образцах тканей.
Таблица 1. Классификация окрашивания образцов тканей.
[0304] Репрезентативные изображения окрашенной ткани предоставлены для следующего: миндалина (фиг. 14A), предстательная железа (фиг. 14B), желудок (фиг. 14C) и почка (фиг. 14D).
[0305] Впоследствии использовали оптимизированный прямой ИГХ способ с использованием конъюгата полимера пероксидазы хрена и антитела против ROR2 для того, чтобы классифицировать ряд образцов тканей злокачественных опухолей. Результаты классификации окрашивания представлены в таблице 2.
Таблица 2. Классификация ROR2 окрашивания образцов тканей злокачественных опухолей.
[0306] Репрезентативные изображения ткани после прямого ИГХ окрашивания предоставлены для следующего: меланома (фиг. 15A и 15B), гепатоцеллюлярная карцинома (фиг. 15C и 15D), нейроэндокринная опухоль (фиг. 15E и 15F), легкая карцинома (фиг. 15G) и светлоклеточная карцинома почки (фиг. 15H).
Группа изобретений относится к прямому иммуногистохимическому окрашиванию ткани. Раскрыт способ обнаружения целевого аналита в ткани, который включает: (а) приведение в контакт ткани, которая содержит целевой аналит, с множеством конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела; причем множество конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела содержит популяцию полимерных ферментов, имеющих распределение по размеру, охарактеризованное по числу молекул фермента на каждый полимерный фермент, причем каждый конъюгат полимерного фермента/первичного антитела имеет молекулярную массу от 400 кДа до 2000 кДа, причем стадию (а) осуществляют в течение инкубационного периода 5 минут или менее; (b) удаление по существу конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела, которые не образуют комплекс; и (c) приведение в контакт среза ткани с субстратом множества молекул ферментов, с обнаружением, таким образом, целевого аналита. Также раскрыт способ лечения индивидуума, имеющего заболевание. Группа изобретений обеспечивает обнаружение целевого аналита в ткани, которая представляется собой срез ткани или клинический мазок. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 пр., 16 ил.
1. Способ обнаружения целевого аналита в ткани, причем ткань представляет собой срез ткани или клинический мазок, который включает:
(a) приведение в контакт ткани, которая содержит целевой аналит, с множеством конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела в условиях, подходящих для формирования комплекса, содержащего целевой аналит и один или болеее из множества конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела,
причем каждый полимерный фермент/первичное антитело содержит: (i) множество полимерных ферментов, причем каждый полимерный фермент содержит множество молекул ферментов; и (ii) антитело, которое распознает целевой аналит,
причем множество конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела содержит популяцию полимерных ферментов, имеющих распределение по размеру, охарактеризованное по числу молекул фермента на каждый полимерный фермент,
причем каждый конъюгат полимерного фермента/первичного антитела имеет молекулярную массу от 400 кДа до 2000 кДа,
причем стадию (а) осуществляют в течение инкубационного периода 5 минут или менее;
(b) удаление по существу конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела, которые не образуют комплекс; и
(c) приведение в контакт среза ткани с субстратом множества молекул ферментов,
с обнаружением, таким образом, целевого аналита.
2. Способ по п.1, в котором число молекул фермента одного из множества полимерных ферментов составляет от 5 молекул фермента до 15 молекул фермента.
3. Способ по п.1, в котором число молекул фермента одного из множества полимерных ферментов составляет от 10 молекул фермента до 25 молекул фермента.
4. Способ по п.1, в котором число молекул фермента одного из множества полимерных ферментов составляет от 25 молекул фермента до 50 молекул фермента.
5. Способ по п.1, в котором срез ткани фиксируют в фиксирующем растворе, содержащем альдегид.
6. Способ по п.4, в котором фиксирующий раствор содержит формалин.
7. Способ по п.5, в котором фиксирующий раствор содержит метанол.
8. Способ по п.1, в котором ткань представляет собой замороженную ткань или свежую ткань.
9. Способ по п.8, в котором ткань представляет собой срез замороженной ткани, и в котором срез ткани имеет толщину от приблизительно 1,5 мкм до приблизительно 5,5 мкм.
10. Способ по п.1, в котором срез ткани представляет собой замороженную ткань.
11. Способ по п.9, в котором тканевой срез выбирают из группы, состоящей из тканевых срезов головного мозга, надпочечников, ободочной кишки, тонкой кишки, желудка, сердца, печени, кожи, почки, легкого, поджелудочной железы, яичка, яичника, предстательной железы, матки, щитовидной железы и селезенки млекопитающего.
12. Способ по п.1, в котором ткань выбирают из группы, состоящей из тканевых срезов головного мозга, надпочечников, ободочной кишки, тонкой кишки, желудка, сердца, печени, кожи, почки, легкого, поджелудочной железы, яичка, яичника, предстательной железы, матки, щитовидной железы и селезенки млекопитающего.
13. Способ по п.1, в котором молекулу фермента выбирают из группы, состоящей из: бета-D-галактозидазы, глюкозооксидазы, пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы, бета-лактамазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, уреазы, уриказы, супероксиддисмутазы, люциферазы, пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, оксидазы галактозы, ацетилхолинэстеразы, энтерокиназы, тирозиназы и ксантиноксидазы.
14. Способ по п.1, где стадию (a) осуществляют при температуре инкубации от 15°C до 37°C.
15. Способ по п.14, в котором стадию (а) осуществляют при комнатной температуре.
16. Способ по п.1, где стадию (a) осуществляют в течение периода инкубации от 3 минут до 5 минут.
17. Способ лечения индивидуума, имеющего заболевание, с использованием средства, включающий:
обнаружение присутствия целевого аналита в ткани индивидуума с использованием множества конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела в соответствии со способом по п.1,
причем каждый полимерный фермент/первичное антитело содержит: (i) множество полимерных ферментов, причем каждый полимерный фермент содержит множество молекул ферментов; и (ii) антитело, которое распознает целевой аналит,
причем множество конъюгатов полимерного фермента/первичного антитела содержит популяцию полимерных ферментов, имеющих распределение по размеру, охарактеризованное по числу молекул фермента на каждый полимерный фермент,
причем каждый конъюгат полимерного фермента/первичного антитела имеет молекулярную массу от 400 кДа до 2000 кДа,
выбор индивидуума, подходящего для лечения средством, на основе присутствия целевого аналита; и
введение индивидууму эффективного количества средства,
причем средство представляет собой терапевтическое антитело.
18. Способ по п.17, в котором антитело, которое специфично связывает целевой аналит, и терапевтическое антитело представляют собой одно и то же.
| Подкатушечный узел лентопротяжногоМЕХАНизМА | 1979 |
|
SU842948A1 |
| СПОСОБ ГЕРМЕТИЗАЦИИ ТРАНСФОРМАТОРОВ НИЗКОЙЧАСТОТЫ | 0 |
|
SU175560A1 |
| СУДНО С БОЛЬШИМ ВОДОИЗМЕЩАЮЩИМ КОРПУСОМ | 2017 |
|
RU2734365C2 |
| LIU R | |||
| et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Cell | |||
| Moll | |||
| Med., 2008, V.12, pp.241-257 | |||
| ФРОЛОВА И.И | |||
| и др | |||
| КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИСКЕРАТОЗОВ ШЕЙКИ МАТКИ И ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ | |||
