АНТИТЕЛА И ИХ КОНЪЮГАТЫ Российский патент 2021 года по МПК A61K39/00 A61K39/44 A61P27/02 

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОРЕДСТВОМ ССЫЛКИ ЛЮБЫХ ПРИОРИТЕТНЫХ ЗАЯВОК

Любые и все заявки, для которых иностранные или отечественные притязания на приоритет указаны в информационном листке заявки, поданном вместе с настоящей заявкой, включены в настоящее описание посредством ссылки в соответствии с 37 CFR § 1.57.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла KDIAK004.txt, созданного 28 декабря 2016 года, размер которого составляет 18231 байт. Информация перечня последовательностей в электронном формате включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и их конъюгатам и способам применения и получения указанных антител, их конъюгатов и других белковых конъюгатов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Диабетическая ретинопатия является основной причиной слепоты у людей в возрасте от 20 до 64 лет. Engelgau M, Geiss L, Saaddine J, Boyle J, et al. 2004. The Evolving Diabetes Burden in the United States. Ann of Int Med. 140 (11): 945-951. В Соединенных Штатах диабетическая ретинопатия составляет приблизительно 12% новых случаев слепоты. Как правило, в случаях диабетической ретинопатии кровеносные сосуды сетчатки разбухают, и жидкость истекает в заднюю область глаза. Гипергликемия вызывает интрамуральность и утолщение базальной мембраны, что приводит к протеканию или проницаемости кровеносных сосудов.

При диабетической ретинопатии изменения уровня глюкозы в крови вызывают изменения в кровеносных сосудах сетчатки. Все люди с сахарным диабетом подвержены этому риску. Чем дольше у человека диабет, тем выше риск развития какого-либо офтальмологического заболевания. От 40 до 45 процентов американцев с диабетом имеют какую-либо стадию развития диабетической ретинопатии. Causes and Risk Factors. Diabetic Retinopathy. United States National Library of Medicine. 15 September 2009.

Диабетическая ретинопатия впервые проявляется при развитии микроаневризмы сетчатки. Микроаневризмы возникают при набухании капилляров (очень маленьких кровеносных сосудов), которые питают сетчатку. Наличие относительно небольшого числа микроаневризм обычно не вызывает проблем со зрением. Однако, если ретинопатия развивается до более поздних стадий, существует значительный риск потери зрения. Такую раннюю стадию ретинопатии называют фоновой диабетической ретинопатией или непролиферативной диабетической ретинопатией (НПДР). Хотя пациенты с НПДР обычно не проявляют симптомов, раннее выявление ретинопатии имеет решающее значение, поскольку, если болезнь переходит к более поздним стадиям, значительная потеря зрения становится очень вероятной.

На следующей стадии диабетической ретинопатии неоваскуляризация происходит в задней области глаза (пролиферативная диабетическая ретинопатия). Новообразованные сосуды протекают, и сосуды могут лопнуть, а затем кровоточить и привести к тому, что зрение будет размытым или замутненным. Из-за недостатка кислорода в глазах происходит дальнейшая неоваскуляризация. Кровеносные сосуды растут вдоль сетчатки и в стекловидном теле. По мере того, как эти сосуды лопнаются, происходит дальнейшее кровотечение, и сетчатка может быть сильно повреждена или разрушена. Накопление жидкости в макуле из-за протекания кровеносных сосудов называется диабетическим отеком макулы. У многих пациентов с диабетической ретинопатией развивается диабетический отек макулы.

Обычно для пациентов с диабетической ретинопатией применяют три пути лечения: лазерная хирургия, инъекция кортикостероидов и инъекция агентов против VEGF (например, AVASTIN® (бевацизумаб), LUCENTIS® (ранибизумаб) и Eylea® (афлиберцепт)). Хотя лазерная хирургия обычно эффективна при лечении диабетической ретинопатии, повреждение сетчатки, вызванное лазером, является частым побочным эффектом. Стероидные препараты, такие как триамцинолон ацетонид, вводят путем инъекции в стекловидное тело для лечения диабетической ретинопатии. Однако для лечения диабетической ретинопатии вводить стероидные растворы нужно часто. Кроме того, обработка стекловидного тела стероидами связана с развитием катаракты, стероид-индуцированной глаукомы и эндофтальмита.

Другим способом лечения диабетической ретинопатии является инъекция в стекловидное тело агентов против VEGF. В связи с этим недавно были одобрены LUCENTIS® (ранибизумаб) и EYLEA® (афлиберцепт) для лечения диабетической ретинопатии у пациентов с диабетическим отеком макулы. VEGF-направленная терапия эффективна не только при диабетической ретинопатии, но также при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), такой как неоваскулярная (влажная форма) ВМД.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитела против VEGF-A, связанного через цистеин вне вариабельной области антитела с полимером, содержащим фосфорилхолин, где указанный цистеин добавляли с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Необязательно, антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, а тяжелая цепь включает Fc область. Необязательно, антитело против VEGF-A представляет собой иммуноглобулин G (IgG). Необязательно, цистеин находится в Fc области тяжелой цепи. Необязательно, тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10), и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а положение 221 (посредством последовательного подсчета как в SEQ ID NO: 3) представляет собой Т, и легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13), и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14), а положение 4 по Кабату представляет собой L. Необязательно, изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой человеческий IgG1.

Необязательно, константный домен тяжелой цепи антитела против VEGF-A IgG1 имеет одну или более мутаций относительно константного домена IgG1 для модуляции эффекторной функции. Мутации необязательно находятся в одном или более следующих аминокислотных положений (нумерация EU): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X и P331X, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту. Необязательно, мутации выбирают из группы, состоящей из (нумерация EU): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S. Необязательно, мутации представляют собой (нумерация EU) L234A, L235A и G237A. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция снижена. В некоторых вариантах осуществления CDC, ADCC и/или ADCP уменьшено по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или более процентов. В некоторых вариантах осуществления CDC опосредовано связыванием Fc с C1q, ADCC и ADCP опосредованы связыванием Fc с различными Fc-гамма-рецепторами, и каждое из этих связывающих взаимодействий уменьшено по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или более процентов.

Остаток цистеина необязательно находится в тяжелой цепи антитела против VEGF-A и представляет собой необязательно Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU). Необязательно, тяжелая цепь антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2. Необязательно, цистеин представляет собой L443C (нумерация EU).

Необязательно полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономеры 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфата (MPC), как указанный ниже:

.

Так, что полимер включает следующие повторяющиеся звенья:

где n представляет собой целое число от 1 до 3000, а волнистые линии указывают точки присоединения между мономерными звеньями в полимере.

Полимер необязательно имеет три или более луча, или синтезирован с инициатором, включающим 3 или более сайтов инициации полимера. Необязательно, полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 лучей, или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера. Необязательно, полимер имеет 2, 3, 6 или 9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера. Необязательно, полимер имеет 9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 9 сайтов инициации полимера.

Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да, определяемую с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с многоугловым светорассеянием (MALS) (здесь и далее "SEC-MALS"). Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 500000 до приблизительно 1000000 Да. Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 800000 Да.

Необязательно, конъюгат антитела очищают, и полимер является полидисперсным. Необязательно, полимер имеет индекс полидисперсности (ИП) меньше, чем 1,2. В некоторых вариантах осуществления любой из обеспеченных здесь конъюгатных растворов может иметь индекс полидисперсности (ИП) равный или меньше 1,8, например, меньше или равный 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1.

Необязательно, конъюгат антитела, включающий иммуноглобулин G (IgG) против VEGF-A, связан с полимером, включающим мономеры MPC, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, а последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2, и где антитело связано только в положении C449 в последовательности SEQ ID NO: 1 с полимером. Необязательно, полимер имеет 9 лучей; и полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 800000 Да.

Необязательно, конъюгат антитела, включающий иммуноглобулин G (IgG) против VEGF-A, связан с полимером, включающим мономеры MPC, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, а последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2, и где антитело связано только в C443 (нумерация EU) с полимером. Необязательно, полимер имеет 9 лучей; и полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 800000 Да.

Необязательно конъюгат антитела имеет следующую структуру:

,

где каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой H, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой L; полимер связан с антителом против VEGF-A через сульфгидрильную группу C449 в последовательности SEQ ID NO: 1, причем эта связь изображена на одной из тяжелых цепей; PC представляет собой , где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера; где X представляет собой a) OR, где R представляет собой H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными так, что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 представляет собой 2500 плюс или минус 15 %. Необязательно, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются независимо целыми числами от 0 до 3000. Необязательно n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются независимо целыми числами от 0 до 500. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой OR, где R представляет собой сахар, аминоалкил, монозамещенный, полизамещенный или незамещенный варианты следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбонилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, -CO-O-R₇, карбонил -CCO-R₇, -CO-NR₈R₉, - (CH₂)_n-COOR₇, -CO-(CH)_n-COOR₇, -(CH₂)_n-NR₈R₉, сложный эфир, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, где n представляет собой целое число от 1 до 6, где каждый из R₇, R₈ и R₉ отдельно выбирают из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, монозамещенного, полизамещенного или незамещенного вариантов следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, 5-членное кольцо и 6-членное кольцо.

Необязательно, конъюгат антитела имеет следующую структуру:

где каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой H, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой L; полимер связан с антителом против VEGF-A через сульфгидрильную группу C443 (нумерация EU), эта связь изображена на одной из тяжелых цепей; PC представляет собой , где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера; где X представляет собой a) OR, где R представляет собой H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными так, что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 представляет собой 2500 плюс или минус 15 %. Необязательно, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются независимо целыми числами от 0 до 3000. Необязательно n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются независимо целыми числами от 0 до 500. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой OR, где R представляет собой сахар, аминоалкил, монозамещенный, полизамещенный или незамещенный варианты следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбонилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, -CO-O-R₇, карбонил -CCO-R₇, -CO-NR₈R₉, -(CH₂)_n-COOR₇, -CO-(CH)_n-COOR₇, -(CH₂)_n-NR₈R₉, сложный эфир, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, где n представляет собой целое число от 1 до 6, где каждый из R₇, R₈ и R₉ отдельно выбирают из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, монозамещенного, полизамещенного или незамещенного вариантов следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, 5-членное кольцо и 6-членное кольцо.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела обеспечен, как описано выше, в жидком растворе. Необязательно жидкий раствор содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело против VEGF-A, которое включает тяжелую цепь и легкую цепь. Тяжелая цепь включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а положение 221 (посредством последовательного подсчета, как в SEQ ID NO: 3) представляет собой Т, а легкая цепь включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14), а положение 4 по Кабату представляет собой L. Необязательно, изотип тяжелой цепи представляет собой IgG1, где константный домен IgG1 имеет одну или более следующих мутаций для модуляции эффекторной функции (нумерация EU): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S. Необязательно, антитело имеет (нумерация EU) L234A, L235A и G237A. Необязательно, последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания. Способ включает введение конъюгата антитела, как то, что описано выше, или фармацевтической композиции, как та, что описана выше. Необязательно, офтальмологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), патологической миопии, болезни фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзии ветвей центральной вены сетчатки (ОВЦВС), неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, ретинопатии недоношенных (РН), субконъюнктивального кровоизлияния и гипертонической ретинопатии. Необязательно, заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ получения конъюгата антитела, включающего антитело против VEGF-A, конъюгированное с полимером, содержащим фосфорилхолин. Способ включает стадию: конъюгирования антитела против VEGF-A с полимером, содержащим фосфорилхолин; где антитело против VEGF-A включает остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, и где цистеин находится вне вариабельной области антитела; где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает специфичную к сульфгидрилу реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из малеимида, винилсульфона, ортопиридилдисульфида и иодацетамида; и где специфичная к сульфгидрилу реакционноспособная группа на полимере, содержащем фосфорилхолин, взаимодействует с остатком цистеина на антителе против VEGF-A с получением конъюгата антитела.

Необязательно, антитело против VEGF-A представляет собой иммуноглобулин G (IgG), а цистеин находится в Fc области антитела. Необязательно, антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, где тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а положение 221 (посредством последовательного подсчета, как в SEQ ID NO: 3) представляет собой T, и легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14), а положение 4 по Кабату представляет собой L. Необязательно, изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой IgG1.

Необязательно, константный домен IgG1 имеет одну или более мутаций относительно константного домена IgG1 для модуляции эффекторной функции. Необязательно, мутации находятся в одном или более следующих аминокислотных положений (нумерация EU): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X и P331X, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту. Необязательно, мутации выбраны из группы, состоящей из (нумерация EU) E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S. Необязательно, мутации представляют собой (нумерация EU) L234A, L235A и G237A.

Необязательно, остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, выбирают из группы, состоящей из Q347C (нумерация EU) и L443C (нумерация EU). Необязательно, остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, представляет собой L443C (нумерация EU). Необязательно, последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.

Необязательно, полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономеры 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфата (MPC), как представленый ниже:

,

Так, что полимер включает следующие повторяющиеся звенья:

где n представляет собой целое число от 1 до 3000, а волнистые линии указывают точки присоединения между мономерными звеньями в полимере.

Необязательно, полимер имеет три или более луча. Необязательно, полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 лучей. Необязательно, полимер имеет 2, 3, 6 или 9 лучей. Необязательно, полимер имеет 9 лучей.

Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до 1750000 Да. Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 500000 до 1000000 Да. Необязательно, полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до 800000 Да.

Необязательно, способ включает дополнительную стадию, включающую стадию взаимодействия антитела против VEGF-A с тиоловым восстановителем в условиях, при которых получают восстановленную сульфгидрильную группу цистеина с образованием восстановленного антитела против VEGF-A, в котором все цистеиновые остатки восстановлены. Необязательно, тиоловый восстановитель выбран из группы, состоящей из трис[2-карбоксиэтил]фосфин гидрохлорида (TCEP), дитиотреитола (DTT), дитиоэритритола (DTE), боргидрида натрия (NaBH₄), цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃), β-меркаптоэтанола (BME), цистеингидрохлорида и цистеина. Необязательно, тиоловый восстановитель представляет собой TCEP. Необязательно, тиоловый восстановитель находится в от 1 до 100-кратном молярном избытке относительно концентрации антитела против VEGF-A. Необязательно, тиоловый восстановитель находится в от 20 до 50-кратном молярном избытке относительно концентрации антитела против VEGF-A.

Необязательно, способ дополнительно включает стадии удаления тиолового восстановителя из восстановленного антитела против VEGF-A и обработки восстановленного антитела против VEGF-A окислителем. Необязательно, окислитель представляет собой воздух, водный CuSO₄ или дегидроаскорбиновую кислоту (ДАК). Необязательно, способ дополнительно включает стадию очистки конъюгата антитела.

Необязательно конъюгат антитела очищают способом, выбранным из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии и их комбинаций. Необязательно, очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 20 % биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A. Необязательно, очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 50 % биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A. Необязательно, очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 90 % биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A. Необязательно, очищенный конъюгат антитела имеет увеличенный период полувыведения относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A. Необязательно, очищенный конъюгат антитела имеет по меньшей мере 1,5-кратное увеличение периода полувыведения относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.

Необязательно, способ дополнительно включает стадию полимеризации свободнорадикально полимеризуемого мономера, содержащего фосфорилхолин,, в полимеризационной среде с получением полимера, содержащего фосфорилхолин, причем среда содержит: радикально полимеризуемый мономер, содержащий фосфорилхолин; катализатор на основе переходного металла M_t^(q-1)+, где M_t представляет собой переходный металл, q представляет собой максимальную степень окисления металла, а q-1 представляет собой степень окисления металла, где металл может действовать как катализатор, катализатор на основе переходного металла подают в виде соли формы M_t^(q-1)+X'_(q-1), где X' представляет собой противоион или группу, или где катализатор на основе переходного металла подают in situ путем обеспечения соли неактивного металла в его высшей степени окисления M_t^q+X'_q вместе с восстановителем, который способен восстанавливать переходный металл из окисленного неактивного состояния до восстановленного активного состояния; лиганд; и инициатор.

Необязательно, радикально полимеризуемый фосфорилхолинсодержащий мономер представляет собой

j

i
,

где R1 представляет собой Н или С_1-6 алкил; каждый из R2, R3, R4 представляет собой метил; и каждый из i и j равен 2.

Необязательно, Mt выбирают из группы, состоящей из Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au и Ag. Необязательно, металлический катализатор подают в виде соли формы M_t^(q-1)+X'_(q-1). Необязательно, M_t^(q-1)+ выбирают из группы, состоящей из Cu¹⁺, Fe²⁺, Ru²⁺, Cr²⁺, Mo²⁺, W²⁺, Mn³⁺, Rh³⁺, Re²⁺, Co⁺, V²⁺, Zn⁺, Au⁺, и Ag⁺, и X' выбран из группы, состоящей из галогена, C_1-6 алкокси, (SO₄)_1/2, (PO₄)_1/3, (R7PO₄)_1/2, (R7₂PO₄), трифлата, гексафторфосфата, метансульфоната, арилсульфоната, CN и R7CO₂, где R7 представляет собой Н или неразветвленную или разветвленную C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним-пятью атомами галогена. Необязательно, M_t^(q-1)+ представляет собой Cu¹⁺ и X' представляет собой Br. Необязательно, M_t^(q-1)+ подают in situ. Необязательно, M_t^q+X_q представляет собой CuBr₂.

Необязательно, восстановитель представляет собой неорганическое соединение. Необязательно, неорганическое соединение выбирают из группы, состоящей из соединения серы с низкой степенью окисления, гидросульфита натрия, сульфита натрия, неорганической соли, содержащей ион металла, металла, гидразингидрата и производных таких соединений.

Необязательно, восстановитель представляет собой металл. Необязательно, восстановитель представляет собой Cu⁰.

Необязательно, восстановитель представляет собой органическое соединение. Необязательно, органическое соединение выбирают из группы, состоящей из алкилтиолов, меркаптоэтанола или карбонильных соединений, которые могут быть легко енолизованы, аскорбиновой кислоты, ацетилацетоната, камфосульфоновой кислоты, гидроксиацетона, восстанавливающих сахаров, моносахаридов, глюкозы, альдегидов и производных таких органических соединений.

Необязательно, лиганд выбирают из группы, состоящей из 2,2'-бипиридина, 4,4'-ди-5-нонил-2,2'-бипиридина, 4,4-динонил-2,2'- дипиридила, 4,4',4''-трис(5-нонил)-2,2':6',2''-терпиридина, N,N,N',N',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, трис(2-диметиламиноэтил)амина, N,N-бис(2-пиридилметил)октадециламина, N,N,N',N'-тетра[(2-пиридил)метил]этилендиамина, трис[(2-пиридил)метил]амина, трис(2-аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-бутокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-(2-этилгексокси)-3-оксопропил)аминоэтил)амина и трис(2-бис(3-додекокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина. Необязательно, лиганд представляет собой 2,2'-бипиридин.

Необязательно, инициатор имеет структуру:

где R1 представляет собой нуклеофильную реакционноспособную группу, R2 содержит линкер, а R3 содержит фрагмент инициатора полимерного синтеза, имеющий структуру

,

где R4 и R5 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкилена, алкокси, карбоксиалкила, галогеналкила, циклоалкила, циклического алкилового эфира, алкенила, алкенилена, алкинила, алкинилена, циклоалкилена, гетероциклоалкила, гетероциклоалкилена, арила, арилена, ариленокси, гетероарила, амино, амидо и любой их комбинации; Z представляет собой галоген или NCS; и s представляет собой целое число от 1 до 20.

Необязательно, Z представляет собой Br, и каждый из R4 и R5 представляет собой метил. Необязательно, R1 выбирают из группы, состоящей из NH₂-, OH- и SH-. Необязательно, R1 представляет собой NH₂-. Необязательно, R2 представляет собой алкил, замещенный алкил, алкилен, алкокси, карбоксиалкил, галогеналкил, циклоалкил, циклический алкиловый эфир, алкенил, алкенилен, алкинил, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкил, гетероциклоалкилен, арил, арилен, ариленокси, гетероарил, амино, амидо, и любую их комбинацию. Необязательно, R2 представляет собой

где α и β являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 20.

Необязательно, каждый из α и β равен 4. Необязательно, R3 дополнительно включает

,

где R6, R7 и R8 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из

,

и

,

где Z представляет собой NCS, F, Cl, Br или I. Необязательно, Z представляет собой Br. Необязательно, каждый из R6, R7 и R8 представляет собой

.

Необязательно, инициатор имеет структуру

,

где A и B являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 2 до 12, а Z представляет собой любой галогенид, такой как Br. Необязательно, A и B каждое равно 4.

Необязательно, способ дополнительно включает стадию взаимодействия полимера с малеимидным реагентом с получением полимера, имеющего концевой малеимид. Необязательно, соединение малеимида представляет собой

.

В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь варианты помогают избежать одну или более проблем, связанных с другими способами или формами лечения. Например, с их помощью можно снизить частоту введения инъекции в стекловидное тело до менее 1 раза в месяц, поскольку такие инъекции в стекловидное тело могут быть болезненными и нуждаться в клинических условиях. Кроме того, пациенты с диабетической ретинопатией, чье зрение относительно не нарушено, могут быть устойчивы к ежемесячным инъекциям в стекловидное тело и, таким образом, другие формы лечения могут стать неэффективными. Таким образом, существует потребность в лечении диабетической ретинопатии с менее частым дозированием. В этом контексте, лечение диабетической ретинопатии можно применять на ранней стадии заболевания, чтобы предотвратить прогрессирование заболевания и связанные с ним опасные для зрения события.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела включает (1) антитело против VEGF-A и (2) полимер, содержащий фосфорилхолин. Полимер ковалентно связан с антителом через цистеин вне вариабельной области антитела, и указанный цистеин добавлен с промощью технологии рекомбинантных ДНК.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления полимер, конъюгированный с антителом, имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да, определяемую с помощью эксклюзионной хроматографии с многоугловым светорассеянием (здесь и далее "SEC-MALS").

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A включает тяжелую цепь и легкую цепь. Тяжелая цепь включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а легкая цепь включает CDRL1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDRL3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14), а изотип тяжелой цепи представляет собой IgG1. Константный домен IgG1 имеет одну или более следующих мутаций для снижения эффекторной функции (нумерация EU): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S.

В некоторых вариантах осуществления в любом из способов можно применять антитело против VEGF-A, которое включает легкую цепь и тяжелую цепь, где тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления антитело включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая включает SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческий IgG1, а константный домен тяжелой цепи включает одну или более мутаций, которые снижают иммуно-опосредованную эффекторную функцию.

В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно конъюгируют с полимером с образованием биоконъюгата, где биоконъюгат имеет молекулярную массу от приблизительно 450000 до приблизительно 1900000 Да.

В некоторых вариантах осуществления индекс полидисперсности (ИП) равен или меньше 1,5.

В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с VEGF-A, включает CDR_H1, который представляет собой CDR_H1 в SEQ ID NO: 1; CDR_H2, который представляет собой CDR_H2 в SEQ ID NO: 1; CDR_H3, который представляет собой CDR_H3 в SEQ ID NO: 1; CDR_L1, который представляет собой CDR_L1 в SEQ ID NO: 2; CDR_L2, который представляет собой CDR_L2 в SEQ ID NO: 2; CDR_L3, который представляет собой CDR_L3 в SEQ ID NO: 2; по меньшей мере одну из следующих мутаций: L234A, L235A и G237A (нумерация EU); и по меньшей мере одну из следующих мутаций: Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU).

В некоторых вариантах осуществления антитело включает все три из следующих мутаций (нумерация EU) L234A, L235A и G237A, и где антитело включает L443C (нумерация EU).

В некоторых вариантах осуществления способ получения конъюгированного белка включает восстановление одного или более цистеинов в белке с образованием декэппированного белка в растворе, повторное окисление декэппированного белка для восстановления по меньшей мере одной дисульфидной связи в восстановленном белке, при обеспечении того, что сконструированный остаток цистеина в белке остается в свободной тиоловой форме, чтобы таким образом образовать в растворе повторно окисленный декэппированный белок, и добавление по меньшей мере одного эксципиента к раствору, где эксципиент уменьшает осаждение белка, индуцированное полимером. Способ дополнительно включает добавление полимера к раствору и конъюгирование полимера с повторно окисленным декэппированным белком в сконструированном остатке цистеина с образованием конъюгированного белка. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой антитело, гибридный белок, содержащий антитело, или их связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления эксципиент представляет собой кислоту или основание. В некоторых вариантах осуществления эксципиент выбирают из группы, состоящей из по меньшей мере одного из детергента, сахара и заряженной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления взаимодействие полимера с восстановленным белком происходит в водной среде при значении рН от 6,0 до 8,5. В некоторых вариантах осуществления количество восстановленного белка меньше, чем количество полимера. В некоторых вариантах осуществления конъюгирование полимера с белком осуществляют при температуре от 2 до 37°С. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает способ взаимодействия раствора, включающего конъюгированный белок, со средой для ионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии, или со средой для аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления среда для ионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии, или среда для аффинной хроматографии отделяет конъюгированный белок от свободного полимера и повторно окисленного декэппированного белка. В некоторых вариантах осуществления полимер включает цвиттер-ион. В некоторых вариантах осуществления полимер включает фосфорилхолин. В некоторых вариантах осуществления полимер включает линкер PEG, соединяющий центр точки разветвления полимера с малеимидной функциональной группой.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен конъюгат антитела против VEGF, который способен блокировать по меньшей мере 90 % взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF рецептором.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен конъюгат антитела против VEGF, который блокирует по меньшей мере 95 % взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF рецептором.

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело против VEGF, которое блокирует по меньшей мере 90 % взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF рецептором.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 представлено соединение L.

На фиг. 2 представлено соединение K.

На фиг. 3 представлено получение OG1802 из R3707.

На фиг. 4 представлено OG1786.

На фиг. 5 представлено получение OG1546 из OG1550.

На фиг. 6 представлено получение OG1784 из OG1546 и OG1563.

На фиг. 7 представлено получение OG1405 из OG1784.

На фиг. 8 представлено получение OG 1785 из OG1405.

На фиг. 9 представлено получение OG1786 из OG1785.

На фиг. 10 представлено OG1802.

На фиг. 11 представлено соединение E.

На фиг. 12 представлены некоторые варианты осуществления тяжелой цепи антитела против VEGF-A с некоторыми мутациями эффекторной функции и L443C (нумерация EU, которая представляет собой положение 449 в последовательности SEQ ID NO: 1).

На фиг. 13 представлены некоторые варианты осуществления легкой цепи антитела против VEGF-A (SEQ ID NO: 2).

На фиг. 14 представлены некоторые варианты осуществления тяжелой цепи бевацизумаба (SEQ ID NO: 3).

На фиг. 15 представлены некоторые варианты осуществления легкой цепи бевацизумаба (SEQ ID NO: 4).

На фиг. 16 представлены некоторые варианты осуществления тяжелой цепи ранибизумаба (SEQ ID NO: 5).

На фиг. 17 представлены некоторые варианты осуществления легкой цепи ранибизумаба (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 18 представлены некоторые варианты осуществления способа получения конъюгата антитела.

На фиг. 19 представлен ионообменный анализ (поглощение A280) реакций от A до G.

На фиг. 20 представлено влияние различных молекул против VEGF на связывание биотин-VEGF со связанным на планшете белком VEGFR ECD-Fc, и их значения IC50.

На фиг. 21 представлена аффинность связывания OG1950 с VEGF, измеренная с помощью кинетики одиночного цикла BIAcore.

На фиг. 22 представлено связывание OG1950 с Fc-гамма-рецептором I.

На фиг. 23 представлено связывание OG1950 с Fc-гамма-рецептором IIIa.

На фиг. 24 представлено связывание QG1950 с белком комплемента человека C1q.

На фиг. 25 представлены результаты анализа пролиферации (включая значения IC50).

На фиг. 26 представлены результаты кинетики одиночного цикла связывания VEGF с агентами против VEGF.

На фиг. 27 представлены некоторые варианты осуществления последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей.

На фиг. 28 представлены результаты скрининга после инкубации различных образцов (различных эксципиентов) в растворе полимера (OG1802) в течение 20 часов при температуре от 2 до 8°С.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам против VEGF-A. В некоторых вариантах осуществления эти антитела могут быть конъюгированы с фрагментом, увеличивающим период полувыведения. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может быть применен для лечения определенных состояний, таких как диабетическая ретинопатия и/или возрастная макулярная дегенерация.

Также настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатных композиций антител (любого типа антитела). В некоторых вариантах осуществления эти способы обеспечивают пониженное образование агрегатов или более высокую эффективность образования желаемого конъюгата антитела.

Эти и дополнительные варианты осуществления раскрыты ниже, после раздела с определениями.

Определения

"Неоваскулярное заболевание" представляет собой заболевание или болезнь, характеризующееся измененным, с нарушенной регуляцией или нерегулируемым ангиогенезом. Примеры неоваскулярных заболеваний включают неопластическую трансформацию (например, рак) и офтальмологические неоваскулярные заболевания, включая диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию.

"Офтальмологическое неоваскулярное" заболевание представляет собой заболевание, характеризующееся измененным, с нарушенной регуляцией или нерегулируемым ангиогенезом в глазах пациента. Такие нарушения включают неоваскуляризацию диска зрительного нерва, неоваскуляризацию радужки, неоваскуляризацию сетчатки, неоваскуляризацию хориоидеи, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию стекловидного тела, глаукому, паннус, птеригиум, отек макулы, диабетическую ретинопатию, диабетический отек макулы, сосудистую ретинопатию, дегенерацию сетчатки, увеит, воспалительные заболевания сетчатки и пролиферативную витреоретинопатию.

Термин антитело включает интактные антитела и их связывающие фрагменты. Связывающий фрагмент относится к молекуле, отличной от интактного антитела, содержащей часть интактного антитела, которое связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры связывающих фрагментов включают Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; димеры; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. scFv антитела описаны в Houston JS. 1991. Methods in Enzymol. 203:46-96. Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики домена VH, а именно способность собираться вместе с доменом VL, или домена VL, а именно, возможность собираться вместе с доменом VH в функциональный антигенсвязывающий сайт, тем самым обеспечивая антигенсвязывающее свойство полноразмерных антител.

Специфическое связывание антитела с его целевым антигеном(ами) означает аффинность по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ M^-1. Специфическое связывание в большей степени обнаруживают и отличают от неспецифического связывания, возникающего по меньшей мере в одной неродственной мишени. Специфическое связывание может быть результатом образования связей между конкретными функциональными группами или конкретным пространственным состоянием (например, по типу "ключа и замка"), тогда как неспецифическое связывание обычно является результатом сил Ван-дер-Ваальса. Однако специфическое связывание не обязательно означает, что антитело или гибридный белок связывает одну и только одну мишень.

Основная структурная единица антитела представляет собой тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно от 50 до 70 кДа). Аминотерминальная часть каждой цепи включает вариабельную область приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. Эта вариабельная область первоначально экспрессируется связанной с расщепляемым сигнальным пептидом. Вариабельную область без сигнального пептида иногда называют зрелой вариабельной областью. Так, например, зрелая вариабельная область легкой цепи означает вариабельную область легкой цепи без сигнального пептида легкой цепи. Однако отношение к вариабельной области не означает, что обязательно присутствует сигнальная последовательность; и на самом деле сигнальные последовательности расщепляются, когда антитела или гибридные белки экспрессируются и секретируются. Пара вариабельных областей тяжелой и легкой цепей определяет область связывания антитела. Карбокситерминальная часть легкой и тяжелой цепей соответственно определяет константные области легкой и тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи главным образом отвечает за эффекторную функцию. В IgG антителах константная область тяжелой цепи разделена на области CH1, шарнирную область, CH2 и CH3. Область CH1 связывается с константной областью легкой цепи дисульфидной и нековалентной связью. Шарнирная область обеспечивает гибкость между связывающей и эффекторной областями антитела, а также обеспечивает сайты для межмолекулярного дисульфидного связывания между двумя константными областями тяжелой цепи в тетрамерной субъединице. Области CH2 и CH3 являются основным сайтом эффекторных функций и связывания FcR.

Легкие цепи делят на каппа или лямбда. Тяжелые цепи делят на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. В легкой и тяжелой цепях вариабельная и константная области соединены участком "J", содержащим приблизительно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает участок "D", содержащий приблизительно 10 или более аминокислот (см., Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7) (включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).

Зрелые вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей образуют сайт связывания антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два сайта связывания, то есть является двухвалентным. В природных антителах сайты связывания одинаковы. Однако можно получить биспецифические антитела, в которых два сайта связывания различны (см., например, Songsivilai S, Lachmann PC. 1990. Bispecific antibody: a tool for diagnosis and treatment of disease. Clin Exp Immunol. 79:315-321; Kostelny SA, Cole MS, Tso JY. 1992. Formation of bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol. 148: 1547-1553). Все вариабельные области имеют одну и ту же общую структуру из относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность или CDR. CDR из двух цепей каждой пары выровнены по каркасным областям, что позволяет связывание со специфическим эпитопом. От N-конца до C-конца как легкие, так и тяжелые цепи включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Для удобства CDR вариабельные тяжелой цепи можно назвать CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; CDR вариабельной легкой цепи можно назвать CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3. Распределение аминокислот к каждому домену осуществляется в соответствии с определениями Kabat EA, et al. 1987 и 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD) или Chothia C, Lesk AM. 1987. Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins. J Mol Biol 196:901-917; Chothia C, et al. 1989. Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions. Nature 342:877-883. Широко применяется система нумерации, предложенная Kabat (нумерация по Кабату), где соответствующим остаткам между различными вариабельными областями тяжелой цепи или между различными вариабельными областями легкой цепи присваивается одинаковый номер. Хотя нумерацию по Кабату можно применять и для константных областей антитела, чаще всего применяют нумерацию EU, как это имеет место в настоящей заявке. Хотя конкретные примеры представлены для иллюстративных антител, описанных здесь, будет понятно, что после экспрессии белковых цепей от одной до нескольких аминокислот на амино или карбоксильном конце легкой и/или тяжелой цепи, в частности на C-концевом остатке лизина тяжелой цепи, могут отсутствовать или дериватизироваться пропорционально, или во всех молекулах.

Термин "эпитоп" относится к сайту на антигене, с которым связывается антитело или внеклеточный сегмент ловушки. Эпитоп на белке может быть образован из заменимых аминокислот или незаменимых аминокислот, соединенных третичной укладкой одного или нескольких белков. Эпитопы, образованные из заменимых аминокислот (также известны как линейные эпитопы), обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные путем третичной укладки (также известны как конформационные эпитопы), обычно разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и, обычно, по меньшей мере 5 или от 8 до 10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

Антитела, которые распознают одинаковые или перекрывающиеся эпитопы, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела конкурировать с другим антителом за связывание с целевым антигеном. Эпитоп антитела также можно определить с помощью рентгеновской кристаллографии антитела (или фрагмента Fab), связанного с его антигеном для идентификации контактных остатков.

Альтернативно, два антитела имеют одинаковый эпитоп, если все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание другого. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание другого.

Конкуренцию между антителами определяют анализом, в котором тестируемое антитело ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с обычным антигеном (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 50: 1495, 1990). Тестируемое антитело конкурирует с эталонным антителом, если избыток тестируемого антитела (например, по меньшей мере 2x, 5x, 10x, 20x или 100x) ингибирует связывание эталонного антитела по меньшей мере на 50 %. В некоторых вариантах осуществления тестируемое антитело ингибирует связывание эталонного антитела на 75 %, 90 % или 99 %, что определяют в анализе конкурентного связывания. Антитела, определенные в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающие тот же эпитоп, что и эталонное антитело, и антитела, связывающие смежный эпитоп, достаточно близкий к эпитопу, связанному с эталонным антителом для возникновения стерического несоответствия.

Термин "пациент" включает людей и другие субъекты, относящиеся к млекопитающим, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

Для целей классификации аминокислотных заместителей как консервативных, так и неконсервативных, аминокислоты сгруппированы следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислотные боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gin, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами того же класса. Неконсервативные замены включают замену представителя одного из этих классов представителем другого.

Процент идентичностей последовательностей определяют последовательностью антител, максимально выровненной с помощью системы нумерации по Кабату для вариабельной области или нумерации EU для константной области. После выравнивания, если область антитела субъекта (например, вся зрелая вариабельная область тяжелой или легкой цепи) сравнивают с той же областью эталонного антитела, процент идентичности последовательности между областями антитела субъекта и эталонного антитела равно числу положений, занятых той же аминокислотой, как в области антитела субъекта, так и в области эталонного антитела, деленному на общее количество выровненных положений двух областей, при этом пропуски не учитываются, умноженному на 100 для пересчета в проценты. Идентичности последовательностей других последовательностей можно определить путем выравнивания последовательностей с применением алгоритмов, таких как BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, с применением параметров пропуска по умолчанию или путем проверки и наилучшего выравнивания (т.е. в результате получается самый высокий процент сходства последовательностей в окне сравнения). Процент идентичностей последовательностей вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определения количества положений, в которых одинаковые остатки находятся в обеих последовательностях, чтобы получить количество совместимых положений, деления количества совместимых положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей.

Композиции или способы, "включающие" один или более из указанных элементов, могут включать другие элементы, не указанные конкретно. Например, композиция, которая включает антитело, может содержать антитело отдельно или в комбинации с другими веществами.

Термин "антителозависимая клеточная цитотоксичность" или АЗКЦ представляет собой механизм индуцирования клеточной гибели, который зависит от взаимодействия клеток-мишеней, нагруженных антителами (т.е. клеток, связанных с антителом) с иммунными клетками, обладающими литической активностью (также называемые эффекторными клетками). Такие эффекторные клетки включают естественные киллеры, моноциты/макрофаги и нейтрофилы. АЗКЦ инициируется взаимодействием между Fc областью антитела, связанного с клеткой, и рецепторами Fcγ, особенно FcγRI и FcγRIII, на иммунных эффекторных клетках, таких как нейтрофилы, макрофаги и естественные киллеры. Клетка-мишень элиминируется фагоцитозом или лизисом, в зависимости от типа эффекторной клетки. Гибель клетки-мишени, нагруженной антителами, происходит в результате активности эффекторных клеток.

Термин опсонизация, также известный как "антителозависимый клеточный фагоцитоз" или АЗКФ, относится к процессу, посредством которого клетки, нагруженные антителами, полностью или частично поглощаются фагоцитарными иммунными клетками (например, макрофагами, нейтрофилами и дендритными клетками), которые связываются с Fc областью иммуноглобулина.

Термин "комплементзависимая цитотоксичность" или КЗЦ относится к механизму индуцирования клеточной гибели, в котором Fc эффекторный домен(ы) связанного с мишенью антитела активирует серию ферментативных реакций, кульминацией которых является образование отверстий в мембране клетки-мишени. Как правило, комплексы антиген-антитело, такие как на клетках-мишенях, нагруженных антителами, связывают и активируют компонент комплемента Clq, который, в свою очередь, активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клеток-мишеней. Активация комплемента может также приводить к осаждению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, что облегчает АЗКЦ путем связывания рецепторов комплемента (например, CR3) на лейкоцитах.

Гуманизированное антитело представляет собой генетически сконструированное антитело, в котором CDR из "донорного" антитела, не являющегося человеческим, прививают в "акцепторные" последовательности антитела человека (см., например, Queen, US 5,530,101 и 5,585,089; Winter, US 5225539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,85,205, 6,881,557, Foote, US 6888557). Акцепторные последовательности антитела могут представлять собой, например, зрелую последовательность антитела человека, композит таких последовательностей, консенсусную последовательность последовательностей антитела человека или последовательность области зародышевой линии. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, имеющее некоторые или все CDR полностью или по существу из донорных антител, и каркасные последовательности вариабельной области и константных областей, если присутствуют, полностью или по существу из последовательностей антител человека. Аналогично, гуманизированная тяжелая цепь имеет по меньшей мере один, два и обычно все три CDR полностью или по существу из тяжелой цепи донорного антитела, и каркасные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи, если присутствуют, по существу из каркасных последовательностей вариабельной области и константной области тяжелой цепи человека. Подобным образом гуманизированная легкая цепь имеет по меньшей мере один, два и обычно все три CDR полностью или по существу из легкой цепи донорного антитела, и каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи, если присутствуют, по существу из каркасных последовательностей вариабельной области и константной области легкой цепи человека. Помимо нанотел и dAb, гуманизированное антитело содержит гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь. CDR в гуманизированном антителе по существу происходит из соответствующего CDR в антителе, не являющимся человеческим, когда по меньшей мере 85 %, 90 %, 95 % или 100 % соответствующих остатков (как определено по Кабату) идентичны между соответствующими CDR. Каркасные последовательности вариабельной области цепи антитела или константной области цепи антитела по существу происходят из каркасной последовательности вариабельной области человека или константной области человека соответственно, когда по меньшей мере 85 %, 90 %, 95 % или 100 % соответствующих остатков, как определено по Кабату, идентичны.

[0113] Хотя гуманизированные антитела часто включают все шесть CDR (которые могут быть такими, как определено по Кабату) из антитела мыши, они также могут быть получены с меньшим количеством всех CDR (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 CDR из антитела мыши) (например, De Pascalis R, Iwahashi M, Tamura M, et al. 2002. Grafting “Abbreviated” Complementary-Determining Regions Containing Specificity-Determining Residues Essential for Ligand Contact to Engineer a Less Immunogenic Humanized Monoclonal Antibody. J Immunol. 169:3076-3084; Vajdos FF, Adams CW, Breece TN, Presta LG, de Vos AM, Sidhu, SS. 2002. Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2 antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis. J Mol Biol. 320: 415-428; Iwahashi M, Milenic DE, Padlan EA, et al. 1999. CDR substitutions of a humanized monoclonal antibody (CC49): Contributions of individual CDRs to antigen binding and immunogenicity. Mol Immunol. 36:1079-1091; Tamura M, Milenic DE, Iwahashi M, et al. 2000. Structural correlates of an anticarcinoma antibody: Identification of specificity-determining regions (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only. J Immunol. 164:1432-1441).

Химерное антитело представляет собой антитело, в котором зрелые вариабельные области легкой и тяжелой цепей антитела, не являющегося человеческим (например, мыши), объединены с константными областями легкой и тяжелой цепи человека. Такие антитела по существу или полностью сохраняют специфичность связывания антитела мыши и составляют приблизительно две трети человеческой последовательности.

Венированное антитело представляет собой тип гуманизированного антитела, которое сохраняет некоторые и обычно все CDR и некоторые из не являющихся человеческими каркасных остатков вариабельной области антител, не являющихся человеческими, но заменяет другие каркасные остатки вариабельной области, которые могут участвовать в B- или Т-клеточных эпитопах, например, экспонированные остатки (Padlan EA. 1991. A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol Immunol. 28:489-98), с остатками из соответствующих положений последовательности антитела человека. Результатом является антитело, в котором CDR полностью или по существу из антитела, не являющегося человеческим, и каркасы вариабельной области антитела, не являющегося человеческим, делают более подобными человеческим посредством замен. Антитело человека может быть выделено из организма человека или иначе получено экспрессией генов иммуноглобулина человека (например, в трансгенной мыши, in vitro или фаговым дисплеем). Способы получения человеческих антител включают триомный способ по Östberg L, Pursch E. 1983. Human x (mouse x human) hybridomas stably producing human antibodies. Hybridoma 2:361-367; Östberg, Патент США 4,634,664; и Engleman et al., Патент США 4,634,666; применение трансгенных мышей, включающих гены иммуноглобулина человека (см, например, Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) и способы фагового дисплея (см., например, Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 и US 5,565,332).

"Полимер" относится к ряду мономерных групп, связанных друг с другом. Полимер состоит из нескольких звеньев одного мономера (гомополимер) или различных мономеров (гетерополимер). Полимеры с высокой молекулярной массой получают из мономеров, которые включают, но не ограничиваются ими, акрилаты, метакрилаты, акриламиды, метакриламиды, стиролы, винилпиридин, винилпирролидон и виниловые сложные эфиры, такие как винилацетат. Дополнительные мономеры применимы в полимерах с высокой молекулярной массой. Когда применяют два разных мономера, два мономера называются "сомономерами", что означает, что различные мономеры сополимеризуются с образованием единого полимера. Полимер может быть линейным или разветвленным. Когда полимер разветвлен, каждая полимерная цепь называется "луч полимера". Конец полимерного луча, связанный с фрагментом инициатора, является проксимальным концом, а растущий конец цепи луча полимера представляет собой дистальный конец. На растущем конце цепи луча полимера, конечная группа луча полимера может быть акцептором радикалов или другой группой.

"Инициатор" относится к соединению, способному инициировать полимеризацию с использованием мономеров или сомономеров. Полимеризацией может быть обычная свободнорадикальная полимеризация или контролируемая/"живущая" радикальная полимеризация, такая как радикальная полимеризация с переносом атома (ATRP), полимеризация путём обратимого присоединения и фрагментирования (RAFT) или полимеризация с нитроксильными стабильными радикалами (NMP). Полимеризация может быть "псевдо" контролируемой полимеризацией, такой как дегенеративный перенос. Когда инициатор подходит для ATRP, он содержит лабильную связь, которая может быть гомолитически расщеплена с образованием фрагмента инициатора I, являющегося радикалом, способным инициировать радикальную полимеризацию, и акцептора радикала I', который взаимодействует с радикалом растущей полимерной цепи для обратимого завершения полимеризации. Акцептор радикала I' обычно представляет собой галоген, но также может представлять собой органический фрагмент, такой как нитрил. В некоторых вариантах осуществления инициатор содержит одну или более 2-бромизобутиратных групп в качестве сайтов для полимеризации через ATRP.

"Химический линкер" относится к химическому фрагменту, который связывает две группы вместе, такие как фрагмент, увеличивающий период полувыведения, и белок. Линкер может быть расщепляемым или не расщепляемым. Расщепляемые линкеры могут быть гидролизуемыми, ферментативно расщепляемыми, чувствительными к рН, фотолабильными или дисульфидными линкерами, среди прочих. Другие линкеры включают гомобифункциональные и гетеробифункциональные линкеры. "Связующая группа" представляет собой функциональную группу, способную образовывать ковалентную связь, состоящую из одной или более связей с биоактивным агентом. Неограничивающие примеры включают примеры, проиллюстрированные в таблице 1 WO2013059137 (включен в качестве ссылки).

Термин "реакционноспособная группа" относится к группе, которая способна взаимодействовать с другой химической группой с образованием ковалентной связи, то есть является ковалентно реакционноспособной в подходящих реакционных условиях и обычно представляет собой точку присоединения для другого вещества. Реакционноспособная группа представляет собой фрагмент, такой как малеимид или сукцинимидиловый эфир, способный химически взаимодействовать с функциональной группой на другом фрагменте с образованием ковалентной связи. Реакционноспособные группы обычно включают нуклеофилы, электрофилы и фотоактивируемые группы.

"Фосфорилхолин", также обозначаемый как "PC", относится к:

где * обозначает точку присоединения. Фосфорилхолин представляет собой цвиттер-ионную группу и включает соли (такие как внутренние соли), и их протонированные и депротонированные формы.

"Полимер, содержащий фосфорилхолин " представляет собой полимер, который содержит фосфорилхолин. "Полимер, содержащий цвиттер-ион " относится к полимеру, который содержит цвиттерион.

Полимер, содержащий поли(акрилоилоксиэтилфосфорилхолин), относится к полимеру, содержащему 2-(акрилоилокси)этил-2-(триметиламмоний)этилфосфат (HEA-PC, показанный ниже в примере 6) в виде мономера.

Полимер, содержащий поли(метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин), относится к полимеру, содержащему 2-(метакрилоилокси)этил-2-(триметиламмоний)этилфосфат (HEMA-PC или MPC) в виде мономера (см. ниже):

Используемые здесь термины "MPC" и "HEMA-PC" взаимозаменяемы.

"Молекулярная масса" в контексте полимера может быть выражена как среднечисленная молекулярная масса или среднемассовая молекулярная масса, или пиковая молекулярная масса. Если не указано иное, все ссылки на молекулярную массу в настоящем документе относятся к пиковой молекулярной массе. Эти определения молекулярной массы, среднечисленная (M_n), среднемассовая масса (M_w) и пиковая (M_p), могут быть измерены с применением эксклюзионной хроматографии или других методов жидкостной хроматографии. Можно также применить другие способы измерения значений молекулярной массы, такие как применение анализа концевых групп или измерение коллигативных свойств (например, понижение температуры замерзания, повышение температуры кипения или осмотическое давление) для определения среднечисленной молекулярной массы, или применение методов рассеяния света, ультрацентрифугирования или определения вязкости для определения среднемассовой молекулярной массы. В некоторых вариантах осуществления молекулярную массу измеряют с помощью SEC-MALS (эксклюзионной хроматографии с многоугловым светорассеянием). В некоторых вариантах осуществления полимерные реагенты обычно являются полидисперсными (то есть среднечисленная молекулярная масса и среднемассовая молекулярная масса полимеров не равны) и могут обладать низкими значениями полидисперсности, например, меньше приблизительно 1,5, исходя из, например, значения ИП, полученного измерениями SEC-MALS. В некоторых вариантах осуществления значения полидисперсности (ИП) находятся в диапазоне от приблизительно 1,4 до приблизительно 1,2. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет меньше приблизительно 1,15, 1,10, 1,05 или 1,03.

Единственное число объекта относится к одному или более таким объектам; например, соединение относится к одному или более соединениям, или по меньшей мере одному соединению. Таким образом, термины "один или более" и "по меньшей мере один" могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.

"Приблизительно" означает варьирование, которое можно увидеть в измерениях, взятых между различными инструментами, образцами и получением образцов.

"Защищенная", "защищенная форма" и "защитная группа" относятся к присутствию группы (т.е. защитной группы), которая предотвращает или блокирует взаимодействие конкретной химически реакционноспособной функциональной группы в молекуле при определенных условиях реакции. Защитные группы варьируют в зависимости от типа защищаемой химически реакционноспособной группы, а также от условий реакции, которые необходимо использовать, и наличия в молекуле дополнительных реакционноспособных или защитных групп, если таковые имеются. Подходящие защитные группы включают такие, которые содержатся в статье Greene et al., “Protective Groups In Organic Synthesis,” 3^rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999.

"Алкил" относится к линейному или разветвленному, насыщенному алифатическому радикалу, имеющему указанное число атомов углерода. Например, C₁-C₆ алкил включает, но не ограничивается ими, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, гексил и т.д. Другие алкильные группы включают, но не ограничиваются ими, гептил, октил, нонил, децил и т.д. Алкил может включать любое количество атомов углерода, такое как 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 и 5-6. Алкильная группа обычно является одновалентной, но может быть двухвалентной, например, когда алкильная группа связывает два фрагмента вместе.

Термин "нижний", упомянутый выше и далее в связи с органическими радикалами или соединениями, соответственно, обозначает соединение или радикал, который может быть разветвленным или неразветвленным с вплоть до и включительно 7 или вплоть до и включительно 4 и (как неразветвленный) одним или двумя атомами углерода.

"Алкилен" относится к алкильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы, то есть двухвалентный углеводородный радикал. Два фрагмента, связанные с алкиленом, могут быть связаны с одинаковым атомом или различными атомами алкилена. Например, алкилен с линейной цепью может быть двухвалентным радикалом -(CH₂)_n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Алкиленовые группы включают, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, изопропилен, бутилен, изобутилен, втор-бутилен, пентилен и гексилен.

Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) могут представлять собой различные группы, выбранные из: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -галоген, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)₂R', -NH-C(NH₂)=NH, -NR'C(NH₂)=NH, -NH-C(NH₂)=NR', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -CN и -NO₂ в количестве от нуля до (2m' + 1), где m' представляет собой общее число атомов углерода в таком радикале. каждый из R', R" и R"' независимо относится к водороду, незамещенному (C₁-C₈) алкилу и гетероалкилу, незамещенному арилу, арилу, замещенному одним-тремя атомами галогена, незамещенному алкилу, алкокси- или тиоалкоксигруппам или арил-(C₁-C₄) алкильным группам. Когда R' и R" присоединены к одному и тому же атому азота, их можно объединить с атомом азота с образованием 5, 6 или 7-членного кольца. Например, -NR'R" означает 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Термин "алкил" включает группы, такие как галогеналкил (например, -CF₃ и -CH₂CF₃) и ацил (например, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ и тому подобное). В некоторых вариантах осуществления замещенная алкильная и гетероалкильная группы имеют от 1 до 4 заместителей. В некоторых вариантах осуществления, замещенные акильные и гетероалкильные группы имеют 1, 2 или 3 заместителя. Исключением являются пергалогеналкильные группы (например, пентафторэтил и т.п.).

Заместители алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) могут быть одним или более из множества групп, выбранных, но не ограниченных ими: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -галоген, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)₂R'', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -NRSO₂R', -CN и -NO₂ в количестве от нуля до (2m' + 1), где m' представляет собой общее число атомов углерода в таком радикале. каждый из R', R", R"' и R"" независимо относится к водороду, замещенному или незамещенному гетероалкилу, замещенному или незамещенному арилу, например, арилу, замещенному одним-тремя атомами галогена, замещенному или незамещенному алкилу, алкокси- или тиоалкоксигруппам или арилалкильным группам. Когда соединение включает более одной группы R, например, каждая группа R независимо выбрана, как и каждая группа R', R'', R''' и R"", когда присутствует более одной из этих групп. Когда R' и R" присоединены к одному и тому же атому азота, их можно объединить с атомом азота с образованием 5, 6 или 7-членного кольца. Например, NR'R" означает, но не ограничивается, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалист в данной области техники поймет, что термин "алкил" означает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, отличными от групп водорода, такими как галогеналкил (например, -CF₃ и -CH₂CF₃) и ацил (например, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ и т.п.).

"Алкокси" относится к алкильной группе, имеющей атом кислорода, которая либо присоединяет алкоксигруппу к точке присоединения, либо связана с двумя атомами углерода алкоксигруппы. Алкоксигруппы включают, например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, 2-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси, гексокси и т.д. Алкоксигруппы могут быть дополнительно замещены различными описанными заместителями. Например, алкоксигруппы могут быть замещены галогенами с образованием группы "галогеналкокси".

"Карбоксиалкил" означает алкильную группу (как определено в настоящем документе), замещенную карбоксигруппой. Термин "карбоксициклоалкил" означает циклоалкильную группу (как определено в настоящем документе), замещенную карбоксигруппой. Термин «алкоксиалкил» означает алкильную группу (как определено в настоящем документе), замещенную алкоксигруппой. Используемый здесь термин "карбокси" относится к карбоновым кислотам и их сложным эфирам.

"Галогеналкил" относится к алкилу, как определено выше, где некоторые или все атомы водорода замещены атомами галогена. Галоген (гало) представляет собой хлор или фтор, но также может быть бромом или иодом. Например, галогеналкил включает трифторметил, фторметил, 1,2,3,4,5-пентафторфенил и т.д. Термин "перфтор" означает соединение или радикал, который имеет все доступные водороды, которые заменены фтором. Например, перфторфенил относится к 1,2,3,4,5-пентафторфенилу, перфторметил относится к 1,1,1-трифторметилу, а перфторметокси относится к 1,1,1-трифторметокси.

"Фторзамещенный алкил" относится к алкильной группе, где один, некоторые или все атомы водорода замещены фтором.

"Цитокин" является членом группы сигнальных молекул белка, которые могут участвовать в межклеточном взаимодействии в иммунных и воспалительных ответах. Цитокины обычно представляют собой небольшие водорастворимые гликопротеины с массой приблизительно от 8 до 35 кДа.

"Циклоалкил" относится к циклической углеводородной группе, которая содержит от 3 до 12, от 3 до 10 или от 3 до 7 эндоциклических атомов углерода. Циклоалкильные группы включают конденсированные, мостиковые и спирокольцевые структуры.

"Эндоциклический" относится к атому или группе атомов, которые составляют часть циклической кольцевой структуры.

"Экзоциклический" относится к атому или группе атомов, которые присоединены, но не определяют циклическую кольцевую структуру.

"Циклический алкиловый эфир" относится к 4- или 5-членной циклической алкильной группе, имеющей 3 или 4 эндоциклических атома углерода, и 1 эндоциклический атом кислорода или серы (например, оксетан, тиетан, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен); или 6-7-членной циклической алкильной группе, имеющей 1 или 2 эндоциклических атома кислорода или серы (например, тетрагидропиран, 1,3-диоксан, 1,4-диоксан, тетрагидротиопиран, 1,3-дитиан, 1,4-дитиан, 1,4-оксатиан).

"Алкенил" относится к линейному или разветвленному углеводороду, имеющему от 2 до 6 атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Примеры алкенильных групп включают, но не ограничиваются ими, винил, пропенил, изопропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутенил, бутадиенил, 1-пентенил, 2-пентенил, изопентенил, 1,3-пентадиенил, 1,4-пентадиенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 1,3-гексадиенил, 1,4-гексадиенил, 1,5-гексадиенил, 2,4-гексадиенил или 1,3,5-гексатриенил. Алкенильные группы также могут иметь от 2 до 3, от 2 до 4, от 2 до 5, от 3 до 4, от 3 до 5, от 3 до 6, от 4 до 5, от 4 до 6 и от 5 до 6 атомов углерода. Алкенильная группа обычно является одновалентной, но может быть двухвалентной, например, когда алкенильная группа связывает два фрагмента вместе.

"Алкенилен" относится к алкенильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы, то есть двухвалентному углеводородному радикалу. Два фрагмента, связанные с алкениленом, могут быть связаны с одним и тем же атомом или различными атомами алкенилена. Алкениленовые группы включают, но не ограничиваются ими, этенилен, пропенилен, изопропенилен, бутенилен, изобутенилен, втор-бутенилен, пентенилен и гексенилен.

"Алкинил" относится к линейному или разветвленному углеводороду, содержащему от 2 до 6 атомов углерода, имеющему по меньшей мере одну тройную связь. Примеры алкинильных групп включают, но не ограничиваются ими, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, изобутинил, втор-бутинил, бутадиинил, 1-пентинил, 2-пентинил, изопентинил, 1,3-пентадиинил, 1,4-пентадиинил, 1-гексинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 1,3-гексадиинил, 1,4-гексадиинил, 1,5-гексадиинил, 2,4-гексадиинил или 1,3,5-гексатриинил. Алкинильные группы также могут иметь от 2 до 3, от 2 до 4, от 2 до 5, от 3 до 4, от 3 до 5, от 3 до 6, от 4 до 5, от 4 до 6 и от 5 до 6 атомов углерода. Алкинильная группа обычно является одновалентной, но может быть двухвалентной, например, когда алкинильная группа связывает два фрагмента вместе.

"Алкинилен" относится к алкинильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы, то есть двухвалентному углеводородному радикалу. Два фрагмента, связанные с алкиниленом, могут быть связаны с одним и тем же атомом или различными атомами алкинилена. Алкиниленовые группы включают, но не ограничиваются ими, этинилен, пропинилен, бутинилен, втор-бутинилен, пентинилен и гексинилен.

"Циклоалкил" относится к насыщенной или частично ненасыщенной моноциклической конденсированной бициклической или мостиковой полициклической связанной циклической системе, содержащей от 3 до 12 атомов в кольце, или указанное число атомов. Моноциклические кольца включают, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклооктил. Бициклические и полициклические кольца включают, например, норборнан, декагидронафталин и адамантан. Например, C_3-8циклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклооктил и норборнан.

"Циклоалкилен" относится к циклоалкильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы, то есть двухвалентному углеводородному радикалу. Два фрагмента, связанные с циклоалкиленом, могут быть связаны с одним и тем же атомом или различными атомами циклоалкилена. Циклоалкиленовые группы включают, но не ограничиваются ими, циклопропилен, циклобутилен, циклопентилен, циклогексилен и циклооктилен.

"Гетероциклоалкил" относится к циклической системе, имеющей от 3 членов в кольце до приблизительно 20 членов в кольце и от 1 до приблизительно 5 гетероатомов, таких как N, О и S. Дополнительные гетероатомы также могут быть применимы, включая, но не ограничиваясь ими, B, Al, Si и P. Гетероатомы также могут быть окисленными, такими как, но не ограничиваясь ими, -S(O)- и -S(O)₂-. Например, гетероцикл включает, но не ограничивается ими, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофенил, морфолино, пирролидинил, пирролинил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, пиперидинил, индолинил, хинуклидинил и 1,4-диокса-8-аза-спиро[4,5]дец-8-ил.

"Гетероциклоалкилен" относится к гетероциклалкильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы. Два фрагмента, связанные с гетероциклоалкиленом, могут быть связаны с одним и тем же атомом или различными атомами гетероциклоалкилена.

"Арил" относится к моноциклической или конденсированной бициклической, трициклической или более ароматической связанной циклической системе, содержащей от 6 до 16 атомов углерода в кольце. Например, арил может представлять собой фенил, бензил или нафтил. "Арилен" означает двухвалентный радикал, полученный из арильной группы. Арильные группы могут быть моно-, ди- или тризамещенными одним, двумя или тремя радикалами, выбранными из алкила, алкокси, арила, гидрокси, галогена, циано, амино, аминоалкила, трифторметила, алкилендиокси и окси-C₂-C₃-алкилена; все из которых необязательно дополнительно замещены, например, как определено выше; или 1- или 2-нафтила; или 1- или 2-фенантренила. Алкилендиокси представляет собой двухвалентный заместитель, присоединенный к двум смежным атомам углерода фенила, например, метилендиокси или этилендиокси. Окси-C₂-C₃-алкилен также является двухвалентным заместителем, присоединенным к двум смежным атомам углерода фенила, например, оксиэтилен или оксипропилен. Примером окси-C₂-C₃-алкилен-фенила является 2,3-дигидробензофуран-5-ил.

В некоторых вариантах осуществления арил представляет собой нафтил, фенил или фенил, моно- или дизамещенный алкокси, фенилом, галогеном, алкилом или трифторметилом, особенно фенил или фенил, моно- или дизамещенный алкокси, галогеном или трифторметилом и, в частности, фенил.

Примеры замещенных фенильных групп в качестве R представляют собой, например, 4-хлорфен-1-ил, 3,4-дихлорфен-1-ил, 4-метоксифен-1-ил, 4-метилфен-1-ил, 4-аминометилфен-1-ил, 4-метоксиэтиламинометилфен-1-ил, 4-гидроксиэтиламинометилфен-1-ил, 4-гидроксиэтил-(метил)-аминометилфен-1-ил, 3-аминометилфен-1-ил , 4-N-ацетиламинометилфен-1-ил, 4-аминофен-1-ил, 3-аминофен-1-ил, 2-аминофен-1-ил, 4-фенил-фен-1-ил, 4-(имидазол-1-ил)-фенил, 4-(имидазол-1-илметил)-фен-1-ил, 4-(морфолин-1-ил)-фен-1-ил, 4-(морфолин-1-илметил)-фен-1-ил, 4-(2-метоксиэтиламинометил)-фен-1-ил и 4-(пирролидин-1-илметил)-фен-1-ил, 4-(тиофенил)-фен-1-ил, 4-(3-тиофенил)-фен-1-ил, 4-(4-метилпиперазин-1-ил)-фен-1-ил и 4-(пиперидинил)-фенил и 4-(пиридинил)-фенил, необязательно замещенный в гетероциклическом кольце.

"Арилен" относится к арильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы. Два фрагмента, связанные с ариленом, связаны с различными атомами арилена. Ариленовые группы включают, но не ограничиваются ими, фенилен.

"Ариленокси" относится к ариленовой группе, как определено выше, где один из фрагментов, связанных с ариленом, связан через атом кислорода. Ариленоксигруппы включают, но не ограничиваются ими, фениленокси.

Аналогично, заместители для арильной и гетероарильной групп различны и выбраны из: -галогена, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO₂, -CO₂R', -CONR'R'', -C(O)R', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR''C(O)₂R', -NR'-C(O)NR''R''', -NH-C(NH₂)=NH, -NR'C(NH₂)=NH, -NH-C(NH₂)=NR', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -N₃, -CH(Ph)₂, перфтор(C₁-C₄)алкокси и перфтор(C₁-C₄)алкил, в количестве от нуля до общего числа открытых валентностей в ароматической циклической системе; и где R', R" и R"' независимо выбраны из водорода, (C₁-C₈)алкила и гетероалкила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенного арил)-(C₁-C₄)алкила и (незамещенного арил)окси-(C₁-C₄)алкила.

Два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно замещены заместителем формулы -T-C(O)-(CH₂)_q-U-, где T и U независимо представляют собой -NH-, -O-, -CH₂- или одинарную связь, и q представляет собой целое число от 0 до 2. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно замещены заместителем формулы -A-(CH₂)_r-B-, где A и B независимо представляют собой -CH₂-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)₂NR' или одинарную связь, а r представляет собой целое число от 1 до 3. Одна из одинарных связей нового сформированного таким образом кольца, необязательно может быть заменена двойной связью. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно замещены заместителем формулы -CH₂)_s-X-(CH₂)_t-, где s и t независимо представляют собой целые числа от 0 до 3 и X представляет собой -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, or -S(O)₂NR'-. Заместитель R' в -NR'- и -S(O)₂NR'- выбран из водорода или незамещенного (C₁-C₆)алкила.

"Гетероарил" относится к моноциклической или конденсированной бициклической или трициклической ароматической связанной циклической системе, содержащей от 5 до 16 атомов в кольце, где каждый от 1 до 4 атомов в кольце представляют собой гетероатом N, О или S. Например, гетероарил включает пиридил, индолил, индазолил, хиноксалинил, хинолинил, изохинолинил, бензотиенил, бензофуранил, фуранил, пирролил, тиазолил, бензотиазолил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, имидазолил, тиенил или любые другие радикалы, замещенные, особенно моно- или дизамещенные, например алкилом, нитро или галогеном. Пиридил представляет собой 2-, 3- или 4-пиридил, прдпочтительно 2- или 3-пиридил. Тиенил представляет собой 2- или 3-тиенил. В некоторых вариантах осуществления хинолинил представляет собой 2-, 3- или 4-хинолинил. В некоторых вариантах изохинолинил представляет собой 1-, 3- или 4-изохинолинил. В некоторых вариантах осуществления бензопиранил, бензотиопиранил могут представлять собой 3-бензопиранил или 3-бензотиопиранил, соответственно. В некоторых вариантах осуществления тиазолил может представлять собой 2- или 4-тиазолил. В некоторых вариантах осуществления триазолил может представлять собой 1-, 2- или 5-(1,2,4-триазолил). В некоторых вариантах осуществления тетразолил может представлять собой 5-тетразолил.

В некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой пиридил, индолил, хинолинил, пирролил, тиазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, имидазолил, тиенил, фуранил, бензотиазолил, бензофуранил, изохинолинил, бензотиенил, оксазолил, индазолил или любой из замещенных радикалов, особенно моно- или дизамещенных.

Термин "гетероалкил" относится к алкильной группе, имеющей от 1 до 3 гетероатомов, таких как N, О и S. Дополнительные гетероатомы также могут быть применимы, включая, но не ограничиваясь ими, B, Al, Si и P. Гетероатомы также могут быть окисленными, такими как, но не ограничиваясь ими, -S(O)- и -S(O)₂-. Например, гетероалкил может включать простые эфиры, тиоэфиры, алкиламины и алкилтиолы.

Термин "гетероалкилен" относится к гетероалкильной группе, как определено выше, связывающей по меньшей мере две другие группы. Два фрагмента, связанные с гетероалкиленом, могут быть связаны с одним и тем же атомом или различными атомами гетероалкилена.

"Электрофил" относится к иону или атому, или совокупности атомов, который может быть ионным, имеющим электрофильный центр, то есть центр, который является электроноакцепторным, способным реагировать с нуклеофилом. Электрофил (или электрофильный реагент) представляет собой реагент, который образует связь со своим реакционным партнером (нуклеофилом), акцептируя оба связывающих электрона от этого реакционного партнера.

"Нуклеофил" относится к иону или атому, или совокупности атомов, который может быть ионным, имеющим нуклеофильный центр, то есть центр, который ищет электрофильный центр или способен реагировать с электрофилом. Нуклеофил (или нуклеофильный реагент) представляет собой реагент, который образует связь со своим реакционным партнером (электрофилом), выступая в качестве донора обоих связывающих электронов. "Нуклеофильная группа" относится к нуклеофилу после взаимодействия с реакционноспособной группой. Неограничивающие примеры включают амино, гидроксил, алкокси, галогеналкокси и тому подобное.

"Малеимидо" относится к пиррол-2,5-дион-1-ил группе, имеющей структуру:

которая при взаимодействии с сульфгидрилом (например, тиоалкилом) образует -S-малеимидогруппу, имеющую структуру

где "•" указывает точку присоединения для малеимидогруппы и "" указывает точку присоединения атома серы тиолом к остальной части исходной несущей сульфгидрильной группы.

Для целей раскрытия настоящего изобретения, "природные аминокислоты", обнаруженные в белках и полипептидах, представляют собой L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и/или L-валин. "Неприродные аминокислоты", обнаруженные в белках, представляют собой любую аминокислоту, отличную от природных аминокислот. Неприродные аминокислоты включают, без ограничения, D-изомеры природных аминокислот и смеси D- и L-изомеров природных аминокислот. Другие аминокислоты, такие как N-альфа-метиламинокислоты (например, саркозин), 4-гидроксипролин, десмозин, изодесмозин, 5-гидроксилизин, эпсилон-N-метиллизин, 3-метилгистидин, хотя и обнаружены в природных белках, считаются неприродными аминокислотами, обнаруженными в белках, для целей раскрытия настоящего изобретения, поскольку они обычно вводятся с помощью иных средств, кроме рибосомной трансляции мРНК.

"Линейный" в отношении геометрии, архитектуры или общей структуры полимера, относится к полимеру, имеющему один полимерный луч.

"Разветвленный" в отношении геометрии, архитектуры или общей структуры полимера относится к полимеру, имеющему 2 или более полимерных "луча", простирающихся от сердцевинной структуры, содержащейся в инициаторе. Инициатор можно применять в реакции радикальной полимеризации с переносом атома (ATRP). Разветвленный полимер может иметь две полимерные цепи (луча), 3 полимерных луч, 4 полимерных луча, 5 полимерных лучей, 6 полимерных лучей, 7 полимерных лучей, 8 полимерных лучей, 9 полимерных лучей или более. Каждый полимерный луч простирается от сайта инициации полимера. Каждый сайт инициации полимера способен быть сайтом роста полимерной цепи путем добавления мономеров. Например, и без ограничения, применяя ATRP, сайт инициации полимера на инициаторе обычно представляет собой органический галогенид, подвергающийся обратимому окислительно-восстановительному процессу, катализируемому соединением переходного металла, таким как галогенид меди. В некоторых вариантах осуществления галогенид представляет собой бром.

"Фармацевтически приемлемый эксципиент" относится к эксципиенту, который может быть включен в композиции и который не вызывает значительного неблагоприятного токсикологического воздействия на пациента и одобрен или утвержден FDA для терапевтического применения, в частности у людей. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов включают воду, NaCl, нормальные солевые растворы, раствор Рингера с лактатом, нормальную сахарозу, нормальную глюкозу и т.п.

Терапевтические белки вводят в эффективном режиме, что означает дозировку, способ введения и частоту введения, которая задерживает начало, уменьшает тяжесть, ингибирует дальнейшее ухудшение и/или улучшает по меньшей мере один признак или симптом заболевания. Если пациент уже страдает от заболевания, режим можно назвать терапевтически эффективным режимом. Если пациент подвергается повышенному риску заболевания по сравнению с общей популяцией, но еще не имеет симптомов, режим можно назвать профилактически эффективным режимом. В некоторых случаях терапевтическая или профилактическая эффективность может наблюдаться у отдельного пациента по сравнению с историческим контролем или прошлым опытом у того же пациента. В других случаях терапевтическая или профилактическая эффективность может быть продемонстрирована в доклиническом или клиническом исследовании в популяции пациентов, получавших лечение, по сравнению с контрольной популяцией пациентов, не получавших лечение.

"Биологический период полувыведения" вещества представляет собой фармакокинетический параметр, который определяет время, необходимое для выведения половины вещества из ткани или организма после введения этого вещества.

"OG1786" представляет собой 9-лучевой инициатор, применяемый для синтеза полимера со структурой, представленной на фиг. 30, на которой изображена форма соли OG1786 с трифторуксусной кислотой. OG1786 можно применять в качестве других солей или в качестве свободного основания.

"OG1801" представляет собой приблизительно (плюс/минус 15 %) полимер размером 750 кДа (либо M_n, либо M_p), полученный с применением OG1786 в качестве инициатора для синтеза ATRP с применением мономера HEMA-PC.

"OG1802" представляет собой OG1801 с добавленной малеимидной функциональностью и показан на фиг. 36, где каждый из n₁, n₂, n₃, n₄, n₅, n₆, n₇, n₈ и n₉ представляет собой целое число (положительное) (от 0 до приблизительно 3000), так что общая молекулярная масса полимера равна (M_w) 750000 плюс/минус 15 % дальтон.

Многоугловое светорассеяние (MALS) представляет собой способ анализа макромолекул, где лазерный свет падает на молекулу, осциллирующее электрическое поле света индуцирует в нем осциллирующий диполь. Этот осциллирующий диполь будет повторно излучать свет и может быть измерен с помощью детектора MALS, такого как Wyatt miniDawn TREOS. Интенсивность излучаемого света зависит от величины индуцированного в макромолекуле диполя, которая, в свою очередь, пропорциональна поляризуемости макромолекулы, чем больше индуцированный диполь и, следовательно, тем больше интенсивность рассеянного света. Поэтому для анализа рассеяния на растворе таких макромолекул следует знать их поляризуемость относительно окружающей среды (например, растворителя). Это можно определить из измерения изменения Δn показателя преломления раствора n с изменением молекулярной концентрации Δc путем измерения значения dn/dc (равное Δn/Δc) с применением дифференциального рефрактометра Wyatt Optilab T-rEX. Два параметра молярной массы, в которых используется определение MALS, представляют собой среднечисленную молекулярную массу (M_n) и среднемассовую молекулярную массу (M_w), где индекс полидисперсности (ИП) равен M_w, деленной на M_n. SEC также позволяет определить другое среднее значение молекулярной массы пиковой молекулярной массы M_p, которое определяется как молекулярная масса самого высокого пика в SEC.

ИП применяют как измерение ширины молекулярно-массового распределения полимера и биоконъюгата, который получают путем конъюгации дискретного белка (например, OG1950) с полидисперсным биополимером (например, OG1802). Для образца белка его полидисперсность близка к 1,0 вследствие того, что он является продуктом трансляции, где каждая молекула белка в растворе должна иметь почти одинаковую длину и молярную массу. Напротив, из-за полидисперсной природы биополимера, где во время процесса полимеризации синтезируется различная длина полимерных цепей, очень важно определить ИП образца в качестве одного из его признаков качества для узкого распределения молекулярного веса.

Эксклюзионная хроматография (SEC) представляет собой способ хроматографии, при котором молекулы в растворе разделяют по их размерам. Обычно водный раствор наносят для транспортировки образца через колонку, которая заполнена смолами с различными размерами пор. Ожидается, что смола инертна для аналита при прохождении через колонку, и аналиты будут отделены друг от друга на основании их уникального размера и характеристик размера пор выбранной колонки.

Сочетание способов SEC и MALS или SEC/MALS обеспечивает точное распределение молярной массы и размера (среднеквадратичный радиус), а не на основании значений калибровочных стандартов SEC. Этот тип распределения имеет много преимуществ по сравнению с традиционными способами калибровки колонок. Поскольку светорассеяние и концентрацию измеряют для каждой фракции элюирования, молярная масса и размер могут определяться независимо от положения элюирования. Это особенно актуально для видов с макромолекулами неглобулярной формы, такими как биополимеры (OG1802) или биоконъюгаты (OG1953); такие виды обычно не элюируются способом, который может быть описан значениями калибровочных стандартов колонки.

В некоторых вариантах осуществления анализ SEC/MALS включает систему Waters HPLC с модулем подачи растворителя Alliance 2695 и ультрафиолетовый детектор с фотодиодной матрицей Waters 2996 Photodiole Array, снабженный колонкой Shodex SEC-HPLC (7,8×300 мм). Систему подключают онлайн с помощью дифференциального рефрактометра Wyatt miniDawn TREOS и Wyatt Optilab T-rEX. Программное обеспечение Empower от Waters можно применять для управления системой Waters HPLC, а программное обеспечение ASTRA V 6.1.7.16 от Wyatt можно применять для получения данных MALS от Wyatt miniDawn TREOS, данные dn/dc от детектора T-rEX и данные определения массы с применением сигнала поглощения A280 от детектора Waters 2996 Photodiole Array. SEC можно осуществлять при 1 мл/мин в 1xPBS, pH 7,4, после инъекции образца, сигналы MALS и RI могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения ASTRA для определения абсолютной молярной массы (M_p, M_w, M_n) и индекса полидисперсности (ИП). Кроме того, расчет также включает входного значения dn/dc для полимера и белка как 0,142 и 0,183 соответственно. Для биоконъюгатов OG1953 значение dn/dc рассчитывают на основании взвешенной MW полимера и белка приблизительно 0,148, по приведенной ниже формуле:

Конъюгат dn/dc = 0,142 x [MWполимер / (MWполимер + MWбелок)] + 0,183 x [MWбелок / (MWполимер + MWбелок)]

Где MWполимер для OG1802 составляет 800 кДа, а MWбелок для OG1950 составляет 146 кДа.

Общие положения

Настоящее изобретение относится к антителам против VEGF и их конъюгатам. В некоторых вариантах осуществления сами антитела отличаются от других агентов против VEGF и обеспечивают превосходные результаты по сравнению с другими агентами против VEGF. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела против VEGF проявляет неожиданное превосходство над другими антителами и/или ожидание активности других конъюгатов антител.

Исторически, конъюгирование молекулы с белком часто приводило к уменьшению связывающих взаимодействий белка с его предполагаемой мишенью. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при конъюгировании с местом, которое находится за пределами активного сайта, такой же уровень снижения, который можно было ожидать, необязательно соблюдается. Представленные здесь доказательства показывают противоположный от ожидаемого результат. В некоторых вариантах осуществления и без ограничения теорией, конъюгат может превосходить только одно антитело. Например, взаимодействие лиганда и его специфического рецептора часто сопровождается стереоспецифическим взаимодействием лиганда и рецептора, в соответствии с взаимодействием гидрофильных аминокислот на лиганде с гидрофильными аминокислотами на рецепторе и молекул воды, находящихся в начале и в центре этих взаимодействий. В то же время эта гидрофильная стереоспецифичность дополнительно усиливается путем ослабления и/или подавления неспецифических гидрофобных взаимодействий, которые обычно могут быть опосредованы/созданы гидрофобно-гидрофобными аминокислотами.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен конъюгат антитела против VEGF, который способен блокировать по меньшей мере 90 % взаимодействия между лигандом VEGF ("VEGFL") и VEGF рецептором ("VEGFR"). Например, он может блокировать по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или эффективно все взаимодействие между VEGFR и VEGFL. В некоторых вариантах осуществления указанная блокировка происходит при насыщающих концентрациях. В некоторых вариантах осуществления обеспечен конъюгат антитела против VEGF, который блокирует по меньшей мере 95% взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF рецептором. В качестве примера такого превосходства блокировки см. фиг. 20, относительно способности OG1953 (и конъюгата антитела, представленного здесь) блокировать в более высокой степени, чем Lucentis® (ранибизумаб) или Avastin® (бевацизумаб), или даже антитело OG1950 (неконъюгированное). Действительно, этот результат был неожиданным в том отношении, что, хотя добавление полимера к антителу (с образованием конъюгата антитела), можно было ожидать, что оно оказывает некоторое или не оказывает отрицательного влияния на связывание/активность антитела, было неожиданным, что оно действительно улучшало блокирующую способность антитела.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их конъюгаты ингибируют по меньшей мере 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 % активности и/или взаимодействия между VEGFR и VEGFL. В некоторых вариантах осуществления значение IC50 может составлять 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 нМ или менее чем любое одно или более из предшествующих значений. В некоторых вариантах осуществления значение KD может составлять 2x10^-13, 1x10^-13, 1x10^-12, 1x10^-11, 1x10^-10 M или менее любого из предыдущих значений. В некоторых вариантах осуществления значение IC₅₀ может составлять 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 или менее любого из предыдущих значений.

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело против VEGF, которое блокирует по меньшей мере 90% взаимодействия между лигандом VEGF и рецептором VEGF. Например, оно может блокировать по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или практически все взаимодействия между VEGFR и VEGFL. В качестве примера такого превосходства блокировки см. фиг. 20, относительно способности OG1950 (и антитела, обеспеченного здесь) блокировать в более высокой степени, чем Lucentis® (ранибизумаб) или Avastin® (бевацизумаб).

В некоторых вариантах осуществления другие антитела, такие как Lucentis® (ранибизумаб) или Avastin® (бевацизумаб), могут быть конъюгированы с одним или более полимерами, как описано здесь, одним или более описанными здесь способами. В некоторых вариантах осуществления любое антитело или его фрагмент могут быть конъюгированы с одним или более полимерами, как описано здесь, одним или более описанными здесь способами.

В некоторых вариантах осуществления антитело включает вариабельную область тяжелой цепи аминокислоты, которая включает последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи аминокислоты, которая включает последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления антитело конъюгировано с одним или более из обеспеченных настоящим изобретением полимеров. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное антитело по меньшей мере на 90 % идентично SEQ ID NO: 1 и/или 2. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит 6 CDR в пределах SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, а также точечную мутацию L443C (нумерация ЕС или 449C в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления конъюгированное антитело по меньшей мере на 90 % идентично SEQ ID NO: 1 и/или 2 и включает следующие мутации: L234A, L235A и G237A (нумерация EU) и по меньшей мере одну из следующих мутаций: Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU).

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело, которое связывает VEGF-A. Антитело включает: CDR_H1, которая представляет собой CDR_H1 в SEQ ID NO: 1, CDR_H2, которая представляет собой CDR_H2 в SEQ ID NO: 1, CDR_H3, которая представляет собой CDR_H3 в SEQ ID NO: 1, CDR_L1, которая представляет собой CDR_L1 в SEQ ID NO: 2, CDR_L2, которая представляет собой CDR_L2 в SEQ ID NO: 2, CDR_L3, которая представляет собой CDR_L3 в SEQ ID NO: 2, по меньшей мере одну из следующих мутаций: L234A, L235A и G237A (нумерация EU), и по меньшей мере одну из следующих мутаций: Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU).

Как будет понятно специалисту в данной области техники, в свете настоящего описания любое из антител, обеспеченных здесь, может быть конъюгировано с любым из предложенных здесь полимеров и/или любое антитело, обеспеченное здесь, может иметь цистеин, добавленный таким образом, что он допускает сайт-специфическую конъюгацию с полимером.

"VEGF" или "фактор роста эндотелия сосудов" представляет собой фактор роста эндотелия человека, который влияет на ангиогенез или ангиогенный процесс. В частности, термин VEGF означает любой член класса факторов роста, который (i) связывается с рецептором VEGF, таким как VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1) или VEGFR-3 (FLT-4); (ii) активирует активность тирозинкиназы, связанную с рецептором VEGF; и (iii) тем самым влияет на ангиогенез или ангиогенный процесс.

Семейство факторов VEGF состоит из пяти родственных гликопротеинов: VEGF-A (также известный как VPE), -B, -C, -D и PGF (фактор роста плаценты). Из них VEGF-A является наиболее хорошо изученным и является объектом антиангиогенной терапии. Ferrara et al, (2003) Nat. Med. 9:669-676. VEGF-A находится в виде ряда различных изотипов, которые образуются как путем альтернативного сплайсинга, так и протеолиза: VEGF-A₂₀₆, VEGF-A₁₈₉, VEGF-A₁₆₅ и VEGF-A₁₂₁. Изоформы отличаются своей способностью связывать гепарин и несигнальные связывающие белки, называемые нейропилинами. Изоформы все биологически активны как димеры.

Различные эффекты VEGF опосредуются связыванием VEGF, например, VEGF-A (P15692), -B (P49766), -C (P49767) и -D (Q43915) с рецепторными тирозинкиназами (RTK). Рецепторы семейства VEGF относятся к классу V RTK, и каждый из них несет семь Ig-подобных доменов во внеклеточном домене (ECD). У человека, VEGF связывается с тремя типами RTK: VEGFR-1 (Flt-1) (P17948), VEGFR-2 (KDR, Flk-1) (P935968) и VEGFR-3 (Flt-4) (P35916). Если иное не вытекает из контекста, ссылка на VEGF означает любой из VEGF-A, -B, -C, -D и PGF в любой из встречающихся в природе изоформе или встречающихся в природе вариантов или индуцированных вариантов, имеющих по меньшей мере 90, 95, 98 или 99%, или 100% идентичность последовательности с природной формой. В некоторых вариантах осуществления такие VEGF представляют собой человеческий VEGF. Аналогично, ссылка на VEGFR означает любой из VEGR-1, R-2 или R-3, включая любую природную изоформу или природный вариант, или индуцированный вариант, имеющий по меньшей мере 90, 95, 98 или 99 %, или 100 % идентичность последовательности с природными последовательностями.

Терапия антагонистами VEGF была одобрена для лечения некоторых видов рака и влажной формы AMD. Бевацизумаб (AVASTIN, Genentech/Roche) представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело, которое связывается с и нейтрализует человеческий VEGF, в частности, со всеми изоформами VEGF-A и с биоактивными протеолитическими фрагментами VEGF-A. См., например, , Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W. 2004. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3(5):391-400. Бевацизумаб был одобрен для лечения некоторых видов рака. Белковая последовательность тяжелых и легких цепей бевацизумаба (DrugBank DB00112) представлена в SEQ ID NO: 3 (тяжелая) и SEQ ID NO: 4 (легкая).

CDR вариабельной легкой цепи бевацизумаба представляют собой CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14). CDR вариабельной тяжелой цепи бевацизумаба представляют собой CDR_H1: GYTFTNYGMN, CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPHYYGSSHWYFDV. CDR определяют по Кабату, за исключением того, что для CDRH1 применяют составную систему нумерации Кабат/Чотиа. В некоторых вариантах осуществления цистеин может быть добавлен к последовательности бевацизумаба, и антитело (и/или вариант, который включает 6 CDR бевацизумаба) может быть конъюгировано с любым одним или более полимерами, представленными здесь.

Другая молекула против VEGF, полученная из того же мышиного моноклонального антитела, что и бевацизумаб, была одобрена для лечения влажной формы AMD: ранибизумаб (LUCENTIS® (ранибизумаб), Genentech/Roche). Ранибизумаб представляет собой фрагмент антитела или Fab. Ранибизумаб получали путем созревания аффинности вариабельных тяжелых и легких цепей бевацизумаба. Последовательность тяжелых и легких цепей ранибизумаба (как опубликовано Novartis) представлена в SEQ ID NO: 5 и 6 соответственно. В некоторых вариантах осуществления цистеин может быть добавлен к последовательности ранибизумаба, и антитело (и/или вариант, который включает 6 CDR ранибизумаба) может быть конъюгировано с любым одним или более полимерами, представленными здесь.

CDR ранибизумаба являются такими же, как у бевацизумаба, за исключением тех случаев, когда изменения вносили после созревания аффинности: CDR вариабельной легкой цепи ранибизумаба представляют собой CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14). CDR вариабельной тяжелой цепи ранибизумаба представляют собой CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11).

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела представлен антителом против VEGF-A, связанным через цистеин вне вариабельной области антитела с полимером, содержащим фосфорилхолин, где цистеин добавляли с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления полимер связан с одним цистеином. В некоторых вариантах осуществления "добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК" означает, что остаток цистеина заменяет нецистеиновую аминокислоту, которая встречается в том же положении в известном или существующем антителе, или в консенсусной последовательности антитела. Так, например, когда антитело представляет собой IgG1, а тяжелая цепь имеет лейцин в положении EU 443, лейцин заменяют с промощью технологии рекомбинантных ДНК цистеином (L443C, нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1). Соответственно, нативная последовательность IgG1 в положении EU 347 представляет собой Q (глутамин), а Q заменяют цистеином с пмоощью технологии рекомбинантных ДНК с получением Q347C.

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, где тяжелая цепь имеет Fc область. В некоторых вариантах осуществления цистеин находится в Fc области, а антитело против VEGF-A представляет собой иммуноглобулин G (IgG). В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела против VEGF-A содержит CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), а положение 221 (посредством последовательного подсчета как в SEQ ID NO: 3) представляет собой Т, и легкая цепь против VEGF-A содержит CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14), а положение 4 по Кабату представляет собой L.

В некоторых вариантах осуществления изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления константный домен IgG1 имеет одну или более мутаций относительно константного домена IgG1 (например, константной области SEQ ID NO: 3) для модуляции эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления мутации эффекторной функции представляют собой одну или более из следующих: (нумерация EU) E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X и P331X, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления мутации выбраны из группы, состоящей из (нумерация EU): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела содержит следующие мутации (нумерация EU): L234A, L235A и G237A.

В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина находится в тяжелой цепи антитела против VEGF-A и представляет собой Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина представляет собой L443C (нумерация EU, или 449C в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономеры 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфата (MPC), как указано ниже:

,

Таким образом, полимер включает следующие повторяющиеся звенья:

;

где n представляет собой целое число от 1 до 3000, а волнистые линии указывают точки присоединения между мономерными звеньями в полимере.

В некоторых вариантах осуществления полимер имеет три или более луча или синтезирован с инициатором, включающим 3 или более сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 лучер или синтезирован инициатором, включающим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера. Более предпочтительно, полимер имеет 3, 6 или 9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет 9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 9 сайтов инициации полимера.

В некоторых вариантах осуществления полимер, который добавляют, имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да (SEC-MAL). В некоторых вариантах осуществления полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 500000 до приблизительно 1000000 Да. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 900000 Да. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 750000 до приблизительно 850000 Да. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 800000 до приблизительно 850000 Да. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 750000 до приблизительно 800000 Да.

В некоторых вариантах осуществления любое из описанных здесь антител может быть дополнительно конъюгировано с полимером с образованием биоконъюгата. Молекулярная масса биоконъюгата (в общем, SEC-MALS) может составлять от приблизительно 350000 до 2000000 дальтон, например, от приблизительно 450000 до 1900000 дальтон, от приблизительно 550000 до 1800000 дальтон, от приблизительно 650000 до 1700000 дальтон, от приблизительно 750000 до 1600000 дальтон, от приблизительно 850000 до 1500000 дальтон, от приблизительно 900000 до 1400000 дальтон, от приблизительно 950000 до 1300000 дальтон, от приблизительно 900000 до 1000000 дальтон, от приблизительно 1000000 до 1300000 дальтон, от приблизительно 850000 до 1300000 дальтон, от приблизительно 850000 до 1000000 дальтон и от приблизительно 1000000 до 1200000 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела очищают. В некоторых вариантах осуществления полимер, являясь аспектом конъюгата антитела, является полидисперсным, то есть ИП полимера не равен 1,0. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет менее 1,5. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет менее 1,4. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет менее 1,3. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет менее 1,2. В некоторых вариантах осуществления ИП составляет менее 1,1.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет связанный с полимером иммуноглобулин G (IgG) против VEGF-A, причем этот полимер включает мономеры MPC, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, а последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2, и где антитело связано только в положении C449 SEQ ID NO: 1 с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет 9 лучей и молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 1000000 Да.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет связанный с полимером иммуноглобулин G (IgG) против VEGF-A, причем этот полимер включает мономеры MPC, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, а последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2, и где антитело связано только через C443 (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1) с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет 9 лучей и молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 1000000 Да.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет следующую структуру:

где каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой H, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой L;

полимер связан с антителом против VEGF-A через сульфгидрил C449 последовательности SEQ ID NO: 1, эта связь изображена на одной из тяжелых цепей; PC представляет собой , где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера; где X представляет собой a) OR, где R представляет собой H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными, так что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 и n9 равна 2500 плюс или минус 10 %. В некоторых вариантах осуществления n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 0 до 3000. В некоторых вариантах осуществления n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 0 до 500. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой OR, где R представляет собой сахар, аминоалкил, монозамещенный, полизамещенный или незамещенный варианты следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, -CO-O-R₇, карбонил -CCO-R₇, -CO-NR₈R₉, -(CH₂)_n-COOR₇, -CO-(CH)_n-COOR₇, -(CH₂)_n-NR₈R₉, сложный эфир, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, где n представляет собой целое число от 1 до 6, где каждый из R₇, R₈ и R₉ отдельно выбирают из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, монозамещенных, полизамещенных или незамещенных вариантов следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, 5-членное кольцо и 6-членное кольцо.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет следующую структуру:

где каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой H, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой L;

полимер связывается с антителом против VEGF-A через сульфгидрильную группу C443 (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1), эта связь изображена на одной из тяжелых цепей; PC представляет собой , где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера; где X представляет собой a) OR, где R представляет собой H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными, так что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 и n9 равна 2500 плюс или минус 10 %. В некоторых вариантах осуществления n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 0 до 3000. В некоторых вариантах осуществления n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 0 до 500. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой OR, где R представляет собой сахар, аминоалкил, монозамещенный, полизамещенный или незамещенный варианты следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, -CO-O-R₇, карбонил -CCO-R₇, -CO-NR₈R₉, -(CH₂)_n-COOR₇, -CO-(CH)_n-COOR₇, -(CH₂)_n-NR₈R₉, сложный эфир, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, где n представляет собой целое число от 1 до 6, где каждый из R₇, R₈ и R₉ отдельно выбирают из группы, состоящей из атома водорода, атома галогена, монозамещенных, полизамещенных или незамещенных вариантов следующих остатков: насыщенный C₁-C₂₄ алкил, ненасыщенный C₂-C₂₄ алкенил или C₂-C₂₄ алкинил, ацил, ацилокси, алкилоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, циклоалкил, циклоалкенил, алкокси, циклоалкокси, арил, гетероарил, арилалкоксикарбонил, алкоксикарбонилацил, амино, аминокарбонил, аминокарбоилокси, нитро, азидо, фенил, гидрокси, алкилтио, арилтио, оксисульфонил, карбокси, циано и галогенированный алкил, включая полигалогенированный алкил, 5-членное кольцо и 6-членное кольцо.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела присутствует в жидкой композиции. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела объединяют с фармацевтически приемлемым носителем.

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело против VEGF-A. Тяжелая цепь антитела против VEGF-A содержит по меньшей мере следующие последовательности CDR: CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела против VEGF-A содержит указанные CDR и дополнительно содержит треонин (T) в положении 221 (посредством последовательного подсчета, как в SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела против VEGF-A содержит по меньшей мере следующие CDR: CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A имеет указанные CDR и дополнительно содержит лейцин (L) в положении 4 по Кабату. В некоторых вариантах изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой IgG1 и содержит CH₁, шарнирную область, CH₂ и CH₃ домены. В некоторых вариантах изотип легкой цепи представляет собой каппа.

В некоторых вариантах осуществления домен IgG1 антитела против VEGF-A имеет одну или более мутаций для модуляции эффекторной функции, например, ADCC, ADCP и CDC. В некоторых вариантах осуществления мутации IgG1 снижают эффекторную функцию. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, применяемые для мутаций эффекторной функции, включают (нумерация EU) E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X и P331X, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления мутации включают одну или более из следующих: E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела против VEGF-A содержит следующие мутации (нумерация EU): L234A, L235A и G237A. В некоторых вариантах осуществления количество мутаций эффекторной функции относительно природной последовательности человеческого IgG1 составляет не более 10. В некоторых вариантах осуществления количество мутаций эффекторной функции, относительно природной последовательности человеческого IgG1, составляет не более 5, 4, 3, 2 или 1. В некоторых вариантах осуществления антитело снижает Fc-гамма-связывание и/или связывание с белком комплемента C1q, так что способность антитела приводить к эффекторной функции снижается. Это может быть особенно полезно при офтальмологических показаниях/заболеваниях.

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A включает одну или более следующих аминокислотных мутаций: L234A, L235A, G237A (нумерация EU) и L443C (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A представляет собой человеческий иммуноглобулин G (IgG1) или его часть.

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A включает константный домен тяжелой цепи, который включает одну или более мутаций, которые снижают иммунную опосредованную эффекторную функцию.

В некоторых вариантах осуществления обеспечено антитело против VEGF-A. Антитело против VEGF включает тяжелую цепь, которая включает CDR_H1, включающую последовательность GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2, включающую последовательность WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10), CDR_H3, включающую последовательность YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), CDR_L1, включающую последовательность SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2, включающую последовательность FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3, включающую последовательность QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).

Альтернативно, домен IgG может представлять собой IgG2, IgG3 или IgG4 или композит, в котором константные области образованы из более чем одного из этих изотипов (например, область CH1 из IgG2 или IgG4, шарнирной области, CH2 и CH3 из IgG1). Такие домены могут содержать мутации снижающие и/или модулирующие эффекторную функцию в одном или более положениях EU, указанных для IgG1. Человеческие IgG2 и IgG4 снижают эффекторные функции по сравнению с человеческими IgG1 и IgG3.

Тяжелая цепь антитела против VEGF-A содержит остаток цистеина, добавленный в виде мутации с помощью технологии рекомбинантных ДНК, которую можно применять для конъюгирования фрагмента, увеличивающего период полувыведения. В некоторых вариантах осуществления мутация представляет собой (нумерация EU) Q347C (нумерация EU) и/или L443C (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления мутация представляет собой L443C (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления стехиометрия антитела к полимеру составляет 1:1; другими словами, конъюгат содержит одну молекулу антитела, конъюгированную с одной молекулой полимера.

Период полувыведения антител против VEGF-A может быть увеличен путем присоединения "фрагментов, увеличивающих период полувыведения" или "групп, увеличивающих период полувыведения". Фрагменты, увеличивающие период полувыведения, включают пептиды и белки, которые могут быть экспрессированы в рамке с биологическим лекарственным средством (или конъюгированы химически в зависимости от ситуации) и различными полимерами, которые могут быть присоединены или конъюгированы с одной или более аминокислотными боковыми цепями или концевыми функциональностями, такими как -SH, -OH, -COOH, -CONH₂, -NH₂, или одной или более структур N- и/или O-гликанов. Частицы, увеличивающие период полувыведения, обычно действуют для увеличения циркуляторного периода полувыведения биологических лекарственных средств in vivo.

Примеры пептидных/белковых фрагментов, увеличивающих период полувыведения, включают гибридный белок, содержащий Fc (Capon DJ, Chamow SM, Mordenti J, et al. Designing CD4 immunoadhesions for AIDS therapy. Nature. 1989. 337:525-31), гибридный белок, содержащий сывороточный альбумин человека (HAS) (Yeh P, Landais D, Lemaitre M, et al. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:1904-08), гибридный белок, содержащий карбоксиконцевой пептид (CTP) (Fares FA, Suganuma N. Nishimori K, et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:4304-08), генетическое слияние слитых неструктурированных повторяющихся пептидных последовательностей (XTEN) (Schellenberger V, Wang CW, Geething NC, et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009. 27:1186-90), эластиноподобный пептид (ELPylation) (MCpherson DT, Morrow C, Minehan DS, et al. Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G(VPGVG19-VPGV, from Escheriachia coli. Biotechnol Prog. 1992. 8:347-52), гибридный белок, содержащий трансферрин человека (Prior CP, Lai C-H, Sadehghi H et al. Modified transferrin fusion proteins. Патент WO2004/020405. 2004), пролин-аланин-серин (PASylation) (Skerra A, Theobald I, Schlapsky M. Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability. Патент WO2008/155134 A1. 2008), гомополимер аминокислоты (HAPylation) (Schlapschy M, Theobald I, Mack H, et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007. 20:273-84) и гибридный белок, содержащий желатиноподобный белок (GLK) (Huang Y-S, Wen X-F, Zaro JL, et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor by fusion with gelatin-like protein polymer. Eur J. Pharm Biopharm. 2010. 72:435-41).

Примеры полимерных фрагментов, увеличивающих период полувыведения, включают полиэтиленгликоль (PEG), разветвленный PEG, PolyPEG® (Warwick Effect Polymers; Coventry, UK), полисиаловую кислоту (ПСА), крахмал, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), гидроксиалкилкрахмал (ГАК), углеводы, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансульфат, декстран, карбоксиметилдекстран, полиалкиленоксид (ПАО), полиалкиленгликоль (ПАГ), полипропиленгликоль (ППГ), полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазин, полиоксазолин, ангидрид малеиновой кислоты с полистиролом, поли(1-гидроксиметиэтиленгидроксиметилформаль) (ПГФ), цвиттер-ионный полимер, полимер, содержащий фосфорилхолин, и полимер, включающий MPC, Poly(Gly_x-Ser_y), гиалуроновую кислоту (ГК), полимеры Heparosan (HEP), флексимеры, декстран и поли-сиаловые кислоты (ПСК).

В одном варианте осуществления фрагмент, увеличивающий период полувыведения, может быть конъюгирован с антителом через свободные аминогруппы белка с применением сложных эфиров N-гидроксисукцинимида (NHS). Реагенты, нацеленные на конъюгацию с аминогруппами, могут случайным образом взаимодействовать с ε-аминогруппой лизинов, α-аминогруппой N-концевых аминокислот и δ-аминогруппой гистидинов.

Однако антитела против VEGF-A, раскрытые здесь, имеют много аминогрупп, доступных для полимерной конъюгации. Таким образом, конъюгация полимеров со свободными аминогруппами может отрицательно влиять на способность белков антитела связываться с VEGF.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент, увеличивающий период полувыведения, связывают с одной или более свободными группами SH, применяя любые подходящие тиольные взаимодействия, включая, без ограничения, малеимидные взаимодействия, или сочетание гидразидов полимера или полимерных аминов с углеводными фрагментами антитела после предварительного окисления. В некоторых вариантах осуществления применяют реакцию малеимидного сочетания. В некоторых вариантах осуществления реакция сочетания происходит в цистеинах, естественно присутствующих или вводимых с помощью генной инженерии.

В некоторых вариантах осуществления полимеры ковалентно присоединены к остаткам цистеина, введенным в антитела против VEGF-A путем сайт-направленного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые остатки применяют в Fc части антитела. В некоторых вариантах осуществления сайты для введения остатков цистеина в Fc область приведены в WO 2013/093809, US 7,521,541, WO 2008/020827, US 8,008,453, US 8,455,622 и US2012/0213705, включенных посредством ссылки для всех целей. В некоторых вариантах осуществления мутации цистеина представляют собой Q347C (нумерация EU) и L443C, относящиеся к тяжелой цепи человеческого IgG по нумерации EU.

В некоторых вариантах осуществления обеспечены конъюгаты антитела и высокомолекулярных полимеров, служащих для увеличения периода полувыведения. В некоторых вариантах осуществления конъюгат включает антитело, которое связано с цвиттер-ионным полимером, где полимер образован из одного или более мономерных звеньев и где по меньшей мере одно мономерное звено имеет цвиттер-ионную группу. В некоторых вариантах осуществления цвиттер-ионная группа представляет собой фосфорилхолин.

В некоторых вариантах осуществления одно из мономерных звеньев представляет собой HEMA-PC. В некоторых вариантах осуществления полимер синтезируют из одного мономера, который представляет собой HEMA-PC.

В некоторых вариантах осуществления некоторые конъюгаты антител имеют 2, 3 или более полимерных луча, где мономер представляет собой HEMA-PC. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты имеют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 полимерных лучей, в которых мономер представляет собой HEMA-PC. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты имеют 3, 6 или 9 лучей. В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет 9 лучей.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты полимер-антитело имеют полимерную часть с молекулярной массой от 100000 до 1500000 Да. В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет полимерную часть с молекулярной массой от 500000 до 1000000 Да. В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет полимерную часть с молекулярной массой от 600000 до 800000 Да. В некоторых вариантах осуществления конъюгат имеет полимерную часть с молекулярной массой от 600000 до 850000 Да и имеет 9 лучей. В случае, когда дана молекулярная масса для антитела, конъюгированного с полимером, молекулярная масса будет получаться добавлением молекулярной массы белка, включая любые связанные с ним углеводные фрагменты, и молекулярной массы полимера.

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A имеет полимер HEMA-PC, который имеет молекулярную массу, измеренную M_w от приблизительно 100 кДа до 1650 кДа. В некоторых вариантах осуществления молекулярная измеренная масса полимера M_w, составляет от приблизительно 500 кДа до 1000 кДа. В некоторых вариантах осуществления измеренная молекулярная масса полимера M_w, составляет от приблизительно 600 кДа до приблизительно 900 кДа. В некоторых вариантах осуществления измеренная молекулярная масса полимера M_w, составляет 750 кДа плюс или минус 15 %.

В некоторых вариантах осуществления полимер получают из инициатора, подходящего для ATRP, имеющего один или более сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления сайт инициации полимера имеет сайт 2-бромизобутират. В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет 3 или более сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет 9 сайтов инициации полимера. В некоторых вариантах осуществления инициатор представляет собой OG1786.

Антитела против VEGF-A могут быть получены рекомбинантной экспрессией, включающей (i) получение рекомбинантной ДНК с помощью генной инженерии, (ii) введение рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем, например и без ограничения, трансфекции, электропорации или микроинъекции, (iii) культивирование трансформированных клеток, (iv) экспрессия антитела, например конститутивно или с индукцией, и (v) выделение антитела, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для того, чтобы (vi) получить очищенное антитело.

Антитела против VEGF-A могут быть получены путем экспрессии в подходящей прокариотической или эукариотической системе хозяина, характеризующейся продуцированием фармакологически приемлемой молекулы антитела. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip и HepG2. Другими подходящими экспрессионными системами являются прокариотические (например, E. coli с экспрессионной системой pET/BL21), дрожжи (системы Saccharomyces cerevisiae и/или Pichia pastoris) и клетки насекомых.

Широкое разнообразие векторов можно применить для получения раскрытых здесь антител, их выбирают из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как и без ограничения, preset, pet и pad, где промоторы, применяемые в прокариотических экспрессионных векторах, включают один или более из, без ограничения, lac, trc, trp, recA или araBAD. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) для экспрессии в дрожжах, векторы, такие как и без ограничения, pAO, pPIC, pYES или pMET, с применением промоторов, таких как и без ограничения, AOX1, GAP, GAL1 или AUG1; (ii) для экспрессии в клетках насекомых, векторы, такие как и без ограничения, pMT, pAc5, pIB, pMIB или pBAC, с применением промоторов, таких как и без ограничения PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 или polh и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы, такие как и без ограничения, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 или pBPV, и векторы, полученные, в одном аспекте, из вирусных систем, таких как и без ограничения, вирус вакцины, адено-ассоциированные вирусы, вирусы герпеса или ретровирусы с применением промоторов, таких как и без ограничения, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и бета-актин.

Способ конъюгирования белков с полимерами

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ получения конъюгата терапевтического белка с фрагментом, увеличивающим период полувыведения, включающий стадию конъюгирования терапевтического белка, который содержит остаток цистеина, добавленный с помщью технологии рекомбинантных ДНК, с фрагментом, увеличивающим период полувыведения, имеющим специфичную к сульфгидрилу реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из малеимида, винилсульфонов, ортопиридилдисульфидов и иодацетамидов, с обеспечением конъюгата терапевтического белка с фрагментом, увеличивающим период полувыведения.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ получения конъюгата антитела OG1953 из OG1950. Как показано на фиг. 18, способ включает восстановление белка OG1950 с помощью 50-кратного молярного избытка восстановителя TCEP (фиг. 18). После восстановления, антитело окисляют с образованием декэппированного антитела OG1950, где в легкой и тяжелой цепи антитела естественно образуются внутрицепочечные дисульфидные связи, но сконструированный цистеин в тяжелой цепи в положении L443C (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1) остается декэппированным (фиг. 18). Затем OG1950 конъюгируют путем добавления эксципиента и добавления 5-10-кратного молярного избытка малеимидного биополимера (фиг. 18). Биополимер связывается с антителом OG1950 через ковалентную связь тиолэфира (фиг. 18). После конъюгирования, конъюгат антитела OG19503 очищают с удалением неконъюгированного антитела и полимера (фиг. 18).

Белок и способ, описанные выше, также можно варьировать. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления обеспечен способ получения конъюгированного белка (который не обязательно должен быть антителом или антителом против VEGF). Способ включает восстановление одного или более цистеинов в белке с образованием декэппированного белка в растворе. После восстановления одного или более цистеинов, декэппированный белок повторно окисляют для восстановления по меньшей мере одной дисульфидной связи в восстановленном белке, благодаря чему сконструированный остаток цистеина в белке остается в свободной тиоловой форме с образованием повторно окисленного декэппированного белка в растворе. Затем в раствор добавляют по меньшей мере один эксципиент. Эксципиент уменьшает осаждение белка, индуцированное полимером. После добавления эксципиента, к раствору добавляют полимер, который конъюгирован с повторно окисленным декэппированным белком в сконструированном цистеиновом остатке с образованием конъюгированного белка.

В некоторых вариантах осуществления молярный избыток восстановителя может быть изменен до любого действующего количества. В некоторых вариантах осуществления молярный избыток восстановителя (который не обязательно должен представлять собой TCEP во всех вариантах осуществления) может быть 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90-кратным. В некоторых вариантах осуществления может быть применено любое антитело (терапевтическое или иное). В некоторых вариантах осуществления молярный избыток малеимидного биополимера может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15-кратным. В некоторых вариантах осуществления декэппированный белок находится в избытке по отношению к полимеру. В некоторых вариантах количество восстановленного белка меньше, чем количество полимера. В некоторых вариантах количество восстановленного белка составляет 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % от количества полимера. В некоторых вариантах в качестве белка применяют в 10-15 раз больше полимера. В некоторых вариантах количество восстановленного антитела больше, чем количество полимера. В некоторых вариантах осуществления количество полимера больше, чем количество восстановленного антитела.

В некоторых вариантах осуществления стадия очистки является необязательной.

В некоторых вариантах осуществления способ получения конъюгата антитела включает конъюгирование антитела против VEGF-A с полимером, содержащим фосфорилхолин. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадии конъюгирования антитела против VEGF-A с полимером, содержащим фосфорилхолин. Антитело против VEGF-A содержит аминокислотный остаток, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления добавленный аминокислотный остаток представляет собой остаток цистеина. В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина добавляют вне вариабельной области антитела. Остаток цистеина можно добавлять либо в тяжелую цепь, либо в легкую цепь антитела.

В некоторых вариантах осуществления полимер включает или состоит из полимера, содержащего фосфорилхолин. В некоторых вариантах осуществления полимер, содержащий фосфорилхолин, включает специфичную к сульфгидрилу реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из малеимида, винилсульфона, ортопиридилдисульфида и иодацетамида. В некоторых вариантах осуществления специфичная к сульфгидрилу реакционноспособная группа на полимере, содержащем фосфорилхолин, взаимодействует с остатком цистеина на антителе против VEGF-A для того, чтобы получить конъюгат антитела.

В некоторых вариантах осуществления белок, подлежащий конъюгированию, может представлять собой антитело, гибридный белок, содержащий антитело, или их связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления белок не является антителом, а представляет собой фермент, лиганд, рецептор или другой белок, или мутанты, или варианты. В некоторых вариантах осуществления нативный белок содержит по меньшей мере одну дисульфидную связь и по меньшей мере один ненативный цистеин.

В некоторых вариантах эксципиент может представлять собой кислоту или основание. В некоторых вариантах эксципиент представляет собой детергент, сахар или заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления эксципиент помогает сохранять белок в растворе во время конъюгации с полимером. В некоторых вариантах эксципиент добавляют к раствору, содержащему белок, перед добавлением полимера к раствору, который содержит белок.

В некоторых вариантах осуществления реакцию осуществляют в водных средах при значении рН от приблизительно 5 до приблизительно 9. В некоторых вариантах осуществления реакция протекает при значении рН от 6,0 до 8,5, от 6,5 до 8,0 или от 7,0 до 7,5.

В некоторых вариантах осуществления конъюгирование полимера с белком осуществляют при температуре от 2 до 37°С. В некоторых вариантах осуществления конъюгацию осуществляют при температуре от 0 до 40°С, от 5 до 35°С, от 10 до 30°С и от 15 до 25°С.

В некоторых вариантах осуществления конъюгированные белки, описанные в настоящем изобретении, могут быть подвергнуты взаимодействию со средой для ионообменной или гидрофобной хроматографии, или средой для аффинной хроматографии для очистки (для удаления конъюгированного белка от неконъюгированного). В некоторых вариантах осуществления среда для ионообменной, гидрофобной хроматографии и/или среда для аффинной хроматографии отделяет конъюгированный белок от свободного полимера и повторно окисленного декэппированного белка.

В некоторых вариантах осуществления в способах, раскрытых в настоящем документе и представленных на фиг. 18, участвует эксципиент, способный облегчать и/или поддерживать систему растворимости. В некоторых вариантах осуществления способ позволяет раствору поддерживать растворимость двух компонентов, предназначенных для взаимодействия. То есть растворимость белка и полимера, а также затем конечного конъюгата. В некоторых вариантах осуществления, без применения эксципиента, проблема может заключаться в том, что, хотя белок является растворимым, при добавлении биополимера растворимость раствора (например, белка) падает, и он падает/выпадает из раствора. Конечно, когда белок выпадает, он не может эффективно конъюгировать с биополимером. Таким образом, эксципиент можно применять для поддержания растворимости белка в присутствии биополимера, так что оба могут соединяться с образованием конъюгата белка (или, как показано на фиг. 18, конъюгата антитела). Это также позволяет поддерживать растворимость конъюгата.

В некоторых вариантах полимеры, раскрытые здесь, могут включать один или более из следующих: цвиттер-ион, фосфорилхолин или PEG-линкер, соединяющий центр точки разветвления полимера с функциональной группой малеимида. В некоторых вариантах осуществления любой из обеспеченных здесь полимеров может быть добавлен к белку способами, обеспеченными в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления любой из обеспеченных здесь белков может быть конъюгирован с любым из обеспеченных здесь полимеров посредством одного или более способов, обеспеченных здесь.

В некоторых вариантах осуществления раскрытый в настоящем документе способ(ы) позволяет(ют) в промышленном масштабе получать и очищать конъюгаты белка и/или антитела. В некоторых вариантах осуществления рабочий объем составляет по меньшей мере 1 литр, например, 1, 10, 100, 1000, 5000, 10000 литров или более. В некоторых вариантах осуществления количество конъюгата антитела, полученного и/или очищенного, может составлять 0,1, 1, 10, 100, 1000 или более граммов.

В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок может представлять собой любое из антител против VEGF-A, раскрытых здесь, содержащий остаток цистеина, добавленный с промощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела против VEGF содержит следующие CDR: CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11). Тяжелая цепь также может содержать треонин (Т) в положении 221 (посредством последовательного подсчета, как в SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела против VEGF содержит следующие CDR: CDRs: CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14). Легкая цепь антитела против VEGF-A также может содержать лейцин (L) в положении 4 по Кабату.

В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGF-A представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит одну или более мутаций для модуляции эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления мутации находятся в одном или более из следующих положений аминокислот (нумерация EU): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 и P331. В некоторых вариантах осуществления мутации выбраны из группы, состоящей из: E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления мутации представляют собой (нумерация EU) L234A, L235A и G237A.

В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина, добавленный к терапевтическому белку с помощью технологии рекомбинантных ДНК, не должен быть вовлечен в образование Cys-Cys дисульфидных связей. В этом отношении терапевтические белки могут быть димерными. Так, например, интактное антитело против VEGF-A имеет две легкие цепи и две тяжелые цепи. Если, например, остаток Cys вводят в тяжелую цепь, интактное антитело будет содержать два таких введенных цистеина в одинаковых положениях, и существует вероятность, что эти цистеиновые остатки будут образовывать меж- и внутрицепочечные дисульфидные связи. Если введенные цистеиновые остатки образуют дисульфидные связи Cys-Cys или имеют склонность к этому, то введенный остаток Cys не будет полезен для конъюгации. В уровне техники известно, как избежать положений в тяжелых и легких цепях, приводящих к образованию внутрицепочечных дисульфидных связей. См., например, заявку на патент США 2015/0158952.

В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина, введенный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, выбран из группы, состоящей из (EU нумерация) Q347C и L443C. В некоторых вариантах осуществления остаток цистеина представляет собой L443C (нумерация EU или 449C в SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, а легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления специфичная к сульфгидрилу реакционноспособная группа представляет собой малеимид.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент, увеличивающий период полувыведения, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (PEG), разветвленного PEG, PolyPEG® (Warwick Effect Polymers; Coventry, UK), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), гидроксиалкилкрахмала (ГАК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, ангидрид полиэтилен-со-малеиновой кислоты, ангидрида малеиновой кислоты с полистиролом, поли(1-гидроксиметиэтиленгидроксиметилформаль) (ПГФ), цвиттерионного полимера, фосфорилхолинсодержащего полимера и полимера, содержащего 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфат (MPC).

В некоторых вариантах осуществления фрагмент, увеличивающий период полувыведения, представляет собой цвиттер-ионный полимер. В некоторых вариантах осуществления цвиттер-ион представляет собой фосфорилхолин, то есть полимер, содержащий фосфорилхолин. В некоторых вариантах осуществления полимер состоит из звеньев MPC.

В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет три или более луча. В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 лучей. В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет 3, 6 или 9 лучей. В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет 9 лучей. В некоторых вариантах осуществления полимер синтезируют с инициатором, содержащим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более сайтов инициации полимера.

В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до 1750000 Да. В некоторых вариантах осуществления MPC полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 500000 до 1000000 Да или от приблизительно 600000 до 900000 Да.

В некоторых вариантах осуществления способ получения конъюгата терапевтического белка и фрагмента, увеличивающего период полувыведения, включает дополнительную стадию взаимодействия терапевтического белка с тиоловым восстановителем в условиях, при которых получают восстановленную цистеиновую сульфгидрильную группу. Как обсуждалось выше, предпочтительно, чтобы остаток цистеина, добавленный с пормощью технологии рекомбинантных ДНК, не был парным, то есть не участвовал во внутрицепочечных дисульфидных связях Cys-Cys или не был по существу вовлечен в такое связывание. Однако, остатки Cys, которые не участвуют в таком дисульфидном связывании Cys-Cys и свободны для конъюгирования, как известно, взаимодействуют со свободным цистеином в культуральной среде с образованием дисульфидных аддуктов. См., например, WO 2009/052249. Таким образом, дериватизированный цистеин не будет доступен для конъюгирования. Для того, чтобы освободить вновь добавленный цистеин от дисульфидного аддукта, белок после очистки обрабатывают восстановителем, например, дитиотреитолом. Однако, такая обработка восстановителем восстановит все остатки цистеина в терапевтическом белке, включая нативные цистеины, многие из которых вовлечены в меж- и внутрицепочечные дисульфидные связи Cys-Cys. Нативные дисульфиды Cys-Cys, как правило, играют ключевую роль в стабильности и активности белка, и их следует преобразовать. В некоторых вариантах осуществления все нативные (например, меж- и внутри-) Cys-Cys дисульфиды подвергают преобразованию.

Для преобразования нативных меж- и внутрицепочечных дисульфидных остатков, после восстановления для удаления дисульфидных цистеиновых аддуктов, терапевтический белок подвергают воздействию окислительных условий и/или окислителей в течение заданного периода времени, например, в течение ночи. В некоторых вариантах осуществления воздействие атмосферного воздуха в течение ночи могут применять для преобразования нативных дисульфидных связей. В некоторых вариантах осуществления окислитель применяют для восстановления нативных дисульфидов. В некоторых вариантах осуществления окислитель выбирают из группы, состоящей из водного CuSO₄ и дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК). В некоторых вариантах осуществления окислитель представляет собой ДАК. В некоторых вариантах осуществления диапазон применяемого ДАК составляет от 5 до 30 эквивалентов. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет от 10 до 20 эквивалентов. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет 15 эквивалентов.

В некоторых вариантах осуществления тиоловый восстановитель выбирают из группы, состоящей из трис[2-карбоксиэтил]фосфин гидрохлорида (TCEP), дитиотреитола (DTT), дитиоэритрита (DTE), боргидрида натрия (NaBH₄), цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃), β-меркаптоэтанола (BME), цистеингидрохлорида и цистеина. В некоторых вариантах осуществления тиоловым восстановителем является TCEP.

В некоторых вариантах осуществления концентрация тиолового восстановителя составляет от 1 до 100-кратного молярного избытка относительно концентрации терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления концентрация тиолового восстановителя составляет от 20 до 50-кратного молярного избытка относительно концентрации терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления тиоловый восстановитель удаляют после инкубации с терапевтическим белком для окисления терапевтического белка.

В некоторых вариантах осуществления способ конъюгирования терапевтического белка с фрагментом, увеличивающим период полувыведения, включает дополнительную стадию очистки конъюгата терапевтического белка после конъюгирования. В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка очищают способом, выбранным из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, эксклюзионной хроматографии и аффинной хроматографии или их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка сохраняет по меньшей мере 20 % биологической активности по сравнению с неконъюгированным терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка сохраняет по меньшей мере 50 % биологической активности по сравнению с неконъюгированным терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка сохраняет по меньшей мере 90 % биологической активности по сравнению с нативным терапевтическим белком.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка имеет увеличенный период полувыведения по сравнению с неконъюгированным терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка имеет по меньшей мере 1,5-кратное увеличение периода полувыведения по сравнению с неконъюгированным терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления конъюгат терапевтического белка имеет по меньшей мере 5-кратное увеличение периода полувыведения по сравнению с неконъюгированным терапевтическим белком.

В некоторых вариантах осуществления цвиттер-ионный полимер в способе конъюгирования терапевтического белка с фрагментом, увеличивающим период полувыведения, представляет собой радикально полимеризуемый мономер, имеющий цвиттер-ионную группу, и способ включает дополнительную стадию полимеризации свободнорадикально полимеризуемого цвиттер-ионного мономера в полимеризационной среде для обеспечения полимера, причем среда содержит: радикально полимеризуемый цвиттер-ионный мономер; катализатор на основе переходного металла M_t^(q-1)+, где M_t представляет собой переходный металл, q представляет собой высшую степень окисления металла, а q-1 представляет собой низшую степень окисления металла, где катализатор на основе металла подают в виде соли формы Mt^(q-1)+X'_(q-1), где X' представляет собой противоион или группу, или катализатор на основе переходного металла подают in situ путем обеспечения соли неактивного металла в его высшей степени окисления M_t^q+X'_q вместе с восстанавителем, который способен восстанавливать переходный металл из окисленного неактивного состояния до восстановленного активного состояния; лиганд; и инициатор.

Для того, чтобы функционировать в качестве катализатора переходного металла ATRP, переходный металл должен иметь по меньшей мере две легкодоступных степени окисления, разделенные одним электроном, высшая степень окисления и низшая степень окисления. В ATRP обратимая окислительно-восстановительная реакция приводит к зацикливанию катализатора переходного металла между высшей степенью окисления и низшей степенью окисления, в то время как полимерные цепи совершают цикл от роста концов цепи до затухания их активности. См., например, патент США 7893173.

В некоторых вариантах осуществления радикально полимеризуемый цвиттер-ионный мономер выбирают из группы, состоящей из

,

где R1 представляет собой H или C_1-6 алкил, ZW представляет собой цвиттер-ион, а n представляет собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления радикально полимеризуемый мономер представляет собой

,

где R1 представляет собой H или C_1-6 алкил, R2, R3, R4 являются одинаковыми или различными и представляют собой H или C_1-4 алкил, а i и j являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления каждый из R1, R2, R3 и R4 представляет собой метил, и каждый из i и j равен 2.

В некоторых вариантах осуществления радикально полимеризуемый мономер представляет собой

,

где R1 представляет собой H или C_1-6 алкил, R2 и R3 являются одинаковыми или различными и представляют собой Н или С_1-4 алкил, R4 представляет собой PO₄-, SO₃- или CO₂-, а X и Y являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления R1, R2 и R3 представляют собой метил, R4 представляет собой PO₄-, и каждый из X и Y равен 2.

В некоторых вариантах осуществления мономер представляет собой

где R1 представляет собой H или C_1-6 алкил, R2, R3 и R4 являются одинаковыми или различными и представляют собой Н или С_1-4 алкил, R5 представляет собой PO₄-, SO₃- или CO₂-, а X и Y являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления R1, R2, R3 и R4 представляют собой метил, R5 представляет собой PO₄-, а X и Y равны 2.

В некоторых вариантах осуществления переходный металл Mt выбирают из группы, состоящей из Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au и Ag. В некоторых вариантах катализатор на основе металла подают в виде соли формы Mt^(q-1)+X'_(q-1). M_t^(q-1)+ выбирают из группы, состоящей из Cu¹⁺, Fe²⁺, Ru²⁺, Cr²⁺, Mo²⁺, W²⁺, Mn³⁺, Rh³⁺, Re²⁺, Co⁺, V²⁺, Zn⁺, Au⁺ и Ag⁺, а X' выбирают из группы, состоящей из галогена, C_1-6 алкокси, (SO₄)_1/2, (PO₄)_1/3, (R7PO₄)_1/2, (R7₂PO₄), трифлата, гексафторфосфата, метансульфоната, арилсульфоната, CN и R7CO₂, где R7 представляет собой H или линейную или разветвленную C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним-пятью атомами галогена. В некоторых вариантах осуществления M_t^(q-1)+ представляет собой Cu¹⁺ и X' представляет собой Br.

В некоторых вариантах осуществления M_t^(q-1)+ подают in situ. В некоторых вариантах осуществления M_t^q+X_q представляет собой CuBr₂. В некоторых вариантах осуществления восстановитель представляет собой неорганическое соединение. В некоторых вариантах осуществления восстановитель выбирают из группы, состоящей из соединения серы с низкой степенью окисления, гидросульфита натрия, неорганической соли, содержащей ион металла, металла, гидразингидрата и производных таких соединений. В некоторых вариантах осуществления восстановитель представляет собой металл. В некоторых вариантах осуществления восстановитель представляет собой Cu⁰.

В некоторых вариантах осуществления восстановитель представляет собой органическое соединение. В некоторых вариантах осуществления органическое соединение выбрано из группы, состоящей из алкилтиолов, меркаптоэтанола или карбонильных соединений, которые могут быть легко енолизованы, аскорбиновой кислоты, ацетилацетоната, камфосульфоновой кислоты, гидроксиацетона, восстанавливающих сахаров, моносахаридов, глюкозы, альдегидов и производных таких органических соединений.

В некоторых вариантах осуществления лиганд выбирают из группы, состоящей из 2,2'-бипиридина, 4,4'-ди-5-нонил-2,2'-бипиридина, 4,4-динонил-2,2'-дипиридила, 4,4',4''-трис(5-нонил)-2,2':6',2''-терпиридина, N,N,N',N',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, трис(2-диметиламиноэтил)амина, N,N-бис(2-пиридилметил)октадециламина, N,N,N',N'-тетра[(2-пиридил)метил]этилендиамина, трис[(2-пиридил)метил]амина, трис(2-аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-бутокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-(2-этилгексокси)-3-оксопропил)аминоэтил)амина и трис(2-бис(3-додекокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина. В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой 2,2'-бипиридин.

В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет структуру:

где R1 представляет собой нуклеофильную реакционноспособную группу, R2 включает линкер, а R3 включает фрагмент инициатора полимерного синтеза, имеющий структуру

,

где R4 и R5 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкилена, алкокси, карбоксиалкила, галогеналкила, циклоалкила, циклического простого алкилового эфира, алкенила, алкенилена, алкинила, алкинилена, циклоалкилена, гетероциклоалкила, гетероциклоалкилена, арила, арилена, ариленокси, гетероарила, амино, амидо и любой их комбинации; Z представляет собой галоген или NCS; и s представляет собой целое число от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой Br, и каждый из R4 и R5 представляет собой метил. В некоторых вариантах осуществления R1 выбран из группы, состоящей из NH₂-, OH- и SH-.

В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой алкил, замещенный алкил, алкилен, алкокси, карбоксиалкил, галогеналкил, циклоалкил, циклический простой алкиловый эфир, алкенил, алкенилен, алкинил, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкил, гетероциклоалкилен, арил, арилен, ариленокси, гетероарил, амино, амидо или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой

где α и β являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления каждый из α и β равен 4.

В некоторых вариантах осуществления R3 представляет собой

,

где R6, R7 и R8 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из

и

,

где Z представляет собой NCS, F, Cl, Br или I. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой Br и каждый из R6, R7 и R8 представляет собой

.

В некоторых вариантах осуществления инициатор имеет структуру:

,

где A и B являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 2 до 12, а Z представляет собой любой галогенид, например, Br. В некоторых вариантах осуществления A и B каждое равно 4.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию взаимодействия полимера с малеимидным реагентом с получением полимера, имеющего концевой малеимид. В некоторых вариантах осуществления соединение малеимида представляет собой

.

Способ лечения

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания, включающий стадию введения терапевтического белка, выбранного из группы, состоящей из антитела против VEGF-A (и их конъюгатов). В некоторых вариантах осуществления любое одно или более из антител или конъюгатов антител, обеспеченных здесь, можно применять для лечения и/или профилактики офтальмологического заболевания. Способ включает введение субъекту любого одного или более антител, или конъюгатов антител, обеспеченных здесь.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания. Способ включает введение эффективной дозы любого антитела и/или конъюгатов антитела, описанных здесь, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления заболевание может представлять собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетический макулярный отек (ДМО). В некоторых вариантах осуществления болезнь может представлять собой влажную форму ВМД.

В некоторых вариантах осуществления офтальмологическое заболевание выбрано из одной или более групп, состоящих из диабетической ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), патологической миопии, болезни фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзии ветвей центральной вены сетчатки (ОВЦВС), неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, ретинопатии недоношенных (РН), субконъюнктивального кровоизлияния и гипертонической ретинопатии. Необязательно, офтальмологическое заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.

В некоторых вариантах осуществления антитело или конъюгат антитела вводят не чаще одного раза в месяц. В некоторых вариантах осуществления антитело или его конъюгат вводят два раза в месяц или еженедельно. В некоторых вариантах осуществления антитело или его конъюгат вводят один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев, один раз в семь месяцев, один раз в восемь месяцев, один раз в девять месяцев, один раз в десять месяцев, один раз в одиннадцать месяцев или один раз в двенадцать месяцев.

В некоторых вариантах осуществления одна или более композиций, обеспеченных здесь, могут позволить снизить последствия высокой нагрузки при применении инъекций в стекловидное тело агентов против VEGF для лечения влажной (пролиферативной) формы возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Практические результаты лечения пациентов с влажной формой ВМД отстают от клинических результатов, продемонстрированных в фазе 3 клинических исследований, таких как исследования MARINA и ANCHOR с Lucentis® (ранибизумаб) и исследования VIEW 1 и VIEW с Eylea® (афлиберцепт). Терапевтический белок против VEGF с более длительным временем удержания, так что его можно вводить реже и, следовательно, с лучшей переносимостью пациентом, может принести практические результаты ближе к клиническим результатам фазы 3 для большего числа пациентов.

В некоторых вариантах осуществления соединения, включая конъюгаты антител и антитела против VEGF-A, описанные здесь, применяют для лечения пациентов с фоновой или непролиферативной диабетической ретинопатией, но имеющих незначительное ухудшение зрения или без ухудшения зрения. В некоторых вариантах осуществления таким пациентам вводят дозу реже одного раза в месяц путем инъекции в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления таким пациентам вводят дозу шесть раз в год. В некоторых вариантах осуществления таким пациентам вводят дозу не более чем четыре раза в год. В некоторых вариантах осуществления пациентам вводят дозу не более чем три раза в год. В некоторых вариантах осуществления пациентам вводят дозу не более чем два раза в год. В некоторых вариантах осуществления пациентам вводят дозу не более чем один раз в год. В некоторых вариантах осуществления субъект получает антитела или конъюгат антитела путем введения инъекции в стекловидное тело.

Терапевтические белки (например, как антитела, так и конъюгаты антител), описанные здесь, могут быть применены путем экспрессии таких полипептидов in vivo у пациента, то есть генной терапии.

Существует два основных способа получения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетках пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту вводят непосредственно пациенту, обычно в местах, где требуется терапевтический белок, т.е. когда требуется биологическая активность терапевтического белка. Для лечения ex vivo клетки пациента забирают, нуклеиновую кислоту вводят в такие выделенные клетки, а модифицированные клетки вводят пациенту либо непосредственно, либо, например, инкапсулируют в пористые мембраны, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США 4,892,538 и 5,283,187). Существует множество способов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Способы варьируются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивируемые клетки in vitro или переносят in vivo в клетки предполагаемого хозяина. Способы, подходящие для передачи нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, трансдукцию, слияние клеток, диэтиламиноэтилдекстран, способ осаждения фосфатом кальция и так далее. Трансдукция включает ассоциацию дефектной по репликации, рекомбинантной вирусной (включая ретровирусную) частицы с клеточным рецептором с последующим введением нуклеиновых кислот, переносимых частицой, в клетку. Обычно вектор, применяемый для доставки гена ex vivo представляет собой ретровирус.

В некоторых вариантах осуществления способы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию вирусными или невирусными векторами (такими как аденовирус, лентивирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус (AAV)) и системы на основе липидов (полезными липидами для липидного опосредованного переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol, см., например, Tonkinison et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)). В некоторых вариантах осуществления, применяемые в генной терапии векторы представляют собой вирусы, которые включают аденовирусы, AAV, лентивирусы или ретровирусы. Вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор, содержит по меньшей мере один транскрипционный промотор/энхансер или определяющий локус элемент(ы) или другие элементы, которые контролируют экспрессию гена другими способами, такими как альтернативный сплайсинг, экспорт ядерной РНК или посттрансляционная модификация мессенджера. Кроме того, вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая при транскрибировании в присутствии гена, кодирующего терапевтический белок, функционально связана с ним и действует как последовательность инициации трансляции. Такие векторные конструкции также включают в себя сигнал упаковки, длинные концевые повторы (LTR) или их части, а также сайты связывания праймера с положительными и отрицательными цепями, соответствующие применяемому вирусу (если они еще не присутствуют в вирусном векторе). Кроме того, такой вектор обычно включает сигнальную последовательность для секреции полипептида PRO из клетки-хозяина, в которую он помещен. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность для этой цели представляет собой сигнальную последовательность млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления сигнал является нативной сигнальной последовательностью для терапевтического белка. Необязательно, векторная конструкция может также содержать сигнал, который направляет полиаденилирование, а также один или более сайтов рестрикции и последовательность терминации трансляции. В качестве примера такие векторы обычно включают 5'LTR, сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, точку начала синтеза второй цепи ДНК и 3'LTR или его часть. Возможно применение других векторов, которые являются невирусными, таких как катионные липиды, полилизин и дендримеры.

В некоторых ситуациях желательно обеспечить источник нуклеиновой кислоты с помощью агента, который нацеливается на клетки-мишени, такого как антитело, специфичное для белка мембраны клеточной поверхности или клетки-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. В случае применения липосом, белки, связывающиеся с белком мембраны клеточной поверхности, ассоциированном с эндоцитозом, могут быть применены для нацеливания и/или для облегчения поглощения, например, капсидных белков или их фрагментов для определенного типа клеток, антител к белкам, подвергающихся интернализации в цикле, и белки, нацеленные на внутриклеточную локализацию и повышающие внутриклеточный период полувыведения. Способ опосредованного рецептором эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Для обзора известных в настоящее время протоколов генного мечения и генной терапии см. Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). См. также WO 93/25673 и приведенные там ссылки.

Подходящая генная терапия и способы для получения ретровирусных частиц и структурных белков могут быть найдены, например, в патенте США 5,681,746.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания у млекопитающего, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует терапевтический белок, выбранный из группы, состоящей из антитела против VEGF-A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представлена на фиг. 27.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой то, что указано в SEQ ID NO: 1, а легкая цепь представляет собой то, что указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты вводят ex vivo с помощью генной терапии.

Терапевтические белки могут быть включены в фармацевтическую композицию с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях, или в виде съедобной пены или массы, или в виде эмульсий). Подходящие эксципиенты для таблеток или твердых желатиновых капсул включают лактозу, кукурузный крахмал или их производные, стеариновую кислоту или их соли. Подходящие эксципиенты для применения с мягкими желатиновыми капсулами включают, например, растительные масла, воски, жиры, мягкие или жидкие полиолы и т.д. Эксципиенты, которые можно применять для получения растворов и сиропов, включают, например, воду, полиолы и сахара. Для получения суспензий, можно применять масла (например, растительные масла) для обеспечения суспензий масло-в-воде или вода в масле.

Фармацевтические композиции могут быть адаптированы для назального введения, где эксципиент представляет собой твердое вещество, включающее крупнодисперсный порошок, имеющий размер частиц, например, от 20 до 500 микрон, который вводят способом наподобие приема табак, то есть путем быстрой ингаляции через носовой проход из контейнера порошка, удерживаемого близко к носу. Подходящие композиции, в которых эксципиент представляет собой жидкость, для введения в виде назального спрея или в виде назальных капель, включают водные или масляные растворы активного ингредиента. Фармацевтические композиции, адаптированные для введения путем ингаляции, включают тонкодисперсные пылевые частицы или аэрозоли, которые могут быть получены с помощью различных типов дозированных аэрозолей под давлением, распылителей или инсуффляторов.

Фармацевтические композиции, адаптированные для парентерального введения, включают водный и неводный стерильный раствор для инъекций, который может содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композицию по существу изотоничной с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Эксципиенты, которые можно применять для инъекционных растворов, включают, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильной жидкости, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток. Фармацевтические композиции могут быть по существу изотоническими, что подразумевает осмоляльность приблизительно от 250 до 400 мОсмоль/кг воды.

Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизирующие агенты, стабилизирующие агенты, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, одоранты, соли (сами вещества могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемой соли), буферы, покрывающие агенты или антиоксиданты. Они могут также содержать терапевтически активные агенты в дополнение к веществу. Фармацевтические композиции могут быть применены в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Такие эксципиенты могут включать, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный раствор, (такой как фосфатно-солевой буферный раствор), декстрозу, липосомы, воду, глицерин, этанол и их комбинации.

Антитела и фармацевтические композиции, содержащие их, можно вводить в эффективном режиме для лечения или профилактики болезни пациента, включая, например, пероральное, в стекловидное тело, внутривенное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, интраназальное, местное, внутрибрюшинное введение, и введение внутрь пораженных тканей. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение, или другие пути поступления. В терапии или в качестве профилактического средства, активный агент можно вводить индивидууму в виде инъекционной композиции, например, в виде стерильной водной дисперсии. В некоторых вариантах осуществления агент является изотоническим или по существу изотоническим.

Для введения млекопитающим, и особенно людям, ожидают, что дозировка активного агента составляет от 0,01 мг/кг массы тела, обычно приблизительно 1 мг/кг. Врач может определить фактическую дозировку, наиболее подходящую для индивидуума, которая зависит от факторов, включая возраст, массу, пол и реакцию индивидуума, заболевание или расстройство, подвергаемое лечению, а также возраст и состояние индивидуума, получающего лечение. Вышеуказанные дозы являются примерными для среднего случая. Разумеется, могут быть случаи, когда заслуживают внимания более высокие или более низкие дозы. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять от 0,5 до 20 мг/глаз, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 мг.

Такую дозировку можно повторять так часто, как это необходимо (например, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца, ежеквартально, два раза в год, ежегодно). Если развиваются побочные эффекты, количество и/или частота дозировки могут быть уменьшены в соответствии с обычной клинической практикой. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию могут вводить один раз каждые один-тридцать дней. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию могут вводить дважды каждые тридцать дней. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию могут вводить один раз в неделю.

Антитела и фармацевтические композиции можно применять отдельно или в сочетании с другими соединениями, такими как терапевтические соединения или молекулы, например, противовоспалительные лекарственные средства, анальгетики или антибиотики. Такое введение с другими соединениями может быть одновременным, раздельным или последовательным. Компоненты могут быть получены в виде набора, который может содержать инструкции, если это необходимо.

Антитела и фармацевтические композиции, раскрытые здесь, можно применять для лечения или профилактики заболевания, особенно офтальмологических заболеваний или состояний, описанных здесь.

Таким образом, конъюгаты обычно получают и вводят путем глазной, внутриглазной и/или инъекции в стекловидное тело, и/или околосклеральной инъекции, и/или субретинальной инъекции, и/или субтеноновой инъекции, и/или супрахориоидальной инъекции и/или субконъюнктивальной, и/или местного введения в виде глазных капель и/или мази. Такие антитела и композиции могут быть доставлены различными способами, например, в стекловидное тело в качестве устройства и/или депо, которое обеспечивает медленное высвобождение соединения в стекловидное тело, в том числе описанное в таких ссылках, как Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). В одном примере устройство может быть в виде мини-насоса и/или матрицы. и/или пассивной диффузионной системы. и/или инкапсулированных клеток, которые высвобождают соединение в течение длительного периода времени (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006).

Составы для глазного, внутриглазного или введения в стекловидное тело могут быть получены способами и с применением ингредиентов, известных в данной области техники. Основным требованием для эффективного лечения является надлежащее проникновение через глаз. В отличие от заболеваний передней части глаза, когда препараты могут быть доставлены местно, заболевания сетчатки требуют более сайт-специфичного подхода. Глазные капли и мази редко проникают в заднюю часть глаза, а гематоофтальмический барьер препятствует проникновению системно вводимых лекарственных средств в глазную ткань. Соответственно, обычно способ выбора доставки лекарственных средств для лечения заболеваний сетчатки, таких как ВМД и ХНВ, представляет собой прямое введение в стекловидное тело. Инъекции в стекловидное тело обычно повторяют с интервалами, которые зависят от состояния пациента, а также от свойств и периода полувыведения введенного лекарственного средства.

Терапевтические антитела и связанные с ними конъюгаты обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное отверстие для доступа, например, пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции. Такие композиции могут также поставляться в виде предварительно заполненных шприцев.

"Стабильная" композиция представляет собой композицию, в которой белок или белок, конъюгированный с полимером другого фрагмента, увеличивающего период полувыведения, по существу сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. Под "стабильной" подразумевается также композиция, которая мало или вообще не имеет признаков нестабильности, включая агрегацию и/или дезамидирование. Например, обеспеченные композиции могут оставаться стабильными в течение по меньшей мере двух лет при хранении, как указано при температуре от 5 до 8°C.

Различные аналитические способы измерения стабильности белка доступны в данной области техники и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) и Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. В некоторых вариантах осуществления хранение композиций является стабильным в течение по меньшей мере 6 месяцев, 12 месяцев, от 12 до 18 месяцев или в течение 2 или более лет.

Белок, такой как антитело или его фрагмент, "сохраняет свою физическую стабильность" в фармацевтической композиции, если он не обнаруживает признаков агрегации, осаждения, дезамидирования и/или денатурации при визуальном осмотре цвета и/или прозрачности, или при измерении ультрафиолетовым рассеянием света или эксклюзионной хроматографией.

Белок "сохраняет свою химическую стабильность" в фармацевтической композиции, если химическая стабильность в данный момент такова, что считается, что белок сохраняет свою биологическую активность. Химическую стабильность можно оценить путем обнаружения и количественного определения химически измененных форм белка. Химическое изменение может включать модификацию размера (например, усечение), которая может быть оценена, например, эксклюзионной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС-ПААГ) и/или времяпролётной масс-спектрометрией с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI/TOF MS). Другие типы химических изменений включают изменение заряда (например, происходящее в результате дезамидирования), которое может быть оценено, например, ионообменной хроматографией. Антитело "сохраняет свою биологическую активность" в фармацевтической композиции, если биологическая активность антитела в данный момент составляет не более 10 % (в пределах погрешностей анализа) биологической активности, проявляемой во время получения фармацевтической композиции, как определено в анализе связывания антигена, например.

Конъюгат белка с полимером "сохраняет свою химическую стабильность", когда химическая связь между белком и полимером сохраняется неизменной, например, не гидролизуется или не разрушается иным образом. Белковая часть конъюгата сохраняет свою химическую стабильность, как описано выше.

Под "изотоническим" подразумевается, что представляющий интерес состав имеет по существу то же самое осмотическое давление, что и человеческая кровь или стекловидное тело для инъекций в стекловидное тело. Изотонические составы обычно имеют осмотическое давление от приблизительно 250 до 400 мОсмоль. Изотоничность может быть измерена, например, с применением парового осмометра или осмометра по точке замерзания.

В контексте настоящего документа, термин "буфер" относится к буферному раствору, который препятствует изменениям рН под действием его кислотно-щелочных конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления значение рН буфера составляет от приблизительно 3,0 до приблизительно 8,0; например, от приблизительно 4,5 до 8; или от приблизительно 6 до приблизительно 7,5; или от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5; или от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,4. Также предполагается значение рН любой точки между вышеуказанными диапазонами.

В некоторых вариантах осуществления применяют фосфатно-солевой буферный раствор "PBS", буферы на основе Трис и буферы на основе гистидина.

В некоторых вариантах осуществления буфер PBS состоит из по меньшей мере Na₂HPO₄, KH₂PO₄ и NaCl для обеспечения соответствующего значения рН. В некоторых вариантах осуществления буфер может содержать другие фармацевтические эксципиенты, такие как KCl и другие соли, детергенты и/или консерванты для обеспечения устойчивости при хранении раствора.

"Консервант" представляет собой соединение, которое может быть включено в композицию, чтобы существенно снизить в ней бактериальную активность, что облегчает, например, получение многократно применяемого состава. Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы представляют собой соединения с длинной цепью) и хлорид бензетония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутил и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол.

В некоторых вариантах осуществления композиции, которые должны быть безопасными для применения человеком или для тестирования на животных, должны иметь достаточно низкие уровни эндотоксина. "Эндотоксин" представляет собой липополисахарид (ЛПС), полученный из клеточной мембраны грамотрицательных бактерий. Эндотоксин состоит из гидрофильного полисахаридного фрагмента, ковалентно связанного с гидрофобным липидным фрагментом (липид А). Raetz CR, Ulevitch RJ, Wright SD, Sibley CH, Ding A, Nathan CF. 1991. Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction. FASEB J. 5(12):2652-2660. Липид А ответственен за большую часть биологической активности эндотоксина, то есть его токсичности. Эндотоксины в большом количестве теряются при гибели бактериальных клеток, а также во время роста и деления. Они обладают высокой теплостойкостью и не разрушаются при обычных условиях стерилизации. Необходимо применять экстремальную обработку теплом или рН, например, от 180 до 250°С и более 0,1 М кислоты или основания (Petsch D, Anspach F. 2000. Endotoxin removal from protein solutions. J Biotechnol. 76: 97-119). Очевидно, что такие условия вредны для биологических лекарственных средств.

В биотехнологической и фармацевтической промышленности можно обнаружить эндотоксины как в процессе получения, так и в конечных продуктах. Поскольку бактерии могут расти в энергетически бедных средах, включая воду, физиологический раствор и буферы, количество эндотоксинов будет расти, если не принять меры предосторожности. Инъекция эндотоксина животному или человеку вызывает широкий спектр патофизиологических эффектов, включая эндотоксиновый шок, повреждение тканей и даже смерть. Ogikubo Y, Ogikubo Y, Norimatsu M, Noda K, Takahashi J, Inotsume M, Tsuchiya M, Tamura Y. 2004. Evaluation of the bacterial endotoxin test for quantifications of endotoxin contamination of porcine vaccines. Biologics 32:88-93.

Пирогенные реакции и шок индуцируются у млекопитающих при внутривенном введении эндотоксина в низких концентрациях (1 нг/мл) (Fiske JM, Ross A, VanDerMeid RK, McMichael JC, Arumugham. 2001. Method for reducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2 protein preparations. J Chrom B. 753:269-278). Максимальный уровень эндотоксина для внутривенных применений фармацевтического и биологического продукта составляет 5 единиц эндотоксина (EU) на кг массы тела в час по всем фармакопеям (Daneshiam M, Guenther A, Wendel A, Hartung T, Von Aulock S. 2006. In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatory drugs. J Immunol Method 313:169-175). EU представляет собой единицу измерения биологической активности эндотоксина. Например, 100 пг стандартного эндотоксина EC-5 и 120 пг эндотоксина из Escherichia coli O111:B4 имеют активность 1 EU (Hirayama C, Sakata M. 2002. Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. J Chrom B 781:419-432). Достижение этого порогового уровня всегда было проблемой в биологических исследованиях и фармацевтической промышленности (Berthold W, Walter J. 1994. Protein Purification: Aspects of Processes for Pharmaceutical Products. Biologicals 22:135-150; Petsch D, Anspach FB. 2000. Endotoxin removal from protein solutions. J Biotech 76:97-119).

Особое беспокойство вызывает наличие эндотоксина в лекарственных средствах, доставляемых путем инъекции в стекловидное тело. Инъекция в стекловидное тело лекарственного средства (пенициллин) была впервые выполнена в 1945 году Рикрофтом. Rycroft BW. 1945. Penicillin and the control of deep intra-ocular infection. British J Ophthalmol 29 (2): 57-87. Стекловидное тело представляет собой камеру, в которую можно вводить и поддерживать высокий уровень лекарственного средства в течение относительно продолжительных периодов времени. Концентрация лекарственного средства, которая может быть достигнута путем инъекции в стекловидное тело, намного превышает таковую при местном введении или системном введении (например, внутривенном).

Одним из наиболее опасных осложнений, потенциально возникающих при инъекциях в стекловидное тело, является эндофтальмит. Эндофтальмит подразделяется на два класса: инфекционный и стерильный. Инфекционный эндофтальмит обычно вызывается бактериями, грибами или паразитами. Симптомы инфекционного эндофтальмита включают сильную боль, потерю зрения и покраснение конъюнктивы и подлежащей эписклеры. Инфекционный эндофтальмит требует незамедлительной диагностики и лечения. Возможные способы лечения включают инъекцию антибиотиков в стекловидное тело и первичную витрэктомию в некоторых случаях. Энуклеацией называют удаление слепого и болезненного глаза. См., например, Christy NE, Sommer A. 1979. Antibiotic prophylaxis of postoperative endophthalmitis. Ann Ophthalmol 11 (8): 1261-1265.

Стерильный эндофтальмит, напротив, не включает воздействия инфекционного агента и может быть определен как острое внутриглазное воспаление стекловидной полости, которое устраняется без необходимости введения антибиотиков в стекловидное тело и/или применения витреоретинальной хирургии. Для обеспечения диагноза стерильного эндофтальмита при проведении микробиологического исследования стекловидного тела, культура не должна иметь роста. Marticorena J, Romano V, Gomez-Ulla F. 2012 “Sterile Endophthalmitis after Intravitreal Injections” Med Inflam. 928123.

Было обнаружено, что инъекция в стекловидное тело биологических лекарственных средств, загрязненных эндотоксином, может приводить к возникновению стерильного эндофтальмита. Marticorena, et al. Бевацизумаб (Avastin) одобрен Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) для лечения глиобластомы и метастатического колоректального рака, прогрессирующего неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого и метастатического рака почки. Бевацизумаб также широко применяют не по утверждённым показаниям для лечения влажной формы ВМД. Бевацизумаб поступает от производителя в дозировке 100 мг/4 мл. Такой раствор не может быть применен непосредственно для инъекций в стекловидное тело и должен приготовляться фармацевтом. Наблюдали кластеры стерильного эндофтальмита, которые, как предполагается, являются следствием случайного заражения бевацизумаба эндотоксином при приготовлении фармацевтом.

Учитывая тяжелые клинические результаты инъекции эндотоксина в стекловидное тело, общее количество эндотоксина, которое может быть дано пациенту путем дозирования в стекловидное тело, крайне ограничено. В некоторых вариантах осуществления обеспечен раствор, содержащий антитело или конъюгат антитела, имеющий уровень эндотоксина, который не превышает 5,0 EU/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень эндотоксина не превышает 1,0 EU/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень эндотоксина не превышает 0,5 EU/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень эндотоксина не превышает 0,2 EU/мл. В некоторых вариантах осуществления уровень эндотоксина не превышает 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 или 0,01 EU/мл.

Два широко применяемых теста, одобренных FDA, на присутствие эндотоксина, представляют собой пирогенную пробу на кролике и реакцию с лизатом амёбоцитов мечехвоста (LAL) (Hoffman S, et al. 2005. International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells J. Immunol. Methods 298:161-173; Ding JL, Ho BA. 2001. New era in pyrogen testing. Biotech. 19:277-281). Пирогенная проба на кролике была разработана в 1920-х годах и включает мониторинг повышения температуры у кролика, после инъекции тестового раствора. Тем не менее, применение пирогенной пробы на кролике значительно уменьшилось за эти годы из-за расходов и длительного времени обработки. Гораздо более распространенным является тест LAL. LAL получают из крови мечехвоста и сгустков при воздействии эндотоксина.

Одним из простейших анализов LAL является гель-тромб тест LAL. По существу, анализ коагулирующей активности LAL комбинируют с последовательным разведением исследуемого образца. Образование геля пропорционально количеству эндотоксина в образце. Последовательные разведения получают из образца, и каждое разведение анализируют на его способность образовывать гель LAL. В некоторой точке наблюдается отрицательная реакция. Количество эндотоксина в исходном образце можно оценить по анализу разведения.

Также были разработаны другие тесты LAL, в том числе турбидиметрический анализ LAL (Ong KG, Lelan JM, Zeng KF, Barrett G, Aourob M, Grimes CA. 2006. A rapid highly-sensitive endotoxin detection system. Biosensors and Bioelectronics 21:2270-2274) и хромогенный анализ LAL (Haishima Y, Hasegawa C, Yagami T, Tsuchiya T, Matsuda R, Hayashi Y. 2003. Estimation of uncertainty in kinetic-colorimetric assay of bacterial endotoxins. J Pharm Biomed Analysis. 32:495-503). Турбидиметрический и хромогенный анализы намного более чувствительны и количественны, чем простой тест разведения гель-тромб.

В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ снижения количества эндотоксина в композиции, содержащей антитело, раскрытое в настоящем документе. Способ, включающий стадии взаимодействия композиции со смолой для аффинной хроматографии, которая связывает антителом; элюирования антитела из смолы для аффинной хроматографии с образованием элюента аффинной хроматографии, имеющего антагонист; взаимодействия элюента аффинной хроматографии с ионообменной смолой, которая связывает антитело; и элюирования антитела из ионообменной смолы, где антитело, элюируемое из ионообменной смолы, по существу не содержит эндотоксина.

Вышеуказанный способ снижения количества эндотоксина или другой способ, или процесс, раскрытые в настоящем документе, может быть выполнен стадиями в порядке, описанном выше, или может необязательно быть выполнен с изменением порядка стадий или даже повторения одной или более стадий. В одном варианте осуществления способ снижения количества эндотоксина в композиции выполняют стадиями в описанном порядке. В некоторых вариантах осуществления стадии взаимодействия со смолой для аффинной хроматографии, промывки и элюирования повторяют в том же порядке более одного раза, перед взаимодействием элюента аффинной хроматографии с ионообменной смолой. Способ также может включать стадию фильтрации, например, с фильтром 0,1, 0,22 или 0,44 микрон, который может быть выполнен на одном или более из элюентов, удаленных после каждой стадии связывания смолы.

В некоторых случаях стадии взаимодействия композиции со смолой для аффинной хроматографии, промывки и элюирования антитела из смолы для аффинной хроматографии можно повторить более одного раза перед взаимодействием первого элюента с ионообменной смолой. В одном варианте осуществления смола для аффинной хроматографии включает смолу с рекомбинантным белком A ("rProteinA").

Одним из примеров подходящей смолы с рекомбинантным белком А является смола rProteinA Sepharose FF® (Amersham, Piscataway, N.J.). В другом варианте осуществления подходящая смола для аффинной хроматографии будет включать хроматографическую смолу с белком G. В других вариантах осуществления подходящая смола для аффинной хроматографии включает смешанную смолу с белком А и белком G. В других вариантах осуществления подходящая смола для аффинной хроматографии включает смолу для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда, включающую 4-меркаптоэтилпиридиновый лиганд, такую как смола MEP HyperCel® (BioSepra, Cergy, Saint Christophe, France).

В некоторых вариантах осуществления ионообменная смола включает анионообменную смолу. Как будет понятно специалисту в данной области техники, ионообменники могут быть основаны на различных материалах относительно матрицы, а также прикрепленных заряженных групп. Например, можно применять следующие матрицы, в которых указанные материалы могут быть более или менее сшитыми: MacroCap Q (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ), на основе агарозы (например, Sepharose CL-6B®, Sepharose Fast Flow® и Sepharose High Performance®), на основе целлюлозы (например, DEAE Sephacel®), на основе декстрана (например, Sephadex®), на основе двуокиси кремния и синтетического полимера. Для анионообменной смолы, заряженные группы, ковалентно присоединенные к матрице, могут представлять собой, например, диэтиламиноэтил, четвертичный аминоэтил и/или четвертичный аммоний. В некоторых вариантах осуществления анионообменная смола содержит четвертичную аминогруппу. Примерная анионообменная смола, которая содержит четвертичную аминогруппу для связывания антитела против M-CSF, представляет собой смолу Q Sepharose® (Amersham, Piscataway, N.J.).

В других аспектах, если уровни эндотоксина выше желаемого после того, как композиция была подвергнута вышеупомянутой стадии анионообменной хроматографии, композиция может альтернативно быть подвергнута воздействию катионообменной смолы. В некоторых вариантах осуществления любой эндотоксин в композиции должен обладать дифференциальным связыванием с ионообменной смолой, чем интересующий белок, чтобы обеспечить очистку белка от эндотоксина. В этом отношении эндотоксин является отрицательно заряженным и обычно связывается с анионообменной смолой. Если и белок, и эндотоксин связываются с анионообменной смолой, очистка одного от другого может быть осуществлена с применением солевого градиента для элюирования обоих в разные фракции. Относительное связывание белка с конкретной смолой также может быть осуществлено путем изменения рН буфера относительно pI белка. В некоторых вариантах осуществления катионообменная хроматография является единственной применяемой ионообменной хроматографией.

В некоторых вариантах осуществления, если уровни эндотоксина слишком высоки после анионообменной смолы, композиция может быть дополнительно подвергнута второй ионообменной стадии, например, путем взаимодействия композиций с катионообменной смолой и последующей промывки, затем элюирования из ионообменной смолы. В некоторых вариантах осуществления катионообменная смола содержит сульфогруппу для связывания. Типичными катионообменными смолами являются SP Sepharose® resin FF (Amersham, Piscataway, N.J.) Poros XS (CEX) (Life Technology, Grand Island, New York).

В некоторых вариантах осуществления после того, как раствор белка антитела получают с указанным уровнем эндотоксина, перед конечным получением белка осуществляют несколько стадий. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, увеличивающий период полувыведения, конъюгируют с белком. Затем конъюгат преобразуют в конечную лекарственную форму, которую вводят пациентам. В некоторых вариантах осуществления конъюгат снова очищают на ионообменной смоле, которая может представлять собой катионообменную смолу. В других вариантах осуществления получают белок. Во всех случаях следует применять обычные лабораторные способы для предотвращения попадания эндотоксиновых загрязнителей в образец белка или в конъюгат белок-полимер.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Способ 1 получения OG1802.

Первый способ получения OG1802 является таким, как указано далее. Во-первых, инициатор соли ТФУ/амин (соединение L), имеющий структуру, представленную на фиг. 1, получали, как указано далее.

Во-первых, соединение K, имеющее структуру, представленную на фиг. 2 получали, как указано далее. В круглодонную колбу емкостью 200 мл в атмосфере азота помещали соединение J (OG1563) (1,9 г, 2,67 ммоль, 3,3 экв.)

Соединение J

и соединение E (0,525 г, 0,81 ммоль, 1,0 экв.) (см. фиг. 11), затем диметилформамид (10 мл), затем диизопропилэтиламин (2,5 мл, 14,6 ммоль, 18 экв.). Колбу охлаждали до 0°С с использованием ледяной бани. К смеси добавляли раствор пропилфосфонового ангидрида (50 мас.% в этилацетате, 2,5 мл, 4,04 ммоль, 5 экв.) в течение приблизительно 6 минут.

Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 минут. Реакционную смесь гасили добавлением воды (20 мл), насыщенного водного бикарбоната натрия (20 мл) и этилацетата (100 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (75 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным бикарбонатом натрия (30 мл), 0,5 М водной лимонной кислотой (40 мл), водой (25 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (40 мл), затем сушили (сульфат натрия), фильтровали и концентрировали под вакуумом. Остаток, который использовали без дополнительной очистки, приводил к получению 2,0 г (0,80 ммоль, 99%) соединения K.

1H ЯМР (400 МГц ДМСО-d6): δ = 1,36 (s, 9H, OCCH3), 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,31 (t, J = 7,2 Гц, 6H, CCH2CH2NH), 2,98 (d, J = 5,6 Гц, 6H, CCH2NH), 3,04 (q, J = 6,0 Гц, 2H, OCH2CH2NH), 3,18 (s, 2H, OCH2C), 3,3-3,37 (m, 8H, CH2), 3,47-3,55 (m, 12H, CH2), 3,58 (s, 6H, OCH2C), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 6,74 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7,69 (t, J = 6,8 Гц, 3H, CH2NHC=O), 7,84 (t, J = 6,0 Гц, 3H, CH2NHC=O).

ЖХ/МС (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ Вычислено для (C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2 = 1196,6; Найдено 1196,6.

Следующее соединение L (фиг.1) получали, как указано ниже: в круглодонную колбу емкостью 100 мл в атмосфере азота добавляли соединение K (2,0 г, 0,8 ммоль), дихлорметан (10 мл), а затем трифторуксусную кислоту (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом. Реакционную смесь разбавляли с использованием дихлорметана (10 мл) и концентрировали под вакуумом. Остаток растворяли с применением ацетонитрила (10 мл), фильтровали через шприцевой фильтр (Acrodisc CR25, PN 4225T) и загружали в подготовительную колонку ВЭЖХ (выскоэффективная жидкостная хроматография) и элюировали 60 % ацетонитрилом в воде (с 0,1% трифторуксусной кислотой) до 98% ацетонитрила (с 0,1% трифторуксусной кислотой). Пробирки, содержащие продукт, объединяли, концентрировали под вакуумом, замораживали и помещали на лиофилизатор. Это привело к получению 990 мг (0,4 ммоль, 50% в течение 2 этапов) соединения L в виде белого порошка.

¹H ЯМР (400 МГц DMSO-d6): δ = 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,31 (t, J = 7,2 Гц, 6H, CCH2CH2NH), 2,97-3,0 (m, 8H, CCH2NH и OCH2CH2NH), 3,17 (s, 2H, OCH2C), 3,3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3,4-3,59 (m, 20H, CH2), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7,69-7,84 (m, 9H, оба CH2NHC=O и NH3+).

ЖХ/МС (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ Вычислено для (C84H136Br9N7O33+2H)/2 = 1196,6; Найдено 1197,4.

Затем соединение L применяли в качестве инициатора получения полимера MPC. Инициатор обычно получают в виде исходного раствора в ДМФ приблизительно 100 мг/мл. Инициатор и лиганд (2,2'-бипиридил) вводили в сосуд Шленка. Полученный раствор охлаждали до 78°С с применением смеси сухого льда/ацетона и дегазировали под вакуумом в течение 10 мин. Сосуд заправляли в атмосфере аргона, и катализатор (CuBr, если не указано иное), хранившийся под аргоном, вводили в сосуд Шленка (молярное отношение атомного брома на инициаторе/катализаторе (CuBr)/лиганде поддерживали на уровне 1/1/2). Раствор сразу становился темно-коричневым. Сосуд Шленка герметизировали и сразу же продували, применяя короткий цикл вакуум/аргон. Раствор HEMA-PC получали путем смешивания определенного количества мономера, полученного в перчаточном боксе, хранившемся в атмосфере азота, с 200-стойким дегазационным этанолом. Раствор мономера добавляли по каплям в сосуд Шленка (через канюлю) (и гомогенизировали при слабом перемешивании). Температуру поддерживали 78°С. К реакционной смеси в течение по меньшей мере 10-15 мин применяли тщательный вакуум пока из раствора не прекращали выходить пузырьки. Затем сосуд заполняли аргоном и нагревали до комнатной температуры. Раствор перемешивали, и по мере протекания полимеризации раствор становится вязким. После 3-8 часов или просто в течение ночи реакционную смесь гасили с помощью прямого воздействия воздуха для окисления Cu(I) до Cu(II), смесь становилась сине-зеленой по цвету и ее пропускали через колонку с диоксидом кремния, чтобы удалить медный катализатор. Собранный раствор концентрировали путем ротационного испарения и полученную смесь либо осаждали тетрагидрофураном, либо диализировали против воды, а затем сушили вымораживанием, получая безводный белый порошок. В таблице 1.1 ниже приведены данные о полимерах для полимера, использующего соединение L в качестве инициатора.

Таблица 1.1

Теор. M_W
(кДа) Полимер ID No. Инициатор M_n(кДа) M_p(кДа) ИП 500 130 L 490 530 1,1 750 150 L 645 750 1,1

Затем сложный эфир малеимида Mal-PEG4-PFP фиксировали (как показано на фиг. 29) к полимеру 750 кДа, упомянутому выше, для обеспечения OG1802. В пробирку емкостью 20 мл помещали полимер R3707 (полимер 750 кДа, полученный с применением L в качестве инициатора, 515 мг) и растворяли с применением этанола (4,0 мл) после перемешивания в течение 40 минут. К этому добавляли 1%-ный раствор 4-метилморфолина в ацетонитриле (22 мкл). В отдельной пробирке растворяли Mal-PEG4-PFP (1,97 мг) в ацетонитриле (1,0 мл) и этот раствор добавляли к раствору полимера в течение приблизительно 2 минут при комнатной температуре и полученный раствор перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли 0,1% водной трифторуксусной кислотой (2 мл) (рН приблизительно 5), затем водой (приблизительно 12 мл), фильтровали через шприцевой фильтр (Acrodisc Supor, PN 4612) и помещали равномерно в 3 мембранные диализные центрифужные пробирки Amicon (30000 НОММ). Пробирки разбавляли и смешивали с водой (по 5 мл каждый), помещали в центрифугу (3200 об./мин) в течение 25 минут. Фильтрат извлекали для анализа, а ретентат разбавляли и смешивали с водой (приблизительно 10 мл/пробирка). Центрифугирование повторяли еще 5 раз, после чего ретентат извлекали и помещали в пробирку. Мембранные пробирки Amicon промывали водой (2 × приблизительно 2 мл каждую пробирку), и объединяли с ретентатом. Раствор ретентата фильтровали через шприцевой фильтр (Acrodisc Supor, PN 4612), замораживали и помещали на лиофилизатор. Получали 485 мг в виде белого порошка.

Пример 2. Получение инициатора OG1786

OG1786 является девятилучевым инициатором для получения полимера, применяемым в качестве предшественника в получении OG1802. Каждый луч заканчивается 2-бромизобутиратом, способным инициировать полимеризацию под ATRP. OG1786 представляет собой соль трифторуксусной кислоты (ТФУ), как представлено на фиг. 30. OG1786 получали как указано далее. Сначала OG1550 подвергают взаимодействию с ТФУ (трифторуксусной кислотой) с получением OG1546, как изображено на фиг. 31.

В круглодонную колбу емкостью 1 л, снабженную магнитной мешалкой и добавочной воронкой, добавляли OG1550 (14,8 г), метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) (350 мл) и воду (30 мл). Смесь перемешивали для растворения OG1550, затем охлаждали на ледяной бане. К этой смеси по каплям в течение 90 минут добавляли раствор трифторуксусной кислоты (4,9 мл) в воде (90 мл). После завершения добавления смесь перемешивали еще 15 минут, затем извлекали из ледяной бани и давали нагреться до комнатной температуры. Смесь перемешивали (после извлечения из ледяной бани) еще в течение 4-5 часов, пока ТСХ (тонкослойная хроматография) не покажет оставшееся исходное вещество приблизительно 5 %, а рН водного раствора не составит от 3 до 4 (индикаторная бумага для определения pH).

Смесь разделяли. Слой МТБЭ промывали водой (30 мл). Объединяли водные слои, затем водный раствор экстрагировали МТБЭ (150 мл). Вторую МТБЭ фазу промывали водой (30 мл). Объединенные водные слои промывали третьей порцией МТБЭ (100 мл). Третью фазу МТБЭ промывали водой (25 мл). Водные слои снова объединяли (приблизительно 250 мл, значение рН приблизительно равно 4, определенное с помощью индикаторной бумаги для определения pH).

Продукт собирали путем лиофилизации. Получили 11,5 г белого твердого вещества. Этот материал чрезвычайно гигроскопичен, поэтому лучше всего его обрабатывать в атмосфере азота. Продукт был подтвержден ЖХ/МС.

Полученный OG1546 затем подвергали взаимодействию с OG1563 с получением OG1784 (как изображено на фиг. 32).

В колбу емкостью 250 мл в атмосфере азота, снабженную магнитной мешалкой, добавляли OG1546 (гигроскопичный, 9,0 г) с последующим добавлением N,N-диметилформамида (110 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре до полного растворения OG1546 (около 15 минут), затем добавляли OG1563 (29,9 г) и смесь перемешивали еще 3 минуты до тех пор, до растворения OG1563. Полученный раствор охлаждали на ледяной бане и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (37,6 мл) в течение 3 минут, а затем пропилфосфоновый ангидрид (T3P), 50 % в этилацетате (34,5 мл) по каплям в течение 5 минут (добавление Т3Р экзотермическое). После завершения добавления Т3Р, колбу извлекали из охлаждающей бани и оставляли до достижения комнатной температуры. Затем образцы обрабатывали с интервалом 5 минут для анализа ЖХ/МС. Реакционная смесь показала очень светлый желтый/коричневый цвет.

Через 20 минут реакционную смесь снова охлаждали на ледяной бане и добавляли 5 мл воды. Затем смесь извлекали из охлаждающей бани и добавляли еще 50 мл воды частями, затем добавляли 50 мл 0,5 М лимонной кислоты, затем изопропилацетат (300 мл). Смесь разделяли. Водную фазу (приблизительно 300 мл) экстрагировали дополнительным изопропилацетатом (150 мл). Водная фаза представляла собой AQ1 для теста ВЭЖХ. Объединенные органические фазы промывали водной лимонной кислотой (115 мл, 65 мМ, которая представляла собой смесь 15 мл 0,5 М лимонной кислоты плюс 100 мл воды), а водная фаза представляла собой AQ2 (pH приблизительно равно 3). Органическую фазу промывали водой/насыщенным хлоридом натрия (100 мл/25 мл) и водная фаза представляла собой AQ3 (рН приблизительно равно 3). Органическую фазу окончательно промывали насыщенным хлоридом натрия (100 мл), а водная фаза представляла собой AQ4. Ни одна из фракций AQ не содержала значительного продукта (данные не предоставлены). Органическую фазу подтвердила продукт путем ЖХ/МС. Продукт сушили над сульфатом натрия (80 г), фильтровали и промывали изопропилацетатом (75 мл) и концентрировали на роторном испарителе до получения желтовато-коричневого масла (33,2 г). Неочищенный продукт хранили в течение ночи в атмосфере азота.

На следующий день неочищенный продукт доводили до комнатной температуры, затем растворяли в ацетонитриле/воде (46 мл/12 мл) и фильтровали с использованием фильтра для ВЭЖХ (Cole-Parmer PTFE 0,2 мкм, номер продукта 02915-20). Фильтрат разделяли на три равные части и очищали трижды.

Фильтрат загружали в колонку RediSep Rf Gold C18 (275 г, SN 69-2203-339, Lot# 24126-611Y), уравновешенную 50% ацетонитрилом/водой. Материал элюировали со скоростью 100 мл/мин, используя следующий градиент (растворитель A: вода, растворитель B: ацетонитрил). Все соответствующие фракции проверяли с помощью ВЭЖХ. Фракции, которые считаются достаточно чистыми, объединяли (из всех трех опытов) и концентрировали (температуру бани поддерживали приблизительно 20°С) на роторном испарителе, затем распределяли между дихлорметаном (100 мл) и водой (5 мл)/насыщенным раствором хлорида натрия (25 мл). Водный экстракт дважды экстрагировали дихлорметаном (2× 30 мл). Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия (35 г), фильтровали, промывали ДХМ (30 мл) и концентрировали. Продукт и чистота были подтверждены способами ЖХ/МС. Практический выход и чистота R5172 и R5228 представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1

OG1784 часть R5172 R5228 OG1546 использовано 5,3 г 9,0 г OG1563 использовано 17,6 г 29,9 г Практический выход 53 % 58 % Чистота (a/a 210 нм) 99,3 % 100,0 %

Затем OG1405 получали из OG1784, как показано на фиг. 33. В круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную магнитной мешалкой, добавляли OG1784 (20,9 г), далее дихлорметан (50 мл), затем трифторуксусную кислоту (20 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре, и анализ ВЭЖХ показал полное снятие защиты в течение 23 минут. Смесь концентрировали на роторном испарителе, повторно растворяли в дихлорметане (25 мл) и повторно концентрировали, затем повторно растворяли в ацетонитриле (25 мл) и повторно концентрировали. Продукт был подтвержден ЖХ/МС. Вещество, указанное выше (OG1405, 34,5 г, предположительно, 21,0 г в качестве количественного выхода) применяли в качестве неочищенного масла на следующей стадии. Никакой очистки не требуется.

Затем OG1405 подвергали взаимодействию с OG1402 для получения OG1785, как показано на фиг. 34. В колбу емкостью 500 мл, снабженную магнитной мешалкой, в атмосфере азота помещали OG1402 (5,5 г) с последующим добавлением ацетонитрила (70 мл), затем N,N-диизопропилэтиламин (26,3 мл) и раствор Т3Р (см. выше) (7,9 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем охлаждали на ледяной бане и добавляли раствор OG1405 (неочищенное масло, как указано выше, 34,5 г) в ацетонитриле (70 мл). Смесь нагревали до комнатной температуры. Через 20 минут реакционную смесь охлаждали на ледяной бане и гасили водой (5 мл). Затем смесь концентрировали в вакууме до половины объема, используя роторный испаритель. Образцы были взяты для ЖХ/МС.

Добавляли еще воду (50 мл), а затем 0,5 М лимонной кислоты (75 мл) и изопропилацетат (175 мл). Смесь разделяли через 5 минут. Водный экстракт экстрагировали дополнительным изопропилацетатом (50 мл). Объединенные органические вещества промывали водной лимонной кислотой (0,13 М, 30 мл, состоящей из 10 мл 0,5 М лимонной кислоты и 20 мл воды). Органические вещества затем промывали смесью насыщенного хлорида натрия (25 мл) и воды (25 мл), затем окончательно промывали насыщенным хлоридом натрия (25 мл). Затем их сушили над сульфатом натрия (124 г), фильтровали и промывали изопропилацетатом (30 мл) и концентрировали в роторном испарителе до коричневого масла (27,3 г). Образцы были взяты для анализа ЖХ/МС.

Масло растворяли в ацетонитриле/воде (3:1, 15 мл/5 мл), фильтровали через фильтровальный диск ВЭЖХ (мембрана Cole-Parmer PTFE 0,2 мкм, номер продукта 02915-20) и делили на три равные части, каждую из которых индивидуально очищали, как указано далее.

Части загружали в колонку Redi-Sep Gold C18 (275 г, SN - 69-2203-339, Lot 241234-611W), уравновешенную 50% растворителя B (ацетонитрил)/50% растворителя A (вода). Затем материал очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой градиентом растворитель A: вода/растворитель B: ацетонитрил. Соответствующие фракции объединяли и распределяли между дихлорметаном (150 мл) и водой (5 мл)/насыщенным раствором хлорида натрия (25 мл). Водный экстракт дважды экстрагировали дихлорметаном (2 x 50 мл). Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия (60 г), фильтровали и промывали дихлорметаном (40 мл) и концентрировали. Структуру и чистоту подтверждали различными анализами, включая ЖХ/МС: OG1785 выделяли в виде пенистого твердого вещества (R5329, 19,0 г, выход 83 %, чистота 95,1 % (а/а 210 нм), хранили в атмосфере азота при 4°С.

Затем трет-бутилоксикарбонильную защитную группу на OG1785 удаляли с применением трифторуксусной кислоты (ТФУ) для получения OG1786, как показано на фиг. 35.

Пример 3. Получение полимера OG1801

Полимер OG1801 получают сначала от инициатора OG1786. OG1801 имеет аминофункциональность, которая является более стабильной (чем малеимид) во время получения полимера. Для получения полимера OG1801 применяют модифицированную версию ATRP, в которой виды меди (Cu (I)) генерируются in situ путем добавления металлической меди к Cu (II). Исходные материалы и реагенты, необходимые в реакции, рассчитывают на основе вводных партий мономера (HEMA-PC) OG47, а также целевой молекулярной массы (M_w).

Взвешивали 50 г мономера OG47 в перчаточном боксе и добавляли 200 мл дегазированного EtOH для растворения мономера при комнатной температуре; отбирали образцы для анализа концентрации мономеров. Взвешивали Cu(II), Bpy, Cu(0) в колбе емкостью 500 мл; продували аргоном, добавляя в колбу раствор мономера; закупоривали колбу пробкой и вакуумировали в течение 25 мин до исчезновения пузырьков. Реакционная смесь постепенно меняла цвет от светло-зеленого до темно-зеленого, затем к светло-коричневому; взвешивали приблизительно 200 мг инициатора OG1786 в перчаточном боксе и растворяли в приблизительно 2000 мкл ДМФ при комнатной температуре для получения 100 мг/мл исходного раствора; отбирали образцы для анализа концентрации и чистоты инициатора; добавляли раствор инициатора в колбу в атмосфере аргона. Реакционный раствор становился темно-коричневым и со временем загустевал; систему герметично закрывали и реакцию оставляли протекать в течение 2 дней.

Затем получали OG1801 для добавления малеимида, а катализатор (медь) удаляли следующим образом: для удаления катализатора применяли заполненную диоксидом кремния колонку RediSep® Rf с нормальной фазой. Размер колонки выбирают исходя из количества меди в реакционной смеси. Например, для партии 50 г OG1801 применяли колонку 330 г (№ 69-2203-330, размер колонки 330 г, CV = 443 мл). Тефлоновую трубку применяют для всех соединений, так как EtOH является растворителем для элюирования.

После удаления меди все фракции переносили в круглодонную колбу партиями и выпаривали EtOH с помощью роторного испарителя при температуре от 45 до50°С при пониженном давлении досуха. На этой стадии контролировали объем EtOH, собранный из конденсата, чтобы обеспечить удаление EtOH более 90 %. Полимер растворяли в 250 мл воды для инъекций и фильтровали, используя фильтр 0,2 мкм. В результате получился прозрачный светло-желтый полимерный раствор приблизительно 150 мг/мл. Раствор хранили при температуре от 2 до 8°C до 3 месяцев перед применением.

Пример 4. Получение полимера OG1802

Исходные материалы и реагенты, необходимые в реакции, рассчитывают на основе ввода партии OG1801. Линкером ющим агентом является 3-малеимидопропионовая кислота, сложный эфир NHS. Добавляли 30 мл 0,5 М фосфата натрия (в воде для инъекций, pH 8) к 50 г раствора полимера (приблизительно 150 мг/мл). Перемешивали в течение 1 мин; значение рН составляло 8,0, определенное с помощью индикаторной бумаги для определения pH. Взвешивали 204,8 мг линкера и растворяли в ДМФ 4,1 мл, с получением 50 мг/мл исходного раствора. Добавляли раствор линкера по каплям 815 мкл в минуту к раствору полимеру при быстром перемешивании. В течение 5 минут добавляли 4095 мкл раствора линкера. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию гасили 20 мл 5% уксусной кислоты для достижения конечного рН 5. Фильтровали раствор с применением вакуумного фильтра 1 литр (0,2 мкм).

Затем OG1802 (см. фиг. 36) очищали следующим образом: кассеты с поперечным потоком Milipore применяли для очистки полимеров в водной системе. Начинали концентрирование раствора полимера до 250 мл (приблизительно 200 мг/мл). Добавляли свежую воду для инъекций из резервуара и регулировали скорость подачи свежей воды для инъекций до такой же как у пермеата (приблизительно 2 мкл/мин). UF/DF оставляли при 2-8°С в течение ночи. Обычно применяли 2,5 л воды для инъекций (10-кратное объемное отношение к раствору полимера). Образец ретентата собирали для анализа чистоты. Целевая чистота составляла более 98 %. Фильтровали раствор полимера с помощью 0,2 мкМ 1 л фильтровальной бутылки. Раствор полимера хранили при температуре от 2 до 8°C в течение 3 месяцев перед конъюгированием.

Пример 5. Альтернативные фосфорилхолиновые полимеры

Полимер HEA-PC получали, как описано ниже. HEA-PC (2-(акрилоилокси)этил-2-(триметиламмоний)этилфосфат), который представляет собой акрилат, в отличие от метакрилата HEMA-PC, описанного выше, имеет следующую структуру:

HEA-PC

HEA-PC полимеризовали с инициатором, представленным в примере 1 в виде соединения L.

Таблица 5.1

Реактант Наименование Количество M_w Инициатор Соединение L (как указано выше) 1,65 мг 2505,5 Мономер HEA-PC 0,461 г 281,24 Катализатор Cu (I) Бромид 1,2 мг 143,45 Лиганд Трис[2-(диметиламино)этил]амин
(Me6TREN) 2,73 мг 230,39 Растворитель A N,N-диметилформамид (ДМФ) 21,85 мкл 73,09 Растворитель B Вода 0,7 мл 18,02 Растворитель C Метанол 0,7 мл 32,04

Получили исходный раствор инициатора 200 мг/мл путем растворения 2,2 мг инициатора в 11 мкл сухого ДМФ и 200 мг/мл раствора лиганда путем растворения 4,6 мг Me6TREN в 23 мкл сухого ДМФ. Внесли 8,25 мкл исходного раствора инициатора и 13,6 мкл лиганда в пробирку. Дегазировали при минус 78°C в течение 5 минут, затем снова наполняли аргоном и добавляли 1,2 мг CuBr. Дегазировали и наполняли аргоном. Добавляли исходный раствор HEA-PC в метаноле (взвесили 0,461 г HEA-PC и растворили его в 0,5 мл метанола) к раствору внутри реактора при минус 78°C. Промывали флакон 200 мкл метанола и добавляли его в реактор при минус 78°C, а затем 0,5 мл дистиллированной воды, затем еще 200 мкл воды. Тщательно дегазировали, пока не будет видно пузырьков и исчезнет всякая гетерогенность (твердые частицы растворяются или исчезают). Наполняли 4 фунт/квадратный дюйм (27,57 кПа) аргона и оставляли реакцию протекать при комнатной температуре в течение часа. Реакционная смесь уже была вязкой. Реакцию продолжали в течение приблизительно одного часа. Добавляли раствор бипириндина в метаноле (5 мг в 0,5 мкл). Добавляли еще 2-3 мл метанола и давали возможность катализатору окисляться в течение ночи при 4°С. Конверсия, определенная с помощью 1H ЯМР, оценивалась в 94 %.

На следующий день полимер диализировали и подвергали анализу SEC/MALS с применением колонки Shodex SB806M_HQ (7,8×300 мм) в 1× PBS pH 7,4 при 1 мл/мин, с получением PDI 1,157, Mn 723,5 кДа, Mp 820,4 кДа и M_w 837,2 кДа (до диализа ИП составляет 1,12, M_n составляет 695 кДа, M_p составляет 778 кДа). Затем к полимеру добавляли малеимидную функциональность, чтобы ее можно было конъюгировать с белком.

Затем сложный эфир малеимида Mal-PEG4-PFP (см. пример 1 выше) помещали на полимер HEA-PC, как представлено в Примере 1. Полученный в результате функционализированный малеимидом полимер HEA-PC затем конъюгировали с сульфгидрильными группами, как описано в настоящем документе для полимеров HEMA-PC.

Полимер PC акриламида также был получен с применением мономера 2-(акриламил)этил-2-(триметиламмоний)этилфосфата (Am-PC), имеющего следующую структуру:

Am-PC применяли для полимеризации с использованием 3-лучевого инициатора (соль ТФУ), имеющего структуру:

.

Синтез полимера Am-PC проводили, как указано далее:

Таблица 5.2

Реактант Наименование/ Идентичность Количество M_W Инициатор 3-лучевой инициатор (как указано выше) 2,2 мг 885,35 Мономер Am-PC 0,5 г 280,26 Катализатор (I) Cu (I) Бромид 1 мг 143,45 Катализатор (II) Cu (II) Бромид 0,2 мг 223,35 Лиганд трис[2-(диметиламино)этил]амин (Me6TREN) 3,94 мг 230,39 Растворитель A N,N-диметилформамид (ДМФ) 31,7 мкл 73,09 Растворитель B Вода 1 мл 18,02 Растворитель C Метанол 1 мл 32,04

Исходный раствор лиганда 200 мг/мл получали растворением 9 мг Me6TREN в 45 мкл сухого ДМФ. Добавляли 19,7 мкл исходного раствора в реакционный сосуд. Получали исходный раствор инициатора 200 мг/мл, растворяя 6,5 мг вещества в 32,5 мкл ДМФ. Добавляли 11 мкл исходного раствора инициатора к лиганду, как указано выше. Дегазировали в течение 5 мин. Добавляли 1 мг CuBr. Получали исходный раствор CuBr₂ 200 мг/мл путем растворения 4 мг CuBr₂ в 20 мкл ДМФ. Добавляли 0,5 г мономера (AmPC) к 1 мл метанола (медленное растворение/вязкий раствор), затем 1 мкл исходного раствора CuBr₂. Добавляли раствор мономера по каплям в реакционную смесь, как указано выше. Промывали 1 мл воды. Реакционную смесь тщательно дегазировали (замораживание-оттаивание). Реакцию оставляли протекать в течение 24 часов.

После этого полимер Am-PC диализовали. Молекулярную массу вышеуказанного полимера определяли с помощью SEC/MALS: M_n составила 215 кДа, M_p: 250 кДа, ИП составил 1,17. Конверсия, определяемая с помощью 1H ЯМР составила 94 %. Малеимидная функциональность была добавлена к полимеру Am-PC, как рассматривалось выше для HEMA-PC и HEA-PC. Малеимидный функционализированный полимер Am-PC конъюгировали с белком, как описано выше.

Пример 6. Обратный анализ Эллмана для расчета свободного малеимида в соединении.

После добавления функциональности малеимида к полимеру OG1801 с образованием OG1802 (как указано выше) для определения количества функционального малеимида (то есть конъюгируемого) в образце применяли анализ Эллмана. Тиолом преобразуют реактив Эллмана (DTNB) до TNB-, затем до TNB2- в воде при нейтральном и щелочном рН, который дает желтый цвет (измеренный при 412 нм). Стандартную кривую устанавливали с цистеином. Поскольку малеимид реагирует с тиолом, этим анализом фактически измеряли оставшийся тиол(цистеин). Ингибирование рассчитывали как (исходный тиол минус тиол, оставшийся после добавления малеимидного полимера) разделить на (исходный тиол) и выражали в процентах.

Реагенты, используемые в анализе: стандартную кривую получали с применением цистеина от 62,5 мкМ до 2 мкМ. Полимерные исходные растворы получали растворением порошка в 1×PBS pH 7,4 (реакционный буфер) и тщательно перемешивали. Равные молярные растворы полимера и цистеина смешивали и оставляли реагировать при 27°С в течение 30 минут. 150 мкМ раствора DTNB добавляли к стандартам цистеина и реакционной смеси полимер/цистеин, и цвет проявляли при 27°С в течение 5 минут. Оптическую плотность (OD) при 412 нм считывали на планшетном ридере Spectramax, а процентное ингибирование рассчитывали с помощью программного обеспечения Softmax Pro и стандартной кривой цистеина.

Пример 7. Белковая последовательность антитела (OG1950), включающая тяжелую цепь антитела против VEGF-A с мутацией L443C (нумерация EU, или 449C в SEQ ID NO: 1) и легкую цепь антитела против VEGF-A

Клонировали антитело против VEGF-A с мутацией L443C (нумерация EU), имеющее последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO: 1 (фиг. 12) (тяжелая цепь). Клонировали легкую цепь антитела против VEGF-A, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 (фиг. 13).

Пример 8a. Очистка и декэппирование OG1950

Тяжелая и легкая цепи OG1950 были клонированы в экспрессионные плазмиды и трансфицировали в клетки СНО. Клетки выращивали в соответствующих средах и отбирали для анализа. OG1950 очищали с применением способов, описанных выше. Цистеиновый остаток OG1950 в положении 443 (L443C (нумерация EU)) обычно являлся"кэпированным" или окисленным химическими веществами в среде для культивирования клеток и был недоступен для конъюгирования. В этой связи очищенный OG1950 подвергали процессу декэппирования (т.е. восстановлению) для удаления кэпа и обеспечения возможности конъюгирования свободного (т.е. не участвующего в дисульфидных связях Cys-Cys) цистеинового остатка с малеимидной функциональностью полимера. Декэппирование осуществляли путем смешивания очищенного белка OG1950 с 30-кратным молярным избытком восстановителя TCEP (3,3',3''-фосфантриилтрипропановая кислота) в течение 1 часа при 25°C. Реакцию восстановления с TCEP контролировали с помощью ДНС-ПААГ. После денатурации белок OG1950 промывали UF/DF с применением кассеты ультрафильтрации Pellion XL с 20 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ буфера TCEP для удаления кэпа. Затем реагент TCEP удаляли в той же системе UF/DF с 20 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl. Затем восстановленный OG1950 подвергали рефолдингу с применением воздуха (кислорода воздуха), после чего в качестве анализа проводили ДНС-ПААГ.

Пример 8b. Очистка и декэппирование OG1950

Тяжелая и легкая цепи OG1950 были клонированы в экспрессионные плазмиды и трансфицировали в клетки СНО. Клетки выращивали в соответствующих средах и отбирали для анализа. OG1950 очищали с применением способов, описанных выше. Цистеиновый остаток OG1950 в положении 443 (L443C (нумерация EU)) обычно являлся "кэпированным" или окисленным химическими веществами в среде для культивирования клеток и был недоступен для конъюгирования. В этой связи очищенный OG1950 подвергали процессу декэппирования (т.е. восстановлению) для удаления кэпа и обеспечения возможности конъюгирования свободного (т.е. не участвующего в дисульфидных связях Cys-Cys) цистеинового остатка с малеимидной функциональностью полимера. Декэппирование осуществляли путем смешивания очищенного белка OG1950 с 30-кратным молярным избытком восстановителя TCEP (3,3',3''-фосфантриилтрипропановая кислота) в течение 1 часа при 25°C. Реакцию восстановления с TCEP контролировали с помощью ДНС-ПААГ. После восстановления белок OG1950 промывали системой ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF) с применением ультрафильтрационной кассеты Pellicon XL с мембраной MWCO 30 кДа от Millipore с 20 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ буфера TCEP для удаления кэпа и избытка TCEP. Остаточный реагент TCEP удаляли в той же системе UF/DF с 20 мМ Трис pH7,5, 150 мМ NaCl. Затем восстановленный OG1950 подвергали повторному окислению с применением dHAA при температуре окружающей среды в течение 1 часа, а затем UF/DF для удаления dHAA с образованием декэппированного OG1950. Состояние декэппирования контролировали с помощью анализа ДНС-ПААГ.

Пример 9. Конъюгирование OG1950 с полимером MPC

Декэппированный OG1950 был конъюгирован с полимером OG1802. Применяли избыток OG1802 (10-20-кратный молярный избыток). Конъюгирование контролировали с помощью ДНС-ПААГ и доводили до конца. Конъюгат OG1950 очищали с помощью катионообменной хроматографии и буфера, замененного в буферной смеси на UF/DF. Конъюгат полимера с OG1950 очищали хроматографически, как описано выше.

Пример 10. Кинетика связывания OG1950 SPR

Этот пример иллюстрирует связывание OG1950 с VEGF-165 в кинетике одиночного цикла BIAcore™.

Анализ взаимодействия SPR OG1950 с человеческим VEGF-165 проводили в системе BIAcore™ T200 (GE Healthcare), оснащенной чипом протеина A (GE Healthcare). Осуществляли способ кинетики одиночного цикла. 25 мкг/мл антитела удерживали в буфере HBS-EP⁺ (0,01 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты, 0,15 М хлорида натрия и 0,05% полисорбата 20) с импульсом 25 с при скорости потока 10 мкл/мин. Затем рекомбинантные человеческие VEGF-165 (R&D Systems) применяли в различных концентрациях с импульсом 60 с при скорости потока 30 мкл/мин и конечным временем диссоциации 1000 сек. Эксперимент проводили при 25°С. Поверхность регенерировали 10 мМ глицина с рН 1,7 в течение 1 мин при скорости потока 50 мкл/мин. Анализ кинетики связывания проводили с использованием программного обеспечения для оценки Biacore T200 с ответами, глобально подходящими для взаимодействия 1:1. Результаты суммированы в таблице 10.1 и на фиг. 21.

Таблица 10.1. Кинетика связывания OG1950 с VEGF-165

ka (1/Mc) kd (1/с) KD(M) OG1950 3,35E+05 6,77E-08 2,02E-13

OG1950 демонстрирует меньше 1 пМ KD в модели связывания 1:1 (за пределами чувствительности прибора).

Пример 11. Конъюгирование и очистка OG1953 с применением с катионообменной хроматографии

Экспрессия белка OG1950 и получение белка: белок OG1950 экспрессировали в экспрессионной системе млекопитающих GSCHOK1 с последующей очисткой с применением аффинной колонки с белком А. Чистота очищенного OG1950 с применением колонки с белком A составила более 90 % на основе эксклюзионной хроматографии и ДНС-ПААГ. Сконструированный специфический цистеиновый остаток OG1950 был доступен для тиоловой конъюгации с биополимером OG1802. Тиольная реагирующая химическая группа OG1802 реагировала с образованием стабильной ковалентной связи, которая образует биоконъюгат OG1953. Для этого 1 мг OG1950 полностью восстанавливали восстановителем трис-(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридом (TCEP) с последующим удалением TCEP посредством буферного обмена с применением 30 кДа концентратор-центрифуга. Полностью восстановленный белок OG1950 затем подвергали повторному окислению, чтобы гарантировать, что все ожидаемые дисульфидные связи белка сформированы, за исключением сконструированного остатка цистеина (декэппированный OG1950), который оставался в восстановленной форме для конъюгации с биополимером посредством специфического тиольного взаимодействия.

Конъюгирование: Конъюгирование проводили путем смешивания 100 мкг декэппированного OG1950 с 15-кратным молярным избытком биополимера OG1802 с конечной концентрацией белка 2 мг/мл в Трис-буфере (20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH 7,5). Различные добавки оценивали в различных реакциях конъюгирования, как представлено в таблице 11.1., чтобы сравнить их влияние на эффективность конъюгирования. Все реакции выполняли в фиксированном объеме и инкубировали при 4°С в течение 20 часов. В таблице 11.1 и на фиг. 19 представлен ионнообменный анализ (поглощение А280) и разделение на фракции реакций конъюгирования от А до G. Реакция А включала только буфер; реакция B включала только антитело OG1950; реакция C включала антитело OG1950 плюс полимер OG1802; реакция D включала антитело OG1950 плюс полимер OG1802 плюс сахарозу; реакция E включала антитело OG1950 плюс полимер OG1802 плюс трегалозу; реакция F включала антитело OG1950 плюс полимер OG1802 плюс глутаминовую кислоту; реакция G включала антитело OG1950 плюс полимер OG1802 плюс аспарагиновую кислоту. Реакции B-G начинали с 100 мкг белка OG1950 с фиксированным общим объемом реакции. По завершении реакции для ионнообменного анализа вводили равные объемы реакций B-G. Сравнение эффективности коньюгирования показано на фиг. 19. Пик 1 (P1) представляет собой избыток биополимера (OG1802), который не конъюгирован с белком и не может связываться с ионообменной колонкой и поэтому элюируется как несвязанная фракция в каждой реакции; Пик 2 (Р2) представляет собой биоконъюгат полимера и антитела в каждой реакции; Пик 3 (Р3) представляет собой свободное антитело, которое не конъюгировано с полимером в каждой реакции.

Таблица 11.1

Образцы (P2)
Конъюгат OG1953 (Au x секунды) (P3)
Белок OG1950 (AU x секунды) Эффективность конъюгации P2/[P3 рекции B] A Контрольный буфер NA NA NA B Контрольный белок OG1950 0 410129 NA C Биополимер OG1950 плюс OG1802 37334 125884 9 % D C плюс Сахароза 198064 110356 48 % E C плюс Трегалоза 202682 139313 49 % F C плюс Глутаминовая кислота 30401 220577 7 % G C плюс Аспарагиновая кислота 29054 175266 7 %

Как видно из приведенных выше результатов, различные эксципиенты допускают значительно более высокую эффективность конъюгирования. Не ограничиваясь теорией, такие эксципиенты, которые помогают поддерживать растворимость ингредиентов, помогают эффективности конъюгирования.

Катионообменный анализ реакции конъюгирования OG1953: По завершении реакции конъюгирования, 5 мкл каждой реакционной смеси разбавляли 3 раза буфером для уравновешивания колонки (20 мМ ацетата натрия, рН 5,5) для анализа катионообменной хроматографии (IEX) и разделения с применением колонки ВЭЖХ Shodex SP-825. IEX проводили в режиме связывания и элюирования, где реакционную смесь сначала разбавляли, чтобы снизить концентрацию соли, так чтобы как конъюгат, так и непрореагировавший белок связывались бы с колонкой с последующим элюированием с градиентом соли, где увеличение концентрации NaCl приводило к элюированию конъюгата (OG1953) и неконъюгированного свободного белка (OG1950) при разном времени удерживания из-за изменения дифференциального заряда. Результаты анализа IEX, как представлено на фиг. 19, показывают, что конъюгат OG1953 (пик P2) очень хорошо отделяется от непрореагировавшего свободного полимера (OG1802), как представлено на пике P1, и непрореагировавшего свободного белка (OG1950), как представлено на пике P3.

Увеличение очистки конъюгата OG1953 для анализа активности. Реакции конъюгирования D и E объединяли и далее разделяли с помощью IEX, где элюированные фракции конъюгата пика (Р2) собирали и концентрировали для анализа активности.

Пример 12. Влияние молекул против VEGF на связывание биотин-VEGF с VEGFR с применением ELISA.

Способности OG1950, OG1953 и других молекул против VEGF ингибировать связывание биотин-VEGF-165 с VEGFR тестировали анализом ELISA. 96-луночные планшеты ELISA покрывали 1 мкг/мл рекомбинантного белка VEGF R1-Fc (R&D systems партия# 321-FL-050). Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Затем планшеты промывали и блокировали блокирующим буфером (1% BSA в 1× PBS, pH 7,4) в течение более или равно 90 мин с осторожным встряхиванием. Получали 3-кратные серии разведений образцов. Начиная с 400 нм образцы смешивали с биотин-VEGF (R&D systems партия # заказ06). Конечная концентрация биотин-VEGF составляла 4 нг/мл (100 пМ). Верхняя концентрация серии разбавления образца составляла 85 мкг/мл. После разбавления образцы инкубировали при комнатной температуре в течение более или равно 30 мин, а затем промывали 3 раза. После промывки, 100 мкл смеси образец/биотин-VEGF переносили в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение более или равно 90 мин при комнатной температуре с осторожным встряхиванием. После инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:1500 SA-HRP (R&D systems партия # A7906). Инкубированные планшеты защищали от света в течение приблизительно 20 мин. Затем планшеты промывали 3 раза. После промывки добавляли 100 мкл субстрата TMB (R&D systems партия # DY998). Планшеты инкубировали и защищали от света в течение приблизительно 30 мин. Проявление цвета контролировали. Проявление цвета останавливали, добавляя 50 мкл стоп-раствора. Планшеты читали при 450 нм. Результаты представлены на фиг. 20.

Эти результаты показывают, что антитело OG1953/конъюгат достигло максимального ингибирования связывания биотин-VEGF с VEGFR по сравнению с OG1950 (неконъюгированным антителом), а также коммерчески доступных ингибиторов VEGF Lucentis® (ранибизумаб) и Avastin® (бевацизумаб). В типичном анализе связывания рецептора VEGF и лиганда VEGF добавление OG1953 приводит к ингибированию от 97 до 98 % связывания лиганда VEGF с рецептором VEGF. Что сравнивают с добавлением OG1950, который приводит к ингибированию от 75 до 87 % связывания лиганда VEGF и рецептора VEGF и добавлением Lucentis® (ранибизумаб) или Avastin® (бевацизумаб), каждый из которых приводит только к ингибированию от 68 до 78 % связывания лиганда VEGF и рецептора VEGF. Более того, предыдущие исследования показали, что добавление либо OG1950, Lucentis® (ранибизумаб), либо Avastin® (бевацизумаб) в концентрациях 400 нм не приводит к 100%-ному ингибированию связывания лиганда VEGF с рецептором VEGF.

На фиг. 20 также представлено, что другой конъюгат антитела против VEGF Био Конъюгат (против VEGF BC) достигает максимального ингибирования связывания VEGF с рецептором VEGF по сравнению с только антителом (против VEGF). Вместе эти результаты показывают, что (i) конъюгат антитела OG1953 более эффективен при ингибировании связывания лиганда VEGF с рецептором VEGF по сравнению с имеющимися в настоящее время ингибиторами VEGF и (ii) конъюгирование антител VEGF на участке вне области активного сайта может приводить к усилению ингибирования связывания лиганда VEGF с рецептором VEGF.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к конъюгатам антител против VEGF, которые демонстрируют превосходящий (или, по меньшей мере, равный) уровень блокирующей способности по сравнению с только антителом против VEGF.

Пример 13. Способ определения связывания OG1950 с Fc-гамма-рецептором I и IIIa.

Эксперименты по кинетике связывания проводили при 25°С с применением BIAcore T200. Антитело анти-his иммобилизовали на чипе CM5. Гистидин-меченый FcγRI и FcγRIIIa в концентрации 0,5 мкг/мл, полученный в буфере HBS-EP (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005 % Твин-20) вводили независимо в течение 60 с при скорости потока 5 мкл/мин только в активной проточной ячейке. Конъюгат антитела и Avastin® (бевацизумаб), используемый в качестве положительного контроля, затем инъецировали через контрольную и активную проточную ячейку с использованием 60-секундных инъекций при 30 мкл/мл, применяя способ кинетики одиночного цикла. Концентрации антител в диапазоне от 0,48 до 300 нм применяли для FcγRI и от 7,8 до 2000 нм для FcγRIIIa. После каждого прогона проточные ячейки регенерировали 60-секундной инъекцией 10 мМ глицина с рН 1,7 при скорости потока 50 мкг/мл. Данные вычитали с двойной ссылкой, используя вычитание, как проточной ячейки, так и контрольных циклов. Анализ проводили с использованием программного обеспечения для оценки BIA. Результаты представлены на фигурах 22 и 23. Результаты показывают, что OG1950 не показал никакого существенного связывания с Fc-гамма-рецептором I и IIIa в этом анализе.

Пример 14. Способ определения связывания OG1950 с белком комплемента человека C1q

Комплемент оценивали с помощью связывания C1q ELISA. Панель антител титровали 1:2 от верхней концентрации 10 мкг/мл в 1×PBS для покрытия в течение ночи при 4°C. Затем планшеты блокировали после 2-часовой блокировки в 1 % BSA. Затем очищенный человеческий C1q применяли при 5 мкг/мл в 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре с последующим детектированием HRP-конъюгированным антителом против человеческого C1q и проявлением ТМВ. Результаты представлены на фиг. 24. Результаты показывают, что C1q обладает большей аффинностью связывания с Avastin® (бевацизумабом) относительно OG1950 при концентрациях антител от 10 мкг/мл до 0,625 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления OG1950 имеет менее 10 % связывания с Avastin. В некоторых вариантах осуществления OG1950 имеет меньшее связывание с C1q, чем Avastin® (бевацизумаб).

Пример 15. Влияние агентов против VEGF на VEGF стимулированную пролиферацию HRMVEC

Анализы пролиферации микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HuRMVEC) проводили следующим образом: клетки поддерживали в полной среде CSC (cell systems, #4Zo-500), дополненной 2% CultureBoost (cell systems, #4CB-500) и 0,2% Bac-off (cell systems, #4ZO-643), высевали в 96-луночные планшеты в среде для анализа (бессывороточная среда (cell systems, #4Z3-500-S) с 5% FBS) при плотности 10000 клеток на лунку. Ингибиторы VEGF сначала добавляли в указанных концентрациях в каждую лунку. Через 30 минут к конечной концентрации 1,3 нМ добавляли VEGF 165 (R&D systems, #293-VE-500/CF). Через 3 дня клетки инкубировали с реагентом для анализа пролиферации клеток WST-1 и считывали при OD450 нМ.

Результаты показали, что оба независимых образца OG1953 (OG1953A и OG1953B) проявляют сильное ингибирование пролиферации HuRNVEC. Оба значения максимального ингибирование и IC50 OG1953 сравнимы с таковым только для антитела OG1950 в этом анализе. Максимальное ингибирование OG1953 также значительно лучше, чем у Avastin® (бевацизумаб) и Eylea® (афлиберцепт). Результаты (включая значения IC50 и их сравнение с Lucentis® (ранибизумаб), Eylea® (афлиберцепт) и Avastin® (бевацизумаб)) представлены на фиг. 25.

Пример 16. Кинетика одиночного цикла (SCK) связывания VEGF с агентами против VEGF, захваченными на чипе с протеином A при 25 градусах

Кинетику связывания проводили при 25°С с применением BIAcore T200 на Avastin® (бевацизумаб), OG1950 и OG1953. Кратко, агенты против VEGF захватывали на чипе с протеином A (GE). 1 мкг/мл OG1950 и Avastin® (бевацизумаб) пропускали при скорости потока 25 мкл/мин в течение 2 минут. 10 мкг/мл OG1953 пропускали при 10 мкл/мин в течение 10 минут. VEGF (рекомбинантный, R&D systems) пропускали через захваченные антитела в течение времени контакта 240 секунд каждый при 0,56 нМ, 1,67 нМ, 5 нМ, 15 нМ и 45 нМ для кинетики одиночного цикла и диссоциировали в течение 30 минут. Анализ проводили с применением программного обеспечения BiaEvaluation (GE). Все сенсограммы вычитали с двойной ссылкой и устанавливали с применением модели связывания Ленгмюра 1:1. Отклонение этих агентов против VEGF может быть недооценено в этом эксперименте из-за диссоциации между агентами против VEGF и захватом белка A.

Результаты представлены на фиг. 26, включая рассчитанные значения KD, ka и kd.

Пример 17. Скрининг эксципиентов для предотвращения осаждения IgG1, вызванного полимером OG1802

При применении стандартного способа конъюгирования, реакционная смесь конъюгирования OG1950 оказалась мутной, и осадок сразу же присутствовал при перемешивании. Дальнейшее исследование показало, что осадок представлял собой сам белок, что, в свою очередь, приводило к пониженной эффективности конъюгирования, наблюдаемой с помощью ДНС-ПААГ или ионообменного анализа, поскольку белок терялся при осаждении вместо того, чтобы участвовать в реакции конъюгирования.

Первоначальные эксперименты по поиску и устранению ошибок выявили условия, при которых не получали прозрачный реакционный раствор, включая (1) уменьшение отношения молярного избытка полимера от более 10 до менее 5; (2) предварительное регулирование значения рН реакционного раствора до более кислого (например, рН 5) или основного (например, рН 8,5) из стандартного нейтрального диапазона рН (например, рН от 6,5 до 7,5); (3) тестирование других образцов белка IgG1 с одинаковой или различной изоэлектрической точкой (pI) по сравнению с OG1950; (4) замена буфера для хранения образца на 1×PBS, pH 7,4 или 20 мМ Трис буфер, pH 7,4, 100 мМ NaCl; и (5) предварительное регулирование раствора OG1802 с помощью 20 мМ трис буфера рН 7,4.

Известно, что белок несет чистый поверхностный заряд, который способствует растворимости белка в водном растворе. Гидрофильными называются аминокислоты, которые включают аргинин, лизин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. При нейтральном рН 7 боковые цепи этих аминокислот несут положительные заряды для аргинина и лизина, отрицательные для аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Изменение рН раствора может модулировать внутреннюю растворимость белка, поэтому в некоторых упомянутых выше экспериментах по устранению ошибок, таких как (2), применялся этот подход. Теоретически растворимость белков в водном растворе отличается зависимостью от уровня гидрофобных или гидрофильных свойств поверхности. Белки с поверхностями, которые обладают большими гидрофобными свойствами, будут легко осаждаться. Добавление ионов (например, NaCl или другой соли) создает эффект экранирования электронов, который аннулирует некоторую активность между частицами воды и белком, уменьшая растворимость, поскольку белки связываются друг с другом и начинают агрегировать. В нынешней ситуации было высказано предположение, что биополимер прямо или косвенно модулирует поверхностный заряд белка и/или открытые поверхности таким образом, который способствует межмолекулярным гидрофобным взаимодействиям, что приводит к осаждению белка.

Эксципиенты, которые были определены для модуляции растворимости белка, включают следующие категории (i) детергенты, включая нейтральный детергент (например, 0,1-1% полисорбат 20 или твин 20) или заряженный детергент (например, 0,1-1% додецилсульфат натрия (SDS)) (ii) сахара (например, 6% трегалоза или 6% сахароза) (iii) отрицательно заряженные аминокислоты (например, 0,03-1 мМ глутаминовая кислота или 0,03-1 мМ аспарагиновая кислота) или положительно заряженные аминокислоты (например, 1-100 мМ лизин или аргинин) (iv) хаотропные агенты или денатуранты (например, 1-100 мМ мочевина, аналог гидрохлорида гуанидина или 1-100 мМ аргинин) (v) полиэтиленгликоль (например, 0,03-1 мМ PEG8000); и (vi) органический растворитель (например, 20% этанол).

В дополнительном варианте эксперимента (DOE) различные эксципиенты из каждой категории, упомянутых выше, были выбраны на основе их совместимости с фармацевтическим получением для применения в виде инъекций у человека. Кроме того, в такую оценку также включали крайне кислое значение рН 4 и основное значение рН 9. Для оценки выбирали стандартный образец белка IgG1, который не содержал сконструированный цистеин для минимизации потенциальной интерференции такого неспаренного остатка цистеина, усложняющего наблюдение за осадками. В табл. 17.1 показана такая матрица. Заштрихованные код/ строки представляют собой условия, при которых получают прозрачный раствор, в то время как незаштрихованные строки представляют собой условия, при которых получают раствор с различной степенью мутности или с осадком.

Таблица 17.1

код Эксципиент Рабочий буферный раствор 1 OG1898_R5782_5xR7473 (контроль) 20 мМ Трис pH 7,4, 100 мМ NaCl 2 5 мг/мл_R5782_5xR7473_pH4 ацетата натрия 3 5 мг/мл_R5782_5xR7473_pH9 карбонат натрия 4 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1% Твин20 Трис 20 мМ NaCl 5 5 мг/мл_R5782_5xR7473_0,1% Твин20 Трис 20 мМ NaCl 6 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1% SDS Трис 20 мМ NaCl 7 5 мг/мл_R5782_5xR7473_0,1% SDS Трис 20 мМ NaCl 8 5 мг/мл_R5782_5xR7473_6% Сахароза Трис 20 мМ NaCl 9 5 мг/мл_R5782_5xR7473_6% Трегалоза Трис 20 мМ NaCl 10 5 мг/мл_R5782_5xR7473_0,03 мМ Аспарагиновая кислота Трис 20мМ NaCl 11 5мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ Аспарагиновая кислота Трис 20 мМ NaCl 12 5 мг/мл_R5782_5xR7473_0,03 мМ Глутаминовая кислота Трис 20 мМ NaCl 13 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ Глутаминовая кислота Трис 20 мМ NaCl 14 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ Аргинин Трис 20 мМ NaCl 15 5 мг/мл_R5782_5xR7473_100 мМ Аргинин Трис 20 мМ NaCl 16 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ Мочевина Трис 20 мМ NaCl 17 5 мг/мл_R5782_5xR7473_100 мМ Мочевина Трис 20 мМ NaCl 18 5 мг/мл_R5782_5xR7473_0,03 мМ PEG8000 Трис 20 мМ NaCl 19 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ PEG8000 Трис 20 мМ NaCl 20 5 мг/мл_R5782_5xR7473_20% EtOH Трис 20 мМ NaCl 21 5 мг/мл_OG1931_R8399_5xR7473_CTL Трис 20 мМ NaCl 22 5 мг/мл_OG1931_R8399_5xR7473_1 мМ Аспарагиновая кислота Трис 20 мМ NaCl 23 5 мг/мл_OG1931_R8399_5xR7473_1 мМ Аргинин Трис 20 мМ NaCl 24 8 мг/мл_OG1321_R7587_5xR7473_CTL Трис 20 мМ NaCl 25 5 мг/мл_R5782_5xR7473_1 мМ Лизин Трис 20 мМ NaCl 26 5 мг/мл_R5782_5xR7473_100 мМ Лизин Трис 20 мМ NaCl

Полученные осажденные растворы (или не осажденные растворы) представлены на фиг. 28.

Все патентные заявки, веб-сайты, другие публикации, номера присоединения и тому подобное, упомянутые выше или ниже, включены в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был конкретно и индивидуально указан и, таким образом включен в качестве ссылки. Если разные версии последовательности связаны с номером присоединения в разное время, подразумевается версия, связанная с номером присоединения, в действительную дату подачи настоящей заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю дату фактической подачи или дату подачи приоритетной заявки, относящуюся к номеру присоединения, если это применимо. Аналогично, если разные версии публикации, веб-сайта или тому подобного публикуются в разное время, подразумевается, если не указано иное, наиболее ранняя опубликованная версия в действительную дату подачи настоящей заявки. Любой признак, стадия, элемент, вариант осуществления или аспект, раскрытый здесь, могут применяться в сочетании с любым другим, если специально не указано иное. Хотя некоторые варианты осуществления были подробно описаны в качестве иллюстрации и примера для ясности и понимания, будет очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть реализованы в рамках прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат антитела против VEGF-A, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики офтальмологического заболевания, способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания, включающий введение эффективного количества конъюгата антитела или фармацевтической композиции и способ получения конъюгата антитела. В одном из вариантов реализации конъюгат антитела включает антитело против VEGF-A и полимер, содержащий фосфорилхолин, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да, и конъюгат антитела имеет молекулярную массу между приблизительно 450000 и 1900000 Да. Изобретение расширяет арсенал средств против VEGF-A. 4 н. и 42 з.п. ф-лы, 7 табл., 17 пр., 28 ил.

1. Конъюгат антитела против VEGF-A, включающий (1) антитело против VEGF-A и (2) полимер, содержащий фосфорилхолин, где полимер ковалентно связан с антителом через ненативный цистеин вне вариабельной области антитела, причем полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да, и конъюгат антитела имеет молекулярную массу между приблизительно 450000 и 1900000 Да.

2. Конъюгат антитела по п. 1, где антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная тяжелая цепь включает Fc область, и ненативный цистеин находится в Fc области тяжелой цепи.

3. Конъюгат антитела по п. 1 или 2, где тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_H1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR_H2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR_H3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), и легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR_L1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR_L2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR_L3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).

4. Конъюгат антитела по п. 2 или 3, где изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой человеческий IgG1, и константный домен тяжелой цепи антитела против VEGF-A имеет одну или более мутаций относительно константного домена человеческого IgG1 для модуляции эффекторной функции.

5. Конъюгат антитела по п. 4, где:

мутации находятся в одном или более из следующих аминокислотных положений (нумерация EU): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X и P331X, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту;

мутации выбраны из группы, состоящей из (нумерация EU): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S; или

мутации представляют собой: L234A, L235A и G237A (нумерация EU).

6. Конъюгат антитела по любому из пп. 2-5, где ненативный цистеин представляет собой L443C (нумерация EU).

7. Конъюгат антитела по п. 6, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.

8. Конъюгат антитела по любому из пп. 1-7, где полимер имеет индекс полидисперсности (ИП) меньше чем приблизительно 1,2.

9. Конъюгат антитела по любому из пп. 6-8, имеющий следующую структуру:

,

где:

каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой H, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой L;

полимер связан с антителом против VEGF-A через сульфгидрильную группу C443 (нумерация EU), причем связь изображена на одной из тяжелых цепей;

PC представляет собой , где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера, где X представляет собой a) OR, где R представляет собой H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и

n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными, такими что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 и n9 равна 2500 плюс или минус 15%.

10. Конъюгат антитела по любому из пп. 1-8, где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономер 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфат (MPC), как указано ниже:

11. Конъюгат антитела по п. 10, где полимер имеет:

три или более луча или синтезирован с инициатором, включающим 3 или более сайтов инициации полимера;

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера;

2, 3, 6 или 9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера; или

9 лучей или синтезирован с инициатором, включающим 9 сайтов инициации полимера.

12. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики офтальмологического заболевания, включающая эффективное количество конъюгата антитела по любому из пп. 1-11 и фармацевтически приемлемый носитель.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, содержащая указанный конъюгат антитела в растворе.

14. Способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания, включающий введение эффективного количества конъюгата антитела по любому из пп. 1-11 или фармацевтической композиции по п. 12 или 13, причем офтальмологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), патологической миопии, болезни фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзии ветвей центральной вены сетчатки (ОВЦВС), неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, ретинопатии недоношенных (РН), субконъюнктивального кровоизлияния и гипертонической ретинопатии.

15. Способ по п. 14, где офтальмологическое заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.

16. Способ получения конъюгата антитела по любому из пп. 1-11, включающий стадию конъюгирования антитела против VEGF-A с полимером, содержащим фосфорилхолин;

где антитело против VEGF-A включает ненативный остаток цистеина вне вариабельной области антитела;

где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает специфичную к сульфгидрилу реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из малеимида, винилсульфона, ортопиридилдисульфида и иодацетамида; и

где специфичная к сульфгидрилу реакционноспособная группа на полимере, содержащем фосфорилхолин, взаимодействует с ненативным остатком цистеина на антителе против VEGF-A с получением конъюгата антитела.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий стадию полимеризации свободнорадикально полимеризуемого мономера, содержащего фосфорилхолин, в полимеризационной среде с получением полимера, содержащего фосфорилхолин, причем среда включает:

радикально полимеризуемый мономер, содержащий фосфорилхолин;

катализатор на основе переходного металла M_t^(q-1)+, где M_t представляет собой переходный металл, q представляет собой максимальную степень окисления металла, а q-1 представляет собой степень окисления металла, причем металл может действовать как катализатор, где катализатор на основе переходного металла поставляют в виде соли формы M_t^(q-1)+X'_(q-1), где X' представляет собой противоион, или катализатор на основе переходного металла поставляют in situ путем обеспечения соли неактивного металла в его высшей степени окисления M_t^q+X'_q вместе с восстановителем, который способен восстанавливать переходный металл из окисленного неактивного состояния до восстановленного активного состояния;

лиганд; и

инициатор.

18. Способ по п. 17, где радикально полимеризуемый мономер, содержащий фосфорилхолин, представляет собой

i

j

где R1 представляет собой Н или С_1-6 алкил;

каждый R2, R3, R4 представляет собой метил; и

каждый из i и j равен 2.

19. Способ по п. 18, где M_t выбран из группы, состоящей из Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au и Ag.

20. Способ по п. 19, где металлический катализатор поставляют в виде соли формы M_t^(q-1)+X′_(q-1).

21. Способ по п. 20, где M_t^(q-1)+ выбран из группы, состоящей из Cu¹⁺, Fe²⁺, Ru²⁺, Cr²⁺, Mo²⁺, W²⁺, Mn³⁺, Rh³⁺, Re²⁺, Co⁺, V²⁺, Zn⁺, Au⁺, и Ag⁺, и X' выбран из группы, состоящей из галогена, C_1-6 алкокси, (SO₄)_1/2, (PO₄)_1/3, (R7PO₄)_1/2, (R7₂PO₄), трифлата, гексафторфосфата, метансульфоната, арилсульфоната, CN и R7CO₂, где R7 представляет собой Н или прямую или разветвленную C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним-пятью атомами галогена.

22. Способ по п. 21, где M_t^(q-1)+ представляет собой Cu¹⁺, и X' представляет собой Br.

23. Способ по п. 18, где M_t^(q-1)+ поставляют in situ.

24. Способ по п. 23, где M_t^q+X_q представляет собой CuBr₂.

25. Способ по п. 18, где восстановитель представляет собой неорганическое соединение.

26. Способ по п. 25, где неорганическое соединение выбрано из группы, состоящей из соединения серы с низкой степенью окисления, гидросульфита натрия, неорганической соли, включающей ион металла, металла, гидразингидрата и производных таких соединений.

27. Способ по п. 26, где восстановитель представляет собой металл.

28. Способ по п. 27, где восстановитель представляет собой Cu⁰.

29. Способ по п. 18, где восстановитель представляет собой органическое соединение.

30. Способ по п. 29, где органическое соединение выбрано из группы, состоящей из алкилтиолов, меркаптоэтанола или карбонильных соединений, которые могут быть легко енолизованы, аскорбиновой кислоты, ацетилацетоната, камфорсульфоновой кислоты, гидроксиацетона, восстанавливающих сахаров, моносахаридов, глюкозы, альдегидов и производных таких органических соединений.

31. Способ по п. 18, где лиганд выбран из группы, состоящей из 2,2'-бипиридина, 4,4'-ди-5-нонил-2,2'-бипиридина, 4,4-динонил-2,2'-дипиридила, 4,4',4''-трис(5-нонил)-2,2':6',2''-терпиридина, N,N,N',N',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, трис(2-диметиламиноэтил)амина, N,N-бис(2-пиридилметил)октадециламина, N,N,N',N'-тетра[(2-пиридил)метил]этилендиамина, трис[(2-пиридил)метил]амина, трис(2-аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-бутокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-(2-этилгексокси)-3-оксопропил)аминоэтил)амина и трис(2-бис(3-додекокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина.

32. Способ по п. 31, где лиганд представляет собой 2,2'-бипиридин.

33. Способ по п. 18, где инициатор имеет структуру:

,

где R1 представляет собой нуклеофильную реакционноспособную группу, R2 включает линкер, и R3 включает фрагмент инициатора полимерного синтеза, имеющий структуру

,

где R4 и R5 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкилена, алкокси, карбоксиалкила, галогеналкила, циклоалкила, циклического простого алкилового эфира, алкенила, алкенилена, алкинила, алкинилена, циклоалкилена, гетероциклоалкила, гетероциклоалкилена, арила, арилена, ариленокси, гетероарила, амино, амидо и любой их комбинации, причем замещенный алкил содержит заместитель, выбранный из группы, состоящей из: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'' -SR', -галоген, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)₂R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -NRSO₂R', -CN и -NO₂, в количестве от нуля до (2m'+1), где m' - это общее количество атомов углерода в замещенном алкиле, а каждый из R', R'', R''' и R'''' независимо представляют собой водород, незамещенный гетероалкил, незамещенный арил, арил, замещенный одним-тремя атомами галогена, незамещенный алкил, алкокси или тиоалкокси или арилалкил;

Z представляет собой галоген или NCS; и s представляет собой целое число от 1 до 20.

34. Способ по п. 33, где Z представляет собой Br, а каждый из R4 и R5 представляет собой метил.

35. Способ по п. 34, где R1 выбран из группы, состоящей из NH₂-, OH- и SH-.

36. Способ по п. 35, где R1 представляет собой NH₂-.

37. Способ по п. 36, где R2 представляет собой алкил, замещенный алкил, алкилен, алкокси, карбоксиалкил, галогеналкил, циклоалкил, циклический простой алкиловый эфир, алкенил, алкенилен, алкинил, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкил, гетероциклоалкилен, арил, арилен, ариленокси, гетероарил, амино, амидо и любую их комбинацию, причем замещенный алкил содержит заместитель, выбранный из группы, состоящей из: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', -галоген, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)₂R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -NRSO₂R', -CN и –NO₂, в количестве от нуля до (2m'+1), где m' - это общее количество атомов углерода в замещенном алкиле, а каждый из R', R'', R''' и R'''' независимо представляют собой водород, незамещенный гетероалкил, незамещенный арил, арил, замещенный одним-тремя атомами галогена, незамещенный алкил, алкокси или тиоалкокси или арилалкил.

38. Способ по п. 37, где R2 представляет собой

β

α
,

где α и β являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 20.

39. Способ по п. 38, где каждый из α и β равен 4.

40. Способ по п. 39, где R3 дополнительно включает

,

где R6, R7 и R8 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из

,

и

,

где Z представляет собой NCS, F, Cl, Br или I.

41. Способ по п. 40, где Z представляет собой Br.

42. Способ по п. 41, где каждый из R6, R7 и R8 представляет собой

.

43. Способ по п. 42, где инициатор имеет структуру

где A и B являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 2 до 12, и Z представляет собой Br.

44. Способ по п. 43, где каждый из А и В равен 4.

45. Способ по п. 44, дополнительно включающий стадию взаимодействия полимера с малеимидным реагентом с получением полимера, имеющего концевой малеимид.

46. Способ по п. 45, где малеимидный реагент представляет собой