АНТИТЕЛА И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ ДЛЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО КОНЪЮГИРОВАНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C07K16/32 C07K19/00 A61K47/68 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

[1] Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающих фрагментам, сконструированных для введения аминокислот для сайт-специфического конъюгирования.

Уровень техники

[2] Антитела конъюгировали с множеством цитотоксических средств, в том числе малыми молекулами, которые алкилируют ДНК (например, дуокармицин и калихеамицин), разрушают микротрубочки (например, майтанзиноиды и ауристатины) или связывают ДНК (например, антрациклины). Один такой конъюгат антитела-лекарственного средства (ADC), включающий гуманизированное антитело против CD33, конъюгированное с калихеамицином - Милотарг™ (гемтузумаб озогамицин) - был одобрен для лечения острого миелоидного лейкоза. Адцетрис™ (брентуксимаб ведотин), ADC конъюгат, включающий химерное антитело к CD30, конъюгированное с ауристатином, монометилауристатином E (MMAE), был одобрен для лечения лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы.

[3] Хотя ADC конъюгаты являются перспективными для терапии рака, цитотоксические средства обычно конъюгированы с антителами через боковые цепи лизина или при восстановлении межцепочечных дисульфидных связей, присутствующих в антителах, с получением активированных сульфгидрильных групп цистеина. Такой неспецифический метод конъюгирования, тем не менее, имеет многочисленные недостатки. Например, конъюгирование лекарственного средства с остатками лизина антитела осложняется тем, что в антителе присутствует множество остатков лизина (~30), доступных для конъюгирования. Поскольку оптимальный показатель отношения лекарственного средства к антителу (DAR) намного ниже (например, около 4:1), конъюгирование лизина часто дает сильно гетерогенный профиль. Кроме того, много лизинов расположено в важных антигенсвязывающих участках CDR-области, и конъюгирование лекарственного средства может привести к снижению аффинности антитела. С другой стороны, тогда как тиол-опосредованное конъюгирование в основном направлено на восемь цистеинов, включенных в дисульфидные связи шарнирной области, все еще трудно предсказывать и определять, какие четыре из восьми цистеинов последовательно конъюгированы в различных препаратах.

[4] Недавно генная инженерия свободных остатков цистеина позволила проводить сайт-специфическое конъюгирование с применением химических способов на основе тиолов. Сайт-специфические ADC конъюгаты имеют гомогенные профили и четко определенные сайты конъюгирования, и демонстрировали мощную цитотоксичность in vitro и сильную противоопухолевую активность in vivo.

[5] В WO 2013/093809 раскрыты сконструированные константные области антитела (Fc, Cγ, Cκ, Cλ) или их фрагмент, которые включают аминокислотные замены в определенных сайтах для введения остатка цистеина для конъюгирования. Раскрыты различные Cys-мутантные сайты в тяжелой цепи IgG и лямбда/каппа константных областях легкой цепи.

[6] Успешное применение введенных остатков Cys для сайт-специфического конъюгирования основано на возможности отбирать нужные сайты, в которых Cys-замена не изменяет структуру или функцию белка. Кроме того, применение различных сайтов конъюгирования приводит к различным свойствам, таким как биологическая стабильность ADC или возможность конъюгирования. Поэтому стратегия сайт-специфического конъюгирования, которая позволяет получать ADC с определенным сайтом конъюгирования и нужными свойствами ADC, была бы крайне полезной.

Сущность изобретения

[7] Изобретение относится к полипептидам, антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые включают замененный цистеин для сайт-специфического конъюгирования.

[8] Специалистам в данной области будет известно, или они сумеют установить с помощью не более чем стандартных экспериментов, множество эквивалентов определенных вариантов осуществления согласно изобретению, описанных в настоящей заявке. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующими вариантами осуществления (E).

E1. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении 290, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E2. Полипептид E1, где указанный константный домен включает CH₂ домен тяжелой цепи IgG.

E3. Полипептид E2, где указанный IgG является IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

E4. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60 в SEQ ID NO: 61, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 61.

E5. Полипептид E4, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 290 CH₂ домена IgG согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E6. Полипептид E5, где указанный IgG является IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

E7. Полипептид E1 или E4, где указанный константный домен включает CH₂ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂).

E8. Полипептид E1 или E4, где указанный константный домен включает CH₂ домен тяжелой цепи IgD.

E9. Полипептид E1 или E4, где указанный константный домен включает CH₂ домен тяжелой цепи IgE.

E10. Полипептид E1 или E4, где указанный константный домен включает CH₂ домен тяжелой цепи IgM.

E11. Полипептид согласно любому из E1-E10, где указанный константный домен является константным доменом человеческого антитела.

E12. Полипептид согласно любому из E1-E11, где указанный константный домен дополнительно включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 118, 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, 444 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E13. Полипептид согласно любому из E1-E12, где указанный константный домен дополнительно включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 118, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E14. Полипептид согласно любому из E1-E13, где указанный константный домен дополнительно включает модифицированный остаток цистеина в положении 334 согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие полипептид согласно любому из E1-E14.

E16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

(a) полипептид согласно одному из E1-E14, и

(b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 183 согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 76 в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63.

E17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

(a) полипептид согласно одному из E1-E14, и

(b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 или их любой комбинации согласно нумерации Кэбата; (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 42, 81, 100, 103 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63 (каппа легкая цепь); или (iii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 или их любой комбинации SEQ ID NO: 64, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 64 (лямбда легкая цепь).

E18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно E16 или E17, где указанная константная область легкой цепи включает константный домен каппа легкой цепи (CLκ).

E19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно E16 или E17, где указанная константная область легкой цепи включает константный домен лямбда легкой цепи (CLλ).

E20. Соединение, включающее полипептид согласно любому из E1-E14, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из E15-E19, где полипептид или антитело конъюгированы с одним или более терапевтическими средствами через указанный сконструированный цистеиновый сайт.

E21. Соединение согласно E20, где терапевтическое средство конъюгировано с полипептидом или антителом или его антигенсвязывающим фрагментом через линкер.

E22. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 375, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E23. Полипептид согласно E22, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E24. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 145, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E25. Полипептид согласно E24, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 334, 375, 392 или их любой комбинации CH₂ домена IgG, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E26. Полипептид согласно E22 или E24, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM, или оба.

E27. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 347, 388, 421, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E28. Полипептид согласно E27, где константный домен включает CH₃ домен IgG.

E29. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем 117, 158, 191, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E30. Полипептид согласно E29, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 347, 388, 421, 443 или их любой комбинации CH₃ домена IgG согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E31. Полипептид согласно E27 или E29, где указанный константный домен включает CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM.

E32. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 347, 388, 421 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E33. Полипептид согласно E32, где константный домен включает CH₃ домен тяжелой цепи IgG.

E34. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 117, 158, 191 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E35. Полипептид согласно E34, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 347, 388, 421 или их любой комбинации CH₃ домена IgG согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E36. Полипептид согласно E32 или E34, где указанный константный домен включает CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM.

E37. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 290, 334, 392, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E38. Полипептид согласно E37, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E39. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60, 104, 162, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E40. Полипептид E39, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 290, 334, 392, 443 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E41. Полипептид согласно E37 или E39, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM или оба.

E42. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 388, 421, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E43. Полипептид согласно E42, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E44. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем 104, 158, 191, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E45. Полипептид согласно E44, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 334, 388, 421, 443 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E46. Полипептид согласно E42 или E44, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM или оба.

E47. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 392, 421 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E48. Полипептид согласно E47, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E49. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем 104, 162, 191 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E50. Полипептид согласно E49, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 334, 392, 421 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E51. Полипептид согласно E47 или E49, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM, или оба.

E52. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении 392 согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E53. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении 290, 443 или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E54. Полипептид согласно E52 или E53, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E55. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 162 в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E56. Полипептид согласно E55, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 392 CH₃ домена IgG согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E57. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток в положении, соответствующем остатку 60, 213 или обоим в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E58. Полипептид согласно E57, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 290, 443 или обоих CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E59. Полипептид согласно любому из E52, E53, E55 и E57, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM, или оба.

E60. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 290, 388, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E61. Полипептид согласно E60, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E62. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60, 158, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E63. Полипептид согласно E62, где модифицированный остаток цистеина расположен в остатке 290, 388, 443 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E64. Полипептид согласно E60 или E62, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM, или оба.

E65. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 375, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E66. Полипептид согласно E65, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E67. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 145, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E68. Полипептид согласно E67, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 334, 375, 392 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E69. Полипептид согласно E65 или E67, где указанный константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM или оба.

E70. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 347, 375, 380, 388, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E71. Полипептид согласно E70, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgG или оба.

E72. Полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, включающий модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 117, 145, 150, 158, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62.

E73. Полипептид E72, где модифицированный остаток цистеина расположен в положении 334, 347, 375, 380, 388, 392 или их любой комбинации CH₂ домена, CH₃ домена IgG или обоих, согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E74. Полипептид согласно E70 или E72, где константный домен включает CH₂ домен, CH₃ домен тяжелой цепи IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE или IgM, или оба.

E75. Полипептид согласно любому из E23, E25, E28, E30, E33, E35, E38, E40, E43, E45, E48, E50, E54, E56, E58, E61, E63, E66, D68, E71 и E73, где указанный IgG является IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

E76. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие полипептид, выбранный из любого из E21-E75.

E77. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

(a) полипептид согласно любому из E21-E75, и

(b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 183 согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 76 в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63.

E78. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

(a) полипептид согласно любому из E21-E75, и

(b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 или их любой комбинации согласно нумерации Кэбата; (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 42, 81, 100, 103 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63 (каппа легкая цепь); или (iii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 64, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 64 (лямбда легкая цепь).

E79. Соединение, включающее полипептид согласно любому из E21-E75, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно E76-E78, где полипептид или антитело конъюгированы с терапевтическим средством через сконструированный цистеиновый сайт.

E80. Соединение согласно E79, где терапевтическое средство конъюгировано с полипептидом или антителом или его антигенсвязывающим фрагментом через линкер.

E81. Соединение согласно E79 или E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 375, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 145, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) изменение гидрофобности соединения по сравнению с полипептидом или неконъюгированным антителом, при измерении по относительному времени удерживания HIC, составляет от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,5, от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,4, от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,3 или от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,2.

E82. Соединение согласно E79 или E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 347, 388, 421, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 117, 158, 191, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) изменение гидрофобности соединения по сравнению с полипептидом или неконъюгированным антителом, при измерении по относительному времени удерживания HIC, составляет приблизительно 1,5 или больше, приблизительно 1,6 или больше, приблизительно 1,7 или больше, приблизительно 1,8 или больше, приблизительно 1,9 или больше, или приблизительно 2,0 или больше.

E83. Соединение согласно E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 347, 388, 421 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 117, 158, 191 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании константного домена с SEQ ID NO: 62;

(b) линкер включает сукцинимидную группу; и

(c) процент гидролиза сукцинамида в плазме при 37°C и 5% CO₂ через 72 часа составляет по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85% или по меньшей мере приблизительно 90%.

E84. Соединение согласно E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 347, 388, 421 и их любой комбинации, согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 117, 158, 191 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62;

(b) линкер включает сукцинимидную группу; и

(c) процент гидролиза сукцинамида в 0,5 мМ глутатиона (pH 7,4) при 37°C через 72 часа составляет по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85% или по меньшей мере приблизительно 90%.

E85. Соединение согласно E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 290, 334, 392, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60, 104, 162, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62;

(b) линкер включает сукцинимидную группу; и

(c) процент гидролиза сукцинамида в плазме при 37°C и 5% CO₂ через 72 часа составляет приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше, приблизительно 35% или меньше или приблизительно 30% или меньше.

E86. Соединение согласно E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 290, 334, 392, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60, 104, 162, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62;

(b) линкер включает сукцинимидную группу; и

(c) процент гидролиза сукцинамида в 0,5 мМ глутатиона (pH 7,4) при 37°C через 72 часа составляет приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше, приблизительно 35% или меньше или приблизительно 30% или меньше.

E87. Соединение согласно E79 или E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 388, 421, 443 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 158, 191, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) процент потери отношения лекарственного средства к антителу (DAR) в плазме при 37°C и 5% CO₂ через 72 часа не превышает приблизительно 10%, не превышает приблизительно 9%, не превышает приблизительно 8%, не превышает приблизительно 7%, не превышает приблизительно 6%, не превышает приблизительно 5%, не превышает приблизительно 4%, не превышает приблизительно 3%, не превышает приблизительно 2% или не превышает приблизительно 1%.

E88. Соединение согласно E79 или E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 392, 421 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 162, 191 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) процент потери DAR в 0,5 мМ глутатионе (pH 7,4) при 37°C через 72 часа не превышает приблизительно 10%, не превышает приблизительно 9%, не превышает приблизительно 8%, не превышает приблизительно 7%, не превышает приблизительно 6%, не превышает приблизительно 5%, не превышает приблизительно 4%, не превышает приблизительно 3%, не превышает приблизительно 2% или не превышает приблизительно 1%.

E89. Соединение согласно E82, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 290, 388, 443 и их любой комбинации, согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 60, 158, 213 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) процент опосредованного катепсином расщепления линкера (200-20000 нг/мл катепсина) при 37°C через 20 минут составляет по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85% или по меньшей мере приблизительно 90%.

E90. Соединение согласно E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 375, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 145, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) процент опосредованного катепсином (200-20000 нг/мл катепсина) расщепления линкера при 37°C через 4 часа, составляет приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше, приблизительно 35% или меньше, приблизительно 30% или меньше, приблизительно 25% или меньше, приблизительно 20% или меньше или приблизительно 15% или меньше.

E91. Соединение согласно E79 или E80, где:

(a) константный домен тяжелой цепи, который включает модифицированный остаток цистеина в положении, выбранном из группы, состоящей из: 334, 347, 375, 380, 388, 392 и их любой комбинации согласно нумерации EU индекса Кэбата; или модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 104, 117, 145, 150, 158, 162 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 62, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 62; и

(b) процент соединения в мономерной форме при концентрации 5 мг/мл при 45°C в день 21 составляет приблизительно 96,0% или больше, приблизительно 96,5% или больше, приблизительно 97,0% или больше, приблизительно 97,5% или больше, приблизительно 98,0% или больше.

E92. Соединение согласно любому из E21 и E80-E91, где линкер является расщепляемым.

E93. Соединение согласно любому из E21 и E80-E92, где линкер включает vc, mc, MalPeg6, m(H20)c, m(H20)cvc или их комбинацию.

E94. Соединение согласно любому из E21 и E80-E93, где линкер включает vc.

E95. Соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E94, где терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из: цитотоксического средства, цитостатического средства, химиотерапевтического средства, токсина, радионуклида, ДНК, РНК, миРНК, микроРНК, пептид-нуклеиновой кислоты, неприродной аминокислоты, пептида, фермента, флуоресцентной метки, биотина, тубулизина и их любой комбинации.

E96. Соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E95, где терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из: ауристатина, майтанзиноида, калихеамицина, тубулизина и их любой комбинации.

E97. Соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E96, где терапевтическим средством является ауристатин.

E98. Соединение согласно E97, где ауристатин выбран из группы, состоящей из: 0101, 8261, 6121, 8254, 6780, 0131, MMAD, MMAE, MMAF и их любой комбинации.

E99. Соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E96, где терапевтическим средством является тубулизин.

E100. Конъюгат антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), где: (a) Ab является антителом согласно любому из E76-E78; и (b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, и D является лекарственным средством.

E101. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E100, где L-D включает сукцинимидную группу, малеимидную группу, гидролизуемую сукцинимидную группу или гидролизуемую малеимидную группу.

E102. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E100 или E101, где L-D включает малеимидную группу или гидролизуемую малеимидную группу.

E103. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E100-E102, где L-D включает 6-малеимидокапроил (MC), малеимидопропаноил (MP), валин-цитруллин (val-cit), аланин-фенилаланин (ala-phe), п-аминобензилоксикарбонил (PAB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-(4-иод-ацетил)аминобензоат (SIAB) или 6-малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил (MC-vc-PAB).

E104. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E100-E102, включающий соединение формулы I:

I

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является или ;

R¹ является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(i) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3B является C₁-C₈ алкилом;

(ii) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ; и

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом.

E105. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E100-E102, включающий соединение формулы IIa:

IIa

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является или ;

R¹ является или

;

Y является одной или более группами, выбранными из -C₂-C₂₀ алкилена-, -C₂-C₂₀ гетероалкилена-, -C₃-C₈ карбоцикло-, -арилена-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-арилена-, -арилен-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилена-, -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10-C_1-6алкила, -C(O)-C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-, -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-C(O)-, -C_1-6алкил-(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)CH₂-, -C(O)-C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)- и -C(O)-C_1-6алкил-(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)C_1-6алкила-;

Z является или -NH₂;

G является галогеном, -OH, -SH или -S-C₁-C₆ алкилом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(i) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом; и

R^3B является C₁-C₈ алкилом; или

(ii) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ;

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом;

R¹⁰ является водородом, -C₁-C₁₀алкилом, -C₃-C₈карбоциклилом, -арилом, -C₁-C₁₀гетероалкилом, -C₃-C₈гетероцикло, -C₁-C₁₀алкилен-арилом, -арилен-C₁-C₁₀алкилом, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло), -(C₃-C₈ карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилом, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло) или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилом, где арил на R¹⁰, включающем арил, необязательно замещен [R₇]_h;

R⁷ независимо при каждом появлении выбран из группы, состоящей из F, Cl, I, Br, NO₂, CN и CF₃; и

h является 1, 2, 3, 4 или 5.

E106. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E100-E102, включающий соединение формулы IIb:

IIb

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является ;

R¹ является или

;

Y является -C₂-C₂₀ алкиленом-, -C₂-C₂₀ гетероалкиленом-, -C₃-C₈ карбоцикло-, -ариленом-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-ариленом-, -арилен-C₁-C₁₀алкиленом-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкиленом-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкиленом-;

Z является , или -NH-Ab;

Ab является антителом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(i) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3B является C₁-C₈ алкилом;

(ii) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ; и

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом.

E107. Фармацевтическая композиция, включающая: соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E99 или конъюгат антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E107; и фармацевтически приемлемый носитель.

E108. Способ лечения рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или инфекционного заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно любому из E20-E21 и E79-E99, конъюгат антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E107 или композиции согласно E108.

E109. Соединение согласно любому из E20-E21 и E79-E99, конъюгат антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E107 или композиция согласно E108 для применения в лечении рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или инфекционного заболевания.

E110. Применение соединения согласно любому из E20-E21 и E79-E99, конъюгата антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E107 или композиции согласно E108 для лечения рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или инфекционного заболевания.

E111. Применение соединения согласно любому из E20-E21 и E79-E99, конъюгата антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E107 или композиции согласно E108 в производстве лекарственного средства для лечения рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или инфекционного заболевания.

E112. Конъюгат антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), где:

(a) Ab является антителом, которое связывается с HER2 и включает:

(1) вариабельную область тяжелой цепи, включающую три CDR-области, включающих SEQ ID NO: 2, 3 и 4;

(2) константную область тяжелой цепи любого из SEQ ID NO: 17, 5, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 или 39;

(3) вариабельную область легкой цепи, включающую три CDR-области, включающих SEQ ID NO: 8, 9 и 10;

(4) константную область легкой цепи любого из SEQ ID NO: 41, 11 или 43; и

(b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, и D является лекарственным средством,

при условии, что в том случае, когда константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 5, константная область легкой цепи не является SEQ ID NO: 11.

E113. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E112, где:

(a) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 17, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 41;

(b) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 5, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 41;

(c) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 17, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(d) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 21, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(e) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 23, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(f) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 25, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(g) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 27, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(h) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 23, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 41;

(i) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 25, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 41;

(j) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 27, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 41;

(k) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 29, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(l) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 31, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(m) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 33, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 43;

(n) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 35, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(o) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 37, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11;

(p) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 39, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 11; или

(q) константная область тяжелой цепи является SEQ ID NO: 13, и константная область легкой цепи является SEQ ID NO: 43.

E114. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E112, где:

(a) тяжелая цепь включает любой из SEQ ID NO: 18, 6, 14, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40; и

(b) легкая цепь включает любой из SEQ ID NO: 42, 12 или 44,

при условии, что в том случае, когда тяжелая цепь является SEQ ID NO: 6, легкая цепь не является SEQ ID NO: 12.

E115. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E114, где:

(a) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 18, и легкая цепь является SEQ ID NO: 42;

(b) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 6, и легкая цепь является SEQ ID NO: 42;

(c) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 18, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(d) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 22, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(e) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 24, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(f) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 26, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(g) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 28, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(h) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 24, и легкая цепь является SEQ ID NO: 42;

(i) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 26, и легкая цепь является SEQ ID NO: 42;

(j) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 28, и легкая цепь является SEQ ID NO: 42;

(k) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 30, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(l) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 32, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(m) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 34, и легкая цепь является SEQ ID NO: 44;

(n) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 36, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(o) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 38, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12;

(p) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 40, и легкая цепь является SEQ ID NO: 12; или

(q) тяжелая цепь является SEQ ID NO: 14, и легкая цепь является SEQ ID NO: 44.

E116. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E112-E115, где линкер выбран из группы, состоящей из vc, mc, MalPeg6, m(H20)c и m(H20)cvc.

E117. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E116, где линкер является расщепляемым.

E118. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E116 или E117, где линкером является vc.

E119. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E112-E118, где лекарственное средство обладает мембранной проницаемостью.

E120. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E112-E119, где лекарственное средство является ауристатином.

E121. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E120, где ауристатин выбран из группы, состоящей из следующего:

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]-пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид, соль трифторуксусной кислоты;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]-пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид, соль трифторуксусной кислоты;

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид; и

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид,

или их фармацевтически приемлемой соли или сольвата.

E122. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E120, где ауристатин является 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамидом или его фармацевтически приемлемой солью или сольватом.

E123. Конъюгат антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), где:

(a) Ab является антителом, которое связывается с HER2 и включает тяжелую цепь, включающую SEQ ID NO: 18, и легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 42; и

(b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является vc линкером, и D является ауристатином 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамидом или его фармацевтически приемлемой солью или сольватом.

E124. Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E112-E123 и фармацевтически приемлемый носитель.

E125. Конъюгат антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), где Ab является антителом, которое связывается с экстра-доменом B (EDB) фибронектина (FN), и L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, и D является лекарственным средством.

E126. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E125, где указанное антитело включает:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая включает:

(a) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или 67,

(b) CDR-H2 VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или 69; и

(c) CDR-H3 VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; и

(ii) вариабельную область легкой цепи (VL), которая включает:

(a) определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73,

(b) CDR-L2 VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и

(c) CDR-L3 VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.

E127. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E125 или E126, где линкер выбран из группы, состоящей из vc, mc, MalPeg6, m(H20)c и m(H20)cvc.

E128. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E127, где линкер является расщепляемым.

E129. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E127 или E128, где линкером является vc.

E130. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E125-E129, где лекарственное средство обладает мембранной проницаемостью.

E131. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E125-E130, где лекарственным средством является ауристатин.

E132. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E131, где ауристатин выбран из группы, состоящей из следующего:

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид, соль трифторуксусной кислоты;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид, соль трифторуксусной кислоты;

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид;

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид; и

N-метил-L-валил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид,

или их фармацевтически приемлемой соли или сольвата.

E133. Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно E132, где ауристатин является 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамидом или его фармацевтически приемлемой солью или сольватом.

E134. Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитела-лекарственного средства согласно любому из E125-E133 и фармацевтически приемлемый носитель.

E135. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид согласно любому из E1-E14 и E22-E75,

E136. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из E15-E19 и E76-E78.

E137. Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела соединения согласно любому из E20, E21 и E79-E99.

E138. Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела конъюгата антитела лекарственного средства согласно любому из E100-E106, E112-E123 и E125-E133.

E139. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который включает константный домен тяжелой цепи антитела, где указанный константный домен тяжелой цепи включает модифицированный остаток цистеина в положении 290 согласно нумерации EU индекса Кэбата.

E140. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая включает:

(a) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или 67,

(b) CDR-H2 VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или 69; и

(c) CDR-H3 VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; и

(ii) вариабельную область легкой цепи (VL), которая включает:

(a) определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73,

(b) CDR-L2 VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; и

(c) CDR-L3 VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.

E141. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту согласно любому из E135-E140.

E142. Способ получения полипептида или антитела, включающий культивирование клетки-хозяина согласно E141 в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида или антитела, и выделение указанного полипептида или антитела.

Краткое описание чертежей

[9] На ФИГ. 1A-1B показаны ADC конъюгаты (A) T(kK183C+K290C)-vc0101 и (B) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101. Каждый черный круг обозначает линкер/полезную нагрузку, которые конъюгированы с моноклональным антителом. Структура одного такого линкера/полезной нагрузки показана для каждого ADC. Подчеркнутый атом предоставлен аминокислотным остатком на антителе, через который происходит конъюгирование.

[10] На ФИГ. 2A-2E показаны спектры выбранных ADC, полученные с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и показывающие изменения времени удерживания при конъюгировании полученных на основе трастузумаба антител с различными линкерами-полезными нагрузками.

[11] На ФИГ. 3A-3B показаны кривые связывания ADC конъюгатов с HER2. (A) прямое связывание с HER2-положительными клетками BT474 и (B) конкурентное связывание с ФЭ-меченым трастузумабом с клетками BT474. Эти результаты указывают, что связывающие свойства антитела в таких ADC коъюгатах не были изменены в результате процесса конъюгирования.

[12] На ФИГ. 4 показаны ADCC активности ADC, полученных на основе трастузумаба.

[13] На ФИГ. 5 показаны данные исследования цитотоксичности in vitro (IC₅₀), представленные в нМ концентрации полезной нагрузки для ряда полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ряда клеточных линий с различными уровнями экспрессии HER2.

[14] На ФИГ. 6 показаны данные исследования цитотоксичности in vitro (IC₅₀), представленные в концентрации антитела нг/мл для ряда полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ряда клеточных линий с различными уровнями экспрессии HER2.

[15] На ФИГ. 7A-7I показана противоопухолевая активность девяти полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ксенотрансплантатов N87, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(kK183C+K290C)-vc0101; (B) T(kK183C)-vc0101; (C) T(K290C)-vc0101; (D) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (E) T(K290C+K334C)-vc0101; (F) T(K334C+K392C)-vc0101; (G) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (H) T-vc0101; (I) T-DM1. Клетки рака желудка N87 экспрессируют высокие уровни HER2.

[16] На ФИГ. 8A-8E показана противоопухолевая активность шести полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ксенотрансплантатов HCC1954, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (B) T(K290C+K334C)-vc0101; (C) T(K334C+K392C)-vc0101; (D) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (E) T-DM1. Клетки рака молочной железы HCC1954 экспрессируют высокие уровни HER2.

[17] На ФИГ. 9A-9G показана противоопухолевая активность семи полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ксенотрансплантатов JIMT-1, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(kK183C+K290C)-vc0101; (B) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (C) T(K290C+K334C)-vc0101; (D) T(K334C+K392C)-vc0101; (E) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (F) T-vc0101; (G) T-DM1. Клетки рака молочной железы JIMT-1 экспрессируют средние/низкие уровни HER2.

[18] На ФИГ. 10A-10D показана противоопухолевая активность пяти полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении ксенотрансплантатов MDA-MB-361 (DYT2), объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (B) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (C) T-vc0101; (D) T-DM1. Клетки рака молочной железы MDA-MB-361 (DYT2) экспрессируют средние/низкие уровни HER2.

[19] На ФИГ. 11A-11E показана противоопухолевая активность пяти полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении полученных от пациента ксенотрансплантатов PDX-144580, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(kK183C+K290C)-vc0101; (B) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (C) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (D) T-vc0101; (E) T-DM1. Полученные от пациента клетки PDX-144580 являются PDX-моделью ТНРМЖ.

[20] На ФИГ. 12A-12D показана противоопухолевая активность четырех полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении полученных от пациента ксенотрансплантатов PDX-37622, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T(kK183C+K290C)-vc0101; (B) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (C) T(K297C+K334C)-vc0101; (D) T-DM1. Полученные от пациента клетки PDX-37622 являются PDX-моделью НМРЛ, экспрессирующей средние уровни HER2.

[21] На ФИГ. 13A-13B показана иммуногистоцитохимия ксенотрансплантатов опухоли N87, обработанных (A) T-DM1 или (B) T-vc0101 и окрашенных на фосфогистон H3 и IgG антитело. Неспецифическую активность наблюдали с T-vc0101.

[22] На ФИГ. 14 показаны данные исследования цитотоксичности in vitro (IC₅₀), представленные в нМ концентрации полезной нагрузки и концентрации нг/мл антитела для ряда полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов и свободных полезных нагрузок в отношении клеток, сделанных устойчивыми к T-DM1 in vitro (N87-TM1 и N87-TM2), или исходных клеток, чувствительных к T-DM1 (клетки N87). Клетки рака желудка N87 экспрессируют высокие уровни HER2.

[23] На ФИГ. 15A-15G показана противоопухолевая активность семи полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении T-DM1-чувствительных (клетки N87) и резистентных (N87-TM1 и N87-TM2) клеток рака желудка. (A) T-DM1; (B) T-mc8261; (C) T(297Q+K222R)-AcLysvc0101; (D) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (E) T(K290C+K334C)-vc0101; (F) T(K334C+K392C)-vc0101; (G) T(kK183C+K290C)-vc0101.

[24] На ФИГ. 16A-16B показаны Вестерн-блоты, на которых показана: (A) экспрессия белка MRP1, эффлюксного насоса, обеспечивающего лекарственную устойчивость, и (B) белка MDR1, эффлюксного насоса, обеспечивающего лекарственную устойчивость, на T-DM1-чувствительных (клетки N87) и резистентных (N87-TM1 и N87-TM2) клетках рака желудка.

[25] На ФИГ. 17A-17B показана экспрессия HER2 и связывание с трастузумабом T-DM1-чувствительных (клетки N87) и резистентных (N87-TM1 и N87-TM2) клеток рака желудка. (A) Вестерн-блот, на котором показана экспрессия белка HER2, и (B) связывание трастузумаба с HER2 клеточной поверхности.

[26] На ФИГ. 18A-18D показан анализ уровней экспрессии белка в T-DM1-чувствительных (клетки N87) и резистентных (N87-TM1 и N87-TM2) клетках рака желудка. (A) Изменения уровня экспрессии 523 белков; (B) Вестерн-блоты, на которых показана экспрессия белков IGF2R, LAMP1 и CTSB; (C) Вестерн-блот, на котором показана экспрессия белка CAV1; (D) ИГХ экспрессии белка CAV1 в опухолях, полученных in vivo при имплантации клеток N87 и N87-TM2.

[27] На ФИГ. 19A-19C показана чувствительность к трастузумабу и различным полученным на основе трастузумаба ADC конъюгатам опухолей, полученных in vivo при имплантации (A) T-DM1-чувствительных исходных клеток N87; (B) T-DM1-резистентных клеток N87-TM1; (C) T-DM1-резистентных клеток N87-TM2.

[28] На ФИГ. 20A-20F показана чувствительность к трастузумабу и различным полученным на основе трастузумаба ADC конъюгатам опухолей, полученных in vivo при имплантации T-DM1-чувствительных исходных клеток N87 и T-DM1-резистентных клеток N87-TM2 или N87-TM1. (A) размер опухоли N87 наносили на кривую в зависимости от времени, в присутствии трастузумаба или двух полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов; (B) размер опухоли N87-TM2 наносили на кривую в зависимости от времени, в присутствии трастузумаба или двух полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов; (C) время до двухкратного увеличения размера опухоли из клеток N87 в присутствии трастузумаба или двух полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов; (D) время до двухкратного увеличения размера опухоли из клеток N87-TM2 в присутствии трастузумаба или двух полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов; (E) размер опухоли N87-TM2 наносили на кривую в зависимости от времени, в присутствии семи различных, полученных на основе трастузумаба, ADC конъюгатов; (F) размер опухоли N87-TM1 наносили на кривую в зависимости от времени, при этом полученный на основе трастузумаба ADC добавляли в день 14.

[29] На ФИГ. 21A-21E показано создание и исследование T-DM1-резистентных клеток, полученных in vivo. (A) клетки рака желудка N87 были изначально чувствительны к T-DM1 при имплантации in vivo. (B) с течением времени имплантированные клетки N87 стали устойчивыми к T-DM1, но остались чувствительными к (C) T-vc0101, (D) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 и (E) T(kK183+K290C)-vc0101.

[30] На ФИГ. 22A-22D показана цитотоксичность in vitro четырех полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов в отношении T-DM1-резистентных клеток (N87-TDM), полученных in vivo, по сравнению с исходными T-DM1-чувствительными клетками N87, объем опухоли представлен на кривой в зависимости от времени. (A) T-DM1; (B) T(kK183+K290C)-vc0101; (C) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (D) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101.

[31] На ФИГ. 23A-23B показаны уровни экспрессии белка HER2 на T-DM1-резистентных клетках (N87-TDM1, у мышей 2, 17 и 18), полученных in vivo, по сравнению с исходными T-DM1-чувствительными клетками N87. (A) FACS анализ и (B) Вестерн-блот анализ. В экспрессии белка HER2 не наблюдали никакого значимого различия.

[32] На ФИГ. 24A-24D показано, что устойчивость к T-DM1 в N87-TDM1 (мыши 2, 7 и 17) не обусловлена обеспечивающими лекарственную устойчивость эффлюксными насосами. (A) Вестерн-блот, на котором показана экспрессия белка MDR1. Цитотоксичность in vitro T-DM1-резистентных клеток (N87-TDM1) и исходных T-DM1-чувствительных клеток N87 в присутствии свободного лекарственного средства (B) 0101; (C) доксорубицина; (D) T-DM1.

[33] На ФИГ. 25A-25B показаны профили зависимости концентрации от времени и фармакокинетика/токсикокинетика: (A) суммарного Ат и ADC на основе трастузумаба (T-vc0101) или сайт-специфического ADC T(kK183C+K290C) после введения дозы яванским макакам и (B) ADC аналита трастузумаба (T-vc0101) или различных сайт-специфических ADC после введения дозы яванским макакам.

[34] На ФИГ. 26 показаны относительные значения времени удерживания хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) в зависимости от экспозиции (AUC) у крыс. На оси X представлено Относительное время удерживания в HIC; тогда как на оси Y представлена фармакокинетическая нормализованная по дозе экспозиция у крыс ("площадь под кривой", AUC для антитела, от 0 до 336 часов, деленная на дозу лекарственного средства 10 мг/кг). Форма символа обозначает приблизительную нагрузку лекарственного средства (DAR): ромб=DAR 2; круг=DAR 4. Стрелка обозначает T(kK183C+K290C)-vc0101.

[35] На ФИГ. 27 показано токсикологическое исследование с использованием обычного ADC конъюгата T-vc0101 и сайт-специфического ADC T(kK183C+K290C)-vc0101. T-vc0101 вызывал тяжелую нейтропению в дозе 5 мг/кг, тогда как T(kK183C+K290C)-vc0101 вызывал минимальное снижение количества нейтрофилов в дозе 9 мг/кг.

[36] На ФИГ. 28A-28C показана кристаллическая структура (A) T(K290C+K334C)-vc0101; (B) T(K290C+K392C)-vc0101; и (C) T(K334C+K392C)-vc0101. Как показано на ФИГ. 28C, с учетом геометрии полезной нагрузки, конъюгирование на любом из сайтов K290, K334, K392 может потенциально нарушать общую траекторию гликана с его удалением от поверхности CH2, вызывая дестабилизацию гликана и структуры самого CH2, и, как следствие, Ch2-Ch2 интерфейса.

[37] ФИГ. 29 представляет собой кривые роста опухоли (N87) при введении доз 3 мг/кг различных vc0101 сайт-мутантные ADC конъюгаты.

[38] На ФИГ. 30 показаны необработанные кривые SEC, иллюстрирующие поведение различных сайт-мутантов при конъюгировании с LP#2.

[39] На ФИГ. 31 показана стабильность ADC конъюгатов Примера 22 в плазме. Тяжелую цепь или легкую цепь, содержащие ацетилированный продукт (массовый сдвиг=993), подсчитывали, как "нагруженные", тогда как цепи, содержащие деацетилированный продукт (массовый сдвиг=951), подсчитывали, как "ненагруженные", для вычислений DAR.

[40] На ФИГ. 32 показана стабильность in vivo ADC конъюгатов Примера 22, измеряемая по DAR.

[41] На ФИГ. 33 показан анализ экспрессии EDB+ FN с помощью Вестерн-блоттинга в клетках WI38-VA13 и HT-29.

[42] На ФИГ. 34A-34F показана противоопухолевая эффективность в PDX-NSX-11122, полученной от пациента (PDX) ксенотрансплантатной модели НМРЛ человеческого рака с высокой экспрессией EDB+ FN, (A) EDB-L19-vc-0101 в дозе 0,3, 0,75, 1,5 и 3 мг/кг; (B) EDB-L19-vc-0101 в дозе 3 мг/кг и 10 мг/кг связанного дисульфидной связью EDB-L19-diS-DM1; (C) EDB-L19-vc-0101 в дозе 1 и 3 мг/кг и 5 мг/кг связанного дисульфидной связью EDB-L19-diS-C₂OCO-1569; (D) сайт-специфически конъюгированный EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 и стандартно конъюгированный EDB-L19-vc-0101 (ADC1) в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг и 1,5 мг/кг, соответственно; (E) сайт-специфически конъюгированный EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг; и (F) группа EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101, в которой вводили дозу 3 мг/кг, в качестве кривых ингибирования роста опухоли для каждой отдельной мыши-опухоленосителя.

[43] На ФИГ. 35A-35F показана противоопухолевая эффективность в H-1975, ксенотрансплантатной модели на клеточной линии (CLX) НМРЛ человеческого рака со средней или высокой экспрессией EDB+ FN, (A) EDB-L19-vc-0101 в дозе 0,3, 0,75, 1,5 и 3 мг/мг; (B) EDB-L19-vc-0101 и EDB-L19-vc-1569 в дозе 0,3, 1 и 3 мг/кг; (C) EDB-L19-vc-0101 и EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI в дозе 0,5, 1,5 и 3 мг/кг и 0,1, 0,3 и 1 мг/кг, соответственно; (D) сайт-специфически конъюгированный EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 и стандартно конъюгированный EDB-L19-vc-0101 в дозе 0,5, 1,5 и 3 мг/кг; (E) EDB-L19-vc-0101 и EDB-(K94R)-vc-0101 в дозе 1 и 3 мг/кг; и (F) EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 и EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 в дозе 1 и 3 мг/кг.

[44] На ФИГ. 36 показана противоопухолевая эффективность в HT29, CLX модели человеческого рака толстой кишки со средней экспрессией EDB+ FN, EDB-L19-vc-0101 и EDB L19 vc 9411 на уровне 3 мг/кг.

[45] На ФИГ. 37A-37B показана противоопухолевая эффективность EDB-L19-vc-0101 в дозе 0,3, 1 и 3 мг/кг в (A) PDX-PAX-13565, PDX поджелудочной железы со средней или высокой экспрессией EDB+FN; и (B) PDX-PAX-12534, PDX поджелудочной железы с низкой или средней экспрессией EDB+FN.

[46] На ФИГ. 38 показана противоопухолевая эффективность EDB-L19-vc-0101 в дозе 1 и 3 мг/кг в Ramos, CLX модели человеческой лимфомы со средней экспрессией EDB+ FN.

[47] На ФИГ. 39A-39B показана противоопухолевая эффективность в EMT-6, мышиной сингенной модели карциномы молочной железы, (A) EDB-mut1κK183C-K290C)-vc-0101 в дозе 4,5 мг/кг; и (B) группа EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101, в которой вводили дозу 4,5 мг/кг, в качестве кривых ингибирования роста опухоли для каждой отдельной мыши-опухоленосителя.

[48] На ФИГ. 40 показаны абсолютные количества нейтрофилов для стандартно конъюгированого EDB-L19-vc-0101 в дозе 5 мг/кг по сравнению с сайт-специфически конъюгированым EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) в дозе 6 мг/кг.

[49] На ФИГ. 41 показано конкурентное связывание антитела X и cys-мутанта X(kK183C+K290C) с антигеном-мишенью. X и X(kK183C+K290C) тестировали в конкурентном ELISA, в котором антиген-мишень иммобилизировали на планшете, а антитело X и cys-мутант X(kK183C+K290C) наносили в серийных разведениях в присутствии биотинилированного исходного антитела в постоянной концентрации. Количество биотинилированного исходного антитела, которое оставалось связанным с антигеном-мишенью на планшете ELISA, определяли при нанесении стрептавидина, конъюгированого с пероксидазой хрена (см. методы).

[50] На ФИГ. 42 показаны кривые роста ксенотрансплантатных человеческих опухолей НМРЛ Calu-6 у самок бестимусных мышей, обработанных ADC конъюгатами или растворителем. Средние объемы опухоли (мм³, среднее±SEM) отдельных мышей в каждой контрольной группе наносили на кривую в зависимости от дней после введения начальной дозы.

Подробное описание изобретения

[51] Изобретение относится к полипептидам, антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые включают замененный цистеин для сайт-специфического конъюгирования. В частности, было обнаружено, что положение 290 в константной области тяжелой цепи антитела (согласно нумерации EU индекса Кэбата) может применяться для сайт-специфического конъюгирования с целью получения конъюгатов антитела-лекарственного средства (ADC конъюгатов) с антителами к различным мишеням (в том числе, без ограничения, HER2). Данные, представленные в настоящем документе, демонстрируют, что конструкции ADC, конъюгированные на положения 290, показывают превосходящие свойства in vivo по сравнению с другими сайтами конъюгирования.

[52] Например, как показано в Примерах, конъюгирование на различных сайтах конъюгирования может приводить к различным свойствам ADC, таким как биофизическое свойство (например, гидрофобность), биологическая стабильность, возможность конъюгирования и эффективность ADC (например, кинетика высвобождения полезной нагрузки и метаболизм ADC).

[53] Гидрофобные линкеры-полезные нагрузки, такие как vc-101, используемый в Примерах, создают особые сложности для ADC конъюгатов. Сообщали, что скорость плазматического клиренса увеличивается при увеличении гидрофобности линкера-полезной нагрузки, что приводит к сниженной эффективности in vivo. Таким образом, предположили, что снижение общей гидрофобности может улучшить ФК in vivo (Lyon et al, Nature Biotechnology 33, 733-735 (2015)). Однако авторы изобретения в серии экспериментов наблюдали, что уменьшенная гидрофобность не всегда коррелирует с улучшенной ФК. Фактически, во многих случаях, гидрофобность не является надежным показателем благоприятного ФК профиля. Кроме того, ФК профили сайт-специфических конъюгатов на основе Cys отличаются от трансглутаминазных конъюгатов. Таким образом, новые схемы и критерии необходимы для оценки требуемых сайтов конъюгирования.

[54] Структурные исследования, проведенные авторами изобретения, дали некоторое первоначальное представление о выборе требуемых сайтов конъюгирования. Например, конъюгирование ADC на определенном сайте может изменять структуру Fc-домена или может влиять на гликозилирование антитела из-за геометрии полезной нагрузки на этом сайте. Кроме того, некоторые сайты могут обеспечить надлежащий баланс поверхностного экспонирования: они достаточно доступны, чтобы обеспечивать конъюгирование лекарственного средства, но не настолько поверхностные, что лекарственное средство метаболизируется in vivo и слишком быстро выводится из плазмы. На основе структурных исследований идентифицировали ряд кандидатных сайтов в качестве потенциальных сайтов конъюгирования (например, 290, 392 тяжелой цепи, 183 легкой цепи).

[55] После структурных исследований разрабатывали и проводили дополнительные анализы. В частности, среди нескольких сайтов конъюгирования, которые были исследованы авторами изобретения, положение 290 первоначально не показало превосходящих свойств по сравнению с другими сайтами конъюгирования. Например, фармакокинетические (ФК) данные in vivo, полученные на основе мышиной модели, не указывали, что положение 290 является особенно предпочтительным. Однако данные ФК in vivo, полученные на яванских макаках, неожиданно показали, что молекулы ADC, конъюгированые в положении 290, обладают превосходящим ФК профилем, что делает данный сайт конъюгирования более предпочтительным для клинического применения. Преимущества сайта 290 вероятно не удалось предсказать из-за гидрофобности линкера-полезной нагрузки.

[56] Другие сайты конъюгирования, которые также обеспечивали превосходный ФК профиль in vivo, включают 392 (тяжелой цепи) и 183 (легкой цепи).

[57] В дополнение к благоприятной ФК in vivo, Cys-290 конъюгаты также показали очень низкие уровни высокомолекулярной (HMW) агрегации и благоприятную антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). В частности, сообщали, что событие конъюгирования часто приводит к потере функции ADCC. Например, антитело к CD70, иммуноглобулиновый компонент SGN-70A ADC, демонстрировал функции ADCC, антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Тем не менее, у анти-CD70-MMAF конъюгатов отсутствует связывание FcγR (Kim et al, Biomol Ther (Seoul). 2015 Nov; 23(6): 493-509). В отличие от этого, в Cys-290 ADC конъюгатах, раскрытых в настоящей заявке, ADCC функция не была нарушена.

[58] Кроме того, данные гематологических и микроскопических исследований, представленные в настоящей заявке, показывают, что сайт-специфическое конъюгирование с применением Cys-290 также уменьшало ADC (например, Ab-vc0101) индуцированную токсичность (такую как нейтропения и миелотоксичность), по сравнению с обычными конъюгатами.

[59] Наконец, примеры, представленные в настоящей заявке, также показали, что, в зависимости от определенных применений молекул ADC, различные кандидатные сайты конъюгирования могут применяться для решения определенных проблем. Например, некоторые сайты обеспечивают лучший метаболизм полезной нагрузки, некоторые сайты уменьшают общую гидрофобность молекулы, и некоторые места обеспечивают ускоренное или замедленное расщепление линкера. Такие предпочтительные сайты конъюгирования могут применяться для оптимизации молекул ADC. См. Примеры 21 и 22.

1. КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА-ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА (ADC КОНЪЮГАТЫ)

[60] ADC конъюгаты включают иммуноглобулиновый компонент, конъюгированый с лекарственной полезной нагрузкой, как правило с помощью линкера. Стандартные стратегии конъюгирования ADC конъюгатов основаны на случайном конъюгировании лекарственной полезной нагрузки с антителом через лизины или цистеины, которые эндогенно присутствуют в тяжелой и/или легкой цепи антитела. Соответственно, такие ADC конъюгаты представляют собой гетерогенную смесь молекул, демонстрирующих различные отношения лекарственного средства:антитела (DAR). В отличие от этого, ADC конъюгаты, раскрытые в настоящей заявке, являются сайт-специфическими ADC конъюгатами, в которых лекарственная полезная нагрузка конъюгирована с антителом по определенным модифицированным остаткам на тяжелой и/или легкой цепи антитела. Фактически, сайт-специфические ADC конъюгаты являются гомогенной популяцией ADC конъюгатов, состоящих из молекул с определенным отношением лекарственного средства:антитела (DAR). Таким образом, сайт-специфические ADC конъюгаты демонстрируют однородную стехиометрию, что приводит к улучшенному профилю фармакокинетики, биораспределения и безопасности конъюгата. ADC конъюгаты согласно изобретению включают антитела и полипептиды изобретения, конъюгированные с линкерами и/или полезными нагрузками.

[61] В настоящем изобретении предложены конъюгаты антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), где: (a) Ab является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с антигеном, и (b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, и D является лекарственным средством.

[62] Также настоящее изобретение охватывает конъюгаты антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D)_p, где: (a) Ab является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с HER2, (b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, и D является лекарственным средством, и (c) p является количеством молекул линкера/лекарственного средства, присоединенных к антителу. В случае сайт-специфических ADC конъюгатов, p является целым числом вследствие гомогенной природы ADC. В некоторых вариантах осуществления p равно 4. В других вариантах осуществления p равно 3. В других вариантах осуществления p равно 2. В других вариантах осуществления p равно 1. В других вариантах осуществления p больше 4.

A. Антитела и сайты конъюгирования

[63] Полипептиды и антитела согласно изобретению конъюгированы с полезной нагрузкой сайт-специфическим способом. Для применения такого типа конъюгирования константный домен модифицируют с предоставлением какого-либо реакционноспособного остатка цистеина, введенного с помощью методов генной инженерии в один или более определенных сайтов (иногда называемых "Cys" мутантами). Также раскрыты антитела, которые могут применяться для конъюгирования на основе трансглутаминазы, в котором ацил-донорная глутамин-содержащая метка или эндогенный глутамин сделаны реакционноспособными в результате инженерии полипептида в присутствии трансглутаминазы и амина.

[64] Как правило, области тяжелой или легкой цепи антитела определяют как "константную" (C) область или "вариабельные" (V) области на основе относительного отсутствия вариации последовательности в областях различных представителей класса. Константная область антитела может относиться к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как связывание Fc-рецептора (FcR), участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности (ADCC), опсонизации, инициировании комплементзависимой цитотоксичности и дегрануляции тучных клеток.

[65] Константные и вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела уложены в домены. Константную область на легкой цепи иммуноглобулина обычно называют "домен CL". Константные домены на тяжелой цепи (например, шарнирная область, CH1, CH2 или CH3 домены) называют "CH доменами". Константные области полипептида или антитела (или его фрагмента) согласно изобретению могут быть получены из константных областей любого из IgA, IgD, IgE, IgG, IgM или их любых изотипов, а также субклассов и мутантных вариантов.

[66] Домен CH1 включает первый (большую часть N-концевой области) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который начинается, например, примерно от положений 118-215 согласно нумерации EU индекса Кэбата. Домен CH1 примыкает к домену VH и расположен ближе к N-концу от шарнирной области молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина, и не является частью Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина.

[67] Шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, которая соединяет CH1 домен с CH2 доменом. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 остатков и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо. Шарнирные области можно разделить на три различных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены.

[68] CH2 домен включает часть тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, которая начинается, например, примерно от положений 231-340 согласно нумерации EU индекса Кэбата. CH2 домен уникален тем, что он не спарен непосредственно с другим доменом. Напротив, две N-связанных разветвленных углеводных цепи расположены между двумя CH2 доменами интактной нативной молекулы IgG. В некоторых вариантах осуществления полипептид или антитело (или его фрагмент) согласно изобретению включает CH2 домен, полученный из молекулы IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления IgG является человеческим IgG.

[69] CH₃ домен включает часть тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, которая расположена на протяжении приблизительно 110 остатков от N-конца CH2 домена, например, примерно от положений 341-447 согласно нумерации EU индекса Кэбата. CH₃ домен, как правило, формирует C-концевую часть антитела. Впрочем, в некоторых иммуноглобулинах дополнительные домены могут располагаться после CH₃ домена, формируя C-концевую часть молекулы (например, CH4 домен в μ-цепи IgM и ε-цепи IgE). В некоторых вариантах осуществления полипептид или антитело (или его фрагмент) согласно изобретению включают CH₃ домен, полученный из молекулы IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления IgG является человеческим IgG.

[70] CL домен включает домен константной области легкой цепи иммуноглобулина, который начинается, например, примерно от положений 108-214 согласно нумерации EU индекса Кэбата. CL домен примыкает к VL домену. В некоторых вариантах осуществления полипептид или антитело (или его фрагмент) согласно изобретению включает константный домен каппа легкой цепи (CLκ). В некоторых вариантах осуществления полипептид или антитело (или его фрагмент) согласно изобретению включает константный домен лямбда легкой цепи (CLλ). CLκ содержит известные полиморфные локусы CLκ-V/A45 и CLκ-L/V83 (при использовании нумерации Кэбата), обеспечивая, таким образом, полиморфизмы Km(1): CLκ-V45/L83; Km(1,2): CLκ-A45/L83; и Km(3): CLκ-A45/V83. Полипептиды, антитела и ADC конъюгаты согласно изобретению могут иметь иммуноглобулиновые компоненты с любой из указанных константных областей легкой цепи.

[71] Fc-область обычно включает CH2 домен и CH3 домен. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут изменяться, обычно определяют, что Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG начинается от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 (согласно нумерации EU индекса Кэбата), до C-конца. Fc-область согласно изобретению может быть нативной последовательностью Fc-области или вариантом Fc-области.

[72] В одном аспекте изобретения предложен полипептид, включающий константный домен тяжелой цепи антитела, который включает замененный остаток цистеина в положении 290, согласно нумерации EU индекса Кэбата. Как раскрыто и представлено в качестве примера в настоящей заявке, конъюгирование в положении 290 обеспечивает неожиданно предпочтительные ФК профили in vivo.

[73] Может быть введена дополнительная цистеиновая замена, например, в положения 118, 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, 444 или их любую комбинацию, согласно нумерации EU индекса Кэбата. В частности, могут использоваться положения 118, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 или их любая комбинация. Остаток 118 также указан в примерах как A114, A114C, C114 или 114C, потому что в первоначальной публикации данного сайта использовали нумерацию Кэбата (114) вместо EU индекса (118), и после этого в уровне техники его обычно указывают как сайт 114.

[74] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 183 согласно нумерации EU индекса Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 76 в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63.

[75] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 или их любой комбинации согласно нумерации Кэбата; (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 42, 81, 100, 103 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63 (каппа легкая цепь); или (iii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 64, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 64 (лямбда легкая цепь).

[76] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область каппа легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 111, 149, 188, 207, 210 или их любой комбинации (предпочтительно 111 или 210) согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 42, 81, 100, 103 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 63 (предпочтительно остатку 4 или 103), при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63.

[77] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область лямбда легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 или их любой комбинации (предпочтительно 110, 111, 125, 149 или 155) согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 64 (предпочтительно остатку 4, 5, 19, 43 или 49), при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 64.

[78] Модификации аминокислот могут быть выполнены с помощью любого способа, известного в данной области, и многие такие способы известны и являются стандартными для специалиста. Например, но не в качестве ограничения, аминокислотные замены, делеции и вставки могут быть выполнены при использовании любой известной методики на основе ПЦР. Аминокислотные замены могут быть выполнены с помощью сайт-направленного мутагенеза (см., например, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; и Kunkel, 1985, PNAS 82:488).

[79] В таких применениях, в которых требуется сохранение связывания антигена, подобные модификации следует вводить в участки, которые не нарушают антигенсвязывающей способности антитела. В предпочтительных вариантах осуществления одна или более модификаций сделаны в константной области тяжелой и/или легкой цепей.

[80] Как правило, K_D для антитела в отношении мишени будет в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз меньше, чем K_D в отношении другой, нецелевой молекулы, такой как, без ограничения, посторонний материал или сопровождающий материал в окружающей среде. Более предпочтительно K_D будет в 50 раз меньше, например, в 100 раз меньше или в 200 раз меньше; еще более предпочтительно в 500 раз меньше, например, в 1000 раз меньше или в 10000 раз меньше, чем K_D в отношении нецелевой молекулы.

[81] Значение этой константы диссоциации может быть определено непосредственно с помощью известных способов, и может быть вычислено даже для сложных смесей с помощью таких способов, как, например, способы, приведенные в Caceci et al., 1984, Byte 9: 340-362. Например, K_D может быть установлено при помощи анализа связывания на нитроцеллюлозном фильтре с использованием двух мембран, такого как раскрыто в публикации Wong and Lohman, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432. Другие стандартные анализы для оценки связывающей способности лигандов, таких как антитела, в отношении мишеней известны в уровне техники, в том числе, например, ИФА анализы, Вестерн-блот анализы, РИА и проточный цитометрический анализ. Кинетика связывания и аффинность связывания антитела также могут быть оценены с помощью стандартных анализов, известных в уровне техники, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), например, при помощи системы BiaCore™.

[82] Может быть проведен анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом такой мишени, таким как другое антитело. Концентрация, при которой наблюдается 50-процентное ингибирование связывания, известна как K_i. При идеальных условиях K_i эквивалентна K_D. Значение K_i никогда не будет меньше K_D, поэтому измерение K_i можно заменить с получением верхней границы K_D.

[83] Антитело согласно изобретению может иметь K_D в отношении мишени не больше чем приблизительно 1×10^-3 M, например, не больше чем приблизительно 1×10^-3 M, не больше чем приблизительно 9×10^-4 M, не больше чем приблизительно 8×10^-4 M, не больше чем приблизительно 7×10^-4 M, не больше чем приблизительно 6×10^-4 M, не больше чем приблизительно 5×10^-4 M, не больше чем приблизительно 4×10^-4 M, не больше чем приблизительно 3×10^-4 M, не больше чем приблизительно 2×10^-4 M, не больше чем приблизительно 1×10^-4 M, не больше чем приблизительно 9×10^-5 M, не больше чем приблизительно 8×10^-5 M, не больше чем приблизительно 7×10^-5 M, не больше чем приблизительно 6×10^-5 M, не больше чем приблизительно 5×10^-5 M, не больше чем приблизительно 4×10^-5 M, не больше чем приблизительно 3×10^-5 M, не больше чем приблизительно 2×10^-5 M, не больше чем приблизительно 1×10^-5 M, не больше чем приблизительно 9×10^-6 M, не больше чем приблизительно 8×10^-6 M, не больше чем приблизительно 7×10^-6 M, не больше чем приблизительно 6×10^-6 M, не больше чем приблизительно 5×10^-6 M, не больше чем приблизительно 4×10^-6 M, не больше чем приблизительно 3×10^-6 M, не больше чем приблизительно 2×10^-6 M, не больше чем приблизительно 1×10^-6 M, не больше чем приблизительно 9×10^-7 M, не больше чем приблизительно 8×10^-7 M, не больше чем приблизительно 7×10^-7 M, не больше чем приблизительно 6×10^-7 M, не больше чем приблизительно 5×10^-7 M, не больше чем приблизительно 4×10^-7 M, не больше чем приблизительно 3×10^-7 M, не больше чем приблизительно 2×10^-7 M, не больше чем приблизительно 1×10^-7 M, не больше чем приблизительно 9×10^-8 M, не больше чем приблизительно 8×10^-8 M, не больше чем приблизительно 7×10^-8 M, не больше чем приблизительно 6×10^-8 M, не больше чем приблизительно 5×10^-8 M, не больше чем приблизительно 4×10^-8 M, не больше чем приблизительно 3×10^-8 M, не больше чем приблизительно 2×10^-8 M, не больше чем приблизительно 1×10^-8 M, не больше чем приблизительно 9×10^-9 M, не больше чем приблизительно 8×10^-9 M, не больше чем приблизительно 7×10^-9 M, не больше чем приблизительно 6×10^-9 M, не больше чем приблизительно 5×10^-9 M, не больше чем приблизительно 4×10^-9 M, не больше чем приблизительно 3×10^-9 M, не больше чем приблизительно 2×10^-9 M, не больше чем приблизительно 1×10^-9 M, от приблизительно 1×10^-3 М до приблизительно 1×10^-13 М, 1×10^-4 М до приблизительно 1×10^-13 М, 1×10^-5 М до приблизительно 1×10^-13 М, от приблизительно 1×10^-6 М до приблизительно 1×10^-13 М, от приблизительно 1×10^-7 М до приблизительно 1×10^-13 М, от приблизительно 1×10^-8 М до приблизительно 1×10^-13 М, от приблизительно 1×10^-9 М до приблизительно 1×10^-13 М, 1×10^-3 М до приблизительно 1×10^-12 М, 1×10^-4 М до приблизительно 1×10^-12 М, от приблизительно 1×10^-5 М до приблизительно 1×10^-12 М, от приблизительно 1×10^-6 М до приблизительно 1×10^-12 М, от приблизительно 1×10^-7 М до приблизительно 1×10^-12 М, от приблизительно 1×10^-8 М до приблизительно 1×10^-12 М, от приблизительно 1×10^-9 М до приблизительно 1×10^-12 М, 1×10^-3 М до приблизительно 1×10^-11 М, 1×10^-4 М до приблизительно 1×10^-11 М, от приблизительно 1×10^-5 М до приблизительно 1×10^-11 М, от приблизительно 1×10^-6 М до приблизительно 1×10^-11 М, от приблизительно 1×10^-7 М до приблизительно 1×10^-11 М, от приблизительно 1×10^-8 М до приблизительно 1×10^-11 М, от приблизительно 1×10^-9 М до приблизительно 1×10^-11 М, 1×10^-3 М до приблизительно 1×10^-10 М, 1×10^-4 М до приблизительно 1×10^-10 М, от приблизительно 1×10^-5 М до приблизительно 1×10^-10 М, от приблизительно 1×10^-6 М до приблизительно 1×10^-10 М, от приблизительно 1×10^-7 М до приблизительно 1×10^-10 М, от приблизительно 1×10^-8 М до приблизительно 1×10^-10 М или от приблизительно 1×10^-9 М до приблизительно 1×10^-10 М.

[84] [131] Хотя, в целом, предпочтительна K_D в наномолярном диапазоне, в некоторых вариантах осуществления антитела низкой аффинности могут быть предпочтительными, например, для направленного взаимодействия с экспрессируемыми на высоком уровне рецепторами в компартементах и исключения нецелевого связывания. Кроме того, в некоторых терапевтических применениях может быть выгодным антитело с более низкой аффинностью связывания для облегчения рециклинга антитела.

[85] Антитела согласно настоящему описанию должны сохранять антигенсвязывающую способность своих нативных аналогов. В одном варианте осуществления антитела согласно настоящему описанию демонстрируют по существу такую же аффинность по сравнению с антителом до замены Cys. В другом варианте осуществления антитела согласно настоящему описанию демонстрируют сниженную аффинность по сравнению с антителом до замены Cys. В другом варианте осуществления антитела согласно настоящему описанию демонстрируют повышенную аффинность по сравнению с антителом до замены Cys.

[86] В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему описанию может иметь константу диссоциации (K_D) приблизительно равную K_D антитела до замены Cys. В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему описанию может иметь константу диссоциации (K_D) приблизительно в 1 раз, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 100 раз, приблизительно в 150 раз, приблизительно в 200 раз, приблизительно в 250 раз, приблизительно в 300 раз, приблизительно в 400 раз, приблизительно в 500 раз, приблизительно в 600 раз, приблизительно в 700 раз, приблизительно в 800 раз, приблизительно в 900 раз или приблизительно в 1000 раз больше в отношении его когнатного антигена по сравнению с K_D антитела до замены Cys.

[87] В еще одном варианте осуществления антитело согласно настоящему описанию может иметь K_D приблизительно в 1 раз, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 100 раз, приблизительно в 150 раз, приблизительно в 200 раз, приблизительно в 250 раз, приблизительно в 300 раз, приблизительно в 400 раз, приблизительно в 500 раз, приблизительно в 600 раз, приблизительно в 700 раз, приблизительно в 800 раз, приблизительно в 900 раз или приблизительно в 1000 раз ниже в отношении его когнатного антигена по сравнению с K_D антитела до замены Cys.

[88] Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи антител, применяемых для получения ADC конъюгатов согласно изобретению, могут быть клонированы в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для последующего применения.

[89] В Таблице 1 представлены аминокислотные (белковые) последовательности гуманизированных антител к HER2, применяемых в конструировании сайт-специфических ADC конъюгатов согласно изобретению. Показанные CDR-области определены согласно схеме нумерации Кэбата.

[90] Тяжелые цепи и легкие цепи антител, показанные в Таблице 1, имеют вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) трастузумаба. Константная область тяжелой цепи и константная область легкой цепи получены на основе трастузумаба и содержат одну или более модификаций, позволяющих применение сайт-специфического конъюгирования при получении ADC конъюгатов согласно изобретению.

[91] Модификации в аминокислотных последовательностях в константной области антитела, позволяющие применять сайт-специфическое конъюгирование, подчеркнуты и выделены полужирным шрифтом. Обозначение антител, полученных на основе трастузумаба, включает T (от трастузумаба) и затем в круглых скобках положение аминокислотной модификации между однобуквенным кодом аминокислоты для остатка дикого типа и однобуквенным кодом аминокислоты для остатка, который теперь присутствует в данном положении в производном антителе. Двумя исключениями в данной номенклатуре являются "kK183C", которое обозначает, что положение 183 легкой (каппа) цепи было модифицировано с заменой лизина на цистеин, и "LCQ05", которое обозначает содержащую восемь аминокислотных остатков глутамина метку, которая была присоединена к C-концу константной области легкой цепи.

[92] Одна из модификаций, показанных в Таблице 1, не используется для конъюгирования. Остаток в положении 222 тяжелой цепи (при использовании EU индекса Кэбата) может быть изменен для получения более гомогенного конъюгата антитела и полезной нагрузки, лучшего межмолекулярного поперечного сшивания между антителом и полезной нагрузкой и/или значительного уменьшения межцепочечного поперечного сшивания.

Таблица 1: Последовательности гуманизированных антител к HER2

SEQ ID NO. Описание Последовательность 1 Белок VH трастузумаба EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 2 Белок VH CDR1 DTYIH 3 Белок VH CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG 4 Белок VH CDR3 WGGDGFYAMDY 5 Белок константной области тяжелой цепи трастузумаба ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 6 Белок тяжелой цепи трастузумаба EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 7 Белок VL трастузумаба DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 8 Белок VL CDR1 RASQDVNTAVA 9 Белок VL CRD2 SASFLYS 10 Белок VL CDR3 QQHYTTPPT 11 Белок константной области легкой цепи трастузумаба RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 12 Белок легкой цепи трастузумаба DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 13 Белок T(K222R) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 14 Белок T(K222R) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15 Белок T(K246C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPCPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16 Белок T(K246C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPCPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 17 Белок T(K290C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 18 Белок T(K290C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 19 Белок T(N297A) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 20 Белок T(N297A) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 21 Белок T(N297Q) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 22 Белок T(N297Q) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 23 Белок T(K334C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 24 Белок T(K334C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 25 Белок T(K392C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 26 Белок T(K392C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 27 Белок T(L443C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCSPG 28 Белок T(L443C)
тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCSPG 29 Белок T(K290C+K334C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 30 Белок T(K290C+K334C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 31 Белок T(K290C+K392C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 32 Белок T(K290C+K392C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 33 Белок T(N297A+K222R) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 34 Белок T(N297A+K222R) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 35 Белок T(N297Q+K222R)
константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 36 Белок T(N297Q+K222R) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 37 Белок T(K334C+K392C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 38 Белок T(K334C+K392C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 39 Белок T(K392C+L443C) константной области тяжелой цепи ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCSPG 40 Белок T(K392C+L443C) тяжелой цепи EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCSPG 41 Белок T(kK183C) константной области легкой цепи RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSCADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 42 Белок T(kK183C) легкой цепи DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSCADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 43 Белок T(LCQ05)
константной области легкой цепи RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGLLQGPP 44 Белок T(LCQ05) легкой цепи DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGLLQGPP

[93] Могут быть получены ADC конъюгаты с иммуноглобулиновым компонентом, направленным против любого антигена, с применением сайт-специфического конъюгирования через модифицированный цистеин в положении 290 (согласно EU индексу Кэбата), отдельно или в комбинации с другими положениями.

[94] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен (т.е. вариабельная область, содержащая все 6 CDR-областей, или эквивалентная область, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична вариабельной области антитела), группа, состоящая из следующего: абаговомаб, абатацепт (Оренсиа^®), абциксимаб (РеоПро^®, c7E3 Fab), адалимумаб (Хумира^®), адекатумумаб, алемтузумаб (Кэмпас^®, MabCampath или Campath-1H), алтумомаб, афелимомаб, анатумомаб мафенатокс, анетумумаб, анрукизумаб, аполизумаб, арцитумомаб, аселизумаб, атлизумаб, аторолимумаб, бапинейзумаб, базиликсимаб (Симулект^®), бавитуксимаб, бектумомаб (LYMPHOSCAN^®), белимумаб (LYMPHO-STAT-B^®), бертилимумаб, безилесомаб, βцепт (Энбрел^®), бевацизумаб (Авастин^®), бициромаб браллобарбитал, биватузумаб мертанзин, брентуксимаб ведотин (Адцетрис^®), канакинумаб (ACZ885), кантузумаб мертанзин, капромаб (PROSTASCINT^®), катумаксомаб (Ремоваб^®), цеделизумаб (Симзия^®), цертолизумаба пегол, цетуксимаб (Эрбитукс^®), кленоликсимаб, дацетузумаб, дакликсимаб, даклизумаб (Зенапакс^®), деносумаб (AMG 162), детумомаб, дорлимомаб аритокс, дорликсизумаб, дунтумумаб, дуримулумаб, дурмулумаб, экромексимаб, экулизумаб (Солирис^®), эдобакомаб, эдреколомаб (Mabl7-1A, PANOREX^®), эфализумаб (Раптива^®), эфунгумаб (MYCOGRAB^®), элзилимомаб, энлимомаба пегол, эпитумомаб цитуксетан, эфализумаб, эпитумомаб, эпратузумаб, эрлизумаб, эртумаксомаб (REXOMUN^®), этарацизумаб (этаратузумаб, VITAXIN^®, ABEGRIN™), эксбивирумаб, фанолесомаб (NEUTROSPEC^®), фаралимомаб, фелвизумаб, фонтолизумаб (HUZAF^®), галиксимаб, гантенерумаб, гавилимомаб (ABX-CBL(R)), гемтузумаб озогамицин (Милотарг^®), голимумаб (CNTO 148), гомиликсимаб, ибализумаб (TNX-355), ибритумомаб тиуксетан (ZEVALIN^®), иговомаб, имциромаб, инфликсимаб (Ремикейд^®), инолимомаб, инотузумаб озогамицин, ипилимумаб (Ервой^®, MDX-010), иратумумаб, келиксимаб, лабетузумаб, лемалесомаб, лебрилизумаб, лерделимумаб, лексатумумаб (HGS-ETR2, ETR2-ST01), лекситумумаб, либивирумаб, линтузумаб, лукатумумаб, лумиликсимаб, мапатумумаб (HGS-ETR1, TRM-I), маслимомаб, матузумаб (EMD72000), меполизумаб (BOSATRIA^®), метелимумаб, милатузумаб, минретумомаб, митумомаб, моролимумаб, мотавизумаб (NUMAX)™, муромонаб (OKT3), наколомаб тафенатокс, наптумомаб эстафенатокс, натализумаб (Тизабри^®, ANTEGREN^®), небакумаб, нерелимомаб, нимотузумаб (THERACIM hR3^®, THERA-CIM-hR3^®, THERALOC^®), нофетумомаб мерпентан (VERLUMA^®), окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, омализумаб (Ксолар^®), ореговомаб (OVAREX^®), отеликсизумаб, пагибаксимаб, паливизумаб (Синагис^®), панитумумаб (ABX-EGF, Вектибикс^®), пасколизумаб, пемтумомаб (THERAGYN^®), пертузумаб (2C4, OMNITARG^®), пекселизумаб, пинтумомаб, понезумаб, приликсимаб, притумумаб, ранибизумаб (Луцентис^®), раксибакумаб, регавирумаб, реслизумаб, ритуксимаб (RITUXAN^®, Мабтера^®), ровелизумаб, руплизумаб, сатумомаб, севирумаб, сибротузумаб, сиплизумаб (MEDI-507), сонтузумаб, стамулумаб (Myo-029), сулесомаб (LEUKOSCAN^®), такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, таплитумомаб паптокс, тефибазумаб (AUREXIS^®), телимомаб аритокс, тенеликсимаб, теплизумаб, тицилимумаб, тоцилизумаб (Актемра^®), торализумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тремелимумаб (CP-675,206), тукотузумаб целмолейкин, тувирумаб, уртоксазумаб, устекинумаб (CNTO 1275), вапаликсимаб, велтузумаб, вепалимомаб, визилизумаб (NUVION^®), волоциксимаб (M200), вотумумаб (HUMASPECT^®), залутумумаб, занолимумаб (HuMAX-CD4), зиралимумаб или золимомаб аритокс.

[95] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен включает вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, содержащий шесть CDR-областей, и/или конкурирует за связывание с антителом, выбранным из предыдущего списка. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, как и антитела в предыдущем списке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен включает вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, содержащий шесть полных CDR-областей, и связывается с тем же антигеном, как и антитела в предыдущем списке.

[96] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен включает вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, содержащий шесть (6) полных CDR-областей, и специфично связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: PDGFRα, PDGFRβ, PDGF, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, FGF, FGF2, HGF, KDR, FLT-1, FLK-1, Ang-2, Ang-1, PLGF, CEA, CXCL13, BAFF, IL-21, CCL21, TNF-α, CXCL12, SDF-I, bFGF, MAC-I, IL23p19, FPR, IGFBP4, CXCR3, TLR4, CXCR2, EphA2, EphA4, эфринВ2, EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2 или pl85neu), HER3 (ErbB3), HER4 (ErbB4 или tyro2), SC1, LRP5, LRP6, RAGE, s100A8, s100A9, Navl.7, GLP1, RSV, RSV F белок, белок HA вируса гриппа, белок NA вируса гриппа, HMGB1, CD16, CD19, CD20, CD21, CD28, CD32, CD32b, CD64, CD79, CD22, ICAM-I, FGFRl, FGFR2, HDGF, EphB4, GITR, β-амилоид, hMPV, PIV-I, PIV-2, OX40L, IGFBP3, cMet, PD-I, PLGF, неприлизин, CTD, IL- 18, IL-6, CXCL-13, IL-IR1, IL-15, IL-4R, IgE, PAI-I, NGF, EphA2, uPARt, DLL-4, αvβ5, αvβ6, α5β1, α3β1, рецептор интерферона I типа и II типа, CD 19, ICOS, IL-17, фактор II, Hsp90, IGF, IGF-I, IGF-II, CD-19, GM-CSFR, PIV-3, CMV, IL-13, IL-9 и EBV.

[97] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфично связывается с членом (рецептором или лигандом) суперсемейства ФНО. Член суперсемейства ФНО может быть выбран из группы, включающей, без ограничения перечисленным, фактор некроза опухоли α ("ФНО-α"), фактор некроза опухоли-β ("ФНО-β"), лимфотоксин-α ("LT-α"), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд 4-1 BB, лиганд Apo-1 (также называемый Fas-лигандом или лигандом CD95), лиганд Apo-2 (также называемый TRAIL), лиганд Apo-3 (также называемый TWEAK), остеопротегерин (OPG), APRIL, лиганд RANK (также называемый TRANCE), TALL-I (также называемый BLyS, BAFF или THANK), DR4, DR5 (также известный как Apo-2, TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER), DR6, DcR1, DcR2, DcR3 (также известный как TR6 или M68), CAR1, HVEM (также известный как ATAR или TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-I, TNFL1, CD30, LTBr, 4-1BB рецептор и TR9.

[98] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен способен связывать одну или более мишеней, выбранных из группы, включающей, без ограничения перечисленным, 5T4, ABL, ABCB5, ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, AD0RA2A, аггрекан, AGR2, AICDA, AIFI, AIGl, AKAPl, AKAP2, AMH, AMHR2, ангиогенин (ANG), ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, аннексин A2, ANPEP, APC, APOC1, AR, ароматазу, ATX, AX1, AZGP1 (цинк-a-гликопротеин), B7.1, B7.2, B7-H1, BAD, BAFF, BAG1, BAIl, BCR, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDR15), BLyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP11, BMP12, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAGl (плектин), BRCAl, C19orf10 (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CANT1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCLl (1-309), CCLI 1 (эотаксин), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (TECK), CCL26(эотаксин-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNAl, CCNA2, CCNDl, CCNEl, CCNE2, CCRl (CKRl/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA),CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1),CCR8 (CMKBR8/TERl/CKR-Ll), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR),CD164, CD19, CDlC, CD20, CD200, CD-22, CD24, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G,CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD46, CD52, CD69, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD105, CD137, CDHl (E-кадгерин), CDCP1CDH10, CDH12, CDH13, CDH18,CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kipl), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, хитиназу, CHST10, CKLFSF2,CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN7 (клаудин-7), CLN3, CLU (кластерин), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, COL1 8A1, COL1A1.COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (М-КСФ), CSF2 (ГМ-КСФ), CSF3 (Г-КСФ), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-катенин), CTSB (катепсин B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCLl (GRO1), CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL 14, CXCL 16, CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, Cyr61, CYSLTR1, c-Met, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DNCL1, DPP4, E2F1, ECGF15EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, ELAC2, ENG, эндоглин, ENO1, EN02, EN03, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRIN-A3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN-B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8, эстрогеновый рецептор, ESR1, ESR2, F3 (TF), FADD, фарнезилтрансферазу, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21 (такой как mimAb1), FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR3, FIGF (VEGFD), FIL1 (эпсилон), FBL1 (зета), FLJ12584, FLJ25530, FLRTl (фибронектин), FLT1, FLT-3, FOS, FOSL1 (FRA-I), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GDF8, GFI1, GGT1, ГМ-КСФ, GNAS1, GNRH1, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC10 (C10), gremlin, GRP, GSN (гельзолин), GSTP1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HGF, HIF1A, HIP1, гистамин и гистаминовые рецепторы, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFN гамма, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-I, IL10, IL10RA, IL10RB, IL-1, IL1R1 (CD121a), IL1R2 (CD121b), IL-1RA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB (CD122), IL2RG (CD132), IL-4, IL-4R (CD123), IL-5, IL5RA (CD125), IL3RB (CD131), IL-6, IL6RA (CD126), IR6RB (CD130), IL-7, IL7RA (CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2 (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R (CD129), IL-10, IL10RA (CD210), IL10RB (CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, 1L16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, DL1F9, IL1HY1, IL1R1, IL1R2, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RL1, IL1RL2, IL1RN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23,DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, IL4R, IL6ST (гликопротеин 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAKI, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (α 6 интегрин), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (β 4 интегрин), JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KIM-1, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (кератин 19), KRT2A, KRTHB6 (специфический кератин волос II типа), LAMA5, LEP (лептин), Lingo-p75, Lingo-Troy, LPS, LRP5, LRP6, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG или Omgp, MAP2K7 (c-Jun), MCP-I, MDK, MIBl, мидкин, MIF, MISRII, MJP-2,MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (металлотионеин-III), mTOR, MTSS1, MUC1 (муцин), MYC, MYD88, NCK2, neurocan, нейрегулин-1, нейропилин-1, NFKB1, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NME1 (NM23A), NOTCH, NOTCH1, N0X5, NPPB, NROBl, NR0B2, NRlDl, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRPl, NRP2, NT5E, NTN4, OCT-1, ODZ1, OPN1, OPN2, OPRDl, P2RX7, PAP, PARTl, PATE, PAWR, PCA3, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl, ПЭГ-аспарагиназу, PF4 (CXCL4), плексин B2 (PLXNB2), PGF, PGR, фосфакан, PIAS2, PI3 киназу, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG5PLXDCl, PKC, PKC-β, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, pro-NGF, просапозин, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, RAC2 (P21Rac2), RANK, RANK лиганд, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI10 (ZNF144), Ron, R0B02, RXR, селектин, S100A2, S100A8, S100A9, SCGB 1D2 (липофилин B), SCGB2A1 (маммаглобин 2), SCGB2A2 (маммаглобин 1), SCYE1 (эндотелиальный моноцит-активирующий цитокин), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINB5 (маспин), SERPINE1 (PAI-1), SERPINF1, SHIP-I, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPPl, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, STABl, STAT6, STEAP, STEAP2, SULF-1, Sulf-2, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB111, TGFB2, TGFB3, TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1 (тромбоспондин-1), THBS2/THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, тканевой фактор, TIKI2, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6JLR7, TLR8, TLR9, TM4SF1, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF 18, TNFSF4 (OX40 лиганд), TNFSF5 (CD40 лиганд), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 лиганд), TNFSF8 (CD30 лиганд), TNFSF9 (4-1BB лиганд), TOLLIP, Толл-подобные рецепторы, TLR2, TLR4, TLR9, TOP2A (топоизомеразу IIa), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TRPC6, TROY, TSLP, TWEAK, тирозиназу, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, версикан, VHL C5, VLA-4, Wnt-1, XCL1 (лимфотактин), XCL2 (SCM-Ib), XCRl (GPR5/CCXCR1), YY1 и ZFPM2.

[99] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с экстрадоменом B (EDB) фибронектина (FN). FN-EDB представляет собой малый домен из 91 аминокислоты, который может быть встроен в молекулы фибронектина по механизму альтернативного сплайсинга. Аминокислотная последовательность FN-EDB на 100% консервативна у человека, яванского макака, крысы и мыши. FN-EDB повышенно экспрессируется в процессе эмбрионального развития и широко экспрессируется в различных раковых опухолях человека, но практически не поддается обнаружению в нормальных тканях взрослых за исключением тканей женских репродуктивных органов.

[100] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке, включают следующие CDR-последовательности тяжелой цепи: (i) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 66 или 67, CDR-H2, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 68 или 69, и CDR-H3, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 70; и/или (ii) следующие CDR-последовательности легкой цепи: определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 73, CDR-L2, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 74, и CDR-L3, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 75.

[101] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке, включают: (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 65, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи (VL), включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 72. Любая комбинация этих VL и VH последовательностей также включена в объем изобретения.

[102] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке, включают Fc-домен. Fc-домен может быть получен из IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgG, IgE или IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄).

[103] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке, включают: (i) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 71 или 77, и/или (ii) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 76 или 78. Любая комбинация таких последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи также включена в объем изобретения.

[104] Также в изобретении предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с EDB с любым антителом против EDB или его антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящей заявке, таким как любое из антител, перечисленных в Таблице 33, или их антигенсвязывающих фрагментов.

[105] В изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный полипептид, описанный в настоящей заявке. В изобретении также предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, включающее сконструированный полипептид, описанный в настоящей заявке.

[106] В изобретении также предложена клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированный полипептид, описанный в настоящей заявке. В изобретении также предложена клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, включающее сконструированный полипептид, описанный в настоящей заявке.

[107] В изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, любого из антител к HER2, раскрытых в настоящей заявке, и клетка-хозяин, включающая такую нуклеиновую кислоту.

[108] В изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, любого из антител против EDB, раскрытых в настоящей заявке, и клетка-хозяин, включающая такую нуклеиновую кислоту.

[109] В изобретении предложен способ получения сконструированного полипептида, описанного в настоящей заявке, или антитела или его антигенсвязывающей части, включающих такой сконструированный полипептид. Способ включает культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии полипептида, антитела или его антигенсвязывающей части, и выделение полипептида или антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента.

B. Лекарственные средства

[110] Лекарственные средства, применимые при получении сайт-специфических ADC конъюгатов согласно изобретению, включают любое терапевтическое средство, применимое в лечении рака, в том числе, без ограничения перечисленными, цитотоксические средства, цитостатические средства, иммуномодулирующие средства и химиотерапевтические средства. Цитотоксическое действие относится к истощению, элиминированию и/или уничтожению клетки-мишени (т.е. опухолевых клеток). Цитотоксическое средство относится к средству, которое оказывает цитотоксическое действие на клетку. Цитостатическое действие относится к ингибированию пролиферации клеток. Цитостатическое средство относится к средству, которое оказывает цитостатическое действие на клетку, приводящее к ингибированию роста и/или размножения определенной субпопуляции клеток (т.е. опухолевых клеток). Иммуномодулирующее средство относится к средству, которое стимулирует иммунный ответ посредством продуцирования цитокинов и/или антител и/или модулирования функции T-клеток, в результате чего наблюдается ингибирование или уменьшение роста субпопуляции клеток (т.е. опухолевых клеток), прямое или опосредованное, что позволяет другому средству быть более эффективным. Химиотерапевтическое средство относится к средству, которое является химическим соединением, применимым для лечения рака. Лекарственное средство также может быть производным лекарственного средства, где лекарственное средство было функционализировано для обеспечения конъюгирования с антителом согласно изобретению.

[111] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство является лекарственным средством, обладающим мембранной проницаемостью. В таких вариантах осуществления полезная нагрузка может оказывать неспецифическое воздействие, при котором клетки, окружающие клетку, которая первоначально интернализировала ADC, уничтожаются полезной нагрузкой. Это происходит при высвобождении полезной нагрузки от антитела (т.е. при расщеплении расщепляемого линкера) и проникновении через клеточную мембрану и, при диффузии, вызывает гибель окружающих клеток.

[112] В соответствии с раскрытыми способами, лекарственные средства применяются для получения конъюгатов антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), в которой: (a) Ab является антителом, которое связывается со специфической мишенью; и (b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, а D является лекарственным средством.

[113] Отношение лекарственного средства к антителу (DAR) или лекарственная нагрузка указывает количество молекул лекарственного средства (D), которые конъюгированы с каждой молекулой антитела. В конъюгатах антитела-лекарственного средства согласно настоящему изобретению применяется сайт-специфическое конъюгирование, в результате чего присутствует по существу гомогенная популяция ADC конъюгатов, имеющих одно DAR в композиции ADC конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления DAR равно 1. В некоторых вариантах осуществления DAR равно 2. В других вариантах осуществления DAR равно 3. В других вариантах осуществления DAR равно 4. В других вариантах осуществления DAR больше 4.

[114] Применение обычного конъюгирования (а не сайт-специфического конъюгирования) приводит к гетерогенной популяции различных ADC конъюгатов, каждый из которых с индивидуальным различным DAR. Композиции ADC конъюгатов, полученные таким образом, включают множество антител, причем каждое антитело конъюгировано с определенным количеством молекул лекарственного средства. Фактически композиции имеют среднее DAR. В T-DM1 (Кадсила^®) применяется обычное конъюгирование по остаткам лизина, при этом среднее DAR составляет приблизительно 4, с широким распределением, включающим ADC конъюгаты, нагруженные 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 молекулами лекарственного средства (Kim et al., 2014, Bioconj Chem 25(7):1223-32).

[115] DAR может быть определено с помощью различных стандартных способов, таких как УФ-спектроскопия, масс-спектроскопия, ИФА, радиометрические методы, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), электрофорез и ВЭЖХ.

[116] В одном варианте осуществления лекарственный компонент ADC конъюгатов согласно изобретению является антимитотическим лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления антимитотическим лекарственным средством может быть ауристатин (например, 0101, 8261, 6121, 8254, 6780 и 0131; см. Таблицу 2 ниже). В более конкретном варианте осуществления лекарственным средством из группы ауристатинов является 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид (также известный как 0101).

[117] Ауристатины ингибируют пролиферацию клеток, ингибируя формирование микротрубочек во время митоза посредством ингибирования полимеризации тубулина. В публикации международной заявки PCT WO 2013/072813, которая полностью включена посредством отсылки, раскрыты ауристатины, которые могут применяться в производстве ADC конъюгатов согласно изобретению, и предложены способы получения таких ауристатинов.

Таблица 2: Лекарственные средства

[118] В некоторых аспектах изобретения цитотоксическое средство может быть получено с применением липосомы или биосовместимого полимера. Антитела к HER2, как описано в настоящей заявке, могут быть конъюгированы с биосовместимым полимером для увеличения полупериода существования в сыворотке и биоактивности, и/или увеличения периода полувыведения in vivo. Примеры биосовместимых полимеров включают водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или его производные, и цвиттер-ион-содержащие биосовместимые полимеры (например, фосфорилхолин-содержащий полимер).

C. Линкеры

[119] Сайт-специфические ADC конъюгаты согласно изобретению получают с использованием линкера для соединения или конъюгирования лекарственного средства с антителом. Линкер является бифункциональным соединением, которое может применяться для связывания лекарственного средства и антитела с получением конъюгата антитела-лекарственного средства (ADC). Такие конъюгаты обеспечивают селективную доставку лекарственных средств к опухолевым клеткам. Подходящие линкеры включают, например, расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Расщепляемый линкер обычно подвергается расщеплению во внутриклеточных условиях. Основные механизмы, по которым конъюгированное лекарственное средство отщепляется от антитела, включают гидролиз при кислотном pH лизосом (гидразоны, ацетали и цис-аконитат-подобные амиды), расщепление пептидов лизосомальными ферментами (катепсинами и другими лизосомальными ферментами) и восстановление дисульфидов. В результате такого разнообразия механизмов расщепления, механизмы соединения лекарственного средства с антителом также широко варьируют, при этом может применяться любой подходящий линкер.

[120] Подходящие расщепляемые линкеры включают, без ограничения перечисленными, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как лизосомальная протеаза или эндосомальная протеаза, такой как vc и m(H20)c-vc (Таблица 3, ниже). В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым линкером, таким, что полезная нагрузка может оказывать неспецифическое действие сразу после расщепления линкера. Неспецифическое действие состоит в том, что при высвобождении обладающего мембранной проницаемостью лекарственного средства от антитела (т.е. при расщеплении расщепляемого линкера) и проникновении через клеточную мембрану и диффузии, лекарственное средство вызывает гибель клеток, окружающих клетку, которая первоначально интернализировала ADC.

[121] Подходящие нерасщепляемые линкеры включают, без ограничения перечисленными, mc, MalPeg6, Mal-PEG2C2, Mal-PEG3C2 и m(H20)c (Таблица 3, ниже).

[122] Другие подходящие линкеры включают линкеры, гидролизуемые при определенном pH или в диапазоне pH, такие как гидразоновый линкер. Дополнительные подходящие расщепляемые линкеры включают дисульфидные линкеры. Линкер может быть ковалентно связан с антителом в такой степени, что антитело должно расщепляться внутриклеточно для высвобождения лекарственного средства, например, mc линкер и т.п.

[123] В определенных аспектах изобретения линкер в сайт-специфических ADC конъюгатах согласно изобретению является расщепляемым и может быть vc.

[124] Многие терапевтические средства, конъюгированные с антителами, обладают низкой, если вообще обладают, растворимостью в воде, и это может ограничивать лекарственную нагрузку на конъюгате вследствие агрегации конъюгата. Один из способов решения данной проблемы заключается в добавлении к линкеру солюбилизирующих групп. Могут примененяться конъюгаты, полученные с применением линкера, состоящего из ПЭГ и дипептида, в том числе такие, которые содержат ПЭГ-дикислоту, тиол-кислоту или малеимид-кислоту, присоединенные к антителу, дипептидный спейсер и амидную связь с амином аналога антрациклина или дуокармицина. Другим примером является конъюгат, полученный с ПЭГ-содержащим линкером, в котором дисульфид связан с цитотоксическим средством, а амид связан с антителом. Способы, которые включают ПЭГ-группы, могут быть полезными в преодолении агрегации и ограничений в лекарственной нагрузке.

Таблица 3: Линкеры

[125] Линкеры присоединены к моноклональному антителу с левой стороны молекулы, а лекарственное средство с правой стороны молекулы, как показано в Таблице 3.

[126] В определенном варианте осуществления антитело изобретения конъюгировано с тиол-реакционноспособным соединением, в котором реакционноспособная группа является, например, малеимидом, иодацетамидом, пиридилдисульфидом или другим тиол-реакционноспособным партнером по конъюгированию (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G., в Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, стр. 40-55, 643-671).

[127] В определенных вариантах осуществления изобретения предложен конъюгат антитела-лекарственного средства формулы Ab-(L-D), в которой: (a) Ab является антителом, которое связывается со специфической мишенью; и (b) L-D является молекулой линкера-лекарственного средства, где L является линкером, а D является лекарственным средством.

[128] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает сукцинимидную группу, малеимидную группу, гидролизируемую сукцинимидную группу или гидролизируемую малеимидную группу.

[129] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает малеимидную группу или гидролизируемую малеимидную группу. Малеимиды, такие как N-этилмалеимид, считаются специфичными к сульфгидрильным группам, в особенности при значениях pH ниже 7, когда другие группы протонированы.

[130] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает 6-малеимидокапроил (MC), малеимидопропаноил (MP), валин-цитруллин (val-cit), аланин-фенилаланин (ala-phe), п-аминобензилоксикарбонил (PAB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1карбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-(4-иод-ацетил)аминобензоат (SIAB) или 6-малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил (MC-vc-PAB).

[131] В определенном варианте осуществления Ab-(L-D) включает соединение формулы I:

I

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является ;

R¹ является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(iii) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3B является C₁-C₈ алкилом;

(iv) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ; и

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом.

[132] В определенном варианте осуществления Ab-(L-D) включает соединение формулы IIa:

IIa

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является ;

R¹ являетсяили;

Y является одной или более группами, выбранными из -C₂-C₂₀ алкилена, -C₂-C₂₀ гетероалкилена-, -C₃-C₈ карбоцикло-, -арилена-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-арилена-, -арилен-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилена-, -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10-C_1-6алкила, -C(O)-C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-, -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-C(O)-, -C_1-6алкил-(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)CH₂-, -C(O)-C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)- и -C(O)-C_1-6алкил-(OCH₂CH₂)_1-6-NRC(O)C_1-6алкила-;

Z является или NH₂;

G является галогеном, -OH, -SH или -S-C₁-C₆ алкилом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(iii) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом; и

R^3B является C₁-C₈ алкилом; или

(iv) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ;

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом;

R¹⁰ является водородом, - C₁-C₁₀алкилом, -C₃-C₈карбоциклилом, -арилом, -C₁-C₁₀гетероалкилом, -C₃-C₈гетероцикло, -C₁-C₁₀алкилен-арилом, -арилен-C₁-C₁₀алкилом, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло), -(C₃-C₈ карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилом, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло) или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилом, где арил на R¹⁰, включающем арил, необязательно замещен [R₇]_h;

R⁷ независимо при каждом появлении выбран из группы, состоящей из F, Cl, I, Br, NO₂, CN и CF₃; и

h является 1, 2, 3, 4 или 5.

[133] Предпочтительно Y является одной или более группами, выбранными из -C₂-C₂₀ алкилена-, -C₂-C₂₀ гетероалкилена-; -C₃-C₈ карбоцикло-, -арилена-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-арилена-, -арилен-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилена-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилена-; -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10-, -(OCH₂CH₂)_1-10C_1-6алкила, -C(O)-C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6- и -C_1-6алкил(OCH₂CH₂)_1-6-C(O)-;

[134] Предпочтительно Z является или -NH₂.

[135] В определенном варианте осуществления Ab-(L-D) включает соединение формулы IIb:

или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, где, независимо при каждом появлении,

W является или ;

R¹ являетсяили ;

Y является -C₂-C₂₀ алкиленом-, -C₂-C₂₀ гетероалкиленом-, -C₃-C₈ карбоцикло-, -ариленом-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-ариленом-, -арилен-C₁-C₁₀алкиленом-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкиленом-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀алкиленом-;

Z является

или -NH-Ab;

Ab является антителом;

R² является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3A и R^3B являются одним из следующего:

(iii) R^3A является водородом или C₁-C₈ алкилом;

R^3B является C₁-C₈ алкилом;

(iv) R^3A и R^3B, взятые вместе, являются C₂-C₈ алкиленом или C₁-C₈ гетероалкиленом;

R⁵ является ; и

R⁶ является водородом или -C₁-C₈ алкилом.

[136] Предпочтительно Z является , , или -NH-Ab.

[137] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает mcValCitPABC_MMAE ("vcMMAE"):

[138] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает mcValCitPABC_MMAD ("vcMMAD"):

[139] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает mcMMAD ("малеимид капроил MMAD):

[140] В определенных вариантах осуществления Ab-(L-D) включает mcMMAF ("малеимид капроил MMAF"):

[141] Определения общих терминов, используемых в Формулах I, IIa и IIb, таких как алкил, алкенил, галогеналкил; гетероциклил, следует понимать согласно обычному и стандартному значению данных терминов. В частности, данные термины определены в WO 2013/072813 (которая полностью включена в настоящую заявку посредством отсылки), со страницы 15, строки 21 до страницы 18, строки 14.

D. Способы получения сайт-специфических ADC конъюгатов

[142] Также предложены способы получения конъюгатов антитела-лекарственного средства согласно настоящему изобретению. Например, способ получения сайт-специфического ADC, как раскрыто в настоящей заявке, может включать: (a) конъюгирование линкера с лекарственным средством; (b) конъюгирование молекулы линкера-лекарственного средства с антителом; и (c) очистку конъюгата антитела-лекарственного средства.

[143] В ADC конъюгатах согласно настоящему изобретению применены сайт-специфические способы конъюгирования антитела с лекарственной полезной нагрузкой.

[144] В одном варианте осуществления сайт-специфическое конъюгирование осуществляют через один или более остатков цистеина, которые были введены с помощью методов генной инженерии в константную область антитела. Способы получения антител для сайт-специфического конъюгирования через остатки цистеина могут быть осуществлены, как описано в публикации PCT WO2013/093809, которая полностью включена посредством отсылки. Одно или более следующих положений могут быть изменены на цистеин и, таким образом, могут служить в качестве сайта для конъюгирования: a) на константной области тяжелой цепи, остатки 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 290, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 327, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443 и 444 (согласно EU индексу Кэбата для тяжелой цепи) и/или b) на константной области легкой цепи, остатки 111, 149, 183, 188, 207 и 210 (согласно нумерации Кэбата для легкой цепи).

[145] В некоторых вариантах осуществления одно или более положений, которые могут быть изменены на цистеин: a) на константной области тяжелой цепи, являются 290, 334, 392 и/или 443 (согласно EU индексу Кэбата для тяжелой цепи), и/или b) на константной области легкой цепи, являются 183 (согласно нумерации Кэбата для легкой цепи).

[146] В более конкретном варианте осуществления положение 290 на константной области тяжелой цепи и положение 183 на константной области легкой цепи изменены на цистеин для конъюгирования, согласно нумерации Кэбата.

[147] В другом варианте осуществления сайт-специфическое конъюгирование осуществляют через один или более ацил-донорных остатков глутамина, которые были введены с помощью методов генной инженерии в константную область антитела. Способы получения антител для сайт-специфического конъюгирования через остатки глутамина могут быть осуществлены, как описано в публикации PCT WO2012/059882, которая полностью включена посредством отсылки. Антитела могут быть модифицированы с помощью методов генной инженерии для экспрессии остатка глутамина, используемого для сайт-специфического конъюгирования, тремя различными способами.

[148] Короткую пептидную метку, содержащую остаток глутамина, можно ввести в ряд различных положений легкой и/или тяжелой цепи (т.е. на N-конец, на C-конец, внутренне). В первом варианте осуществления короткая пептидная метка, содержащая остаток глутамина, может быть присоединена к C-концу тяжелой и/или легкой цепи. Одна или более следующих глутаминсодержащих меток может быть присоединена в качестве донора ацильной группы для конъюгирования лекарственного средства: GGLLQGPP (SEQ ID NO: 45), GGLLQGG (SEQ ID NO: 46), LLQGA (SEQ ID NO: 47), GGLLQGA (SEQ ID NO: 48), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 49), LLQGPG (SEQ ID NO: 50), LLQGPA (SEQ ID NO: 51), LLQGP (SEQ ID NO: 52), LLQP (SEQ ID NO: 53), LLQPGK (SEQ ID NO: 54), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 55), LLQGAPG (SEQ ID NO: 56), LLQGAP (SEQ ID NO: 57), LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁ является G или P, где X₂ является A, G, P или отсутствует, где X₃ является A, G, K, P или отсутствует, где X₄ является G, K или отсутствует, и где X₅ является K или отсутствует (SEQ ID NO: 58), или LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁ является любой природной аминокислотой, и где X₂, X₃, X₄ и X₅ являются любыми природными аминокислотами или отсутствуют (SEQ ID NO: 59).

[149] В некоторых вариантах осуществления GGLLQGPP (SEQ ID NO: 60) может быть присоединен к C-концу легкой цепи.

[150] В некоторых вариантах осуществления остаток на тяжелой и/или легкой цепи может быть изменен на остаток глутамина с помощью сайт-направленного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления остаток в положении 297 на тяжелой цепи (при использовании EU индекса Кэбата) может быть изменен на глутамин (Q) и, таким образом, может служить в качестве сайта для конъюгирования.

[151] В некоторых вариантах осуществления остаток на тяжелой цепи или легкой цепи может быть изменен так, что это приводит к агликозилированию в данном положении, в результате чего один или более эндогенных глутаминов становятся доступными/реакционноспособными для конъюгирования. В некоторых вариантах осуществления остаток в положении 297 на тяжелой цепи (при использовании EU индекса Кэбата) изменен на аланин (A). В таких случаях глутамин (Q) в положении 295 на тяжелой цепи можно затем использовать в конъюгировании.

[152] Оптимальные условия реакции для образования конъюгата можно эмпирически определить путем изменения переменных параметров реакции, таких как температура, pH, ввод молекулы линкера-полезной нагрузки и концентрация добавляемых реагентов. Условия, подходящие для конъюгирования других лекарственных средств, могут быть определены специалистами в данной области без излишнего экспериментирования. Сайт-специфическое конъюгирование через модифицированные остатки цистеина проиллюстрировано в Примере 5А ниже. Сайт-специфическое конъюгирование через остатки глутамина проиллюстрировано в Примере 5B ниже.

[153] Чтобы дополнительно увеличить число молекул лекарственного средства на конъюгат антитела-лекарственного средства, лекарственное средство можно конъюгировать с полиэтиленгликолем (ПЭГ), включая линейные или разветвленные полимеры и мономеры полиэтиленгликоля. Мономер ПЭГ имеет формулу: -(CH₂CH₂O)-. Лекарственные средства и/или аналоги пептидов могут быть связаны с ПЭГ прямо или косвенно, т.е. через подходящие спейсерные группы, такие как сахара. Композиция ПЭГ-антитела-лекарственного средства также может включать дополнительные липофильные и/или гидрофильньные молекулы, способствующие стабильности лекарственного средства и доставке к целевому участку in vivo. Репрезентативные способы получения ПЭГ-содержащих композиций можно найти, например, в патентах США 6,461,603; 6,309,633 и 5,648,095.

[154] После конъюгирования конъюгаты можно отделять и очищать от неконъюгированных реагентов и/или агрегированных форм конъюгатов с помощью стандартных методов. Это может включать такие процессы, как эксклюзионную хроматографию (SEC), ультрафильтрацию/диафильтрацию, ионообменную хроматографию (IEC), хроматофокусирование (CF), ВЭЖХ, FPLC или хроматографию на Sephacryl S-200. Разделение также может быть выполнено с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). Подходящие среды для HIC включают хроматографическую среду Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, хроматографическую среду Butyl Sepharose 4 Fast Flow, хроматографическую среду Octyl Sepharose 4 Fast Flow, хроматографическую среду Toyopearl Ether-650M, среду Macro-Prep methyl HIC или среду Macro-Prep t-Butyl HIC.

[155] В Таблице 4 показаны HER2 ADC конъюгаты, использованные для получения данных в разделе Примеры. Сайт-специфические HER2 ADC конъюгаты, показанные в Таблице 4 (в строках 1-17), являются примерами сайт-специфических ADC конъюгатов согласно изобретению.

[156] Для получения сайт-специфического ADC согласно изобретению, любое антитело, раскрытое в настоящей заявке, может быть конъюгировано с применением сайт-специфических методик с любым лекарственным средством, раскрытым в настоящей заявке, через любой линкер, раскрытый в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым (например, vc). В некоторых вариантах осуществления лекарственным средством является ауристатин (например, 0101).

[157] Полипептиды, антитела и ADC конъюгаты согласно изобретению могут быть сайт-специфически конъюгированы через модифицированный цистеин в положении 290 (согласно нумерации EU индекса Кэбата). Область CH2 тяжелой цепи IgG1 антитела показана в SEQ ID NO: 61 или SEQ ID NO: 62 (K290, при использовании нумерации EU индекса Кэбата, выделен полужирным шрифтом и подчеркнут).

APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK (SEQ ID NO: 61, CH2 домен)

APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 62, CH2 и CH3 домены)

[158] Модифицированный цистеин может присутствовать в положении 290 отдельно или в комбинации с одним или более модифицированными остатками цистеина в следующих положениях: a) на константной области тяжелой цепи, остатки 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 327, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443 и 444 (согласно нумерации EU индекса Кэбата), и/или b) на константной области легкой цепи, остатки 111, 149, 183, 188, 207 и 210 (согласно нумерации Кэбата).

[159] В некоторых вариантах осуществления полипептиды, антитела и ADC конъюгаты согласно изобретению могут дополнительно включать константную область каппа легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 183, согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 76 в SEQ ID NO: 63, при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63. Этот модифицированный цистеин также указан как "K183C", при использовании нумерации Кэбата, и выделен полужирным шрифтом и подчеркнут, как показано ниже. Пептид, антитело и ADC согласно изобретению могут включать константную область лямбда легкой цепи, включающую модифицированный остаток цистеина в аминокислотном положении, соответствующем остатку аминокислоты 183 константной области каппа легкой цепи человека, указанному как остаток "K183C", показанный ниже.

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO: 63, Cκ константный домен)

[160] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область каппа легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 111, 149, 188, 207, 210 или их любой комбинации (предпочтительно 111 или 210), согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 42, 81, 100, 103 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 63 (предпочтительно остаток 4 или 103), при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 63.

[161] В другом аспекте изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие: (a) полипептид, раскрытый в настоящей заявке, и (b) константную область лямбда легкой цепи антитела, включающую: (i) модифицированный остаток цистеина в положении 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 или их любой комбинации (предпочтительно 110, 111, 125, 149 или 155), согласно нумерации Кэбата; или (ii) модифицированный остаток цистеина в положении, соответствующем остатку 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 или их любой комбинации в SEQ ID NO: 64 (предпочтительно остаток 4, 5, 19, 43 или 49), при выравнивании указанного константного домена с SEQ ID NO: 64.

GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADGSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS (SEQ ID NO: 64, Cλ константный домен)

Таблица 4: HER2 ADC конъюгаты (¹C=расщепляемый; N=нерасщепляемый)

ADC Вариабельная область тяжелой цепи Константная область тяжелой цепи Тяжелая цепь Вариабельная область легкой цепи Константная область легкой цепи Легкая цепь Линкер Полезная нагрузка Тип линкера¹ T(kK183C)-vc0101 1 5 6 7 41 42 vc 0101 C T(K290C)-vc0101 1 17 18 7 11 12 vc 0101 C T(N297Q)-AcLysvc0101 1 21 22 7 11 12 AcLysvc 0101 C T(K334C)-vc0101 1 23 24 7 11 12 vc 0101 C T(K392C)-vc0101 1 25 26 7 11 12 vc 0101 C T(L443C)-vc0101 1 27 28 7 11 12 vc 0101 C T(kK183C+K290C)-vc0101 1 17 18 7 41 42 vc 0101 C T(kK183C+K334C)-vc0101 1 23 24 7 41 42 vc 0101 C T(kK183C+K392C)-vc0101 1 25 26 7 41 42 vc 0101 C T(kK183C+L443C)-vc0101 1 27 28 7 41 42 vc 0101 C T(K290C+K334C)-vc0101 1 29 30 7 11 12 vc 0101 C T(K290C+K392C)-vc0101 1 31 32 7 11 12 vc 0101 C T(N297A+K222R+LCQ05)-AcLysvc0101 1 33 34 7 43 44 AcLysvc 0101 C T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 1 35 36 7 11 12 AcLysvc 0101 C T(K334C+K392C)-vc0101 1 37 38 7 11 12 vc 0101 C T(K392C+L443C)-vc0101 1 39 40 7 11 12 vc 0101 C T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 1 13 14 7 43 44 AcLysvc 0101 C T-mc8261 1 5 6 7 11 12 mc 8261 N T-m(H20)c8261 1 5 6 7 11 12 m(H20)c 8261 N T-MalPeg8261 1 5 6 7 11 12 MalPeg6 8261 N T-vc8261 1 5 6 7 11 12 vc 8261 C T-mc6121 1 5 6 7 11 12 mc 6121 N T-MalPeg6121 1 5 6 7 11 12 MalPeg6 6121 N T-mc0101 1 5 6 7 11 12 mc 0101 N T-vc0101 1 5 6 7 11 12 vc 0101 C T-vc8254 1 5 6 7 11 12 vc 8254 C T-vc6780 1 5 6 7 11 12 vc 6780 C T-vc0131 1 5 6 7 11 12 vc 0131 C T-MalPegMMAD 1 5 6 7 11 12 MalPeg6 MMAD N T-vcMMAE 1 5 6 7 11 12 vc MMAE C T-DM1 1 5 6 7 11 12 mcc DM1 N

2. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ И ПРИМЕНЕНИЕ

[162] Полипептиды, антитела и ADC конъюгаты, описанные в настоящей заявке, могут быть изготовлены в виде фармацевтических композиций. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы. Кроме того, композиции могут включать больше одного из ADC конъюгатов, раскрытых в настоящей заявке.

[163] Композиции, применяемые в настоящем изобретении, могут дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover) в форме лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в таких дозах и концентрациях, и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат, и другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (меньше чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильньные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстраны; хелатообразующие вещества, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). "Фармацевтически приемлемая соль" при использовании в настоящей заявке относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям молекулы или макромолекулы. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества также описаны в настоящей заявке.

[164] Для введения могут применяться различные лекарственные формы одного или более ADC конъюгатов, в том числе, без ограничения перечисленными, лекарственные формы, включающие один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества известны в уровне техники и являются относительно инертными веществами, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, вспомогательное вещество может придавать форму или консистенцию, или действовать как разбавитель. Подходящие вспомогательные вещества включают, без ограничения перечисленными, стабилизирующие вещества, смачивающие и эмульгирующие вещества, соли для различной осмолярности, инкапсулирующие вещества, буферы и вещества, усиливающие проникновение через кожу. Вспомогательные вещества, а также лекарственные формы для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственного средства представлены в справочнике Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000.

[165] В некоторых аспектах изобретения такие средства изготовлены в форме для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Таким образом, эти вещества могут быть объединены с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретная схема дозирования, т.е. доза, время введения и повтор, будет зависеть от конкретного субъекта и сведений о перенесенных им заболеваниях.

[166] Терапевтические лекарственные формы ADC конъюгатов согласно изобретению подготавливают для хранения путем смешивания ADC, обладающего требуемой степенью чистоты, с дополнительными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), в форме лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат, и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (меньше чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильньные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие вещества, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[167] Липосомы, содержащие ADC конъюгаты согласно изобретению, могут быть получены с помощью способов, известных в уровне техники, таких как описаннные в Eppstein, et al., 1985, PNAS 82:3688-92; Hwang, et al., 1908, PNAS 77:4030-4; и патентах США 4,485,045 и 4,544,545. Липосомы с увеличенной продолжительностью циркуляции раскрыты в патенте США 5,013,556. Особенно полезные липосомы могут быть получены методом обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, включающей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГилированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭА). Липосомы экструдируют через фильтры с порами определенного размера, получая липосомы нужного диаметра.

[168] Активные компоненты также могут быть заключены в микрокапсулах, изготовленных, например, с помощью методов коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсулах и полиметилметакрилатных микрокапсулах, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие технологии раскрыты в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

[169] Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы изготовлены в виде изделий, имеющих определенную форму, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли-(2-гидроксиэтил-метакрилат), или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемые сополимеры этилена-винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), ацетат-изобутират сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

[170] Лекарственные формы, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается, например, при фильтрации через стерилизующие фильтрующие мембраны. Терапевтические ADC композиции обычно помещены в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции.

[171] Подходящие поверхностно-активные вещества включают, в частности, неионогенные ПАВ, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, TWEEN™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Span™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным веществом обычно включают 0,05-5% поверхностно-активного вещества и могут включать 0,1-2,5%. Следует понимать, что могут быть добавлены другие компоненты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые разбавители, при необходимости.

[172] Подходящие эмульсии могут быть приготовлены при использовании коммерчески доступных жировых эмульсий, таких как INTRALIPID™, LIPOSYN™, INFONUTROL™, LIPOFUNDIN™ и LIPIPHYSAN™. Действующее вещество может быть растворено в предварительно смешанной эмульсионной композиции или, в альтернативе, оно может быть растворено в масле (например, соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле) и эмульсии, полученной после смешивания с фосфолипидом (например, яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Следует понимать, что могут быть добавлены другие компоненты, например глицерин или глюкоза, для регулирования тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии, как правило, будут содержать 20% масла, например 5- 20%. Жировая эмульсия может включать капли жира размером 0,1-1,0 мкм, в особенности 0,1-0,5 мкм, и иметь pH в пределах 5,5-8,0. Эмульсионные композиции могут быть получены при смешивании ADC с INTRALIPID™ или компонентами, входящими в его состав (соевым маслом, яичными фосфолипидами, глицерином и водой).

[173] В изобретении также предложены наборы для применения в настоящих способах. Наборы согласно изобретению включают один или более контейнеров, включающих один или более ADC конъюгатов согласно изобретению и инструкции по применению в соответствии с любым из способов изобретения, описанных в настоящей заявке. Обычно такие инструкции включают описание применения ADC для вышеописанного терапевтического лечения.

[174] Инструкции по применению ADC конъюгатов согласно изобретению обычно включают информацию в отношении дозирования, схемы дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, упаковки с множеством доз (например, многодозовые упаковки) или субъединичные дозы. Инструкции, поставляемые с наборами изобретения, являются, как правило, письменными инструкциями на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажным листом, включенный в набор), однако также допускаются машиночитаемые инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом носителе данных).

[175] Наборы согласно настоящему изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, без ограничения перечисленными, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или полиэтиленовые пакеты) и т.п. Также предусмотрены упаковки для применения в сочетании со специальным устройством, таким как инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с раствором для внутривенного введения или флаконом с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с раствором для внутривенного введения или флаконом с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одним действующим веществом в композиции является ADC согласно изобретению. Контейнер может дополнительно включать второе фармацевтически активное вещество.

[176] В наборах необязательно могут быть предоставлены дополнительные компоненты, такие как буферы и информация по интерпретации результатов. Обычно набор включает контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или связанные с контейнером.

[177] ADC конъюгаты согласно изобретению могут применяться для терапевтических, диагностических или нетерапевтических целей. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут применяться в качестве средств для аффинной очистки (например, для очистки in vitro), в качестве диагностического средства (например, для обнаружения экспрессии представляющего интерес антигена в определенных клетках, тканях или сыворотке).

[178] Для терапевтических применений ADC конъюгаты согласно изобретению можно вводить млекопитающему, в особенности человеку, стандартными методами, например, внутривенно (в виде болюса или непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени), внутримышечно, внутрибрюшинно, интрацереброспинально, подкожно, интраартикулярно, интрасиновиально, интратекально, перорально, наружно или ингаляцией. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты также соответственно вводят интратуморальным, перитуморальным, внутриочаговым или околоочаговым путями. ADC конъюгаты согласно изобретению могут применяться в профилактическом лечении или терапевтическом лечении.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[179] Если в настоящей заявке не определено иное, научно-технические термины, использованные в настоящем изобретении, должны иметь значения, которые обычно известны средним специалистам в данной области. Кроме того, если из контекста не следует иное, термины в единственном числе должны включать множества, и термины во множественном числе должны включать единственное число. Как правило, номенклатура, используемая в отношении, а также методики, культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, а также химии и гибридизации белков и нуклеиновых кислот, описанные в настоящей заявке, являются известными и широко используются в данной области.

[180] Термин "L-D" относится к молекуле линкера-лекарственного средства, полученной в результате связывания лекарственного средства (D) с линкером (L). Термин "Лекарственное средство (D)" относится к любому терапевтическому средству, применимому в лечении заболевания. Лекарственное средство обладает биологической или поддающейся обнаружению активностью, например, цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство, цитостатическое средство и иммуномодулирующее средство. Применительно к лечению рака, терапевтическое средство оказывает цитотоксическое действие на опухоли, включающее истощение, элиминирование и/или уничтожение опухолевых клеток. Термины лекарственное средство, полезная нагрузка и лекарственная полезная нагрузка используются попеременно. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства оказывают цитотоксическое действие на опухоли, включающее истощение, элиминирование и/или уничтожение опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство является антимитотическим средством. В некоторых вариантах осуществления лекарственным средством является ауристатин. В некоторых вариантах осуществления лекарственным средством является 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид (также известный как 0101). В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предпочтительно обладает мембранной проницаемостью.

[181] Термин "Линкер (L)" описывает прямое или косвенное соединение антитела с лекарственной полезной нагрузкой. Присоединение линкера к антителу может быть достигнуто множеством способов, например, через поверхностные лизины, восстановительное связывание с окисленными углеводами, остатками цистеина, освобожденными при восстановлении межцепочечных дисульфидных связей, реакционноспособные остатки цистеина, введенные с помощью методов генной инженерии в определенные сайты, и ацил-донорную глутаминсодержащую метку или эндогенный глутамин, сделанный реакционноспособным посредством инженерии полипептида в присутствии трансглутаминазы и амина. В настоящем изобретении применяются сайт-специфические способы соединения антитела с лекарственной полезной нагрузкой. В одном варианте осуществления конъюгирование осуществляют через остатки цистеина, которые были введены с помощью методов генной инженерии в константную область антитела. В другом варианте осуществления конъюгирование осуществляют через ацил-донорные остатки глутамина, которые были: a) добавлены в константную область антитела посредством пептидной метки, b) введены с помощью методов генной инженерии в константную область антитела или c) сделаны доступными/реакционноспособными в результате модификации окружающих остатков с помощью методов генной инженерии. Линкеры могут быть расщепляемыми (т.е. поддающимися расщеплению во внутриклеточных условиях) или нерасщепляемыми. В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым линкером.

[182] "Антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к фрагменту полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфично связываться с антигеном (предпочтительно по существу с такой же аффинностью связывания). Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают: Fab-фрагмент; F(ab')2-фрагмент; Fd-фрагмент; Fv-фрагмент; dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); выделенную определяющую комплементарность область (CDR); связанный дисульфидной связью Fv (dsFv); антиидиотипические (анти-Id) антитела; интратело; одноцепочечный Fv (scFv, см., например, Bird et al. Science 242:423-426 (1988) и Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)); и диатело (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123). Антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению включает сконструированный константный домен антитела, описанный в настоящей заявке, но не должен обязательно включать полноразмерную Fc-область нативного антитела. Например, антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению может быть "минителом" (VL-VH-CH3 или (scFv-CH3)₂; см., Hu et al., Cancer Res. 1996; 56(13):3055-61, и Olafsen et al., Protein Eng Des Sel. 2004;17(4):315-23).

[183] Остатки в вариабельном домене антитела пронумерованы согласно системе нумерации Кэбата, которая используется для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при компиляции антител. См, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). При использовании этой системы нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или дополнительное количество аминокислот, что соответствует усечению или вставке в FR или CDR область вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Кэбату) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c согласно Кэбату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кэбату может быть определена для данного антитела при выравнивании в областях гомологии последовательности антитела со "стандартной" последовательностью, пронумерованной согласно Кэбату. Доступны различные алгоритмы для определения нумерации Кэбата. Алгоритм, реализованный в выпуске 2012 года Abysis (www.abysis.org), применяется в настоящей заявке для присвоения нумерации Кэбата вариабельным областям, если не указано иное.

[184] Если не определено иное, аминокислотные остатки в константном домене тяжелой цепи IgG антитела пронумерованы согласно EU индексу Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85, как описано в Kabat et al., 1991, указанному в настоящей заявке как "EU индекс Кэбата". Как правило, Fc-домен включает приблизительно от аминокислотного остатка 236 до приблизительно 447 константного домена IgG1 человеческого. Соответствие между C нумерациями можно найти, например, в базе данных IGMT. Аминокислотные остатки константного домена легкой цепи пронумерованы согласно Kabat et al., 1991. Нумерация аминокислотных остатков константного домена антитела также показана в публикации международной заявки на патент WO 2013/093809.

[185] Единственным исключением для использования EU индекса Кэбата в константном домене тяжелой цепи IgG является остаток A114, описанный в примерах. A114 соответствует к нумерации Кэбата, а соответствующий номер согласно EU индексу - 118. Это вызвано тем, что в первоначальной публикации сайт-специфического конъюгирования в этом сайте использовали нумерацию Кэбата, при этом данный сайт указали как A114C и с тех пор широко использовали в уровне техники как сайт "114". См. Junutula et al., Nature Biotechnology 26, 925-932 (2008). Для соответствия стандартному употреблению данного сайта в уровне техники в примерах используются "A114", "A114C", "C114" или "114C".

[186] Если не определено иное, аминокислотные остатки в константном домене легкой цепи антитела пронумерованы согласно Kabat et al., 1991.

[187] Аминокислотный остаток запрашиваемой последовательности "соответствует" указанному положению референсной последовательности (например, положение 60 в SEQ ID NO: 61 или 62 или положение 76 в SEQ ID NO: 63), когда при выравнивании запрашиваемой аминокислотной последовательности с референсной последовательностью положение данного остатка соответствует указанному положению. Такие выравнивания могут быть выполнены вручную или при помощи известных программ выравнивания последовательности, таких как ClustalW2 или "BLAST 2 Sequences" при использовании параметров по умолчанию.

[188] "Fc слитый" белок является белком, в котором один или более полипептидов функционально связаны с полипептидом Fc. При Fc слиянии Fc-область иммуноглобулина объединяют с партнером по слиянию.

[189] Термин "приблизительно", при использовании в настоящем описании, относится к +/-10% от значения.

[190] При использовании в настоящем описании термины "модифицированный" (как в модифицированном цистеине) и "замененный" (как в замененном цистеине) используются попеременно и относятся к мутации аминокислоты с заменой на цистеин с целью создания сайта конъюгирования для присоединения другой молекулы к полипептиду или антителу.

ДЕПОНИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

[191] Репрезентативные материалы настоящего изобретения были депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, 17 ноября 2015 года. Вектор T(K290C)-HC, имеющий регистрационный номер в ATCC PTA-122672, включает в себя вставку ДНК, кодирующую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 18, и вектор T(kK183C)-LC, имеющий регистрационный номер в АТСС PTA-122673, содержит вставку ДНК, кодирующую последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 42. Депозиты были сделаны в соответствии с положениями Будапештского соглашения о Международном признании депонирования микроорганизмов в рамках патентной процедуры, а также нормативных актов на его основе (Будапештское соглашение). Это гарантирует сохранение жизнеспособной депонированной культуры в течение 30 лет с даты депонирования. Депозит будет доступен в ATCC в соответствии с Будапештским соглашением и по согласнованию между Pfizer Inc. и ATCC, которая гарантирует постоянную и неограниченную доступность потомства депонированной культуры неограниченному кругу лиц после выдачи соответствующего патента США или после публикации в открытом доступе любой заявки на патент США или иностранной заявки на патент, в зависимости от того, что наступит раньше, и гарантирует доступность потомства лицу, определенному комиссаром патентного ведомства США, имеющему право на него согласно 35 U.S.C., раздел 122, и регламенту комиссара в соответствии с этим (включая 37 C.F.R., раздел 1.14, с уделением особого внимания 886 OG 638).

[192] Настоящий заявитель согласился с тем, что если культура депонированных материалов погибнет или будет потеряна или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, материалы будут незамедлительно заменены при уведомлении другим таким же материалом. Доступность депонированного материала не следует расценивать как лицензию на практическое осуществление изобретения в нарушение прав, предоставляемых в соответствии с патентным законодательством любого государства.

ПРИМЕРЫ

[193] Изобретение далее подробно описано в отношении следующих экспериментальных примеров. Эти примеры представлены исключительно в целях иллюстрации и не должны быть ограничивающими, если не определено иное. Таким образом, изобретение никоим образом не следует рассматривать как ограниченное следующими примерами, а скорее следует рассматривать как охватывающее все возможные вариации, которые становятся очевидными на основе описания, представленного в настоящем документе.

Пример 1: Получения антител на основе трастузумаба для конъюгирования

A. Конъюгирование посредством цистеина

[194] Способы получения производных трастузумаба для сайт-специфического конъюгирования через остатки цистеина в целом выполняли, как описано в публикации PCT WO2013/093809 (которая полностью включена в настоящую заявку). Один или более остатков на легкой цепи (183 при использовании схемы нумерации Кэбата) или на тяжелой цепи (290, 334, 392 и/или 443 при использовании EU индекса Кэбата) изменяли на остаток цистеина (C) с помощью сайт-направленного мутагенеза.

B. Конъюгирование посредством трансглутаминазы

[195] Способы получения производных трастузумаба для сайт-специфического конъюгирования через остатки глутамина обычно выполняли, как описано в публикации PCT WO2012/059882 (которая полностью включена в настоящую заявку). Трастузумаб подвергали генно-инженерной модификации с целью экспрессии остатка глутамина, применямого для конъюгирования тремя различными способами.

[196] В первом способе метку из 8 аминокислотных остатков (LCQ05), содержащую остаток глутамина, присоединяли на C-конец легкой цепи.

[197] Во втором способе остаток на тяжелой цепи (положение 297 при использовании EU индекса Кэбата) изменяли с аспарагина (N) на остаток глутамина (Q) с помощью сайт-направленного мутагенеза.

[198] В третьем способе остаток на тяжелой цепи (положение 297 при использовании EU индекса Кэбата) изменяли с аспарагина (N) на аланин (A). Это приводит к агликозилированию в положении 297 и доступному/реакционноспособному эндогенному глутамину в положении 295.

[199] Кроме того, некоторые производные трастузумаба имеют изменение, которое не используется для конъюгирования. Остаток в положении 222 на тяжелой цепи (положение 297 при использовании EU индекса Кэбата) изменяли с лизина (K) на остаток аргинина (R). Замена K222R, как обнаружили, приводила к более гомогенному конъюгату антитела и полезной нагрузки, лучшему межмолекулярному сшиванию между антителом и полезной нагрузкой и/или значительному уменьшению межцепочечного сшивания с глутаминовой меткой на C-конце легкой цепи антитела.

Пример 2: Получение стабильно трансфицированных клеток, экспрессирующих антитела-производные трастузумаба

[200] Для определения, что содержащие одиночную и двойную модификацию цистеина варианты антител-производных трастузумаба можно было стабильно экспрессировать в клетках и получать в крупном масштабе, клетки CHO трансфицировали ДНК, кодирующей девять вариантов антител-производных трастузумаба (T(ĸK183C), T(K290C), T(K334C), T(K392C), T(ĸK183C+K290C), T(ĸK183C+K392C), T(K290C+K334C), T(K334C+K392C) и T(K290C+K392C)), и стабильные высокопродуктивные пулы выделяли при помощи стандартных методик, известных в уровне техники. Для получения T(ĸK183C+K334C) с целью исследования конъюгирования, клетки HEK-293 (рег. номер ATCC CRL-1573) транзиентно совместно трансфицировали ДНК тяжелой и легкой цепи, кодирующими вариант антитела с двойной цистеиновой модификацией, при использовании стандартных методов. Двухколоночный процесс, т.е. аффинный захват на белке A с последующей колонкой TMAE, или трехколоночный процесс, т.е. аффинный захват на белке A с последующей колонкой TMAE, а затем колонкой CHA-TI, использовали для выделения указанных вариантов трастузумаба из концентрированного исходного материала пулов CHO. При использовании такого процесса очистки все препараты цистеин-модифицированных вариантов антител-производных трастузумаба содержали >97% представляющего интерес пика (POI), как определяли с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (Таблица 5). Эти результаты, показанные в Таблице 5, демонстрируют, что допустимые уровни агрегированных молекул высокой молекулярной массы (HMW) обнаруживали после элюции со смолы с белком A в случае всех десяти цистеиновых вариантов, полученных на основе трастузумаба, и что такие нежелательные HMW компоненты можно было удалить при помощи гель-фильтрации. Кроме того, данные продемонстрировали, что участок связывания белка A в константной области IgG1 человека не был изменен в результате присутствия модифицированных остатков цистеина.

Таблица 5: Получение цистеиновых вариантов антител, полученных на основе трастузумаба

Вариант Процесс очистки ProA элюат (% POI) Выход
(ProA) Конечный
(%POI) Выход
(конечный) T(ĸK183C) 2 колонки ND ND >99% 768 мг/л T(K290C) 2 колонки >99% ND >99% 100 мг/л T(K334C) 2 колонки >99% ND >99% 100 мг/л T(K392C) 2 колонки >99% ND >99% 110 мг/л T(ĸK183C+K290C) 3 колонки 93% 567 мг/л >99% 248 мг/л T(K290C+K334C) 3 колонки 91,2% 470 мг/л >99% 240 мг/л T(K334C+K392C) 3 колонки 92,4% 410 мг/л >99% 220 мг/л T(ĸK183C+K334C) 3 колонки ND ND >99% 64 мг/л T(K290C+K392C) 2 колонки 93,1% 700 мг/л 97,9% 420 мг/л T(ĸK183C+K392C) 2 колонки 91,4 ND 97,8 600 мг/л

ND=не определяли

Пример 3: Целостность трастузумаб-производных антител

[201] Молекулярную оценку модифицированных цистеиновых и трансглутаминазных вариантов проводили для оценки ключевых биофизических свойств по сравнению с антителом дикого типа (трастузумабом), чтобы гарантировать, что варианты будут пригодными для стандартного процесса производства антител.

[202] Для определения целостности очищенных препаратов модифицированных цистеиновых вариантов антител, полученных путем стабильной CHO экспрессии, процентную чистоту пиков вычисляли при помощи невосстанавливающего капиллярного гель-электрофореза (Caliper LabChip GXII: Perkin Elmer Waltham, MA). Результаты показывают, что модифицированные цистеиновые варианты антител T(ĸK183C+K290C) и T(K290C+K334C), содержащие низкие уровни фрагментов и компонентов с высокой молекулярной массой (HMMS), подобных антителу дикого типа (трастузумабу). Для сравнения, T(K334C+K392C) содержал высокие уровни пиков фрагментированного антитела по сравнению с другими исследованными вариантами с двойной цистеиновой модификацией (Таблица 6). Эти результаты позволяют предположить, что определенные комбинации модифицированных цистеинов могут оказывать влияние на целостность антитела, предназначенного для сайт-специфического конъюгирования.

Таблица 6: Процентная чистота пиков, вычисленная из электрофореграммы в невосстанавливающих условиях

Антитело Основной пик (%) Фрагменты (%) HMMS (%) трастузумаб WT 95 5 0 T(ĸK183C+K290C) 95,78 4,18 0,04 T(K290C+K334C) 94,6 5,2 0,2 T(K334C+K392C) 80,7 19,3 0

Пример 4: Получение лекарственных соединений полезной нагрузки

[203] Лекарственные соединения группы ауристатина, 0101, 0131, 8261, 6121, 8254 и 6780, были получены согласно способам, описанным в публикации PCT WO2013/072813 (которая полностью включена в настоящую заявку). В опубликованной заявке ауристатиновые соединения обозначены согласно системе нумерации, показанной в Таблице 7.

Таблица 7

Лекарственное соединение из группы ауристатина Обозначение в WO2013/072813 0101 #54 0131 #118 8261 #69 6121 #117 8254 #70 6780 #112

[204] Согласно публикации PCT WO2013/072813 лекарственное соединение 0101 было получено согласно следующей методике.

[205] Стадия 1. Синтез N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (#53). Согласно общей методике D, из #32 (2,05 г, 2,83 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (20 мл, 0,1 М) и N,N-диметилформамиде (3 мл), амина #19 (2,5 г, 3,4 ммоль, 1,2 экв.), HATU (1,29 г, 3,38 ммоль, 1,2 экв.) и триэтиламина (1,57 мл, 11,3 ммоль, 4 экв.) синтезировали неочищенный требуемый материал, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле (градиент: от 0% до 55% ацетона в гептане), получив #53 (2,42 г, 74%) в виде твердого вещества. ЖХ-МС: m/z 965,7 [M+H⁺], 987,6 [M+Na⁺], время удерживания=1,04 минуты; ВЭЖХ (метод A): m/z 965,4 [M+H⁺], время удерживания=11,344 минут (чистота >97%); ¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆), предположительно является смесью ротамеров, характеристические сигналы: δ 7,86-7,91 (м, 2H), [7,77 (д, J=3,3 Гц) и 7,79 (д, J=3,2 Гц), всего 1H], 7,67-7,74 (м, 2H), [7,63 (д, J=3,2 Гц) и 7.65 (д, J=3,2 Гц), всего 1H], 7,38-7,44 (м, 2H), 7,30-7,36 (м, 2H), 7,11-7,30 (м, 5H), [5,39 (ддд, J=11,4, 8,4, 4,1 Гц) и 5,52 (ддд, J=11,7, 8,8, 4,2 Гц), всего 1H], [4,49 (дд, J=8,6, 7,6 Гц) и 4,59 (дд, J=8,6, 6,8 Гц), всего 1H], 3,13, 3,17, 3,18 и 3,24 (4 с, всего 6H), 2,90 и 3,00 (2 шс, всего 3H), 1,31 и 1,36 (2 шс, всего 6H), [1,05 (д, J=6,7 Гц) и 1,09 (д, J=6,7 Гц), всего 3H].

[206] Стадия 2. Синтез 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (#54 или 0101). Согласно общей методике A, из #53 (701 мг, 0,726 ммоль) в дихлорметане (10 мл, 0,07 М) синтезировали неочищенный требуемый материал, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле (градиент: от 0% до 10% метанола в дихлорметане). Остаток разбавляли диэтиловым эфиром и гептаном и выпаривали в вакууме с получением #54 (или 0101) (406 мг, 75%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: m/z 743,6 [M+H⁺], время удерживания=0,70 минуты; ВЭЖХ (метод A): m/z 743,4 [M+H⁺], время удерживания=6,903 минут, (чистота >97%); ¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆), предположительно является смесью ротамеров, характеристические сигналы: δ [8,64 (шд, J=8,5 Гц) и 8,86 (шд, J=8,7 Гц), всего 1H], [8.04 (шд, J=9.3 Гц) и 8.08 (шд, J=9.3 Гц), всего 1H], [7,77 (д, J=3,3 Гц) и 7,80 (д, J=3,2 Гц), всего 1H], [7,63 (д, J=3,3 Гц) и 7,66 (д, J=3,2 Гц), всего 1H], 7,13-7,31 (м, 5H), [5,39 (ддд, J=11, 8,5, 4 Гц) и 5,53 (ддд, J=12, 9, 4 Гц), всего 1H], [4,49 (дд, J=9, 8 Гц) и 4,60 (дд, J=9, 7 Гц), всего 1H], 3,16, 3,20, 3,21 и 3,25 (4 с, всего 6H), 2,93 и 3,02 (2 шс, всего 3H), 1,21 (с, 3H), 1,13 и 1,13 (2 с, всего 3H), [1,05 (д, J=6,7 Гц) и 1,10 (д, J=6,7 Гц), всего 3H], 0,73-0,80 (м, 3H).

[207] Лекарственные соединения MMAD, MMAE и MMAF получали в собственной лаборатории согласно способам, раскрытым в публикации PCT WO 2013/072813.

[208] Лекарственное соединение DM1 получали в собственной лаборатории из приобретенного майтанзинола с применением методик, описанных в патенте США 5,208,020.

Пример 5: Биоконъюгирование антител, полученных на основе трастузумаба

[209] Полученные на основе трастузумаба антитела согласно настоящему изобретению конъюгировали с полезной нагрузкой через линкеры, с получением ADC конъюгатов. Применяли либо способ сайт-специфического конъюгирования (т.е. через определенные остатки цистеина или определенные остатки глутамина), либо обычного конъюгирования.

A. Цистеин сайт-специфические

[210] ADC конъюгаты в Таблице 8 конъюгировали с применением цистеин сайт-специфических способов, описанных ниже.

Таблица 8

T(kK183C)-vc0101
T(K290C)-vc0101
T(K334C)-vc0101
T(K392C)-vc0101
T(kK183C+K290C)-vc0101 T(kK183C+K334C)-vc0101
T(kK183C+K392C)-vc0101
T(K290C+K334C)-vc0101
T(K290C+K392C)-vc0101
T(K334C+K392C)-vc0101

[211] 500 мМ раствор гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (50-100 молярных эквивалентов) добавляли к антителу (5 мг), при этом конечная концентрация антитела составила 5-15 мг/мл в PBS, содержащем 20 мМ ЭДТА. Реакцию оставляли при 37°C на 2,5 часа, после чего антитело подвергали замене буфера на PBS, содержащий 5 мМ ЭДТА, при использовании гель-фильтрационной колонки (обессоливающая колонка PD-10, GE Healthcare). Полученное в результате антитело (5-10 мг/мл) в PBS, содержащем 5 мМ ЭДТА, обрабатывали недавно приготовленным 50 мМ раствором DHA в 1:1 PBS/EtOH (конечная концентрация DHA=1-4 мМ) и оставляли при 4°C на ночь.

[212] Смесь антитела/DHA подвергали замене буфера на PBS, содержащий 5 мМ ЭДТА (pH уравновешивающего буфера доводили до ~7,0 фосфорной кислотой), и концентрировали при использовании центрифужного концентрирующего устройства с отсечением по молекулярной массе 50 кДа. Полученное в результате антитело в PBS (концентрация антитела ~5-10 мг/мл), содержащем 5 мМ ЭДТА, обрабатывали 5-7 молярными эквивалентами 10 мМ малеимидной полезной нагрузки в DMA. После выдерживания в течение 1,5-2,5 часов материал подвергали замене буфера (PD-10). Очистку с помощью SEC проводили (при необходимости) для удаления агрегированного материала и оставшейся свободной полезной нагрузки.

B. Трансглутаминаза сайт-специфические

[213] ADC конъюгаты Таблицы 9 конъюгировали с применением трансглутаминаза сайт-специфических способов, описанных ниже.

Таблица 9

T (N297Q)-AcLysvc0101
T (LCQ05+K222R)-AcLysvc0101
T (N297Q+K222R)-AcLysvc0101
T (N297A+K222R-LCQ05)-AcLysvc0101

[214] В реакции трансамидирования глутамин на антителе действовал в качестве донора ацила, а аминсодержащее соединение действовало в качестве акцептора ацила (донора амина). Очищенное антитело к HER2 в концентрации 33 мкМ инкубировали с 10-25 М избытком акцептора ацила, в пределах 33-83,3 мкМ AcLysvc-0101, в присутствии 2% (в/об) трансглутаминазы Streptoverticillium mobaraense (ACTIVA™, Ajinomoto, Japan) в 150 мМ хлорида натрия и Трис HCl буфере при pH 7,5-8, с 0,31 мМ восстановленного глутатиона, если не указано. Условия реакции корректировали в соответствии с индивидуальными донорами ацила, причем с T(LCQ05+K222R) использовали 10M избыток акцептора ацила при pH 8,0 без восстановленного глутатиона, с T(N297Q+K222R) и T(N297Q) использовали 20M избыток акцептора ацила при pH 7,5 и с T(N297A+K222R+LCQ05) использовали 25M избыток акцептора ацила при pH 7,5. После инкубирования при 37°C в течение 16-20 часов, антитело очищали на смоле MabSelect SuReO или Butyl Sepharose High Performance (GE Healthcare, Piscataway, NJ) при использовании стандартных хроматографических методов, известных специалистам в данной области, таких как коммерческая афинная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия, предоставляемая GE Healthcare.

C. Стандартное конъюгирование

[215] ADC конъюгаты в Таблицах 10 и 11 конъюгировали с помощью стандартных методов конъюгирования, описанных ниже.

Таблица 10

T-DM1
T-mc8261
T-MalPeg8261
T-mc6121
T-MalPeg6121
T-MalPegMMAD T-mc0101
T-vc0101
T-vc8261
T-vc8254
T-vc6780
T-vc0131
T-vcMMAE

Таблица 11

T-m(H20)c8261
T-m(H20)cvc0101

[216] Антитело диализировали в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS, Lonza). Диализированное антитело разводили до 15 мг/мл в PBS, содержащем 5 мМ 2,2',2",2"'-(1,2-этандиилдинитрило)-тетрауксусной кислоты (ЭДТА), pH 7. Полученное в результате антитело обрабатывали 2-3 эквивалентами гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP, 5 мМ в дистиллированной воде) и оставляли при 37°C на 1-2 часа. После охлаждения до комнатной температуры добавляли диметилацетамид (DMA) до получения 10% (об/об) органической фазы от общего объема. Смесь обрабатывали 8-10 эквивалентами соответствующего линкера-полезной нагрузки в виде 10 мМ стокового раствора в DMA. Реакцию оставляли на 1-2 часа при комнатной температуре и затем меняли буфер на DPBS (pH 7,4) при использовании колонок для замены буфера GE Healthcare Sephadex G-25 M согласно инструкциям производителя.

[217] Материал, который должен был остаться с замкнутым кольцом (ADC конъюгаты в Таблице 10), очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC) при использовании системы GE AKTA Explorer с колонкой GE Superdex200 и PBS (pH 7,4) в качестве элюента. Полученные образцы концентрировали до ~5 мг/мл белка, стерилизовали фильтрацией и проверяли на нагрузку при использовании условий масс-спектроскопии, описанных ниже.

[218] Материал, используемый для гидролиза сукцинимидного кольца (ADC конъюгаты Таблицы 11), подвергали замене буфера на 50 мМ боратный буфер (pH 9,2) при использовании ультрафильтрационного устройства (с отсечением по молекулярной массе 50 кДа). Полученный в результате раствор нагревали до 45°C в течение 48 ч. Затем раствор охлаждали, меняли буфер на PBS и очищали с помощью SEC (как описано ниже) для удаления агрегированного материала. Полученные образцы концентрировали до ~5 мг/мл белка, стерилизовали фильтрацией и проверяли на нагрузку при использовании условий масс-спектроскопии, описанных ниже.

D. Конъюгирование T-DM1

[219] Конъюгат трастузумаба-майтанзиноида (T-DM1) структурно подобен трастузумабу эмтанзину (Кадсила^®). T-DM1 состоит из антитела трастузумаба, ковалентно связанного с майтанзиноидом DM1 через бифункциональный линкер сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC). Сульфо-SMCC сначала конъюгировали со свободными аминами на антителе в течение одного часа при 25°C в 50 мМ фосфате калия, 2 мМ ЭДТА, pH 6,8, при стехиометрии реакции 10:1, и затем несвязанный линкер удаляли при обессоливании из конъюгированного антитела. Этот промежуточный продукт антитела-MCC затем конъюгировали с DM1 сульфидом на свободном малеимидном конце MCC линкера антитела в течение ночи при 25°C в 50 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, pH 6,8, при стехиометрии реакции 10:1. Оставшийся непрореагировавший малеимид затем кэпировали L-цистеином, после чего ADC фракционировали через колонку Superdex200 для удаления немономерных компонентов (Chari et al., 1992, Cancer Res 52:127-31).

Пример 6: Очистка ADC конъюгатов

[220] ADC конъюгаты обычно очищали и исследовали с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC), как описано ниже. Нагрузку лекарственного средства в предполагаемом сайте конъюгирования определяли при использовании множества методов, в том числе масс-спектрометрии (МС), обращенно-фазовой ВЭЖХ и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), как более подробно описано ниже. Комбинация трех указанных аналитических методов обеспечивает различные способы подтверждения и количественного определения присутствия полезной нагрузки на антителе, что позволяет точно определять DAR для каждого конъюгата.

A. Препаративная SEC

[221] ADC конъюгаты обычно очищали с помощью SEC хроматографии при использовании колонки Waters Superdex200 10/300GL на системе Akta Explorer FPLC, для удаления агрегатов белка и удаления следов линкера-полезной нагрузки, оставшихся в реакционной смеси. В некоторых случаях ADC конъюгаты не содержали агрегатов и низкомолекулярных компонентов перед SEC очисткой и поэтому не были подвергнуты препаративной SEC. В качестве элюента использовали PBS при скорости потока 1 мл/мин. В таких условиях агрегированный материал (элюирующийся приблизительно через 10 минут при комнатной температуре) легко отделяли от неагрегированного материала (элюирующегося приблизительно через 15 минут при комнатной температуре). Гидрофобные комбинации линкера-полезной нагрузки часто приводили к "правому сдвигу" пиков SEC. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, такой сдвиг пиков SEC может быть вызван гидрофобными взаимодействиями линкера-полезной нагрузки с неподвижной фазой. В некоторых случаях правый сдвиг позволял частично отделять конъюгированный белок от неконъюгированного белка.

B. Аналитическая SEC

[222] Аналитическую SEC проводили на системе ВЭЖХ Agilent 1100 при использовании PBS в качестве элюента для оценки чистоты и мономерного статуса ADC конъюгатов. Элюент контролировали при 220 и 280 нм. В случае, когда колонкой являлась колонка TSKGel G3000SW (7,8×300 мм, номер по каталогу R874803P), в качестве подвижной фазы использовали PBS со скоростью потока 0,9 мл/мин в течение 30 минут. В случае, когда колонкой являлась колонка BiosepSEC3000 (7,8×300 мм), в качестве подвижной фазы использовали PBS со скоростью потока 1,0 мл/мин в течение 25 минут.

Пример 7: Анализ ADC конъюгатов

A. Масс-спектроскопия (МС)

[223] Образцы подготавливали к ЖХ-МС анализу, объединяя приблизительно 20 мкл образца (приблизительно 1 мг/мл ADC в PBS) с 20 мкл 20 мМ дитиотреитол (ДТТ). Смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут, после чего образцы вводили в систему ВЭЖХ Agilent 110, оснащенную колонкой Agilent Poroshell 300SB-C8 (2,1×75 мм). Температуру системы устанавливали на 60°C. Использовали 5-минутный градиент с 20% до 45% ацетонитрила в воде (с 0,1% муравьиной кислоты в качестве модификатора). Элюент контролировали с помощью УФ (220 нм) и масс-спектрометра Waters Micromass ZQ (ЭРИ ионизация; напряжение на конусе: 20 В; Темп. источника: 120°C; Темп. десольватации: 350°C). Необработанный спектр, содержащий многозарядные ионы, подвергали деконволюции при использовании MaxEnt1 в пакете программ MassLynx 4.1 согласно инструкциям производителя.

B. Определение нагрузки на антителе с помощью МС

[224] Общее количество полезной нагрузки на антителе для получения ADC называют Отношение антитела-лекарственного средства или DAR. DAR вычисляли для каждого из полученных ADC конъюгатов (Таблица 12).

[225] Спектры для полного окна элюции (обычно 5 минут) объединяли в один суммированный спектр (т.е. масс-спектр, который представляет МС всего образца). Результаты МС для образцов ADC сравнивали непосредственно с соответствующим МС идентичного контрольного антитела без нагрузки. Это позволило идентифицировать пики нагруженной/ненагруженной тяжелой цепи (HC) и пики нагруженной/ненагруженной легкой цепи (LC). Отношение различных пиков можно использовать для установления нагрузки с помощью уравнения, приведенного ниже (Уравнение 1). Вычисления основаны на предположении, что нагруженные и ненагруженные цепи ионизируются одинаково, что определили как в целом действительное предположение.

[226] Следующее вычисление выполняли, чтобы установить DAR:

Уравнение 1:

Нагрузка=2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*[HC2/(HC0+HC1+HC2)]

Где указанные переменные представляют собой относительную интенсивность: LC0=ненагруженной легкой цепи, LC1=одиночно нагруженной легкой цепи, HC0=ненагруженной тяжелой цепи, HC1=одиночно нагруженной тяжелой цепи и HC2=дважды нагруженной тяжелой цепи. Среднему специалисту в данной области будет известно, что изобретение охватывает расширенный вариант данного вычисления, охватывающий молекулы с более высокой нагрузкой, такие как LC2, LC3, HC3, HC4, HC5 и т.п.

[227] Уравнение 2, представленое ниже, применяется для оценки величины нагрузки на немодифицированных остатках цистеина. В случае модифицированных Fc мутантов, нагрузка на легкой цепи (LC), как предполагали, по определению, является неспецифичной нагрузкой. Кроме того, предполагали, что нагрузка только на LC была результатом случайного восстановления HC-LC дисульфидного мостика (т.е. антитело было "перевосстановлено"). Учитывая, что в реакциях конъюгирования использовали большой избыток малеимидного электрофила (обычно приблизительно 5 эквивалентов для одиночных мутантов и 10 эквивалентов для двойных мутантов), предполагали, что любая неспецифичная нагрузка на легкой цепи сопровождалась соответствующим количеством неспецифичной нагрузки на тяжелой цепи (т.е. другой "половине" расщепленного HC-LC дисульфида). С учетом таких предположений, следующее уравнение (Уравнение 2) использовали для оценки величины неспецифичной нагрузки на белке:

Уравнение 2:

Неспецифичная нагрузка=4*[LC1/(LC1+LC0)]

Где обозначенные переменные представляют собой относительную интенсивность: LC0=ненагруженной легкой цепи, LC1=одиночно нагруженной легкой цепи.

Таблица 12: Отношение антитела-лекарственного средства (DAR) ADC конъюгатов

ADC DAR T(kK183C)-vc0101 2 T(K290C)-vc0101 2 T(K334C)-vc0101 2 T(K392C)-vc0101 2 T(kK183C+K290C)-vc0101 4 T(kK183C+K334C)-vc0101 4 T(kK183C+K392C)-vc0101 4 T(K290C+K334C)-vc0101 4 T(K290C+K392C)-vc0101 4 T(K334C+K392C)-vc0101 4 T(N297Q)-AcLysvc0101 4 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 4 T(N297A+K222R+LCQ05)-AcLysvc0101 4 T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 2 T-mc8261 4,2 T-m(H20)c8261 3,6 T-MalPeg8261 3,1 T-vc8261 4,3 T-mc6121 3,5 T-MalPeg6121 3,6 T-mc0101 4,8 T-vc0101 4,2 T-vc8254 4 T-vc6780 4,2 T-vc0131 4,5 T-MalPegMMAD 4,4 T-vcMMAE 3,8 T-DM1 4,2

C. Протеолиз с использовнием FabRICATOR ^® для определения сайта нагрузки

[228] В случае цистеин-мутантных ADC конъюгатов любое неспецифичное связывание электрофильной полезной нагрузки на антителе, как предполагают, проходит по "межцепочечным", также называемым "внутренними", остаткам цистеина (т.е. таким остаткам, которые, как правило, являются частью HC-HC или HC-LC дисульфидных мостиков). Для того чтобы отличить связывание электрофила на модифицированных цистеинах в Fc-домене от связывания на внутренних остатках цистеина (в ином случае, как правило, образующих S-S связи между HC-HC или HC-LC), конъюгаты обрабатывали протеазой, которая, как известно, расщепляет антитело между Fab-доменами и Fc-доменом. Одной из таких протеаз является цистеиновая протеаза IdeS, выпускаемая как "FabRICATOR^®" фирмой Genovis, и описанная в публикации von Pawel-Rammingen et al., 2002, EMBO J. 21:1607.

[229] Коротко, согласно предложенным производителем условиям, ADC обрабатывали протеазой FabRICATOR^® и инкубировали образец при 37°C в течение 30 минут. Образцы подготавливали для ЖХ-МС анализа, объединяя приблизительно 20 мкл образца (приблизительно 1 мг/мл в PBS) с 20 мкл 20 мМ дитиотреитола (ДТТ), и оставляли смесь при комнатной температуре на 5 минут. Такая обработка человеческого IgG1 приводила к образованию трех фрагментов антитела размером в пределах от приблизительно 23-26 кДа: LC фрагмент, включающий внутренний цистеин, который, как правило, образует LC-HC дисульфидную связь; N-концевой HC фрагмент, включающий три внутренних цистеина (где один, как правило, образует LC-HC дисульфидную связь, а другие два цистеина, присутствующие в шарнирной области антитела, как правило, образуют HC-HC дисульфидные связи между двумя тяжелыми цепями антитела); и C-концевой HC фрагмент, который не содержит реакционноспособных цистеинов кроме цистеинов, введенных в результате мутации в конструкции, раскрытые в настоящей заявке. Образцы анализировали с помощью МС, как описано выше. Вычисления нагрузки выполняли так же, как описано ранее (выше), для количественного определения нагрузки на LC, N-концевой области HC и C-концевой области HC. Нагрузку на C-концевой области HC считают "специфичной" нагрузкой, тогда как нагрузку на LC и N-концевой области HC считают "неспецифичной" нагрузкой.

[230] Для перекрестной проверки вычислений нагрузки, подгруппу ADC конъюгатов также оценивали на нагрузку с использованием альтернативных способов (способов, основанных на обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [офВЭЖХ] и хроматографии гидрофобного взаимодействия [HIC]), как более подробно описано в разделах ниже.

D. Анализ с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ

[231] Образцы для анализа методом обращенно-фазовой ВЭЖХ подготавливали, объединяя приблизительно 20 мкл образца (приблизительно 1 мг/мл в PBS) с 20 мкл 20 мМ дитиотреитола (ДТТ). Смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут, после чего образцы вводили в систему ВЭЖХ Agilent 1100, оснащенную колонкой Agilent Poroshell 300SB-C8 (2,1×75 мм). Температуру системы устанавливали на 60°C и контролировали элюент с помощью УФ (220 нм и 280 нм). Использовали 20-минутный градиент с 20% до 45% ацетонитрила в воде (с 0,1% ТФУ в качестве модификатора): T=0 мин: 25% ацетонитрила; T=2 мин: 25% ацетонитрила; T=19 мин: 45% ацетонитрила; и T=20 мин: 25% ацетонитрила. При использовании таких условий, HC и LC антитела разделяли до нулевой линии. Результаты данного анализа указывают, что LC остается по существу немодифицированной (за исключением антител, содержащих T(kK183C) и T(LCQ05)), тогда как HC модифицирована (данные не показаны).

E. Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)

[232] Соединения подготавливали к HIC анализу путем разведения образцов PBS до приблизительно 1 мг/мл. Образцы исследовали при автоматическом вводе 15 мкл в систему ВЭЖХ Agilent 1200 с колонкой TSK-GEL Butyl NPR (4,6×3,5 мм, размер пор 2,5 мкм; Tosoh Biosciences #14947). Система включает автодозатор с термостатом, нагреватель колонки и УФ-детектор.

[233] Метод градиента использовали следующим образом: Подвижная фаза A: 1,5М сульфата аммония, 50 мМ двухосновного фосфата калия, (pH 7); Подвижная фаза B: 20% изопропилового спирта, 50 мМ двухосновного фосфата калия (pH 7); T=0 мин: 100% A; T=12 мин: 0% A.

[234] Значения времени удерживания показаны в Таблице 13. Выбранные спектры показаны на ФИГ. 2A-2E. ADC конъюгаты, в которых применяется сайт-специфическое конъюгирование (T(kK183C+K290C)-vc0101, T(K334C+K392C)-vc0101 и T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101) (ФИГ. 1A-1C), показали, главным образом, один пик, тогда как ADC конъюгаты, в которых применяется обычное конъюгирование (T-vc0101 и T-DM1) (ФИГ. 2D-2E), показали смесь переменно нагруженных конъюгатов.

Таблица 13: Значения времени удерживания ADC при анализе с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC)

ADC RT (мин) RRT T-vc0101 8,8±0,1 1,68 T(kK183C)-vc0101 7,2±0,1 1,40 T(K334C)-vc0101 ND T(K392C)-vc0101 6,7±0,1 1,29 T(L443C)-vc0101 10,1±0,1 1,98 T(kK183C+K290C)-vc0101 9,0±0,0 1,77 T(kK183C+K334C)-vc0101 ND T(kK183C+K392C)-vc0101 7,7±0,1 1,54 T(kK183C+L443C)-vc0101 10,6 2,04 T(K290C+K334C)-vc0101 6,3±0,0 1,21 T(K290C+K392C)-vc0101 7,8±0,0 1,54 T(K334C+K392C)-vc0101 6,0±0,3 1,18 T(K392C+L443C)-vc0101 10,8±0,0 2,08 T(LCQ05+K222R)-AcLys-vc0101 6,5 1,27 T(N297A+K222R+LCQ05)-AcLys-vc0101 6,3±0,1 1,24 ND=не определяли
RT=время удерживания (в мин) на HIC
RRT=среднее относительное время удерживания, вычисленное по RT ADC конъюгата, деленное на RT референсного некоъюгированного трастузумаба дикого типа, имеющего типичное время удерживания 5,0-5,2 мин

F. Термостабильность

[235] Дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) использовали для определения термической стабильности цистеин- и трансглутаминаза-модифицированных вариантов антител и соответствующих сайт-специфических Aur-06380101 конъюгатов. Для данного анализа образцы, приготовленные в PBS-CMF, pH 7,2, вводили в кювету для образцов MicroCal VP-Capillary DSC с помощью автодозатора (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), уравновешивали в течение 5 минут при 10°C и затем сканировали до 110°C со скоростью 100°C в час. Был выбран период фильтрации 16 секунд. Исходные данные корректировали по нулевой линии и нормализовали концентрацию белка. Программу Origin Software 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) использовали для выравнивания данных согласно модели MN2State с соответствующим количеством переходов.

[236] Все варианты антител с одиночной и двойной цистеиновой модификацией, а также антитело с LCQ05 ацил-донорной глутамин-содержащей меткой показали превосходную термическую стабильность, как было определено первым переходом в расплав (Tm1) >65°C (Таблица 14).

[237] Также оценивали моноклональные антитела, полученные на основе трастузумаба, конъюгированные с 0101 при использовании методов сайт-специфического конъюгирования, и которые также показали исключительную термическую стабильность (Таблица 15). Однако Tm1 для T(K392C+L443C)-vc0101 ADC подверглась наиболее сильному воздействию при конъюгировании полезной нагрузки, так как она составила -4,35°C по сравнению с неконъюгированным антителом.

[238] В совокупности эти результаты продемонстрировали, что цистеин-модифицированные варианты антител и варианты антител с ацил-донорной глутамин-содержащей меткой являлись термически стабильными, и что сайт-специфическое конъюгирование 0101 через vc-линкер давало конъюгаты с превосходной термической стабильностью. Кроме того, более низкая термическая стабильность, наблюдаемая для T(K392C+L443C)-vc0101 по сравнению с неконъюгированным антителом, указывает, что конъюгирование 0101 через vc-линкер с некоторыми комбинациями модифицированных остатков цистеина может влиять на стабильность ADC.

Таблица 14: Термическая стабильность модифицированных вариантов на основе трастузумаба

Антитело Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm3 (°C) T(ĸK183C) 72,17±0,029 80,78±0,37 82,81±0,055 T(L443C) 72,02±0,06 80,98±1,10 82,96±0,11 T(LCQ05) 72,22±0,027 81,16±0,19 82,88±0,033 T(ĸK183C+K290C) 75,4 81,1 82,9 T(ĸK183C+K392C) 75 81 83 T(ĸK183C+L443C) 72,24±0,05 80,89±0,89 82,87±0,16 T(K290C+K334C) 75,0±0,14 83,0±0,1 81,1±0,4 T(K334C+K392C) 75,3±0,25 82,7±0,53 81,0±2,9 T(K290C+K392C) 77 81 83 T(K392C+L443C) 73,95±0,29 80,54±0,70 82,81±0,17

Таблица 15: Термическая стабильность сайт-специфических конъюгатов, конъюгированных с ауристатином 0101

Сайт-специфический конъюгат Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm3 (°C) Tm1_SSC-Tm1_Ab T(ĸK183C)-vc0101 70,16±0,03 80,45±0,12 82,04±0,03 -2,01 T(L443C)-vc0101 72,34±0,10 80,20±0,59 82,44±0,10 0,32 T(ĸK183C+L443C)-vc0101 70,11±0,02 78,89±0,59 81,38±0,10 -2,13 T(K392C+L443C)-vc0101 69,60±0,35 79,21±0,43 82,10±0,05 -4,35

Пример 8: Связывание ADC с HER2

A. Прямое связывание

[239] Клетки BT474 (HTB-20) трипсинизировали, центрифугировали и ресуспендировали в новой среде. Затем клетки инкубировали с серийными разведениями ADC конъюгатов или неконъюгированного трастузумаба с начальной концентрацией 1 мкг/мл в течение одного часа при 4°C. Затем клетки два раза промывали охлажденным во льду PBS и инкубировали с вторичным Alexafluor-488 антителом против антител человека (кат# A-11013, Life technologies) в течение 30 мин. Затем клетки два раза промывали, после чего ресуспендировали в PBS. Среднюю интенсивность флуоресценции считывали при помощи проточного цитометра Accuri (BD Biosciences San Jose, CA).

Таблица 16: Связывание ADC с HER2

ADC/Ab EC₅₀ трастузумаб 0,37 T(kK183C+K392C)-vc0101 0,56 T(kK183C+K290C)-vc0101 0,47 T(K290C+K392C)-vc0101 0,32 T-DM1 (Кадсила) 0,40 T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 0,37 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 0,36

EC50=концентрация антитела или ADC, которая дает полумаксимальное связывание.

[240] Как показано на ФИГ. 3A и в Таблице 16, ADC конъюгаты T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101, T(kK183C+K290C)-vc0101, T(kK183C+K392C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101 обладали подобными аффинностями связывания, как T-DM1 и трастузумаб, при прямом связывании. Это указывает, что модификации в антителе в ADC конъюгатах согласно настоящему изобретению и добавление линкера-полезной нагрузки не оказывали значимого влияния на связывание.

B. Конкурентное связывание согласно FACS

[241] Клетки BT474 трипсинизировали, центрифугировали и ресуспендировили в новой среде. Затем клетки инкубировали в течение одного часа при 4°C с серийными разведениями ADC конъюгатов или неконъюгированного трастузумаба, объединенного с 1 мкг/мл трастузумаба-ФЭ (1:1 ФЭ-меченый трастузумаб, специально синтезированный в eBiosciences (San Diego, CA)). Затем клетки два раза промывали, после чего ресуспендировали в PBS. Среднюю интенсивность флуоресценции считывали при помощи проточного цитометра Accuri (BD Biosciences San Jose, CA).

[242] Как показано на ФИГ. 3B, ADC конъюгаты T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101, T(kK183C+K290C)-vc0101, T(kK183C+K392C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101 обладали подобными аффинностями связывания, как T-DM1 и трастузумаб, при конкурентном связывании с ФЭ-меченым трастузумабом. Это указывает, что модификации в антителе в ADC конъюгатах согласно настоящему изобретению и добавление линкера-полезной нагрузки не оказывало значимого влияния на связывание.

Пример 9: Связывание ADC с человеческим FcRn

[243] На данный момент считается, что FcRn взаимодействует с IgG независимо от субтипа pH-зависимым образом и защищает антитело от деградации, препятствуя его попаданию в лизосомальный компартемент, где антитело расщепляется. Таким образом, соображение по выбору положений для введения реакционноспособных цистеинов в IgG1-Fc область дикого типа состояло в том, чтобы избежать изменения связывающих свойств FcRn и полупериода существования антитела, включающего модифицированный цистеин.

[244] Анализ BIAcore^® проводили с целью определения аффинности в равновесном состоянии (KD) для полученных на основе трастузумаба моноклональных антител и их соответствующих ADC конъюгатов при связывании с человеческим FcRn. Технология BIAcore^® использует изменения показателя преломления в поверхностном слое сенсора при связывании моноклональных антител на основе трастузумаба или их соответствующих ADC конъюгатов с человеческим белком FcRn, иммобилизированным на поверхности сенсора. Связывание обнаруживали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при преломлении луча лазера в поверхностном слое. Человеческий FcRn специфично биотинилировали через введенную Avi-метку при использовании реактива BirA (номер по каталогу: BIRA500, Avidity, LLC, Aurora, Colorado) и иммобилизировали на стрептавидиновом (SA) сенсоре для обеспечения одинаковой ориентации белка FcRn на сенсоре. Затем над поверхностью чипа пропускали различные концентрации моноклональных антител на основе трастузумаба или их соответствующих ADC конъюгатов в 20 мМ MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты, pH 6,0, с 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,5% ПАВ P20 (MES-EP). Поверхность регенерировали при использовании HBS-EP+0,05% ПАВ P20 (GE Healthcare, Piscataway, NJ), pH 7,4, между циклами ввода образцов. Аффинности связывания в равновесном состоянии моноклональных антител на основе трастузумаба или их соответствующих ADC конъюгатов определяли и сравнивали с антителом дикого типа (трастузумабом, который не содержит никаких цистеиновых мутаций в Fc-области IgG1, не имеет никакой ТГаза-модифицированной метки или сайт-специфического конъюгирования полезной нагрузки).

[245] Эти данные продемонстрировали, что включение модифицированных остатков цистеина в Fc-область IgG в указанных положениях согласно изобретению не изменяло аффинность к FcRn (Таблица 17).

Таблица 17: Аффинность в равновесном состоянии сайт-специфических конъюгатов при связывании с FcRn человека

K_D [нМ] Эксперимент 1 K_D [нМ] Эксперимент 2 K_D [нМ] Эксперимент 3 Трастузумаб WT 1050,0 705,8 859,2 T-DM1 ND 500,8 ND T(K290C+K334C) 987,0 ND ND T(K290C+K334C)-vc0101 1218,0 ND ND T(K334C+K392C) 834,1 ND ND T(K334C+K392C)-vc0101 1404,0 ND ND T(ĸK183C+K290C) 1173,0 ND ND T(ĸK183C+K290C)-vc0101 473,8 ND ND T(ĸK183C+K392C) 1009,0 ND ND T(ĸK183C+K392C)-vc0101 672,5 ND ND T(ĸK183C)-vc0101 961,5 ND ND T(LCQ05) 900,9 ND ND T(LCQ05)-vc0101 1050,0 ND ND T(K392C) ND 468,3 ND T(K392C)-vc0101 ND 518,8 ND T(N297Q)-vc0101 ND 647,9 ND T(ĸK183C+K334C)-vc0101 ND 416,5 ND T(ĸK183C+K443C) ND 542,8 ND T(ĸK183C+K443C)-vc0101 ND 287,5 ND T(K290C) ND ND 650,3 T(K290C)-vc0101 ND ND 874,6 T(K290C+K392C)-vc0101 ND ND 554,7 T(K334C) ND ND 631,6 T(K334C)-vc0101 ND ND 791,2 T(K392C+K443C) ND ND 601,7 T(K392C+K443C)-vc0101 ND ND 197,9

ND=не определяли

Пример 10: Связывание ADC с Fcγ-рецепторами

[246] Связывание ADC конъюгатов с применением сайт-специфического конъюгирования с рецепторами Fc-γ человека оценивали с целью исследования, вызывает ли конъюгирование с полезной нагрузкой изменение связывания, что может влиять на функциональные свойства антитела, такие как антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). FcγIIIa (CD16) экспрессируется на NK-клетках и макрофагах, и одновременное связывание этого рецептора с клетками, экспрессирующими мишень, при связывании с антителом вызывает ADCC. Анализ BIAcore^® использовали для исследования связывания моноклональных антител, полученных на основе трастузумаба, и их соответствующих ADC конъюгатов с Fc-γ рецепторами IIa (CD32a), IIb (CD32b), IIIa (CD16) и FcγRI (CD64).

[247] Для этого анализа, основанного на явлении поверхностного плазмонного резонанса (SPR), внеклеточный домен рекомбинантного белка человеческого рецептора эпидермального фактора роста 2 (Her2/neu) (Sino Biological Inc., Beijing, P.R. China) иммобилизировали на чипе CM5 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и захватывали ~300-400 единиц ответа (RU) моноклонального антитела на основе трастузумаба или его соответствующего ADC. T-DM1 включали в данный анализ в качестве положительного контроля, так как было показано, что он сохраняет связывающие свойства после конъюгирования с Fcγ-рецепторами на уровне, сопоставимом с неконъюгированным антителом трастузумабом. Затем различные концентрации Fcγ-рецепторов FcγIIa (CD32a), FcγIIb (CD32b), FcγIIIa (CD16a) и FcγRI (CD64) пропускали над поверхностью и определяли связывание.

[248] FcγR IIa, IIb и IIIa показали высокие скорости ассоциации/диссоциации, и поэтому сенсограммы выравнивали при использовании модели равновесного состояния с получением значений K_D. FcγRI показал более низкие скорости ассоциации/диссоциации, таким образом, данные выравнивали при использовании кинетической модели с получением значений K_D.

[249] Конъюгирование полезной нагрузки в положениях модифицированных цистеинов 290 и 334 показало умеренную потерю аффинности к FcγR, в особенности к CD16a, CD32a и CD64, по сравнению с соответствующими неконъюгированными антителами-аналогами и T-DM1 (Таблица 18). Впрочем, одновременное конъюгирование на сайтах 290, 334 и 392 приводило к существенной потере аффинности к CD16a, CD32a и CD32b, но не к CD64, как наблюдали в случае с T(K290C+K334C)-vc0101 и T(K334C+K392C)-vc0101 (Таблица 18). Примечательно, что T(ĸK183C+K290C)-vc0101 демонстрировал сопоставимое связывание со всеми FcγR, которые оценивали в данном исследовании, несмотря на присутствие лекарственной полезной нагрузки в положении K29°C (Таблица 18). Как ожидали, трансглутаминаза-опосредованно конъюгированный T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 не связывался ни с одним из оцениваемых Fcγ-рецепторов, поскольку присутствие в таком положении ацил-донорной глутамин-содержащей метки приводит к устранению N-связанного гликозилирования. С другой стороны, T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 сохранял полное связывание с Fcγ-рецепторами, поскольку глутамин-содержащую метку вводили в константную область легкой каппа цепи человека.

[250] В совокупности, эти результаты указывают, что положение конъюгированной полезной нагрузки может влиять на связывание ADC с FcγR и может влиять на функциональность антитела в конъюгате.

Таблица 18: Аффинность связывания сайт-специфических конъюгатов для связывания Fcγ-рецепторов с CD16a, CD32a, CD32b и CD64

K_D [M] FcγRIIIa (CD16a)
[мкМ] FcγRIIa
(CD32a)
[мкМ] FcγRIIb
(CD32b)
[мкМ] FcγRI (CD64)
[пМ] Трастузумаб WT мАт 0,36 0,74 4,08 23 T-DM1 ADC 0,30 0,53 2,97 27 T(K290C)-vc0101 1,20 1,70 3,74 185 T(K334C)-vc0101 0,81 1,42 4,74 ND T(K290C+K334C)-vc0101 5,14 6,30 6,38 110 T(K334C+K392C)-vc0101 2,38 4,18 11,30 43 T(K392C)-vc0101 0,45 0,73 4,33 ND T(ĸK183C+K290C)-0101 0,47 0,70 3,63 37 T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 0,43 0,62 3,41 32 T(N297Q-K222R)-AcLysvc0101 NB NB NB NB

NB=не определяли, NB=нет связывания

Пример 11: ADCC активности

[251] В анализах ADCC, Her2-экспрессирующие линии клеток BT474 и SKBR3 использовали в качестве клеток-мишеней, тогда как клетки NK-92 (линия интерлейкин-2-зависимых NK-клеток, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови 50-летнего белого мужчины в компании Conkwest) или мононуклеары периферической крови человека (МКПК), выделенные из недавно забранной крови здорового донора (#179), использовали в качестве эффекторных клеток.

[252] Клетки-мишени (BT474 или SKBR3) в количестве 1×10⁴ клеток/100 мкл/лунка помещали в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи в среде RPMI1640 при 37°C/5% CO₂. На следующий день среду удаляли и заменяли 60 мкл буфера для анализа (среда RPMI1640, содержащая 10 мМ HEPES), 20 мкл 1 мкг/мл антитела или ADC, после чего добавляли 20 мкл суспензии 1×10⁵ (для SKBR3) или 5×10⁵ (для BT474) МКПК или 2,5×10⁵ клеток NK92 обеих клеточных линий в каждую лунку, с получением отношения эффектора к мишени 50:1 для BT474 или 25:1 для SKBR3 в случае МКПК, 10:1 в случае NK92. Все образцы исследовали в трех повторностях.

[253] Планшеты инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение 6 часов и затем уравновешивали до комнатной температуры. Высвобождение ЛДГ при лизисе клеток измеряли при использовании реактива CytoTox-One™ при длине волны возбуждения 560 нм и длине волны эмиссии 590 нм. В качестве положительного контроля добавляли 8 мкл Triton для получения максимального высвобождения ЛДГ в контрольных лунках. Специфическую цитотоксичность, показанную на ФИГ. 4, вычисляли при использовании следующей формулы:

"Экспериментальный" соответствует сигналу, измеренному при одном из условий, описанных выше.

"Эффектор спонтанный" соответствует сигналу, измеренному в присутствии только МКПК.

"Мишень спонтанный" соответствует сигналу, измеренному в присутствии только клеток-мишеней.

"Мишень максимальный" соответствует сигналу, измеренному в присутствии только лизированных детергентом клеток-мишеней.

[254] На ФИГ. 4 показаны ADCC активности, полученные для трастузумаба, T-DM1 и vc0101 ADC конъюгатов. Данные соотвестсвуют ADCC активностям, описанным для Трастузумаба и T-DM1. Поскольку мутация N297Q прсутствует на сайте гликозилирования, предполагали, что T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 не будет обладать ADCC активностью, что было также подтверждено в анализах. В случае ADC конъюгатов с одиночной мутацией (K183C, K290C, K334C, K392C, включающих LCQ05) ADCC активность сохранялась. Неожиданно, ADC конъюгаты с двойной мутацией (K183C+K290C, K183C+K392C, K183C+K334C K290C+K392C, K290C+K334C, K334C+K392C) сохраняли ADCC активность во всех случаях кроме двух ADC конъюгатов с двойной мутацией, связанных с сайтом K334C (K290C+K334C и K334C+K392C).

Пример 12: Исследования цитотоксичности in vitro

[255] Конъюгаты антитела-лекарственного средства получали, как указано в Примере 3. Клетки сеяли в 96-луночные планшеты при низкой плотности, затем на следующий день обрабатывали ADC конъюгатами и неконъюгированными полезными нагрузками в 3-кратных серийных разведениях при 10 концентрациях в двойной повторности. Клетки инкубировали в течение 4 дней при 37°C/5% CO₂ в увлажняемой камере. Материал с планшетов собирали при инкубировании с раствором CellTiter^® 96 AQueous One MTS (Promega, Madison, WI) в течение 1,5 часов и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре Victor (PerkinElmer, Waltham, MA) при длине волны 490 нм. Значения IC₅₀ вычисляли при использовании четырехпараметрической логистической модели с XLfit (IDBS, Bridgewater, NJ) и представляли в концентрации полезной нагрузки в нМ на Фиг. 5 и концентрации антитела в нг/мл на ФИГ. 6. Представлены значения IC₅₀ +/- стандартное отклонение с количеством независимых определений в круглых скобках.

[256] ADC конъюгаты, содержащие линкер-полезную нагрузку vc-0101 или AcLysv-0101, обладали высокой активностью против моделей Her2-позитивных клеток и селективностью против Her2-негативных клеток по сравнению с референсным ADC, T-DM1 (Кадсила).

[257] ADC конъюгаты, синтезированные с применением сайт-специфического конъюгирования с трастузумабом, показали высокую активность и селективность против моделей Her2-клеток. В частности, несколько трастузумаб-vc0101 ADC конъюгатов являлись более активными, чем T-DM1, в моделях клеток со средней или низкой экспрессией Her2. Например, IC₅₀ цитотоксичности in vitro для T(kK183C+K290C)-vc0101 на клетках MDA-MB-175-VII (с 1+ экспрессией Her2) составляет 351 нг/мл, по сравнению с 3626 нг/мл для T-DM1 (в ~10 раз ниже). Для клеток с 2++ уровнем экспрессии Her2, таких как клетки MDA-MB-361-DYT2 и MDA-MB-453, IC₅₀ для T(kK183C+K290C)-vc0101 составила 12-20 нг/мл, по сравнению с 38-40 нг/мл для T-DM1.

Пример 13: Ксенотрансплантатные модели

[258] Полученные на основе трастузумаба ADC конъюгаты согласно изобретению тестировали в ксенотрансплантатной модели рака желудка N87, ксенотрансплантатной модели рака легкого 37622 и различных ксенотрансплантатных моделях рака молочной железы (т.е. моделях HCC 1954, JIMT-1, MDA-MB-361 (DYT2) и 144580 (PDX)). В случае каждой модели, описанной ниже, первую дозу вводили в День 1. Опухоли измеряли по меньшей мере один раз в неделю, и их объем вычисляли согласно формуле: объем опухоли (мм³)=0,5×(ширина опухоли²)(длина опухоли). Средние объемы опухоли (±S.E.M.) для каждой контрольной группы вычисляли при включении в группу максимум 8-10 животных и минимум 6-8 животных.

A. Ксенотрансплантаты рака желудка N87

[259] Действие полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов у иммунодефицитных мышей исследовали в отношении роста ксенотрансплантатов человеческих опухолей in vivo, которые были получены из клеточной линии N87 (ATCC CRL-5822), которая имеет высокий уровень экспрессии HER2. Для получения ксенотрансплантатов самкам голых мышей (Nu/Nu, Charles River Lab, Wilmington, MA) подкожно имплантировали 7,5×10⁶ клеток N87 в 50% Матригеле (BD Biosciences). Когда опухоли достигли объема 250-450 мм³, стадию опухоли определяли, чтобы гарантировать однородность опухолевой массы в разных группах лечения. Животным в модели рака желудка N87 4 раза внутривенно, с интервалом 4 дня (Q4d×4) вводили растворитель PBS, трастузумаб ADC конъюгаты (в дозе 0,3, 1 и 3 мг/кг) или T-DM1 (1, 3 и 10 мг/кг) (ФИГ. 7).

[260] Данные демонстрируют, что полученные на основе трастузумаба ADC конъюгаты ингибировали рост ксенотрансплантатов рака желудка N87 дозо-зависимым образом (ФИГ. 7A-7H).

[261] Как показано на ФИГ. 7I, T-DM1 ингибировал рост опухолей при дозе 1 и 3 мг/кг и вызывал полную регрессию опухолей при дозе 10 мг/кг. При этом T(kK183C+K290C)-vc0101 обеспечивал полную регрессию при дозе 1 и 3 мг/кг и частичную регрессию при дозе 0,3 мг/кг (ФИГ. 7A). Данные показывают, что T(kK183C+K290C)-vc0101 значительно более активный (в ~10 раз), чем T-DM1 в данной модели.

[262] Аналогичная эффективность in vivo ADC конъюгатов с DAR4 (ФИГ. 6E, 6F и 6G) была получена по сравнению с 183+290 (ФИГ. 7A). Кроме того, оценивали одиночные мутанты, которые являются DAR2 ADC конъюгатами (ФИГ. 7B, 7C и 7D). В целом такие ADC конъюгаты менее эффективны по сравнению с DAR4 ADC конъюгатами, но более эффективны, чем T-DM1. Среди DAR2 ADC конъюгатов LCQ05 представляется наиболее активным ADC на основе данных эффективности in vivo.

B. Ксенотрансплантаты рака молочной железы HCC1954

[263] HCC1954 (ATCC# CRL-2338) является линией клеток рака молочной железы с высокой экспрессией HER2. Для получения ксенотрансплантатов самкам мышей SHO (Charles River, Wilmington, MA) подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток HCC1954 в 50% Матригеле (BD Biosciences). Когда опухоли достигали объема 200-250 мм³, определяли стадию опухолей, чтобы гарантировать однородность опухолевой массы в различных группах лечения. В модели рака молочной железы HCC1954 животным внутривенно вводили Q4d×4 растворитель PBS, трастузумаб-производные ADC конъюгаты и ADC отрицательного контроля (ФИГ. 8A-8E).

[264] Данные демонстрируют, что трастузумаб ADC конъюгаты ингибировали рост ксенотрансплантатов рака молочной железы HCC1954 дозо-зависимым образом. При сравнении в дозе 1 мг/кг, vc0101 конъюгаты являлись более эффективными, чем T-DM1. При сравнении в дозе 0,3 мг/кг, DAR4 нагруженные ADC конъюгаты (ФИГ. 8B, 8C и 8D) являлись более эффективными, чем DAR2 нагруженный ADC (ФИГ. 8A). Кроме того, ADC отрицательного контроля в дозе 1 мг/кг оказывал лишь незначительное влияние на рост опухоли по сравнению с контролем растворителем (ФИГ. 8D). Однако T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 вызывал полную регрессию опухолей, что указывает на специфичность к мишени.

C. Ксенотрансплантаты рака молочной железы JIMT-1

[265] JIMT-1 - линия клеток рака молочной железы, экспрессирующая средние/низкие уровни Her2 и изначально устойчивая к трастузумабу. Для получения ксенотрансплантатов самкам голых (Nu/Nu) мышей подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток JIMT-1 (DSMZ# ACC-589) в 50% Матригеле (BD Biosciences). Когда опухоли достигали объема 200-250 мм³, определяли стадию опухолей, чтобы гарантировать однородность опухолевой массы в различных группах лечения. В модели рака молочной железы JIMT-1 животным внутривенно вводили Q4dx4 растворитель PBS, T-DM1 (ФИГ. 9G), трастузумаб-производные ADC конъюгаты с применением сайт-специфического конъюгирования (ФИГ. 9A-9E), трастузумаб-производный ADC с применением обычного конъюгирования (ФИГ. 9F) и huNeg-8.8 ADC отрицательного контроля.

[266] Данные демонстрируют, что все исследованные vc0101 конъюгаты вызывали уменьшение опухолей дозо-зависимым образом. Эти ADC конъюгаты могут вызывать регрессию опухоли в дозе 1 мг/кг. Однако T-DM1 неактивен в данной модели со средней/низкой экспрессией Her2 даже в дозе 6 мг/кг.

D. Ксенотрансплантаты рака молочной железы MDA-MB-361 (DYT2)

[267] MDA-MB-361 (DYT2) является линией клеток рака молочной железы, экспрессирующей средние/низкие уровни Her2. Для получения ксенотрансплантатов самок голых (Nu/Nu) мышей облучали при мощности дозы 100 сГр/мин в течение 4 минут и через три дня подкожно имплантировали 1,0×10⁷ клеток MDA-MB-361 (DYT2) (ATCC# HTB-27) в 50% Матригеле (BD Biosciences). Когда опухоли достигали объема 300-400 мм³, определяли стадию опухоли, чтобы гарантировать однородность опухолевой массы в различных группах лечения. В модели рака молочной железы DYT2 животным внутривенно вводили Q4dx4 растворителя PBS, трастузумаб-производных ADC конъюгатов с использованием сайт-специфического и обычного конъюгирования, T-DM1 и ADC отрицательного контроля (ФИГ. 10A-10D).

[268] Данные демонстрируют, что трастузумаб ADC конъюгаты ингибировали рост ксенотрансплантатов рака молочной железы DYT2 дозо-зависимым образом. Хотя DYT2 является линией клеток со средними/низкими уровнями экспрессии Her2, она более чувствительна к ингибиторам микротрубочек, чем другие линии клеток с низкой/средней экспрессией Her2.

E. Полученные от пациента ксенотрансплантаты рака молочной железы 144580

[269] Действие полученных на основе трастузумаба ADC конъюгатов исследовали у иммунодефицитных мышей на рост in vivo ксенотрансплантатов человеческих опухолей, которые были получены из фрагментов недавно удаленных опухолей молочной железы 144580, полученных в соответствии с надлежащими процедурами согласия. Анализ опухоли 144580 при взятии новой биопсии показал трижды негативную (ER-, PR- и HER2-) опухоль молочной железы. Полученные от пациента ксенотрансплантаты рака молочной железы 144580 подкожно перевивали in vivo в виде фрагментов от животного животному у самок голых (Nu/Nu) мышей. Когда опухоли достигали объема 150-300 мм³, определяли их стадию, чтобы гарантировать однородность размера опухолей в различных группах лечения. В модели рака молочной железы 144580 животным внутривенно вводили четыре дозы раз в четыре дня (Q4d×4) растворителя PBS, трастузумаб ADC конъюгатов с использованием сайт-специфического конъюгирования, трастузумаб-производного ADC с использованием обычного конъюгирования и ADC отрицательного контроля (ФИГ. 11A-11E).

[270] В этой HER2-(по клиническому определению) PDX модели, T-DM1 не был эффективен ни в одной из протестированных доз (1, 5, 3 и 6 мг/кг) (ФИГ. 10E). В случае DAR4 vc0101 ADC конъюгатов (ФИГ. 11А, 11C и 11D), доза 3 мг/кг могла вызывать регрессию опухоли (даже в дозе 1 мг/кг на ФИГ. 11C). DAR2 VC0101 ADC (ФИГ. 11B) оказался менее эффективным, чем DAR4 ADC конъюгаты при дозе 3 мг/кг. Однако DAR 2 vc0101 ADC эффективен при дозе 6 мг/кг в отличие от T-DM1.

F. Полученный от пациента ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого 37622

[271] Несколько ADC конъюгатов тестировали в модели с полученным от пациента ксенотрансплантатом немелкоклеточного рака легкого 37622, полученного в соответствии с надлежащими процедурами согласия. Полученные от пациента ксенотрансплантаты 37622 подкожно перевивали in vivo в виде фрагментов от животного животному у самок голых (Nu/Nu) мышей. Когда опухоли достигали объема 150-300 мм³, определяли их стадию, чтобы гарантировать однородность размера опухолей в различных группах лечения. В модели PDX 37622 животным внутривенно вводили четыре дозы раз в четыре дня (Q4dx4) растворителя PBS, трастузумаб-производных ADC конъюгатов с использованием сайт-специфического конъюгирования, T-DM1 и ADC отрицательного контроля (ФИГ. 12A-12D).

[272] Профили экспрессии Her2 определяли с помощью модифицированного теста Hercept и классифицировали как 2+ с более высокой гетерогенностью, чем наблюдаемой в клеточных линиях. ADC конъюгаты, конъюгированные с vc0101 в качестве линкера-полезной нагрузки (ФИГ. 12A-12C), были эффективными в дозах 1 и 3 мг/кг, вызывающих регрессию опухоли. Однако T-DM1 показали лишь небольшую терапевтическую эффективность при дозе 10 мг/кг (ФИГ. 12D). По-видимому, vc0101 ADC конъюгаты в 10 раз более активны, чем T-DM1, при сравнении результатов в случае дозы 10 мг/кг для T-DM1 и 1 мг/кг для vc0101 ADC конъюгатов. Вероятно, что неспецифическое действие важно для эффективности в отношении гетерогенной опухоли.

[273] Высвобождаемый метаболит T-DM1 ADC, как было показано, являлся лизином-кэпированным линкером-полезной нагрузкой mcc-DM1 (т.е. Lys-mcc-DM1), который является соединением, не способным проникать через мембрану (Kovtun et al., 2006, Cancer Res 66:3214-21; Xie et al., 2004, J Pharmacol Exp Ther 310:844). При этом высвобождаемым из T-vc0101 ADC метаболитом является ауристатин 0101, соединение с более высокой мембранной проницаемостью, чем Lys-mcc-DM1. Способность высвобождаемой из ADC полезной нагрузки уничтожать соседние клетки известна как неспецифическое действие. Вследствие высвобождения мембранопроникающей полезной нагрузки, T-vc0101 способен вызывать сильное неспецифическое действие, а T-DM1 нет. На ФИГ. 13 показана иммуногистоцитохимия ксенотрансплантатных опухолей из линии клеток N87, которые обрабатывали однократной дозой 6 мг/кг T-DM1 (ФИГ. XA) или 3 мг/кг T-vc0101 (ФИГ. XB), а затем собирали и фиксировали формалином через 96 часов. Срезы опухолей окрашивали на IgG человека для обнаружения ADC, связанного с опухолевыми клетками, и фосфогистон H3 (pHH3), для обнаружения митотических клеток в качестве наблюдения предполагаемого механизма действия для полезных нагрузок обоих ADC конъюгатов.

[274] ADC обнаруживали по периферии опухолей в обоих случаях. В опухолях, обработанных T-DM1 (ФИГ. 13A), большинство pHH3-положительных опухолевых клеток располагалось около ADC. Однако в опухолях, обработанных T-vc0101 (ФИГ. 13B), большинство pHH3-положительных опухолевых клеток выходило за пределы локализации ADC (черными стрелками указаны несколько примеров), и находилось внутри опухоли. Это позволяет предположить, что ADC с расщепляемым линкером и мембранопроникающей полезной нагрузкой может вызывать сильное неспецифическое действие in vivo.

Пример 14: Модели резистентности к T-DM1 in vitro

A. Получение T-DM1 резистентных клеток in vitro

[275] Клетки N87 пересевали в две отдельных колбы и каждую колбу идентично обрабатывали в соответствии с протоколом получения резистентности для получения биологических дубликатов. Клетки подвергали пяти циклам обработки конъюгатом T-DM1 приблизительно при IC₈₀ концентрациях (концентрация полезной нагрузки 10 нМ) в течение 3 дней, с последующим восстановлением в течение приблизительно 4-11 дней без обработки. После пяти циклов при 10 нМ конъюгата T-DM1, клетки подвергали шести дополнительным циклам обработки 100 нМ T-DM1 аналогичным образом. Процедура была предназначена для моделирования долговременного, мультицикличного (обработка/перерыв) дозирования в максимально переносимых дозах, обычно используемых для цитотоксических средств в клинике, с последующим периодом восстановления. Исходные клетки, полученные из N87, обозначены как N87, и клетки, которые подвергали длительному воздействию T-DM1, обозначены как N87-™. Умеренная или высокая устойчивость к лекарственному средству развивалась в течение 4 месяцев для клеток N87-™. Слективное давление лекарственного средства снимали через ~3-4 месяца циклов обработки, когда уровень устойчивости уже не увеличивался после продолжения воздействия лекарственного средства. Реакции и фенотипы оставались стабильными в культивируемых линиях клеток в течение приблизительно 3-6 месяцев после этого. Затем иногда наблюдали снижение величины фенотипа устойчивости при измерении с помощью анализов цитотоксичности, и в этом случае криоконсервированные резистентные к Т-DM1 клетки ранних пассажей размораживали для дополнительных исследований. Все описанные исследования проводили после снятия селективного пресса T-DM1 по меньшей мере на 2-8 недель, чтобы обеспечить стабилизацию клеток. Данные собирали с различными размороженными криоконсервированными популяциями, полученными при одном отборе, за приблизительно 1-2 года после разработки модели, чтобы гарантировать согласованность результатов. Линию клеток рака желудка N87 отбирали по резистентности к конъюгату антитела-лекарственного средства, трастузумабу-майтанзиноиду (T-DM1), в циклах обработки в дозах, которые составляли приблизительно IC₈₀ (~10 нМ концентрацию полезной нагрузки) для соответствующей клеточной линии. Исходные клетки N87 были изначально чувствительными к конъюгату (IC₅₀=1,7 нМ концентрация полезной нагрузки; концентрация антитела 62 нг/мл) (ФИГ. 14). Две популяции исходных клеток N87 подвергали циклам обработки, и после цикличного воздействия в течение всего лишь приблизительно четырех месяцев 100 нМ T-DM1 две указанных популяции (далее называемых N87-TM-1 и N87-TM-2) стали рефракторными к ADC в 114 и 146 раз, соответственно, по сравнению с исходными клетками (ФИГ. 14 и ФИГ. 15A). Примечательно, что наблюдалась минимальная перекрестная резистентность (~2,2-2,5×) к соответствующему неконъюгированному свободному майтанзиноидному лекарственному средству, DM1 (ФИГ. 14).

B. Исследования цитотоксичности

[277] ADC конъюгаты были получены, как указано в Примере 3. Неконъюгированный аналог майтанзина (DM1) и аналоги ауристатина были получены в Pfizer Worldwide Medicinal Chemistry (Groton, CT). Другие химиотерапевтические средства стандарта лечения приобретали в Sigma (St. Louis, MO). Клетки сеяли в 96-луночные планшеты при низкой плотности, затем на следующий день обрабатывали ADC конъюгатами и неконъюгированными полезными нагрузками в 3-кратных серийных разведениях при 10 концентрациях в двойной повторности. Клетки инкубировали в течение 4 дней при 37°C/5% CO₂ в увлажняемой камере. Материалы с планшетов собирали при инкубировании с раствором CellTiter^® 96 AQueous One MTS (Promega, Madison, WI) в течение 1,5 часов и оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре Victor (PerkinElmer, Waltham, MA) при длине волны 490 нм. Значения IC₅₀ вычисляли при использовании четырехпараметрической логистической модели с XLfit (IDBS, Bridgewater, NJ).

[278] Определяли профиль перекрестной резистентности к другим трастузумаб-производным ADC конъюгатам. Наблюдали значимую перекрестную резистентность ко многим полученным на основе трастузумаба ADC конъюгатам, состоящим из нерасщепляемых линкеров и доставляемых полезных нагрузок с антитубулиновым механизмом действия (ФИГ. 14). Например, в клетках N87-™ в сравнении с исходными клетками N87 наблюдали >330- и >272-кратное снижение активности с T-mc8261 (ФИГ. 14 и ФИГ. 15B) и T-MalPeg8261 (ФИГ. 14), которые представляют собой полезные нагрузки на основе ауристатина, связанные с трастузумабом через нерасщепляемые малеимидокапроил или Mal-PEG линкеры, соответственно. Более чем 235-кратную резистентность наблюдали в клетках N87-™ против T-mcMalPegMMAD, другого трастузумаб-ADC, с другим нерасщепляемым линкером, доставляющим монометил-доластатин (MMAD) (ФИГ. 14).

[279] Примечательно то, что наблюдали, что линия клеток N87-™ сохраняла чувствительность к полезным нагрузкам в случае доставки через расщепляемый линкер, даже несмотря на то, что такие лекарственные средства функционально ингибируют подобные мишени (т.е. деполимеризация микротрубочек). Примеры ADC конъюгатов, которые преодолевают устойчивость, включают, без ограничения перечисленными, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 (ФИГ. 14 и ФИГ. 15C), T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 (ФИГ. 14 и ФИГ. 15D), T(K290C+K334C)-vc0101 (ФИГ. 10 и ФИГ. 11E), T(K334C+K392C)-vc0101 (ФИГ. 14 и ФИГ. 15F) и T(kK183C+K290C)-vc0101 (ФИГ. 14 и ФИГ. 15G). Они представляют собой ADC конъюгаты на основе трастузумаба, доставляющие аналог ауристатина 0101, но высвобождают полезные нагрузки внутриклеточно, при протеолитическом расщеплении vc линкера.

[280] Для определения, обладают ли такие ADC-резистентные раковые клетки широкой устойчивостью к другим терапиям, модели с клетками N87-TM обрабатывали группой химиотерапевтических средств стандарта лечения, имеющих разные механизмы действия. В целом, низкомолекулярные ингибиторы микротрубочек и функции ДНК сохраняли эффективность против резистентных линий клеток N87-TM (ФИГ. 14). Хотя такие клетки приобрели резистентность к ADC, доставляющему аналог деполимеризующего микротрубочки средства, майтанзина, минимальную перекрестную резистентность или ее отсутствие наблюдали к нескольким деполимеризующим или полимеризующим тубулин средствам. Аналогичным образом, обе клеточные линии сохраняли чувствительность к средствам, которые нарушали функцию ДНК, в том числе к ингибиторам топоизомеразы, антиметаболитам и алкилирующим/сшивающим средствам. В целом, клетки N87-TM не были рефракторными к широкому спектру цитотоксических средств, за исключением характерных нарушений развития или клеточного цикла, которые могут имитировать резистентность к лекарственным средствам.

[281] Обе популяции N87-™ также сохраняли чувствительность к соответствующим неконъюгированным лекарственным средствам (т.е. DM1 и 0101; ФИГ. 14). Следовательно, клетки N87-™, сделанные рефракторными к конъюгату трастузумаба-майтанзиноида, демонстрировали перекрестную резистентность к другим ADC конъюгатам на основе ингибиторов микротрубочек, при доставке посредством нерасщепляемых линкеров, но оставались чувствительными к неконъюгированным ингибиторам микротрубочек и другим химиотерапевтическим средствам.

[282] Для определения молекулярного механизма устойчивости к T-DM1 в клетках N87-™, определяли уровни экспрессии белков MDR1 и MRP1, эффлюксных насосов, обеспечивающих лекарственную резистентность. Это объяснялось тем, что низкомолекулярные ингибиторы тубулина являются известными субстратами эффлюксных насосов лекарственных средств MDR1 и MRP1 (Thomas and Coley, 2003, Cancer Control 10(2):159-165). Определяли уровни экспрессии этих двух белков в суммарных клеточных лизатах исходных N87 и N87-™ резистентных клеток (ФИГ. 16). Иммуноблот-анализ показал, что резистентные клетки N87-™ имеют незначительно повышенную экспрессию белков MRP1 (ФИГ. 16A) или MDR1 (ФИГ. 16B). В совокупности эти данные, в сочетании с отсутствием перекрестной резистентности к известным субстратам эффлюксных насосов лекарственных средств (например, паклитакселу, доксорубицину) в клетках N87-™, дают основание предполагать, что оверэкспрессия эффлюксных насосов лекарственных средств не является молекулярным механизмом резистентности к T-DM1 в клетках N87-™.

[283] Поскольку механизм действия ADC конъюгатов требует связывания со специфическим антигеном, истощение антигена или пониженное связывание антитела могут объяснять резистентность к T-DM1 в клетках N87-™. Для определения, был ли антиген T-DM1 значимо истощен в клетках N87-™, сравнивали уровни экспрессии белка HER2 в суммарных клеточных лизатах исходных N87 и N87-™ резистентных клеток (ФИГ. 17A). Иммуноблот-анализ показал, что в клетках N87-™ уровень экспрессии белка HER2 не был заметно понижен по сравнению с исходными клетками N87.

[284] Определяли количество антитела, связанного с HER2 антигенами клеточной поверхности клеток N87-™. В исследовании связывания с клеточной поверхностью при использовании сортировки флуоресцентно активированных клеток, клетки N87-™ действительно показали ~50% уменьшение связывания трастузумаба с антигенами клеточной поверхности (ФИГ. 17B). Поскольку клетки N87 имеют высокую экспрессию белка HER2 среди линий раковых клеток (Fujimoto-Ouchi et al., 2007, Cancer Chemother Pharmacol 59(6):795-805), ~50% уменьшение связывания антитела с HER2 в этих клетках, вероятно, не представляет ведущий механизм устойчивости к T-DM1 в клетках N87-™. Доказательством, подтверждающим такую интерпретацию, служит то, что резистентные клетки N87-™ остаются чувствительными к другим HER2-связывающим, полученным на основе трастузумаба ADC конъюгатам с другими линкерами и полезными нагрузками (ФИГ. 14).

[285] Для определения потенциальных механизмов резистентности к T-DM1 в объективном методе, модели с исходными N87 и N87-™ резистентными клетками подвергали протеомному анализу для глобального определения изменений уровней экспрессии мембранных белков, которые могут отвечать за устойчивость T-DM1. Наблюдали значительные изменения уровня экспрессии 523 белков в обеих моделях клеточных линий (ФИГ. 18A). Для подтверждения выбора таких предполагаемых белковых изменений, проводили иммуноблоттинг лизатов клеток N87 и N87-™ для анализа белков с продполагаемой пониженной экспрессией (IGF2R, LAMP1, CTSB) (ФИГ. 18B) и повышенной экспрессией (CAV1) (ФИГ. 18C) в клетках N87-™ по сравнению с клетками N87. Опухоли in vivo были получены при подкожной имплантации клеток N87 и N87-TM-2 мышам NSG для оценки, повторяют ли белковые изменения, наблюдаемые in vivo, результаты, отмеченные in vitro. Опухоли N87-TM-2 сохраняли оверэкспрессию белка CAV1 по сравнению с опухолями N87 (ФИГ. 18D). Хотя ожидали окрашивание CAV1 в строме мышей в обеих моделях, эпителиальное окрашивание CAV1 наблюдали только в модели N87-TM-2.

C. Исследования эффективности in vivo

[286] Для определения, повторяется ли in vivo устойчивость, наблюдаемая в клеточной культуре, исходные клетки N87 и клетки N87-TM-2 размножали и вводили в бока самок мышей NOD scid gamma (NSG) с иммунодефицитом (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), полученных из Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Мышам в правый бок подкожно вводили суспензии клеток N87 или N87-™ (7,5×10⁶ клеток на одну инъекции с 50% Матригелем). Мышей рандомизировано распределяли в исследуемые группы, когда опухоли достигали ~0,3 г (~250 мм³). Конъюгат T-DM1 или растворитель вводили внутривенно в солевом растворе в день 0 и повторно, с введением в общей сложности четырех доз, с интервалом в четыре дня (Q4D×4). Опухоли измеряли еженедельно и вычисляли массу как объем=(ширина×ширина×длина)/2. Проводили анализ времени до наступления события (двухкратное увеличение опухоли) и оценивали значимость с использованием логарифмического рангового критерия (Мантела-Кокса). В этих исследованиях у мышей ни в одной из групп лечения не наблюдали потери веса.

[287] Мышей обрабатывали следующими средствами: (1) контроль растворителем PBS, (2) антитело трастузумаб в дозе 13 мг/кг, затем 4,5 мг/кг; (3) T-DM1 в дозе 6 мг/кг; (4) T-DM1 в дозе 10 мг/кг; (5) T-DM1 в дозе 10 мг/кг, затем T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 в дозе 3 мг/кг; (6) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 в дозе 3 мг/кг. Размеры опухолей контролировали, и результаты показаны на Фигуре 20. Опухоли N87 (ФИГ. 19 и ФИГ. 20A) и N87-TM-2 (ФИГ. 19 и ФИГ. 20B) показали профиль эффективности ADC, аналогичный наблюдаемому в анализах цитотоксичности in vitro (ФИГ. 19 и 20B), где устойчивые к лекарственному средству клетки N87-™ были рефракторными к T-DM1, но при этом отвечали на полученные на основе трастузумаба ADC конъюгаты с расщепляемыми линкерами. Фактически, опухоли, которые были рефракторными к T-DM1 и выросли до массы приблизительно 1 грамм, были переведены на терапию T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 и эффективно регрессировали (ФИГ. 20B). В анализе времени до наступления события в этом исследовании, T-DM1 в дозах 6 и 10 мг/кг предотвращал двухкратное увеличение опухоли у >50% мышей в течение по меньшей мере 60 дней в модели N87, однако T-DM1 не был так же эффективен в модели N87-TM-2 (ФИГ. 2°C и 20D). T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101, вводимый в дозе 3 мг/кг, предотвращал двухкратное увеличение обеих опухолей N87 и N87-™ у мышей в течение всего исследования (~80 дней) (ФИГ. 2°C и 20D).

[288] В другом исследовании все связанные расщепляемыми линкерами ADC конъюгаты, которые преодолевали устойчивость к T-DM1 in vitro, оставались эффективными в данной модели опухоли N87-TM2, которая не отвечала на T-DM1 (ФИГ. 19 и ФИГ. 20E).

[289] После этого оценивали, был ли способен T(kK183+K290C)-vc0101 ADC ингибировать рост опухолей, которые были рефракторными к TDM1. Опухоли N87-™, обработанные растворителем или T-DM1, росли в ходе такой обработки, однако опухоли, переведенные на терапию T(kK183C+K290C)-vc0101 в день 14, сразу регрессировали (ФИГ. 20F).

Пример 15: In vivo T-DM1-резистентные модели

A. Получение резистентных к T-DM1 клеток in vivo

[290] Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию исследовательского центра компании Pfizer в Перл-Ривер согласно установленным рекомендациям. Для получения ксенотрансплантатов самкам голых (Nu/Nu) мышей подкожно имплантировали 7,5×10⁶ клеток N87 в 50% Матригеле (BD Biosciences). Когда средний объем опухоли достиг ~300 мм³, животных рандомизировано распределяли в две группы: 1) контроль растворителем (n=10) и 2) введение T-DM1 (n=20). T-DM1 ADC (6,5 мг/кг) или растворитель (PBS) вводили внутривенно в солевом растворе в день 0, после чего животным раз в неделю вводили дозу 6,5 мг/кг в течение периода продолжительностью до 30 недель. Опухоли измеряли два или один раз в неделю и вычисляли массу как объем=(ширина×ширина×длина)/2. В этих исследованиях у мышей ни в одной из групп лечения не наблюдали потери веса.

[291] Животных считали рефракторными или рецидивирующими при обработке T-DM1, когда объем отдельных опухолей достигал ~600 мм³ (двухкратное увеличение от исходного размера опухоли при рандомизации). По сравнению с контрольной группой большинство опухолей первоначально отвечали на обработку T-DM1, как показано на ФИГ. 21A. В частности, 17 из 20 мышей отвечали на первичную обработку T-DM1, однако значимое количество опухолей (13 из 20) рецидивировали при обработке T-DM1. С течением времени имплантированные опухолевые клетки N87 становились резистентными к T-DM1 (ФИГ. 21B). Три опухоли, которые первоначально не отвечали на лечение T-DM1, собирали для определения экспрессии Her2 с помощью ИГХ, показавшей отсутствие изменений экспрессии HER2. Остальные 10 рецидивировавших опухолей описаны ниже.

[292] Четыре опухоли, которые первоначально отвечали на обработку T-DM1 и затем рецидивировали, были переведены на обработку T-vc0101 раз в неделю в дозе 2,6 мг/кг в день 77 (мыши 1 и 16), 91 (мышь 19), 140 (мышь 6). Как показано на ФИГ. 19C, T-DM1-резистентные опухоли, полученные in vivo, отвечали на T-vc0101, что указывает на то, что полученные T-DM1-резистентные опухоли чувствительны к обработке vc0101 ADC.

[293] Еще три опухоли первоначально отвечали на обработку T-DM1 и затем рецидивировали, после чего были переведены на обработку T (N297Q+K222R)-AcLysvc0101 раз в неделю в дозе 2,6 мг/кг в день 110 (мыши 4, 13 и 18). Как показано на ФИГ. 21D, T-DM1-резистентные опухоли, полученные in vivo, также отвечали на T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101. Последующий эксперимент проводили для оценки T(kK183C+K290C)-vc0101, при этом были получены подобные результаты, что указывает на то, что T-DM1-резистентные опухоли, полученные in vivo, были чувствительны к обработке T(kK183C+K290C)-vc0101, как показано на ФИГ. 21E.

[294] В заключение следует отметить, что все рефракторные к T-DM1 опухоли, подвергнутые последующей обработке, были чувствительны к vc0101 ADC (7 из 7), что указывает на то, что in vivo резистентные к T-DM1 опухоли можно лечить расщепляемыми vc0101 конъюгатами.

[295] Дополнительные три опухоли (мышь 7, 17 и 2, как показано на ФИГ. 21B) первоначально отвечали на T-DM1 и затем рецидивировали, после чего были удалены для исследования in vitro. После 2-5 месяцев культивирования изъятых опухолей in vitro эти клетки оценивали на резистентность к T-DM1 и исследовали in vitro (см. Разделы B и C данного Примера ниже).

B. Исследования цитотоксичности

[296] Клетки, рецидивировавшие при обработке T-DM1 и культивируемые in vitro (как описано в Разделе A данного Примера), сеяли в 96-луночные планшеты и на следующий день вводили 4-кратные серийные разведения ADC конъюгатов или неконъюгированных полезных нагрузок. Клетки инкубировали в течение 96 часов при 37°C/5% CO₂ в увлажняемой камере. В планшеты добавляли раствор CellTiter Glo (Promega, Madison, WI) и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре Victor (PerkinElmer, Waltham, MA) при длине волны 490 нм. Значения IC₅₀ вычисляли при использовании четырехпараметрической логистической модели с XLfit (IDBS, Bridgewater, NJ).

[297] Результаты скрининга цитотоксичности представлены в Таблицах 19 и 20. Клетки были резистентными к T-DM1 (ФИГ. 22A) по сравнению с исходным, но чувствительными к расщепляемым vc0101 конъюгатам T-vc0101 (данные не показаны), T(kK183C+K290C)-vc0101 (ФИГ. 22B), T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 (ФИГ. 22C) и T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 (ФИГ. 22D) (Таблица 19). Резистентные к T-DM1 клетки неожиданно оказались чувствительными к исходной полезной нагрузке DM1, а также к полезной нагрузке 0101 (Таблица 20).

Таблица 19: Чувствительность резистентных клеток к ADC конъюгатам

ADC N87 исходные N87-T-DM1
Мышь #7 N87-T-DM1
Мышь #17 N87-T-DM1
Мышь #2 Кратная резистентность T-DM1 16 1388 944 3700 ~60-230 T(kK183C+K290C)-vc0101 5 - - 5 1 T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 25 9 10 18 ~1 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 9 7 13 16 ~1 T(K334C+K392C)-vc0101 6 - 11 4 ~1 T(K290C+K334C)-vc0101 6 - 16 4 ~1-2

Значения IC₅₀ показаны для каждой из клеточных линий

Таблица 20: Чувствительность резистентных клеточных линий к свободной полезной нагрузке

Клеточная линия DM1-Sme Aur-0101 Доксорубицин N87 10 0,5 48 N87-T-DM1_Ms2 23 0,40 46 N87-T-DM1_Ms7 20 0,60 79 N87-T-DM1_Ms17 27 0,28 34

C. Экспрессия Her2 согласно FACS и Вестерн-блоттингу

[298] Экспрессию Her2 исследовали на клетках, рецидивировавших при обработке T-DM1 и культивируемых in vitro (как описано в Разделе A данного Примера). Для анализа FACS клетки трипсинизировали, центрифугировали и ресуспендировили в новой среде. Затем клетки инкубировали в течение одного часа при 4°C с 5 мкг/мл Трастузумаба-ФЭ (меченый 1:1 ФЭ трастузумаб, специально синтезированный в eBiosciences (San Diego, CA)). Затем клетки два раза промывали и ресуспендировали в PBS. Среднюю интенсивность флуоресценции регистрировали при использовании проточного цитометра Accuri (BD Biosciences, San Jose, CA).

[299] Для Вестерн-блоттинга клетки лизировали при использовании лизирующего буфера RIPA (с ингибиторами протеаз и ингибитором фосфатазы) на льду в течение 15 минут, затем обрабатывали на вортексе и центрифугировали на максимальной скорости в микроцентрифуге при 4°C. Супернатант собирали и добавляли 4× буфер для образцов и восстанавливающий агент с нормализацией образцов по общему содержанию белка в каждом образце. Образцы разделяли в 4-12% бис-трис геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в течение часа и инкубировали с антителом к HER2 (Cell Signalling, 1:1000) в течение ночи при 4°C. Затем мембраны 3 раза промывали в 1× TBST и инкубировали с HRP-антителом против антител мыши (Cell Signalling, 1:5000) в течение 1 часа, 3 раза промывали и проявляли.

[300] Уровни экспрессии HER2 в T-DM1 рецидивировавших опухолях были аналогичны показателям в контрольных опухолях (без обработки T-DM1) согласно анализу FACS (ФИГ. 23A) и Вестерн-блоттингу (ФИГ. 23B).

D. Резистентность к T-DM1 не обусловлена экспрессией эффлюксных насосов лекарственных средств

[301] Клеточные линии не экспрессируют MDR1 согласно Вестерн-блоттингу (ФИГ. 24A), при этом клетки не резистентны к субстрату MDR-1, свободному лекарственному средству 0101 (ФИГ. 24B). Не наблюдали резистентности к доксорубицину (ФИГ. 24C), что указывает на то, что механизм резистентности не опосредован MRP1. Однако клетки все же являются резистентными к свободному DM1 (ФИГ. 24D).

Пример 16: Фармакокинетика (ФК)

[302] Экспозицию обычных или сайт-специфических vc0101 конъюгатов антитела-лекарственного средства определяли после в/в болюсного введения дозы 5 или 6 мг/кг яванским макакам. Концентрации суммарного антитела (суммарное Ат; измерение конъюгированного мАт и неконъюгированного мАт), и ADC (мАт, который конъюгирован по меньшей мере с одной молекулой лекарственного средства) измеряли с помощью анализов связывания лиганда (LBA). ADC был получен с использованием vc0101 во всех случаях, за исключением T(LCQ05), в котором использовали AcLysvc0101. Обычное конъюгирование (не сайт-специфическое конъюгирование) использовали для получения ADC из трастузумаба.

[303] Профили зависимости концентрации от времени и фармакокинетика/токсикокинетика суммарного Ат и трастузумаб-ADC (T-vc0101) (5 мг/кг) или T(kK183C+K290C) сайт-специфического ADC (6 мг/кг) после введения дозы яванским макакам (ФИГ. 25A и Таблица 21). Воздействие T(kK183C+K290C) сайт-специфического ADC характеризовалось повышенной экспозицией и стабильностью по сравнению с обычным конъюгатом.

[304] Профили зависимости концентрации от времени и фармакокинетика/токсикокинетика ADC аналита трастузумаба (T-vc0101) (5 мг/кг) или T(kK183C+K290C), T(LCQ05), T(K334C+K392C), T (K290C+K334C), T(K290C+K392C) и T(kK183C+K392C) сайт-специфического ADC (6 мг/кг) после введения дозы яванским макакам (ФИГ. 25B и Таблица 21). Экспозиция нескольких сайт-специфических ADC (T(LCQ05), T(kK183C+K290C), T(K290C+K392C) и T(kK183C+K392C)) более высокая по сравнению с трастузумабом-ADC с использованием обычного конъюгирования. Однако экспозиция двух других сайт-специфических ADC (T(K290C+K334C) и T(K334C+K392C)) не превышала экспозицию трастузумаба-ADC, что указывает на то, что не все сайт-специфические ADC конъюгаты будут обладать более высокими фармакокинетическими свойствами, чем трастузумаб-ADC, полученный при использовании обычного конъюгирования.

Таблица 21: Фармакокинетика

мАт/ADC Доза (мг/кг) Аналит Cmax (мкг/мл) AUC (0-336 ч)(мкг⋅ч/мл) трастузумаб 5 Суммарное Ат 157 11100 ADC 154 7660 T(K290C+K334C) 6 Суммарное Ат 165 5770 ADC 163 5060 T(K334C+K392C) 6 Суммарное Ат 159 5320 ADC 157 4770 T(LCQ05) 5 Суммарное Ат 165±19 16400±1020 ADC 164±22 16300±989 T(kK183C+K290C) 6 Суммарное Ат 187 16800 ADC 181 15300 T(K183C+K392C) 6 Суммарное Ат 195 18500 ADC 196 16900 T(K290C+K392C) 6 Суммарное Ат 205 13300 ADC 208 12300

Пример 17: Значения относительного удерживания в хроматографии гидрофобного взаимодействия в зависимости от экспозиции (AUC) у крыс.

[305] Гидрофобность является физическим свойством белка, которое можно оценивать с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), при этом время удерживания образцов белка отличается в зависимости от их относительной гидрофобности. ADC конъюгаты можно сравнивать с их соответствующим антителом путем вычисления относительного времени удерживания (RRT), которое является отношением времени удерживания в HIC для ADC, деленного на время удерживания в HIC соответствующего антитела. Сильно гидрофобные ADC конъюгаты имеют большее RRT, при этом возможно, что такие ADC конъюгаты также могут иметь более высокую фармакокинетическую лабильность, в частности меньшую площадь под кривой (AUC или экспозицию). Когда HIC значения ADC конъюгатов с мутациями различных сайтов сравнивали с их измеренной AUC у крыс, наблюдали распределение, показанное на ФИГ. 26.

[306] ADC конъюгаты с RRT≥1,9 показали меньшие значения AUC, тогда как ADC конъюгаты с меньшим RRT обычно имели большую AUC, хотя отношение не было прямым. ADC T(kK183C+K290C)-vc0101, как наблюдали, имел относительно большее RRT (среднее значение 1,77), и поэтому ожидали, что он будет иметь относительно меньшую AUC. Неожиданно, наблюдаемая AUC была относительно высокой, следовательно, не возможно однозначно прогнозировать экспозицию такого ADC на основе данных гидрофобности.

Пример 18: Исследования токсичности

[307] В двух независимых поисковых исследованиях токсичности в общей сложности десять самок и самцов яванских макаков распределяли в 5 групп дозирования (1/пол/доза) и в/в вводили дозы раз в 3 недели (дни исследования 1, 22 и 43). В день исследования 46 (через 3 дня после 3-го введения дозы) животных усыпляли и забирали указанные в протоколе образцы крови и ткани. Клинические наблюдения, клиническую лабораторную диагностику, макроскопические и микроскопические лабораторные исследования проводили прижизненно и при вскрытии. Для исследования анатомической патологии степень выраженности нарушений, обнаруженных в гистопатологических исследованиях, регистрировали на субъективной, относительной, специфической для исследования основе.

[308] В поисковых исследованиях токсичности у яванских макаков при дозе 3 и 5 мг/кг, T-vc0101 вызывал транзиторную, но заметную (390/мкл) или тяжелую (40/мкл до не поддающейся обнаружению) нейтропению в День 11 после первой дозы. В то же время, при дозе 9 мг/кг, ни у одного из яванских макаков, получавших T(kK183C+K290C)-vc0101, не наблюдали или наблюдали минимальную нейтропению, причем количество нейтрофилов значимо превышало 500/мкл в любой момент тестирования (ФИГ. 27). Фактически, получавшие T(kK183C+K290C)-vc0101 животные показали среднее количество нейтрофилов (>1000 в мкл) в день 11 и 14 по сравнению с контролем растворителем.

[309] При микроскопическом исследовании в костном мозге при дозе 3 и 5 мг/кг, яванские макаки, получавшие T-vc0101, имели связанное с лекарственным соединением повышение М/Э отношения. Повышенное миелоидноэритроидное (М/Э) отношение было обусловлено снижением эритроидных клеток-предшественников в сочетании с увеличением первичных зрелых гранулоцитов. В то же время, при дозе 6 и 9 мг/кг только самец, получавший T(kK183C+K290C)-vc0101 в 6 мг/кг/доза, имел минимально или умеренно повышенную насыщенность ткани зрелыми гранулоцитами (данные не показаны).

[310] Таким образом, гемологические и микроскопические данные четко показали, что ADC конъюгат на основе технологии сайт-специфической мутации, T(kK183C+K290C)-vc010, заметно снижал вызванную T-vc010 миелотоксичность и нейтропению.

Пример 19: Кристаллическая структура ADC

[311] Кристаллические структуры были получены для T(K290C+K334C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101 и T(K334C+K392C)-vc0101. Эти конкретные ADC конъюгаты были выбраны для кристаллографии, так как конъюгирование с двойными цистеиновыми вариантами K290C+K334C и K334C+K392C, но не с K290C+K392C, устраняло ADCC активность.

[312] Конъюгированные Fc-области подготавливали к кристаллографии путем расщепления ADC конъюгатов папаином. Кристаллы одной и той же морфологии были получены для трех конъюгированных IgG1-Fc областей при использовании одинаковых условий: 100 мМ цитрата Na, pH 5,0,+100 мМ MgCl₂+15% ПЭГ-4000.

[313] Структуры человеческого IgG1-Fc дикого типа, депонированные в PDB, являются относительно подобными, что демонстрирует то, что CH2-CH2 домены контактируют друг с другом через Asn297-связанные гликаны (углеводные или гликановые антенны), и что CH3-CH3 домены формируют стабильный интерфейс, который является относительно константным в различных структурах. Структуры Fc существуют в "закрытой" или "открытой" конформации, причем структура дегликозилированных Fc принимает структуру "открытой" конформации, что демонстрирует то, что гликановые антенны удерживают вместе CH2 области. Кроме того, опубликованная структура неконъюгированного Phe241Ala-IgG1 Fc мутанта (Yu et al., "Engineering Hydrophobic

[314] Protein-Carbohydrate interactions to fine-tune monoclonal antibodies". JACS 2013) показывает один частично разупорядоченный CH2 домен, поскольку такая мутация приводит к дестабилизации CH2-гликанового интерфейса и CH2-CH2 интерфейса, так как ароматический остаток Phe не может стабилизировать углевод.

[315] "CH2 домен" Fc-области IgG человека (также называемый "Cγ2" доменом) обычно располагается от аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340. CH2 домен уникален тем, что он непосредственно не спарен с другим доменом. Напротив, две N-связанных разветвленных углеводных цепи расположены между двумя CH2 доменами интактной нативной молекулы IgG. Предполагали, что углевод способен заменять междоменное спаривание и может способствовать стабилизации CH2 домена (Burton et al., 1985, Molec. Immunol. 22: 161-206).

[316] "CH3 домен" включает фрагмент, расположенный на C-конце относительно CH2 домена в Fc-области (т.е. от аминокислотного остатка 341 до приблизительно аминокислотного остатка 447 в IgG).

[317] Установленные структуры Fc-областей T(K290C+K334C)-vc0101 и T(K290C+K392C)-vc0101 являлись сходными, что демонстрирует то, что Fc-димер содержал один CH2 и оба CH3, которые были высокоупорядоченными (как в Fc дикого типа). Однако они также содержат разупорядоченный CH2 с присоединенным гликаном (ФИГ. 28A и ФИГ. 28B). Более высокую степень дестабилизации одного CH2 домена связывали с непосредственной близостью сайтов конъюгирования с гликановыми антеннами. С учетом геометрии полезной нагрузки 0101, конъюгирование на любом из сайтов K290, K334, K392 может нарушать общую траекторию гликана с его удалением от поверхности CH2, вызывая дестабилизацию гликана и структуры самого CH2, и, как следствие, CH2-CH2 интерфейса (ФИГ. 28C). Более высокая степень гетерогенности доступна для таких 0101 сайт-специфически конъюгированных двойных цистеиновых Fc-вариантов по сравнению с Fc WT, Phe241Ala-Fc или дегликозилированным Fc. Когда положения модифицированных цистеиновых вариантов картировали на структуре Fc WT в комплексе с FcγR IIb типа, было показано, что конъюгирование по C334 могло напрямую препятствовать связыванию с FcγRIIb (ФИГ. 28C). Такая гетерогенность в расположении CH2, вызванная мутацией или конъюгированием, могла приводить к значимому уменьшению связывания с FcRIIb. Поэтому такие результаты позволяют предположить, что гетерогенность конформации или конъюгирование 0101 с некоторыми комбинациями модифицированных цистеинов в IgG1-Fc могли по отдельности или вместе влиять на ADCC активность двойных цистеиновых вариантов содержащих сайт K334C.

Пример 20: Применение сайт-специфического конъюгирования на других антителах

[318] Сайты и модификации, применяемые для получения сайт-специфических HER2 ADC конъюгатов согласно изобретению, могут применяться на антителах, направленных против других антигенов, и при этом будут обеспечивать более высокую эффективность по сравнению со стандартно конъюгированными ADC конъюгатами.

[319] Антитело A (направленное на опухолеассоциированный антиген) превращали в ADC с применением обычного конъюгирования, а также сайт-специфического конъюгирования. В обоих случаях использовали линкер vc и лекарственное средство ауристатин 0101. В случае сайт-специфического конъюгирования сайты K183 на легкой цепи антитела и K290 в CH2 области тяжелой цепи антитела (при использовании EU индекса Кэбата) изменяли на цистеин (C) для конъюгирования с линкером/полезной нагрузкой.

[320] Способы, применяемые для получения сайт-специфического ADC, аналогичны способам, применяемым для получения T(kK183C+K290C)-vc0101 (выше). Эффективность конъюгирования составляла 61%, и конъюгированое антитело имело среднее DAR 4 с профилем HIC-RRT, аналогичным T(kK183C+K290C)-vc0101.

[321] Оценивали термическую стабильность сайт-специфического конъюгата (SSC), и самая низкая температура плавления SSC составила 65°C, что указывает на достаточную стабильность. Связывание SSC с его целевым опухолевым антигеном также оценивали в сравнении с неконъюгированным антителом, и при этом никакого снижения связывающей способности в анализах связывания на основе ИФА не обнаружили, что указывает на хорошее сохранение аффинности связывания после конъюгирования с линкером полезной нагрузки vc0101.

[322] Затем цитотоксичность in vitro оценивали на линиях опухолевых клеток с повышенной экспрессией опухолевого антигена. SSC обладал сопоставимой цитотоксической активностью с обычным ADC в анализе цитотоксичности с использованием различных линий опухолей. Исследования эффективности in vivo затем проводили на ксенотрансплантатных моделях опухолей, инокулированных опухолевыми клетками с повышенной экспрессией опухолевого антигена. В одной модели при дозе 3 мг/кг, SSC приводил к полной регрессии опухоли после введения 4 доз два раза в неделю. Регрессия опухоли сохранялась приблизительно до 60 дней после введения последней дозы, когда наблюдали возобновление роста опухоли. В отличие от этого, хотя обычный ADC, дозируемый по такой же схеме, также приводил к регрессии опухоли после введения 4 доз, возобновление роста опухоли наблюдали приблизительно через 30 дней после введения последней дозы, намного раньше, чем в случае SSC. Подобные результаты лучшего сохранения эффективности регрессии опухоли наблюдали в исследованиях эффективности на другой модели опухоли. Эти данные указывают, что сайт-специфический конъюгат антитела A на основе kK183C+K29°C лучше сохранял экспозицию у животных после введения доз, чем полученный стандартным способом ADC конъюгат, что указывает на то, что улучшенная стабильность SSC приводит к более высоким фармакокинетическим параметрам.

Пример 21. Разные сайты конъюгирования приводят к разным свойствам ADC

A. Общая методика синтеза cys-мутантных ADC конъюгатов:

[323] Использовали следующие два LP:

LP#1

LP#2

[324] Раствор трастузумаба, включающего модифицированный остаток цистеина (как показано в таблице ниже), приготавливали в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,4. PBS, ЭДТА (0,5 М сток) и TCEP (0,5 М сток) добавляли таким образом, чтобы конечная концентрация белка составила 10 мг/мл, конечная концентрация ЭДТА составила 20 мМ, и конечная концентрация TCEP составила приблизительно 6,6 мМ (100 молярных экв.). Реакцию оставляли при кт на 48 ч, затем меняли буфер на PBS при использовании колонок GE PD-10 Sephadex G25 согласно инструкциям производителя. Полученный раствор обрабатывали приблизительно 50 эквивалентами дегидроаскорбата (50 мМ сток в EtOH/воде 1:1). Антитело оставляли на ночь при 4°C и затем меняли буфер на PBS при использовании колонок GE PD-10 Sephadex G25 согласно инструкциям производителя. Варианты вышеуказанной методики с небольшими изменениями применяли для некоторых мутантов

[325] Антитело, полученное таким образом, разбавляли до ~2,5 мг/мл в PBS, содержащем 10% DMA (об/об), и обрабатывали LP#1 (10 молярных экв.) в виде 10 мМ стокового раствора в DMA. Через 2 ч при кт, смесь подвергали замене буфера на PBS (как указано выше) и очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex200. Мономерные фракции концентрировали и стерилизовали фильтрацией с получением конечного ADC. См. Таблицу 22 ниже по поводу показателей продукта.

Таблица 22: Описание свойств ADC:

Пример Мутант трастузумаба ЖХ-МС DAR
(моль/моль) HIC DAR (моль/моль) ЖХ-МС Наблюдаемый массовый сдвиг ЖХ-МС Ожидаемый массовый сдвиг % мономера HIC RT Главный пик (мин) HIC относительное время удерживания (RRT) ADC#1 1,9 1,74 1342 1341 94% 7,15 1,40 ADC#2 каппа-183C 2 2 1341 1341 99% 7,05 1,38 ADC#3 2,1 2,1 1341 1341 99% 7,85 1,53 ADC#4 2,1 2,1 1341 1341 99% 5,90 1,15 ADC#5 1,9 NA 1341 1341 99% 8,41 1,64 ADC#6 2 NA 1340 1341 99% 6,23 1,22 ADC#7 2 1,9 1341 1341 99% 7,93 1,55 ADC#8 1,9 NA 1340 1341 97% 8,75 1,71 ADC#9 2,1 2,1 1341 1341 98% 6,60 1,29 ADC#10 1,9 NA 1342 1341 93% 8,20 1,60 ADC#11 2 2 1344 1341 90% 9,10 1,78 ADC#12 каппа-183C+K334C 3,7 NA 1341 1341 95% 7,00 1,37 ADC#13 каппа-183C+392C 4 4 1342 1341 97% 7,70 1,50 ADC#14 290C+334C 4 4 1342 1341 97% 6,03 1,18 ADC#15 334C+392C 4 4 1343 1341 97% 5,91 1,15 ADC#16 392C+443C 3,2 NA 1340 1341,68 97% 10,85 2,12 Трастузумаб NA 5,12 1,00

B. Общие аналитические методы для примеров конъюгирования

[326] ЖХ-МС: Колонка=Waters BEH300-C4, 2,1×100 мм (P/N=186004496); Прибор=Acquity UPLC с масс-спектрометрическим детектором SQD2; Скорость потока=0,7 мл/мин; Температура=80°C; Буфер A=вода+0,1% муравьиной кислоты; Буфер B=ацетонитрил+0,1% муравьиной кислоты. Градиент: с 3% B до 95% B за 2 минуты, выдержка при 95% B в течение 0,75 мин, затем повторное уравновешивание при 3% B. Образец восстанавливали TCEP или ДТТ непосредственно перед вводом. Элюат контролировали с помощью ЖХ-МС (400-2000 дальтон), и деконволюцию белкового пика выполняли при использовании MaxEnt1. DAR указана как средневесовая нагрузка.

[327] SEC: Колонка: Superdex200 (5/150 GL); Подвижная фаза: Фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 2% ацетонитрила, pH 7,4; Скорость потока=0,25 мл/мин; Температура=окружающая; Прибор: Agilent 1100 HPLC.

[328] HIC: Колонка: TSKGel Butyl NPR, 4,6 мм × 3,5 см (P/N=S0557-835); Буфер A=1,5 М сульфат аммония, содержащий 10 мМ фосфат, pH 7; Буфер B=10 мМ фосфат, pH 7,+20% изопропилового спирта; Скорость потока=0,8 мл/мин; Температура=окружающая; Градиент=0% B до 100% B за 12 минут, выдержка при 100% B в течение 2 минут, затем повторное уравновешивание при 100% A; Прибор: Agilent 1100 HPLC.

C. Определение гидрофобности сайт-специфических vc0101 конъюгатов

[329] Конъюгаты ADC#1-ADC#16 оценивали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (метод выше) для определения относительной гидрофобности различных конъюгатов. Гидрофобность ADC, как было описано, коррелировала с общей экспозицией антитела.

[330] Конъюгаты по сайтам 334, 375 и 392 демонстрировали наименьшее изменение времени удерживания по сравнению с немодифицированным антителом, тогда как конъюгаты по сайтам 421, 443 и 347 показали наибольшее изменение времени удерживания. Относительную гидрофобность каждого ADC вычисляли путем деления времени удерживания ADC на время удерживания немодифицированного антитела, с получением, таким образом, "относительного времени удерживания" или "RRT". RRT ~1 указывает, что ADC обладает приблизительно такой же гидрофобностью, что и немодифицированное антитело. RRT для каждого ADC показано в Таблице 22.

D. Стабильность сайт-специфических vc0101 ADC конъюгатов в плазме

[331] Образцы ADC (~1,5 мг/мл) разводили в мышиной, крысиной или человеческой плазме с получением конечного раствора 50 мкг/мл ADC в плазме. Образцы инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂, и отбирали аликвоты в трех моментах времени (0, 24 ч и 72 ч). В каждый момент времени образцы ADC после инкубирования с плазмой (25 мкл) дегликозилировали IgG0 при 37°C в течение 1 ч. После дегликозилирования добавляли захватывающее антитело (биотинилированный фрагмент Fcγ IgG1 козы против антител человека, специфичное при 1 мг/мл, в случае плазмы мыши и крысы или биотинилированное антитело против трастузумаба при 1 мг/мл в случае человеческой плазмы) и нагревали смесь при 37°C в течение 1 ч с последующим мягким встряхиванием при комнатной температуре в течение второго часа. Магнитные гранулы Dynabead MyOne Streptavidin T1 добавляли к образцам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с мягким встряхиванием. Затем планшет с образцами промывали 200 мкл PBS+0,05% Tween-20, 200 мкл PBS и водой для ВЭЖХ. Связанный ADC элюировали 55 мкл 2% муравьиной кислоты (МК) (об/об). Аликвоту объемом 50 мкл каждого образца переносили в новый планшет, после чего добавляли еще 5 мкл 200 мМ TCEP.

[332] Анализ интактного белка проводили с помощью масс-спектрометра Xevo G2 Q-TOF, сопряженного с nanoAcquity UPLC (Waters), при использовании колонки BEH300 C4, 1,7 мкм, 0,3×100 мм iKey. Подвижная фаза A (MPA) состояла из 0,1% МК в воде (об/об), и подвижная фаза B (MPB) состояла из 0,1% МК в ацетонитриле (об/об). Хроматографическое разделение выполняли при скорости потока 0,3 мкл/мин с использованием линейного градиента MPB с 5% до 90% за 7 мин. Температуру ЖХ-колонки устанавливали на 85°C. Сбор данных проводили с помощью программы MassLynx версии 4.1. Диапазон регистрации массы составлял от 700 дальтонов до 2400 дальтонов. Анализ данных, включая деконволюцию, проводили при использовании Biopharmalynx версии 1.33.

[333] Присоединение нагрузки и раскрытие сукцинимидного кольца (пик +18 дальтон) контролировали во времени. Данные по присоединению нагрузки представлены как %DAR потеря по сравнению с DAR 0 ч. Данные по раскрытию кольца представлены как % молекул с раскрытым кольцом в сравнении с общим количеством молекул, присутствующих через 72 ч. Несколько сайт-мутантов давали очень стабильные ADC конъюгаты (334C, 421C и 443C), тогда как некоторые сайты теряли значительное количество линкера-полезной нагрузки (38°C и 114C). Скорость раскрытия кольца значительно отличалась в зависимости от сайта. Несколько сайтов, таких как 392C, 183C и 334C, приводили к очень небольшому раскрытию кольца, тогда как другие сайты, такие как 421C, 388C и 347C, приводили к быстрому и спонтанному раскрытию кольца.

[334] Сайты, которые приводят к быстрому и спонтанному раскрытию кольца, могут быть полезными для получения конъюгатов, которые обладают уменьшенной гидрофобностью и/или увеличенной ФК экспозицией. Такое обнаружение находится в противоречии с преобладающим пониманием того, что стабильность кольца коррелирует со стабильностью в плазме. В некоторых аспектах, таким образом, конъюгирование по одному или более сайтам 421C, 388C и 347C может обеспечивать особое преимущество при использовании линкера-полезной нагрузки с высокой гидрофобностью. В некоторых аспектах высокая гидрофобность является значением относительного времени удерживания (RRT) (согласно измерению с помощью HIC) 1,5 или больше. В некоторых аспектах высокая гидрофобность является значением RRT 1,7 или больше. В некоторых аспектах высокая гидрофобность является значением RRT 1,8 или больше. В некоторых аспектах высокая гидрофобность является значением RRT 1,9 или больше. В некоторых аспектах высокая гидрофобность является значением RRT 2,0 или больше.

Таблица 23: Стабильность различных ADC конъюгатов в плазме

ADC Сайт конъюгирования % DAR потери за 72 ч % гидролиза сукцинамида за 72 ч ADC#4 C334 0% 18% ADC#10 C421 0% 100 ADC#11 C443 0% 40% ADC#8 C388 -1,3% 100% ADC#9 C392 3,0% 0% ADC#3 C290 9,5% 21% ADC#5 C347 10% 66% ADC#2 kC183 11% 29% ADC#6 C375 12% 46% ADC#1 C114 20% 33% ADC#7 C380 49% 29%

E. Стабильность сайт-специфических vc0101 конъюгатов в глутатионе

[335] Образцы ADC разводили в водном глутатионе с получением конечной концентрации GSH 0,5 мМ и конечной концентрации белка ~0,1 мг/мл в фосфатном буфере, pH 7,4. Затем образцы инкубировали при 37°C и отбирали аликвоты в трех моментах времени для определения DAR (T-0, T-3 день, T-6 день). Аликвоту каждого момента времени обрабатывали TCEP и анализировали с помощью ЖХ-МС согласно методу, описанному в примере 21 A.

[336] Присоединение нагрузки и раскрытие сукцинимидного кольца (пик +18 дальтон) контролировали во времени. Данные по присоединению нагрузки представлены как %DAR потеря по сравнению с DAR 0 ч (Таблица 24). Данные по раскрытию кольца представлены как % молекул с раскрытым кольцом в сравнении с общим количеством молекул, присутствующих через 72 ч. Несколько сайт-мутантов давали очень стабильные ADC конъюгаты (334C, 421C и 443C), тогда как некоторые сайты теряли значительное количество линкера-полезной нагрузки (38°C и 114C). Скорость раскрытия кольца значительно отличалась в зависимости от сайта. Несколько сайтов, таких как 392C, 183C и 334C, приводили к очень небольшому раскрытию кольца, тогда как другие сайты, такие как 421C, 388C и 347C, приводили к быстрому и спонтанному раскрытию кольца. Результаты данного анализа достаточно хорошо коррелируют с результатами стабильности в плазме (Пример 21 D), что позволяет предположить, что тиол-опосредованное деконъюгирование является основным путем потери полезной нагрузки в плазме. В совокупности эти результаты указывают, что определенные сайты, такие как 334, 443, 290 и 392, могут быть особенно полезными для конъюгирования линкеров-полезных нагрузок, которые могут быть легко потеряны при тиол-опосредованном деконъюгировании. Такие линкеры-полезные нагрузки включают линкеры-полезные нагрузки, в которых используются обычные малеимид-капроильные (mc) и малеимид-капроил-ValCit (vc) связи (например, vc-101, vc-MMAE, mc-MMAF и т.д.).

Таблица 24: Стабильность различных vc0101 сайт-специфических конъюгатов в глутатионе

ADC Сайт конъюгирования % DAR потери за 72 ч % гидролиза сукцинамида за 72 ч ADC#1 A114C 12% 41% ADC#2 kK183C 7% 17% ADC#4 K334C 4% 26% ADC#5 Q347C 10% 71% ADC#6 S375C 18% 47% ADC#7 E380C 79% 50% ADC#8 E388C 19% 100% ADC#9 K392C 0% 17% ADC#10 N421C 0% 80% ADC#11 L443C 12% 41% ADC#3 K290C 17% 33%

F. Фармакокинетическая оценка отобранных сайт-специфических vc0101 конъюгатов на мышах

[337] Не несущие опухоли самки бестимусных Nu/Nu (голых) мышей (возрастом 6-8 недель) были получены из Charles River Laboratories. Все процедуры с использованием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию согласно установленным рекомендациям. Мышам (n=3 или 4) вводили однократную внутривенную дозу ADC 3 мг/кг в расчете на иммуноглобулиновый компонент. Образцы крови забирали у каждой мыши из хвостовой вены через 0,083, 6, 24, 48, 96, 168 и 336 часов после введения дозы. Суммарные концентрации антител (T_ab) и концентрации ADC определяли с помощью LBA, где антитело овцы против IgG человека использовали для захвата, антитело козы против IgG человека использовали для детектирования T_ab или антитело против полезной нагрузки использовали для детектирования ADC. Данные по концентрации в плазе у каждого животного анализировали при использовании Watson LIMS версии 7.4 (Thermo). Экспозиция изменилась в зависимости от сайта. ADC конъюгаты, полученные из 29°C и 443C мутантов, показали наименьшую экспозицию, тогда как ADC конъюгаты, полученные с сайтами каппа-183C и 392C, показали наибольшую экспозицию. Для многих применений могут быть предпочтительны сайты с высокой экспозицией, поскольку это приведет к увеличенной продолжительности действия терапевтического средства. Однако в случае некоторых применений, может быть предпочтительным использование конъюгата с более низкой экспозицией (такого как 29°C и 443C). В частности, применения, в которых требуется более низкая экспозиция (т.е. ниже ФК), могут включать, без ограничения, применение в головном мозге, центральной нервной системе и глазах. Показания включают рак, в особенности головного мозга, центральной нервной системы и/или глаза.

Таблица 25: ФК экспозиция различных сайт-специфических vc0101 ADC конъюгатов

ADC Сайт tAb AUC(0-last) (мг*ч/мл) ADC AUC(0-last)(мг*ч/мл) ADC#2 Каппа-183C 7150 5980 ADC#3 4240 3480 ADC#4 5130 4500 ADC#5 5080 4070 ADC#8 6100 3680 ADC#9 6400 6010 ADC#11 4430 4500

G. Расщепление сайт-специфических vc0101 конъюгатов катепсином

[338] Катепсин B активировали при использовании 6 мМ дитиотреитола (ДТТ) в 150 мМ ацетате натрия, pH 5,2, в течение 15 минут при 37°C. Затем 50 нг активированного катепсина-B смешивали с 20 мкл 1 мг/мл ADC при конечной концентрации 2 мМ ДТТ, 50 мМ ацетата натрия, pH 5,2. Реакции останавливали при использовании 10 мкМ ингибитора цистеиновых протеаз E-64 в 250 мМ боратном буфере, pH 8,5, с последующим инкубированием при 37°C в течение 20 мин, 1 ч, 2 ч и 4 ч. После анализа образцы восстанавливали при использовании TCEP и анализировали с помощью ЖХ/МС при использовании условий, описанных в Примере 21 A. Данные показали, что скорость расщепления линкера сильно зависит от сайта конъюгирования. Определенные сайты расщепляются очень быстро, например, 443C, 388C и 290C, тогда как другие сайты расщепляются очень медленно, например, 334C, 375C и 392C. В некоторых аспектах может быть предпочтительно проводить конъюгирование на сайтах, которые обеспечивают замедление расщепления. В других аспектах предпочтительно быстрое расщепление. Например, может быть предпочтительным быстрое высвобождение полезной нагрузки, чтобы сократить время, проведенное в эндосоме. В других аспектах быстрое расщепление полезной нагрузки может с преимуществом обеспечивать проникновение полезной нагрузки, когда конъюгированная молекула может не позволить сделать это, например, в некоторых солидных опухолях. В других аспектах быстрое расщепление может обеспечивать доставку полезной нагрузки к соседним клеткам, которые не экспрессируют антиген, распознаваемый антителом, что дает возможность, например, проводить терапию гетерогенной опухоли.

Таблица 26: Кинетика расщепления линкеров в различных сайт-специфических vc0101 ADC конъюгатах

ADC Мутант % расщепления
линкера за 20 мин % расщепления
линкера
за 1 ч % расщепления
линкера
за 2 ч % расщепления
линкера
за 4 ч ADC#1 29% 71% 100% 100% ADC#2 Каппа-183C 31% 95% 100% 100% ADC#3 54% 100% 100% 100% ADC#4 0% 0% 0% 13% ADC#5 42% 89% 100% 100% ADC#6 0% 0% 0% 5% ADC#7 15% 48% 83% 92% ADC#8 82% 100% 100% 100% ADC#9 0% 0% 0% 0% ADC#10 31% 61% 73% 100% ADC#11 100% 100% 100% 100%

H. Термическая стабильность сайт-специфических vc0101 конъюгатов

[339] ADC разводили до 0,2 мг/мл в PBS (pH 7,4), содержащем 10 мМ ЭДТА. ADC конъюгаты помещали в изолированный сосуд и нагревали до 45°C. Аликвоту (10 мкл) отбирали с интервалом в 1 неделю для оценки уровня высокомолекулярных соединений (HMWS) и низкомолекулярных соединений (LMWS), которые образовывались с течением времени, с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC). Условия SEC представлены в Примере 21 A. При таких условиях мономер элюировался приблизительно через 3,6 минуты. Любой белковый материал, элюирующийся слева от пика мономера, считали HMWS, и любой белковый материал, элюирующийся справа от пика мономера, считали LMWS. Результаты показаны в Таблице 27 ниже. Отдельные ADC конъюгаты показали превосходную термическую стабильность, например, каппа-183C, 375C и 334C, тогда как другие ADC конъюгаты показали значимое разложение, например, 443C и 392C+443C.

Таблица 27: Термическая стабильность различных сайт-специфических vc0101 ADC конъюгатов

ADC Сайт-мутант День 1 (HMWS) День 1 (LMWS) День 1 (мономер) День 21 (HMWS) День 21 (LMWS) День 21 (мономер) ADC#1 3,31% 3,00% 93,60% 1,70% 5,30% 93,80% ADC#2 Каппа-183C 0,40% 0,60% 99,00% 0,40% 1,30% 98,30% ADC#3 0,90% 0,30% 98,70% 2,00% 2,80% 95,20% ADC#4 0,80% 0,40% 98,80% 1,10% 2,60% 96,30% ADC#5 1,10% 0,40% 98,50% 1,20% 1,50% 97,30% ADC#6 0,70% 0,60% 98,70% 0,80% 2,10% 97,20% ADC#7 0,90% 0,30% 98,80% 1,60% 1,70% 96,60% ADC#8 1,90% 0,70% 97,40% 1,20% 2,10% 96,70% ADC#9 1,20% 0,50% 98,30% 1,40% 2,40% 96,10% ADC#10 2,60% 4,30% 93,00% 2,60% 6,10% 91,30% ADC#11 5,20% 4,60% 90,10% 5,80% 6,30% 87,40% ADC#12 183C+334C 4,60% 0,50% 94,90% 5,70% 1,90% 92,40% ADC#13 183C+392C 2,10% 0,70% 97,10% 2,10% 1,60% 96,30% ADC#14 290C+334C 2,80% 0,60% 96,60% 4,30% 1,90% 93,70% ADC#15 334C+392C 1,90% 0,70% 97,40% 2,70% 2,40% 94,90% ADC#16 392C+443C 2,80% 0,60% 96,60% 8,80% 2,90% 88,30%

I. Эффективность различных vc0101 сайт-мутантов

[340] Исследования эффективности in vivo конъюгатов антитела-лекарственного средства проводили в мишень-экспрессирующей ксенотрансплантатной модели с использованием клеточной линии N87. Приблизительно 7,5 миллионов опухолевых клеток в 50% матригеле подкожно имплантировали голым мышам возрастом 6-8 недель, пока размер опухоли не достигал 250-350 мм³. Лекарственное средство вводили путем болюсной инъекции в хвостовую вену. Животным вводили 10, 3 или 1 мг/кг конъюгата антитела-лекарственного средства в общей сложности четыре раза, один раз в 4 дня (в дни 1, 5, 9 и 13). Всех подопытных животных еженедельно контролировали на изменения массы тела. Объем опухоли измеряли два раза в неделю в течение первых 50 дней, а затем один раз в неделю, с помощью измерительного устройства и вычисляли согласно следующей формуле: Объем опухоли=(длина×ширина²)/2. Животных гуманно умерщвляли, до того как объемы их опухоли достигали 2500 мм³. Размер опухоли, как обычно наблюдали, уменьшался после первой недели лечения. Животных непрерывно контролировали на возобновление роста опухоли после прекращения лечения (до 100 дней после лечения). Данные группы, получавшей дозу 3 мг/кг, показаны на Фигуре 29. ADC конъюгаты, полученные из 388C и 347C мутантов, показали немного более низкую активность, чем ADC конъюгаты из 334C, каппа-183C, 392C и 443C мутантов.

J. Конъюгирование унциаламицина в качестве полезной нагрузки с различными мутантами

[341] Панель цистеиновых мутантов трастузумаба подготавливали к конъюгированию, как описано в Примере 1. Полученных мутантов (5 мг/мл) обрабатывали LP#2 (6 молярных экв.) в PBS, содержащем 10% DMA. Через 2 ч при кт реакции оценивали с помощью ЖХ-МС для определения нагрузки и с помощью SEC для определения правильного фолдинга и отсутствия агрегации. Результаты представлены в Таблице 28, и необработанные результаты SEC показаны на Фигуре 30.

[342] Как можно видеть, различные сайт-мутанты приводят к мономерным ADC конъюгатам с хорошими характеристиками (334C, 375C и 392C). Другие сайт-мутанты не были нагружены (например, 246C, k149C, k111C), агрегировали (например, 443C, 421C, 347C) или давали ADC конъюгаты с поздней элюцией, которые, возможно, были неполностью свернутыми (например, 380C, 388C, 29°C и k183C). В совокупности, эти результаты позволяют предположить, что конкретные полезные нагрузки могут требовать оптимизации для определения сайтов, которые приводят к получению биофизически стабильных и правильно свернутых ADC конъюгатов.

Таблица 28: Представленные в форме таблицы результаты конъюгирования различных мутантов трастузумаба с LP#2

Название мутанта ЖХ-МС DAR %Агр
(rt <6 мин) %Мономера
(rt=6-7 мин) % со сдвигом вправо
(rt >7 мин) PT-A114C 2,0 4 42 53 PT-K246C 0,8 1 99 0 PT-K290C 2,0 1 38 60 PT-K334C 1,5 2,6 97 0 PT-Q347C 1,4 21 15 63 PT-Y373C 1,2 0 63 36 PT-S375C 1,8 0,6 99 0 PT-E380C 1,8 0 0 100 PT-E388C 1,3 0 32 68 PT-K392C 2 2,5 97 2,5 PT-N421C 1,4 77 22 0 PT-L443C 1,8 87 8 0 PT-kA111C 0,7 0 48 50 PT-kK149C 0,9 3 44 50 PT-kK183C 1,9 0 12 87 PT-kK188C 1,4 11 47 39

K. Выводы

[343] Как продемонстрировано в Примерах, сайт конъюгирования может влиять на деконъюгирование LP, метаболизм LP, экспозицию tAb, скорость расщепления линкера, агрегацию ADC, гидрофобность ADC и профиль ФК in vivo.

[344] В зависимости от определенных применений молекул ADC различные кандидатные сайты конъюгирования можно применять для решения конкретных проблем. Например, если требуется более низкая гидрофобность, могут быть предпочтительны сайты 334, 375, 392 или их комбинация, поскольку они показали наименьший сдвиг времени удерживания по сравнению с немодифицированным антителом. В другом примере сайты, которые приводят к быстрому и спонтанному раскрытию кольца (например, 421C, 388C, 347C или их комбинация) можно применять для получения конъюгатов, которые обладают пониженной гидрофобностью и/или увеличенной ФК экспозицией. Такие сайты, как 334, 443, 290, 392 или их комбинация, могут быть особенно полезными для конъюгирования полезных нагрузок-линкеров, которые с легкостью удаляются при тиол-опосредованном деконъюгировании.

Пример 22: Сайт-специфические тубулизин-ADC конъюгаты

A. Общая методика синтеза cys-мутантных ADC конъюгатов :

[345] Использовали следующие два LP. Подробные схемы синтеза LP на основе тубулизина подробно описаны в предварительной заявке на патент США 62/289,485, поданной 1 февраля 2016 года и полностью включены в настоящую заявку посредством отсылки.

LP#3

LP#4

[346] Метод A: Конъюгирование коммерческого антитела ГЕРЦЕПТИНА с линкер-полезной нагрузкой через внутренние дисульфиды. Раствор антитела трастузумаба (~15 мг/мл) приготавливали в 50 мМ фосфатно-солевом буферном растворе (pH 7,0), содержащем 50 мМ ЭДТА. Добавляли трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP) (~2,0 молярных эквивалентов) в виде 5 мМ раствора в дистиллированной воде. Полученный раствор нагревали до 37°C в течение 1 ч. После охлаждения реакцию обрабатывали соответствующими объемами PBS и диметилацетамида (DMA) с получением конечной концентрации раствора ~5 мг/мл в PBS, содержащем ~10% DMA (об/об). Соответствующий линкер-полезную нагрузку добавляли в виде 10 мМ стока в DMA (~7 экв.) и оставляли реакцию без или с мягким перемешиванием при комнатной температуре. Через 70 минут реакцию подвергали замене буфера на PBS с использованием колонок GE PD-10 Sephadex G25 согласно инструкциям производителя. Полученные материал немного концентрировали (с помощью ультрафильтрации) и очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex200. Мономерные фракции концентрировали и стерилизовали фильтрацией с получением конечного ADC.

[347] Метод B: Сайт-специфическое конъюгирование линкер-полезных нагрузок с антителом трастузумабом, содержащим модифицированные остатки цистеина. Раствор трастузумаба, содержащего введенный модифицированный остаток цистеина, такой как сайт 118, 334 и 392 (при использовании EU индекса Кэбата, см. WO2013093809), приготавливали в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,4. PBS, ЭДТА (0,5 М сток), и добавляли TCEP (0,5 М сток) таким образом, что конечная концентрация белка составила ~10 мг/мл, конечная концентрация ЭДТА составила ~20 мМ и конечная концентрация TCEP составила приблизительно ~6,6 мМ (100 молярных экв.). Реакцию оставляли при кт на 2-48 ч и затем заменяли буфер на PBS при использовании колонок GE PD-10 Sephadex G25 согласно инструкциям производителя. Альтернативные методы, такие как диафильтрация или диализ, также могут применяться в определенных обстоятельствах. Полученный в результате раствор обрабатывали приблизительно 50 эквивалентами дегидроаскорбата (50 мМ сток в EtOH/воде 1:1). Антитело оставляли при 4°C на ночь и затем меняли буфер на PBS при использовании колонок GE PD-10 Sephadex G25 согласно инструкциям производителя. Опять же, альтернативные методы, такие как диафильтрация или диализ, также могут применяться в определенных обстоятельствах.

[348] Антитело, полученное таким образом, разводили до ~2,5 мг/мл в PBS, содержащем 10% DMA (об/об), и обрабатывали соответствующим линкером-полезной нагрузкой (10 молярных экв.) в виде 10 мМ стокового раствора в DMA. Через 2 ч при кт смесь подвергали замене буфера на PBS (как описано выше) и очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200. Мономерные фракции концентрировали и стерилизовали фильтрацией с получением конечного ADC.

Таблица 29: Структура тубулизин-ADC конъюгатов и линкер-полезных нагрузок, используемых для их получения

Таблица 30: Аналитическое исследование ADC конъюгатов

ADC# Фактический выход Время удерживания ВЭЖХ-HIC Наблюдаемая
Δ масс для части тяжелой цепи (HC) Отношение лекарственного средства к антителу (DAR)
(метод ЖХ/МС) Отношение лекарственного средства к антителу (DAR)
(метод HIC) ADC#T1 79% 5,43 994 4,4 NA ADC#T2 75% 5,54 993 2,0 2,0 ADC#T3 52% 5,19 993 2,0 2,0 ADC#T4 34% NA 1108 2,0 NA ADC#T5 66% 5,25 1102 2,0 2,0 ADC#T6 68% 5,54 1106 2,0 2,0

B. Методика анализа клеток in vitro

[349] Мишень-экспрессирующие (BT474 (рак молочной железы), N87 (рак желудка), HCC1954 (рак молочной железы), MDA-MB-361-DYT2 (рак молочной железы)) или неэкспрессирующие (HT-29) клетки сеяли в 96-луночный планшет для культур клеток за 24 часа перед обработкой. Клетки обрабатывали 3-кратным серийным разведением конъюгатов антитела-лекарственного средства или свободными соединениями (без конъюгирования антитела с лекарственным средством) в двойной повторности при 10 концентрациях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста CellTiter 96^®, AQueous One Solution Cell Proliferation MTS (Promega) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли в процентах от необработанного контроля. Значения IC₅₀ вычисляли при использовании четырехпараметрической логистической модели #203 с XLfit v4.2. Результаты показаны в Таблице 31.

Таблица 31: Данные исследования цитотоксичности in vitro выбранных ADC конъюгатов

ADC# N87 MDA-MB-361-DYT2 HT29 IC₅₀ (нМ) IC₅₀ антитела (нг/мл) IC₅₀ (нМ) IC₅₀ антитела (нг/мл) IC₅₀ (нМ) IC₅₀ антитела (нг/мл) ADC#T1 0,353 14,403 1,59 57,5 400,7 15835,752 ADC#T2 0,568 43,106 >1000,000 >74977,416 >1000,000 >74977,416 ADC#T3 0,454 33,943 >1000,000 >72740,113 809,98 59870,304 ADC#T4 0,684 55,316 0,139 9,588 >1000,000 >74031,891 ADC#T5 0,442 33,35 0,204 15,238 >1000,000 >72655,218 ADC#T6 0,309 23,138 0,104 7,804 >1000,000 >74977,817

C. Анализ стабильности ADC конъюгатов в плазме in vitro

[350] Образцы ADC (~1,5 мг/мл) разводили в мышиной плазме (Lampire Biological Laboratories) с получением конечного раствора 10% ADC, 90% плазмы. Исследовали три момента времени для определения DAR (T-0, T-24 ч и T-48 ч). Каждый момент времени подвергали процессу иммунопреципитации для обогащения ADC. Коротко, каждую аликвоту разбавляли 1:1 в 20% MPER (Thermo Fisher Scientific) и добавляли равные количества биотинилированных антител мыши против Fc человека и козы против каппа человека (SouthernBiotech). Образцы инкубировали в течение двух часов при 4°C, после чего добавляли Dynabeads со стрептавидином (Thermo Fisher Scientific). Образцы обрабатывали на приборе KingFisher с четырьмя этапами промывки, состоящими из 10% MPER, 0,05% TWEEN 20 и два раза PBS. ADC элюировали со сфер 0,15% муравьиной кислотой. Образцы доводили до pH 7,8 2M Трис, pH 8,5, и удаляли их N-связанные гликаны PNGазой F (New England Biolabs). Образцы восстанавливали TCEP и исследовали с помощью ЖХ-МС на % ацетат гидролизованного ADC по высоте массового сдвига 993 (исходный) и 951 (деацетилированный). Результаты показаны на Фигуре 31. Результаты иллюстрируют, что присоединение тубулизина LP#3 к предпочтительным сайтам, таким как K334C и K392C, может приводить к улучшению стабильности ADC в плазме. Это, в свою очередь, может привести к улучшенной экспозиции и улучшенной эффективности in vivo. Предполагается, что улучшенную стабильность, которую дают такие сайты, можно будет передать другим классам полезной нагрузки, которые подвержены воздействию метаболизма.

D. Стабильность ADC конъюгатов in vivo

[351] Образцы крови получали через 72 ч после введения последней дозы ADC от выбранной мыши-опухоленосителя из исследования с ксенотрансплантатами N87. Образцы забирали в группе, получавшей дозу 3 мг/кг. Образцы ADC, полученные таким образом, дегликозилировали при обработке PNGазой (New England Biolab) при 37°C в течение 1 часа. После инкубирования добавляли захватывающее антитело (биотинилированное антитело козы против Fc человека в концентрации 1,0 мг/мл, Jackson ImmunoResearch) и нагревали смесь при 37°C в течение одного часа с последующим мягким встряхиванием при комнатной температуре в течение еще одного часа. К образцам добавляли сферы Dynabead MyOne T1 со стрептавидином (Invitrogen) и инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут с мягким встряхиванием. Затем планшет с образцами промывали 200 мкл PBS+0,05% Tween 20, 200 мкл PBS и водой для ВЭЖХ. Связанный ADC элюировали 55 мкл 2% муравьиной кислоты (об/об). Пятьдесят микролитров каждого образца переносили в новый планшет, после чего добавляли еще 5 мкл 200 мМ TCEP.

[352] Анализ интактного белка проводили с помощью масс-спектрометра Xevo G2 Q-TOF, сопряженного с nanoAcquity UPLC (Waters) и колонки BEH300 C₄, 1,7 мкм, 0,3×100 мм при использовании программы для сбора данных Masslynx v4.1. Температуру ЖХ-колонки устанавливали на 85°C. Подвижная фаза A состояла из 0,1% ТФУ (ТФУ) в воде. Подвижная фаза B состояла из 0,1% ТФУ в ацетонитриле:1-пропаноле (1:1, об/об). Хроматографическое разделение выполняли при скорости потока 18 мкл/мин с использованием линейного градиента подвижной фазы B с 5% до 90% за 7 мин. Анализ данных, включающий деконволюцию, проводили с использованием Biopharmalynx v1.33 (Waters). Результаты показаны в Таблице 32. Результаты указывают, что тубулизин, конъюгированный через сайт 334 (ADC#T3), улучшал стабильность in vivo по сравнению с (обычным) конъюгатом ADC#T1, конъюгированным через шарнирную область.

Таблица 32: Стабильность ADC конъюгатов in vivo (при измерении DAR)

Пример DAR в 0 ч после введения дозы DAR через 72 ч после введения дозы % DAR, оставшегося через 72 ч ADC#T1 3,8 0,6 16% ADC#T3 1,8 1,7 95%

E. Ксенотрансплантатная модель опухоли N87 in vivo :

[353] Исследования эффективности конъюгатов антитела-лекарственного средства in vivo проводили с мишень-экспрессирующими ксенотрансплантатными моделями при использовании линий клеток N87. Для исследования эффективности 7,5 миллионов опухолевых клеток в 50% матригеле подкожно имплантировали голым мышам возрастом 6-8-недель, пока размеры опухоли не достигали 250-350 мм. Дозирование проводили путем болюсной инъекции в хвостовую вену. В зависимости от ответа опухоли на лечение животным вводили 1-10 мг/кг конъюгатов антитела-лекарственного средства, выполнив четыре обработки раз в четыре дня. Всех подопытных животных еженедельно контролировали на наличие изменений массы тела. Объем опухоли измеряли два раза в неделю в течение первых 50 дней, а затем один раз в неделю с помощью измерительного устройства и вычисляли согласно следующей формуле: Объем опухоли 5=(длина×ширина)/2. Животных гуманно умерщвляли, до того как объем их опухоли достигал 2500 мм. Размер опухоли, как наблюдали, уменьшался после первой недели лечения. Животных могли непрерывно контролировать на возобновление роста опухоли после прекращения лечения. Результаты тестирования модели скрининга ADC #T1 и #T3 на ксенотрансплантате N87 у мышей in vivo показаны на Фигуре 32. Результаты показывают, что присоединение LP#3 на предпочтительных сайтах, таких как K334C, может приводить к повышению эффективности in vivo. Повышенная эффективность, вероятно, является результатом улучшенной стабильности ADC ADC#T3 (334C конъюгата) по сравнению с ADC#T1 (обычным конъюгатом через шарнирную область). Следует обратить внимание на то, что эффективность ADC#T3 значительно больше, чем у ADC#T1, несмотря на то, что DAR ADC#T3 в два раза меньше, чем у ADC#T1.

Пример 23: Сайт-специфические ADC конъюгаты с применением антитела против EDB

[354] В этом примере исследовали эффективность и ФК профиль ADC конъюгатов на основе антител против EDB. Последовательности примерного антитела против EDB, L19, показаны в Таблице 33. Данные, представленные в этом примере, также включают мутантные L19, в которые были введены некоторые мутации (которые не влияют на аффинность связывания L19). CDR-последовательности этих мутантов идентичны последовательностям L19. Например, EDB-(H16-K222R) является мутантом L19, применяемым для конъюгирования ADC на основе трансглутаминазы. Дополнительные детали относительно этих ADC конъюгатов и ADC конъюгатов, направленно взаимодействующих с EDB в целом, подробно описаны в предварительной заявке на патент США 62/409,081, поданной 17 октября 2016 года, и полностью включены в настоящую заявку посредством отсылки.

Таблица 33: Последовательности антител против EDB

SEQ ID NO. Описание Последовательность 65 Белок EDB-L19 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS 66 EDB L19 VH CDR1 Кэбат SFSMS 67 EDB-L19 VH CDR1 Чотиа GFTFSSF 68 EDB-L19 VH CDR2 Кэбат SISGSSGTTYYADSVKG 69 EDB-L19 VH CDR2 Чотиа SGSSGT 70 EDB-L19 VH CDR3 Кэбат/Чотиа PFPYFDY 71 Белок EDB-L19 HC IgG1 человека EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 72 Белок EDB-L19 VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK 73 EDB-L19 VL CDR1 Кэбат/Чотиа RASQSVSSSFLA 74 EDB-L19 VL CDR2 Кэбат/Чотиа YASSRAT 75 EDB-L19 VL CDR3 Кэбат/Чотиа QQTGRIPPT 76 Белок EDB-L19 LC каппа человека EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 77 Белок EDB-(K290C) HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 78 Белок EDB-(κK183C) LC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSCADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

23.1. Связывание EDB ADC конъюгатов in vitro

[355] Для оценки относительного связывания антител против EDB и ADC конъюгатов к EDB, 96-луночные планшеты MaxiSorp покрывали 0,5 или 1 мкг/мл человеческого 7-EDB-89 в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°C с мягким встряхиванием. Затем планшеты освобождали от раствора, промывали 200 мкл PBS и блокировали 100 мкл блокирующего буфера (Thermo Scientific) в течение 3 часов при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляли, лунки промывали PBS и инкубировали с 100 мкл антител против EDB или ADC конъюгатов, которые последовательно разводили (4-кратно) в буфере для анализа ELISA (EAB; 0,5% BSA/0,02% Tween-20/PBS). Первый ряд планшета оставляли пустым, а последний ряд планшета заполняли EAB в качестве пустого контроля. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реактивы удаляли и промывали планшет 200 мкл 0,03% Tween-20 в PBS (PBST). Антитело против человеческого IgG-Fc-HRP (Thermo/Pierce), разведенное 1:5000 в EAB, добавляли в количестве 100 мкл в лунки и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Планшет промывали 200 мкл PBST, затем добавляли 100 мкл BioFX TMB (Fisher) и оставляли для проявления на 4 минуты при комнатной температуре. Реакцию останавливали 100 мкл 0,2Н серной кислоты и считывали оптическую плотность при 450 нм на планшетном спектрофотометре Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA).

[356] В Таблице 34 представлено относительное связывание антител против EDB и ADC конъюгатов с фрагментом человеческого белка 7-EDB-89, связанным на 96-луночном планшете, в формате ELISA. Все антитела и ADC конъюгаты, направленные на EDB, связывались с белком-мишенью с подобной аффинностью в пределах 19-58 пМ. В отличие от этого, неспецифичные к EDB антитела и ADC конъюгаты имеют высокие значения EC₅₀>10000 пМ.

Таблица 34. Связывание антител против EDB и ADC конъюгатов с человеческим EDB.

ID ADC или антитела Название ADC или антитела Сред EC₅₀ (пМ) SD Ab1 EDB-L19 27,0 - ADC1 EDB-L19-vc-0101 37,8 12,8 ADC11 Neg-vc-0101 >10000 - Ab2 EDB-(κK183C-K290C) 30,2 1,6 ADC2 EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101 58,4 17,0 ADC12 Neg-(κK183C-K290C)-vc-0101 >10000 ND Ab3 EDB-mut1 15,0 - ADC3 EDB-mut1-vc-0101 37,1 14,6 Ab4 EDB-mut1(κK183C-K290C) 44,8 8,7 ADC4 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 56,7 13,5 ADC5 EDB-L19-diS-DM1 21,3 - ADC6 EDB-L19-diS-C₂OCO-1569 30,7 - ADC7 EDB-L19-vc-9411 37,5 - ADC15 Neg-vc-9411 >10000 - ADC8 EDB-L19-diS-4574 31,9 - Ab5 EDB-(H16-K222R) 19,3 - ADC9 EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-8314 39,4 2,5 ADC17 Neg-(H16-K222R)-AcLys-vc-8314 >10000 -

Среднее EC₅₀±стандартное отклонение и количество (n) определений. ND=не определяли.

23.2: Цитотоксичность ADC конъюгатов против EDB in vitro

[357] Культура клеток. WI38-VA13 представляют собой трансформированные SV40 человеческие фибробласты легких, полученные из ATCC и поддерживаемые в среде MEM Игла (Cell-Gro) с добавкой 10% FBS, 1% MEM заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина и 2 мМ GlutaMax. HT29 получали из карциномы толстой и прямой кишки человека (ATCC) и поддерживали в среде DMEM с добавкой 10% FBS и 1% глутамина.

[358] Обнаружение EDB+ FN транскрипта. Для экспрессии гена и анализа транскрипта EDB+ FN, адгерентные пролиферирующие клетки WI38-VA13 и HT29 отделяли от культуральных флаконов с помощью TrypLE Express (Gibco). Набор RNeasy Mini Kit (Qiagen) использовали для очистки суммарной РНК из собранных осадков клеток. Остаточную ДНК удаляли с помощью набора RNase-Free DNase Set (Qiagen) во время очистки РНК. Набор High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) использовали для обратной транскрипции суммарной РНК в кДНК. кДНК исследовали с помощью количественной ПЦР в реальном времени при использовании TaqMan Universal Master Mix II с UNG (Applied Biosystems). Сигнал EDB+ FN1 детектировали с помощью праймера TaqMan Hs01565271_m1 и нормализовали по среднему для двух сигналов от ACTB (праймер TaqMan Hs99999903_m1) и GAPDH (праймер TaqMan Hs99999905_m1). Все праймеры были получены в ThermoFisher Scientific. Представлены данные из репрезентативного эксперимента.

[359] Обнаружение белка EDB+ FN с помощью Вестерн-блоттинга. Для обнаружения EDB+ FN с помощью Вестерн-блоттинга, адгерентные пролиферирующие клетки WI38-VA13 и HT29 собирали путем соскабливания клеток. Лизаты клеток получали в буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology) с ингибиторами протеаз и ингибиторами фосфатаз. Лизат опухолей получали в буфере для лизиса RIPA или в 2× буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology) с ингибиторами протеаз и ингибиторами фосфатаз. Белковые лизаты исследовали с помощью ДСН-ПААГЭ с последующим Вестерн-блоттингом. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и затем блокировали 5% молоком/TBS, с последующим инкубированием с антителом EDB-L19 и антителом против GAPDH (Cell Signaling Technology) в течение ночи при 4°C. После промывки анти-EDB блот инкубировали с ECL HRP-связанным вторичным антителом против IgG человека (GE Healthcare) в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки сигнал EDB+ FN проявляли с использованием субстрата Pierce ECL 2 для Вестерн-блоттинга (Thermo Scientific) и детектировали на рентгеночувствительной пленке. Анти-GAPDH блот инкубировали с Alexa Fluor 680-конъюгированым вторичным антителом против IgG кролика (Invitrogen) в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки сигнал GAPDH детектировали на системе визуализации LI-COR Odyssey. Денситометрический анализ EDB Вестерн-блотов проводили при использовании калиброванного денситометра Bio-Rad GS-800 и количественно анализировали при использовании программы Quantity One версии 4.6.9. Показаны данные из репрезентативного эксперимента.

[360] На ФИГ. 33 показана экспрессия EDB+ FN1 на Вестерн-блоте в клетках WI38-VA13 и HT29. EDB+ FN экспрессируется в линии клеток WI38-VA13, но не экспрессируется в линии клеток карциномы толстой кишки HT29 при выращивании in vitro.

[361] Обнаружение белка EDB+ FN с помощью проточной цитометрии. Антитело EDB-L19 использовали для измерения экспрессии EDB+ FN на поверхности клеток WI38-VA13 или клеток HT29 с помощью проточной цитометрии. Клетки отделены с помощью бесферментного буфера для диссоциации клеток (Gibco) и инкубировали с холодным проточным буфером (FB, 3% BSA/PBS+Ca+Mg) на льду для блокирования. Затем клетки инкубировали с первичными антителами на льду в FB. После инкубрования клетки промывали холодным PBS -Ca-Mg и затем инкубировали с красителем для определения жизнеспособных клеток (Biosciences), позволяющим отличить живые и мертвые клетки, согласно методике производителя. Сигналы анализированы на проточном цитометре BD Fortessa и данные анализировали при использовании программы BD FACS DIVA. Показаны данные из репрезентативного эксперимента.

[362] В Таблице 35 представлены результаты Вестерн-блоттинга, кРВ-ПЦР и проточной цитометрии. Данные демонстрируют, что WI38-VA13 являются EDB+ FN положительными и HT29 являются EDB+ FN отрицательными.

Таблица 35. Анализ экспрессии EDB+ FN в клетках WI38 VA13 и HT29

Линия клеток кРВ-ПЦР
(2^(-ddC(t)) Вестерн
(нормализованная плотность (OD/мм²)) Проточно-цитометрическое связывание (MFI-GeoMean (EDB не окрашен)) WI38-VA13 0,224247 475,397 4480 HT29 0,000049 0,093 2

[363] Анализы цитотоксичности in vitro. Пролиферирующие клетки WI38-VA13 или HT29 собирали из культуральных флаконов с помощью бесферментного буфера для диссоциации клеток и культивировали в течение ночи в 96-луночных планшетах (Corning) в количестве 1000 клеток/лунка в увлажняемой камере (37°C, 5% CO₂). На следующий день клетки обрабатывали ADC конъюгатами против EDB или EDB-несвязывающими ADC конъюгатами изотипического контроля, добавляя 50 мкл 3× стоки в двойной повторности в 10 концентрациях. В некоторых экспериментах клетки сеяли в количестве 1500 клетках/лунка и обрабатывали в тот же день. Затем клетки инкубировали с ADC конъюгатами против EDB или EDB-несвязывающими ADC конъюгатами изотипического контроля в течение четырех дней. В день сбора клеток 50 мкл Cell Titer Glo (Promega) добавляли к клеткам и инкубировали 0,5 часа при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли на планшетном спектрофотометре Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA). Относительную жизнеспособность клеток определяли в процентах от необработанных контрольных лунок. Значения IC₅₀ вычисляли при использовании четырехпараметрической логистической модели #203 с с XLfit v4.2 (IDBS).

[364] В Таблице 36 показаны IC₅₀ (нг/мл антитела) при обработке ADC против EDB в анализах цитотоксичности, проведенных на WI38-VA13 (EDB+ FN положительная линия опухолевых клеток) и клетках карциномы толстой кишки HT29 (EDB+ FN отрицательная линия опухолевых клеток). ADC конъюгаты против EDB вызывали гибель клеток в EDB+ FN экспрессирующей клеточной линии. Значения IC₅₀ были аналогичными для всех ADC конъюгатов против EDB, имеющих линкер-полезную нагрузку vc-0101, в пределах от приблизительно 184 нг/мл до 216 нг/мл (EDB-L19-vc-0101, EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101, EDB-mut1-vc-0101, EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101). vc-0101 ADC конъюгаты отрицательного контроля обладали существенно меньшей активностью, со значениями IC₅₀ приблизительно в 70-200 раз выше, чем у vc-0101 ADC конъюгатов против EDB. Все vc-0101 ADC конъюгаты имели в 46-83 раза более высокие значения IC₅₀ в EDB+ FN отрицательной линии опухолевых клеток, HT29. Таким образом, ADC конъюгаты против EDB зависели от экспрессии EDB+ FN для их цитотоксичности in vitro.

[365] Другие ADC конъюгаты против EDB на основе ауристатина с "vc" протеаза-расщепляемыми линкерами, EDB-L19-vc-9411 и EDB-L19-vc-1569, также показали высокую цитотоксичность в клетках WA38-VA13 с высокой селективностью, приблизительно в 50-180 раз более высокой, по сравнению с соответствующими ADC конъюгатами отрицательного контроля и приблизительно в 25-140 раз более высокой селективностью по сравнению с неэкспрессирующей линией клеток. EDB-L19-DM1 ADC обладал подобной активностью, как vc-0101 ADC конъюгаты, однако намного более низкой селективностью по сравнению с ADC отрицательного контроля (приблизительно в 3 раза) и с клетками HT29 (приблизительно 0,9 раз).

Таблица 36. Цитотоксичность in vitro ADC конъюгатов против EDB и контрольных EDB-несвязывающих ADC конъюгатов.

WI38-VA13 HT29 ADC ID# Название ADC Сред IC₅₀ SD n Сред IC₅₀ SD n ADC1 EDB-L19-vc-0101 184 143 23 15346 4448 5 ADC11 Neg-vc-0101 19585 6762 16 10731 8193 24 ADC2 EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101 198 176 6 9276 83 2 ADC12 Neg-(κK183C-K290C)-vc-0101 >40000 ND 4 21913 2635 2 ADC3 EDB-mut1-vc-0101 184 138 7 10577 2065 2 ADC4 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 216 94 6 15584 58 3 ADC5 EDB-L19-diS-DM1 268 150 8 237 180 2 ADC13 Neg-diS-DM1 879 82 5 ND ND ND ADC6 EDB-L19-diS-C2OCO-1569 21 8 6 5 3 2 ADC14 Neg-diS-C2OCO-1569 36 6 3 ND ND ND ADC7 EDB-L19-vc-9411 46 22 3 1153 - 1 ADC15 Neg-vc-9411 2514 260 3 1243 - 1 ADC8 EDB-L19-diS-4574 487 406 4 429 228 2 ADC16 Neg-diS-4574 1279 - 1 ND ND ND ADC9 EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI 34 30 5 3449 - 1 ADC17 Neg-AcLys-vc-CPI 2656 876 3 15110 15,408 2 ADC10 EDB-L19-vc-1569 40 11 2 5702 - 1 ADC18 Neg-vc-1569 7283 - 1 ND ND ND

Среднее IC₅₀±стандартное отклонение и количество (n) определений. ND=не определяли.

23.3: Эффективность сайт-специфических EDB ADC конъюгатов in vivo

[366] ADC конъюгаты против EDB оценивали на ксенотрансплантате клеточной линии (CLX), полученном от пациента ксенотрансплантате (PDX) и сингенных моделях опухолей. Экспрессию EDB+ FN определяли с помощью иммуногистохимического (ИГХ ) анализа, как описано ранее в настоящей заявке.

[367] Для получения CLX моделей, от 8×10⁶ до 10×10⁶ клеток линий H-1975, HT29 или опухоли Ramos подкожно имплантировали самкам бестимусных голых мышей. Клетки Ramos и H-1975 для инокуляции суспендировали в 50% и 100% Матригеле (BD Biosciences), соответственно. В модели Ramos животных подвергали тотальному облучению (4 Гр) перед инокуляцией клеток для ускорения приживления опухолей. Когда средний объем опухоли достигал приблизительно 160-320 мм³, животных случайно распределяли в группы лечения по 8-10 мышей в каждой группе. ADC конъюгаты или растворитель (PBS) вводили внутривенно в день 0, после чего животные получали дозу раз в 4 дня, в количестве 4-8 доз. Опухоли измеряли один или два раза в неделю и объем опухоли вычисляли как объем (мм³)=(ширина×ширина×длина)/2. Массу тела животных контролировали в течение 4-9 недель, при этом ни в одной из групп лечения потери веса у животных не наблюдали.

[368] Для получения PDX моделей, опухоли собирали у животных-доноров и фрагменты опухоли размером приблизительно 3×3 мм имплантировали подкожно в бок самкам бестимусных голых мышей (для модели PDX-NSX-11122) или мышей NOD SCID (для моделей PDX-PAX-13565 и PDX-PAX-12534) при помощи троакара 10 G. Когда средний объем опухолей достигал приблизительно 160-260 мм³, мышей случайно распределяли в группы лечения по 7-10 мышей в каждой группе. Схема и путь введения ADC конъюгатов или растворителя (PBS), а также методики измерения опухолей являлись такими же, как описано выше для моделей CLX. Массу тела животных контролировали в течение 5-14 недель, при этом ни в одной из групп лечения потери веса у животных не наблюдали. Ингибирование роста опухолей наносили на кривую как среднее значение размера опухоли±SEM.

[369] Экспрессия EDB+ FN. Как показано в Таблице 37, экспрессию EDB+ FN в опухолевых моделях CLX H-1975, HT29 и Ramos, моделях PDX PDX-NSX-11122, PDX-PAX-13565 и PDX-PAX-12534 и сингенной модели EMT-6 измеряли посредством связывания антитела EDB-L19 и последующего детектирования в ИГХ анализе. CLX HT-29 показывала среднюю экспрессию CLX, однако являлась отрицательной при исследовании in vitro вследствие преобладания белковой экспрессии в CLX, полученной из стромы опухоли.

Таблица 37. Экспрессия EDB+ FN

Модель оценки эффективности Тип опухоли Общая экспрессия EDB+ FN PDX-NSX-11122 НМРЛ PDX Высокая EMT-6 Сингенная мышиная карцинома молочной железы Высокая PDX-PAX-13565 Аденокарцинома поджелудочной железы PDX Средняя/высокая H-1975 НМРЛ CLX Средняя/высокая HT29 Рак толстой и прямой кишки CLX Средняя Ramos Лимфома Беркитта CLX Средняя PDX-PAX-12534 Аденокарцинома поджелудочной железы PDX Низкая/средняя

[370] PDX-NSX-11122 НМРЛ PDX. Действие различных ADC конъюгатов оценивали в НМРЛ PDX модели PDX-NSX-11122 рака человека, которая экспрессирует высокий уровень EDB+ FN. На ФИГ. 34A показана противоопухолевая активность для EDB-L19-vc-0101 (ADC1) в дозе 0,3, 0,75, 1,5 и 3 мг/кг. Данные демонстрируют, что EDB-L19-vc-0101 (ADC1) показал дозозозависимую регрессию опухоли при дозе 3 мг/кг и 1,5 мг/кг.

[371] Противоопухолевую эффективность vc-связанных ADC конъюгатов сравнивали с дисульфид-связанными ADC конъюгатами. На ФИГ. 34B и 34C показана противоопухолевая активность EDB-L19-vc-0101 (ADC1) при дозе 3 мг/кг в сравнении с 10 мг/кг дисульфид-связанного EDB-L19-diS-DM1 (ADC5) и EDB-L19-vc-0101 (ADC1) при дозе 1 и 3 мг/кг в сравнении с 5 мг/кг дисульфид-связанного EDB-L19-diS-C₂OCO-1569 (ADC6), соответственно. Как показано на ФИГ. 34B и 34C, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) продемонстрировал более высокую эффективность по сравнению с ADC конъюгатами изотипического отрицательного контроля и ADC конъюгатами, которые были получены при использовании дисульфидного линкера, EDB-L19-diS-DM1 и скидка EDB-L19-diS-C₂OCO-1569. Кроме того, животные-опухоленосители, которые получали EDB-L19-vc-0101 (ADC1), показали задержку роста опухоли при дозе 1 мг/кг и полную регрессию при дозе 3 мг/кг. Данные демонстрируют, что EDB-L19-vc-0101 (ADC1) дозозависимо ингибирует рост НМРЛ ксенотрансплантатов PDX-NSX-11122.

[372] Оценивали активность сайт-специфического и стандартно конъюгированых ADC конъюгатов. На ФИГ. 34D показана противоопухолевая эффективность сайт-специфически конъюгированного EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) в сравнении со стандартно конъюгированым EDB-L19-vc-0101 (ADC1) в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг и 1,5 мг/кг, соответственно. Эффективность в зависимости от уровня дозы была сопоставимой, и EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) приводил к дозозависимой регрессии опухоли.

[373] Оценивали активность vc-0101 ADC конъюгаты против EDB, имеющих различные мутации. На ФИГ. 34E показана противоопухолевая эффективность сайт-специфически конъюгированного EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг. EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) вызывал регрессию опухоли в дозе 1 и 3 мг/кг. На ФИГ. 34F показаны кривые ингибирования роста опухоли для 10 отдельных мышей-опухоленосителей в группа EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4), получавшей дозу 3 мг/кг ФИГ. 34E. Регрессия опухолей в группе дозы 3 мг/кг была полной и длительной у 8 из 10 мышей (80%) в конце исследования (95 дней).

[374] НМРЛ CLX H-1975. Действие различных vc-связанных ауристатин и CPI ADC конъюгатов оценивали в модели НМРЛ CLX H-1975 рака человека со средней или высокой экспрессией EDB+ FN. На ФИГ. 35A показан анализ противоопухолевой активности EDB-L19-vc-0101 (ADC1) в дозе 0,3, 0,75, 1,5 и 3 мг/мг. Данные демонстрируют, что EDB-L19-vc-0101 (ADC1) показал дозозависимую регрессию опухоли в дозе 3 мг/кг, а также в дозе не более 1,5 мг/кг. На ФИГ. 35B показан анализ противоопухолевой активности EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-L19-vc-1569 (ADC10) в дозе 0,3, 1 и 3 мг/кг. Данные демонстрируют, что EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-L19-vc-1569 (ADC10) показали дозозависимую регрессию опухоли.

[375] Противоопухолевую активность vc-связанных ауристатин ADC конъюгатов сравнивали с CPI ADC конъюгатами. Как показано на ФИГ. 35C, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI (ADC9) оценивали в дозах 0,5, 1,5 и 3 мг/кг и 0,1, 0,3 и 1 мг/кг, соответственно. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI (ADC9) показали регрессию опухоли в максимальных оцениваемых дозах.

[376] Оценивали активность сайт-специфически и стандартно конъюгированых ADC конъюгатов против EDB. На ФИГ. 35D показана противоопухолевая эффективность сайт-специфически конъюгированного EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) в сравнении со стандартно конъюгированым EDB-L19-vc-0101 (ADC1) в дозах 0,5, 1,5 и 3 мг/кг. Эффективность в зависимости от уровня дозы была сопоставимой, и EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) приводил к дозозависимой регрессии опухоли.

[377] Оценивали активность vc-0101 ADC конъюгатов против EDB с различными мутациями. На ФИГ. 35E показана противоопухолевая эффективность EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-mut1-vc-0101 (ADC3) при дозе 1 и 3 мг/кг. На ФИГ. 35F показана противоопухолевая эффективность сайт-специфического EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) и EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) при дозе 1 и 3 мг/кг. 4 ADC конъюгата продемонстрировали аналогичную эффективность в модели H-1975, независимо от того, содержали ли они мутации κK183C-K290C. Кроме того, все протестированные ADC конъюгаты показали устойчивую противоопухолевую эффективность, включающую регрессию опухолей при дозе 3 мг/кг. Эти данные демонстрируют, что введение мутаций κK183C-K29°C не оказало отрицательного влияния на эффективность ADC конъюгатов.

[378] CLX толстой кишки HT29. Действие различных vc-связанных ауристатин ADC конъюгатов оценивали в CLX модели рака толстой кишки HT29 человека со средней экспрессией EDB+ FN. Как показано на ФИГ. 36, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB L19 vc 9411 (ADC7) тестировали на противоопухолевую активность в дозе 3 мг/кг. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-L19-vc-9411 (ADC7) показывали регрессию опухоли в динамике по времени в дозе 3 мг/кг.

[379] PDX поджелудочной железы PDX-PAX-13565 и PDX-PAX-12534. Противоопухолевую эффективность EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали в PDX моделях рака поджелудочной железы человека. Как показано на ФИГ. 37A, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг в PDX-PAX-13565, PDX поджелудочной железы со средней или высокой экспрессией EDB+FN. Как показано на ФИГ. 37B, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг в PDX-PAX-12534, PDX поджелудочной железы с низкой или средней экспрессией EDB+FN. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) продемонстрировал дозозависимую регрессию опухоли в обеих оцениваемых PDX моделях рака поджелудочной железы.

[380] CLX лимфома Ramos. Противоопухолевую эффективность EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали в CLX модели лимфомы Ramos со средней экспрессией EDB+ FN. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали на противоопухолевую активность в дозе 1 и 3 мг/кг. Как показано на ФИГ. 38, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) показал дозозависимую регрессию опухоли при дозе 3 мг/кг.

[381] Сингенная модель рака молочной железы EMT-6. Противоопухолевую эффективность EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) оценивали в сингенной модели EMT-6 мышной карциномы молочной железы в иммунокомпетентном окружении. Как показано на ФИГ. 39A, EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) демонстрировал ингибирование роста опухоли при дозе 4,5 мг/кг. Ингибирование роста опухоли наносили на кривую как среднее значение размера опухоли у одиннадцати животных-опухоленосителей±SEM. На ФИГ. 39B показаны кривые ингибирования роста опухолей для 11 отдельных мышей-опухоленосителей в группе EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4), получавшей дозу 4,5 мг/кг. Регрессия опухолей в группе дозы 4,5 мг/кг была полной и длительной у 9 из 11 мышей (82%) в конце исследования (34 дня).

23.4: Фармакокинетика (ФК) сайт-специфических EDB ADC конъюгатов

[382] Экспозицию стандартно конъюгированого EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и сайт-специфически конъюгированого EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) конъюгатов антитела-лекарственного средства определяли после внутривенного (в/в) болюсного введения дозы 5 или 6 мг/кг у яванских макаков, соответственно. Концентрации суммарного антитела (суммарное Ат; измерение конъюгированого мАт и неконъюгированного мАт), ADC (мАт, которое конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой лекарственного средства) измеряли с помощью анализов связывания лиганда (LBA), и концентрации высвобождаемой полезной нагрузки 0101 измеряли с помощью масс-спектрометрии. Количественный анализ сумарных концентраций Ат и ADC выполняли с помощью анализа связывания лиганда (LBA) при использовании рабочей станции Gyrolab^® с детектированием флуоресценции. В качестве захватывающего белка использовали биотинилированное антитело овцы против hIgG и в качестве детектирующего антитела использовали Alexa Fluor 647 конъюгат антитела козы против hIgG для суммарного антитела или Alexa Fluor 647 мАт против 0101 для ADC (данные обрабатывали с помощью системы Watson v 7.4 LIMS). Образцы in vivo подготавливали для анализа неконъюгированной полезной нагрузки при использовании осаждения белка и вводили в масс-спектрометр AB Sciex API5500 (QTRAP) при использовании положительной электрораспылительной ионизации Turbo IonSpray (ЭРИ) и режима мониторинга множественных реакций (MRM). Переходы 743,6→188,0 и 751,6→188,0 использовали для аналита и дейтерированного внутреннего стандарта, соответственно. Сбор и обработку данных выполняли с помощью программы Analyst версии 1.5.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canada).

[383] Фармакокинетика суммарного Ат, ADC и высвобождаемой полезной нагрузки из ADC EDB-L19-vc-0101 (в дозе 5 мг/кг) и ADC EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (в дозе 6 мг/кг), вводимых яванским макакам, показана в Таблице 38. Экспозиция сайт-специфического ADC конъюгата EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 показала не только увеличение экспозиции (~2,3× увеличение при измерении AUC, нормализованной по дозе), но и увеличенную стабильность конъюгирования по сравнению с обычным конъюгатом. Стабильность конъюгирования оценивали по более высокому отношению ADC/Ат (84% и 75%), и по более низкой экспозиции высвобождаемой полезной нагрузки (нормализованная по дозе AUC; 0,0058 и 0,0082 мкг*ч/мл) для сайт-специфически конъюгированного EDB-mut2(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC по сравнению с обычным EDB-L19-vc-0101 ADC, соответственно. NA=не применимо.

Таблица 38. Сводная таблица фармакокинетики у не относящихся к человеку приматов.

ADC Доза (мг/кг) Аналит C_max
(мкг/мл) AUC _0-504 (мкг*ч/мл) T_1/2 в конечной фазе (день) AUC/
Доза ADC/Ab
(%) EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 5 Ат 114
±27 6907
±1997 5,1
±2,2 1381
±399 - ADC 110
±31 5190
±1453 4,6
±1,0 1038
±291 75
±2 Полезная нагрузка 0,00053
±0,00025 0,0411
±0,0160 NA 0,0082
±0,0032 - EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) 6 Ат 164
±36 17600
±3045 6,4
±1,3 2933
±507 - ADC 156
±30 14567
±2122 5,9
±1,1 2428
±354 84
±3 Полезная нагрузка 0,00024
±0,00021 0,0349
±0,0030 NA 0,0058
±0,0005 -

23.5: Исследования токсичности сайт-специфических EDB ADC конъюгатов

[384] Доклинический профиль безопасности обычного EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и сайт-специфически конъюгированного EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) исследовали в поисковых исследованиях повторного введения (Q3W×3) у крыс Wistar-Han и яванских макаков. Крысу и яванского макака считали фармакологически релевантными доклиническими видами для оценки токсичности вследствие 100% гомологии белковых последовательностей с человеческим EDB+ FN, а также подобной аффинностью связывания антител EDB-L19 (Ab1) и EDB-mut1(κK183C-K290C) (Ab4) крысой, человеком и обезьяной согласно анализу BiaCore, как продемонстрировано в Примере 2.

[385] EDB-L19-vc-0101 (ADC1) оценивали у крыс Wistar-Han и яванских макаках до 10 и 5 мг/кг/доза, соответственно, и EDB-mut1 (κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) оценивали у яванских макаков до 12 мг/кг/доза. Крысам или обезьянам дозы вводили внутривенно, один раз в 3 недели (в Дни 1, 22 и 43), и усыпляли в День 46 (через 3 дня после введения 3-й дозы). Животных исследовали на клинические проявления, изменения массы тела, потребление пищи, показатели клинической патологии, вес органов и макроскопические и микроскопические наблюдения. Никакой смертности или существенных изменений клинического состояния животных в этих исследованиях не было отмечено.

[386] Не наблюдали никаких признаков мишень-зависимой токсичности в EDB+ FN экспрессирующих тканях/органах у крыс и обезьян. В обоих видах основной токсичностью являлась обратимая миелосупрессия с ассоциированными гемологическими изменениями. У обезьян наблюдали выраженную транзиторную нейтропению в случае стандартно конъюгированого EDB-L19-vc-0101 (ADC1) при 5 мг/кг/доза, тогда как лишь минимальное влияние на количество нейтрофилов наблюдали в случае сайт-специфически конъюгированого EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) при 6 мг/кг/доза, как показано в Таблице 39 и на ФИГ. 40. Точки представляют собой среднее, и планки погрешности представляют собой±1 стандартное отклонение (SD) от среднего.

[387] Данные демонстрируют значимое уменьшение миелосупрессии при сайт-специфическом конъюгировании. Профиль токсичности EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) соответствовал мишень-независимому действию указанных конъюгатов, при этом наибольшие дозы, не вызывающие тяжелых токсических явлений (HNSTD), для EDB-L19-vc-0101 (ADC1) и EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) были определны на уровне≥5 мг/кг/доза и≥12 мг/кг/доза, соответственно.

Таблица 39. Абсолютное количество нейтрофилов у яванских макаков в течение всего исследования.

0 мг/кг (растворитель) EDB-L19-vc-0101
(5 мг/кг) EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101
(6 мг/кг) День Животное 1 Животное 2 Животное 1 Животное 2 Животное 1 Животное 2 -7 3,26 2,9 8,48 4,67 2,41 7,42 7 3,54 2,52 7,08 2,29 3,96 4,3 10 3,16 6,83 0,11 0,82 2,66 1,56 15 3,06 1,98 11,41 3,65 1,37 1,44 31 3,87 4,17 0,39 2,07 1,91 2,22 38 3,09 5,63 16,17 2,73 1,97 1,13 45 3,53 2,07 13,02 1,83 1,4 3,78

Пример 24: Сайт-специфические ADC конъюгаты с антителами, направленными против опухолевого антигена

24.1. Получение сайт-специфического ADC конъюгата

24.1.1 Получение двойного cys-мутанта (kK183C+K290C).

[388] Для подтверждения того, что опосредованное двойным cys-мутантом, kK183C+K290C, сайт-специфическое конъюгирование лекарственного средства обеспечивает значимые преимущества по сравнению с обычным конъюгатом антитела-лекарственного средства, исследовали другое антитело против опухолеассоциированного антигена, Антитело X (в дальнейшем X). Антитело X гуманизировали из соответствующего мышиного исходного антитела. Для получения сайт-специфических конъюгатов антитела-лекарственного средства, конъюгированных с ауристатином 0101, получили X-hIgG1/каппа с мутацией kK183C в каппа легкой цепи и мутацией K29°C в константных областях тяжелой цепи hIgG1. Получали белковые препараты антитела X и его двойной cys-мутантной версии, X(kK183C+K290C), и оценивали их относительную связывающую активность с антигеном-мишенью в конкуретном ELISA. В этом анализе антитело X и cys-мутант X (kK183C+K290C) исследовали на их способность конкурировать против их общего исходного антитела за связывание с антигеном-мишенью, иммобилизированным на планшете для ELISA. Как показано на ФИГ. 41, антитело X и X(kK183C+K290C) обладали эквивалентной конкурентной связывающей активностью с антигеном-мишенью, что указывает на то, что cys-мутации в константной области тяжелой и легкой цепей не влияли на связывающую активность антитела с антигеном-мишенью.

Методы.

[389] Конкурентный ELISA. 96-луночные планшеты (планшеты hi-bound CoStar) покрывали слитым белком антигена-Fc в качестве мишени. От 1 до 3 серийно разведенных растворов антитела X и cys-мутанта X (kK183C+K290C) в блокирующем буфере (1% бычий сывороточный альбумин в PBST) в присутствии постоянной концентрации биотинилированного исходного антитела наносили на планшет. После инкубирования в течение 2 часов, планшеты промывали и наносили HRP-конъюгированый стрептавидин (Southern Biotech), разведенный 1:5000 в блокирующем буфере. Инкубирование со стрептавидином проводили в течение 40 минут, после чего планшеты проявляли раствором TMB в течение 10 минут. Затем реакцию проявления останавливали путем добавления 0,18М H₂SO₄ и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Графическое нанесение и анализ данных проводили с помощью программы Microsoft Excel и Graphpad-Prism.

24.1.2 Получение X-vc0101 и X(kK183C+K290C)-vc0101 конъюгатов

24.1.2.1 Получение обычного ADC (X-vc0101)

[390] Обычный ADC получали посредством неполного восстановления антитела X трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) с последующей реакцией восстановленных остатков цистеина с малеимид-функционализированным линкером-полезной нагрузкой vc0101. В частности, антитело частично восстанавливали путем добавления 2,2 молярного избытка TCEP в 100 мМ буфере HEPES, pH 7,0, и 1 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) в течение 2 часов при 37°C. Затем к реакционной смеси добавляли vc0101 при отношении линкер-полезная нагрузка/антитело 7:1 и проводили реакцию в течение еще 1 часа при 25°C в присутствии 15% об/об диметилацетамида (DMA). Добавляли N-этилмалеимид (NEM) для блокирования непрореагировавших тиолов, с последующим добавлением L-цистеина для блокирования непрореагировавшего линкера-полезной нагрузки. Реакционную смесь диализировали в течение ночи при 4°C в PBS, pH 7,4, и очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC; AKTA avant, смола Superdex 200). Очищенный ADC подвергали замене буфера на 20 мМ гистидина, 85 мг/мл сахарозы, pH 5,8, и хранили при -70°C. Анализ чистоты ADC проводили с помощью аналитической SEC; вычисление отношения ЛС-антитела (DAR) проводили с помощью HIC и ЖХ-ЭРИ МС. Концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектрофотометра.

24.1.2.2 Получение сайт-специфического ADC X(kK183C+K290C)-vc0101

[391] Сконструированный двойной cys-мутант, X(kK183C+K290C), полностью восстанавливали 12-кратным молярным избытком TCEP в 100 мМ буфере HEPES, pH 7,0, и 1 мМ DTPA в течение 6 часов при 37°C с последующим обессоливанием для удаления избытка TCEP. Восстановленное антитело инкубировали в 2 мМ дегидроаскорбиновой кислоте (DHA) в течение 16 часов при 4°C для повторного образования дисульфидных связей. После обессоливания добавляли малеимид-функционализированный линкер-полезную нагрузку vc0101 в молярном отношении линкер-полезной нагрузки/антитела 10:1 и продолжали реакцию в течение еще 2 часов при 25°C в присутствии 15% об/об диметилацетамида (DMA). Реакционную смесь обессаливали и очищали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC, AKTA avant, смола Butyl HP). Очищенный ADC подвергали замене буфера на 20 мМ гистидин, 85 мг/мл сахарозу, pH 5,8, и хранили при -70°C. Анализ чистоты ADC проводили с помощью SEC; вычисление DAR проводили с помощью HIC, обращенно-фазовой ВЭЖХ и ЖХ-ЭРИ МС. Концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектрофотометра.

24.1.2.3 Распределение лекарственного средства ADC

[392] Соединения подготавливали к анализу HIC, разбавляя образцы PBS до приблизительно 1 мг/мл. Анализ образцов проводили с автоматическим вводом 15 мкл на Agilent 1200 HPLC с колонкой TSK-GEL Butyl NPR (4,6×3,5 мм, размер пор 2,5 мкм; Tosoh Biosciences part #14947). Система включает автоматический дозатор с термостатом, нагреватель колонки и УФ-детектор. Метод градиента использовали следующим образом: Подвижная фаза A: 1,5М сульфата аммония, 50 мМ двухосновного фосфата калия, (pH 7); Подвижная фаза B: 20% изопропилового спирта, 50 мМ двухосновного фосфата калия (pH 7); T=0 мин: 100% А; T=12 мин: 0% А.

[393] Профили распределения лекарственного средства показаны в Таблице 40. Хотя оба ADC конъюгата демонстрировали аналогичное среднее DAR, ADC с применением сайт-специфического конъюгирования (X(ĸK183C+K290C)-vc0101) показал по существу один пик (94% - DAR 4), а ADC конъюгаты с применением обычного конъюгирования (X-vc0101) показали смесь дифференцированно нагруженных конъюгатов (51% - DAR 4). Такой гомогенный профиль распределения лекарственного средства является основным преимуществом сайт-специфического ADC по сравнению с обычным ADC.

Таблица 40: Распределение лекарственного средства ADC конъюгатов (в анализе HIC)

ADC Сред. DAR 0 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 6 DAR 8 DAR X-vc0101 3,8 2% 26% 0% 51% 19% 2% X(ĸK183C+K290C)-vc0101 3,9 0% 0% 6,3% 93,7% 0% 0%

24.2. Оценка J145 ADC конъюгатов в качестве монотерапии в ксенотрансплантатной модели с Calu-6, линии клеток немелкоклеточного рака легкого человека

[394] Введение животным-опухоленосителям дозы 3 мг/кг ADC X-vc0101 (обычного конъюгата) и ADC X(kK183C+K290C)-vc0101 приводило к регрессии опухоли в обеих группах после введения последней дозы кандидатных лекарственных средств в день 15, при этом средний объем опухолей составил 60 мм³ и 53 мм³, соответственно. В день исследования 26, когда группу на растворителе усыпляли, обе группы лечения показали четкую регрессию опухолей. Со дня 47-58, два из пяти животных в группе обычного конъюгата перестали отвечать на лечение и показали быстрый рост, однако X(kK183C+K290C)-vc0101 последовательно демонстрировал регрессию опухолей. Средние объемы опухолей для обычного конъюгата и ADC X(kK183C+K290C)-vc0101 в день 58 составили 825 мм³ и 23 мм³ соответственно (Таблица 41 и ФИГ. 42).

[395] В день исследования 61, группа обычного ADC потеряла животное вследствие умерщвления из-за превышения опухолью объема 3520 мм³. Группа X(kK183C+K290C)-vc0101 показывала последовательную регрессию опухоли до дня 82 и впоследствии показала возобновление роста опухолей, причем самая большая масса, присутствующая в конце исследования, составила 1881 мм³ в день исследования 111 (Таблица 41 и ФИГ. 42).

[396] ADC X(kK183C+K290C)-vc0101 показал стабильное противоопухолевое действие в CDX модели НМРЛ человека Calu-6 при схеме дозирования Q4D×4 в дозе 3 мг/кг до дня 82 исследования. ADC X-vc0101 в начальные точки времени в исследовании показал сопоставимое уничтожение опухолевых клеток, однако в ходе исследования опухоли избегали эффектов лечения в день 47 и быстро увеличились в размере.

[397] В заключение следует отметить, что ADC X(kK183C+K290C)-vc0101 обладает наилучшей противоопухолевой активностью в Calu-6, CDX модели НМРЛ человека, при большем количестве выживших животных до дня 111.

Таблица 41: Объемы опухолей отдельных мышей, получавших ADC конъюгаты или контрольный растворитель.

(Объемы отдельных опухолей представлены в мм³ у n=5 животных на каждую из групп лечения до дня 111; Сред: среднее значение)

Дни Растворитель ADC
X(kK183C+K290C)-vc0101
(3 мг/кг) ADC
X-vc0101 (3 мг/кг) 1 2 3 4 5 Сред 1 2 3 4 5 Сред 1 2 3 4 5 Сред 1 149 127 192 135 112 143 115 140 184 130 150 143 133 172 156 113 142,2 143 5 211 167 309 218 167 214 121 173 240 171 155 172 178 288 163 166 161,2 191 8 334 250 350 331 236 300 121 167 300 107 100 159 140 219 125 143 124,9 150 12 448 248 458 353 240 349 61 96 150 60 64 86 72 111 65 74 63,8 77 15 416 270 591 511 460 450 57 50 70 49 38 53 70 74 49 52 55,2 60 19 519 307 770 838 815 650 25 23 30 32 19 26 1 29 7 23 9,8 14 22 657 347 1238 1018 1040 860 34 137 25 26 35 51 0 20 17 15 15,6 13 26 1069 489 1895 1379 912 1149 27 161 25 0 28 48 27 34 19 31 33,5 29 29 30 149 21 0 37 47 18 27 36 15 43,2 28 33 20 135 52 0 22 46 13 25 41 29 25,9 27 36 22 98 70 58 35 57 10 14 33 48 32,5 28 40 30 108 30 48 26 48 25 33 22 66 25,3 34 43 100 29 52 0 45 56 75 22 62 17,5 47 47 84 23 35 0 36 40 269 30 40 12,2 78 50 89 15 12 0 29 28 648 57 90 13,3 167 55 43 27 18 0 22 11 2164 27 368 0 514 58 40 32 20 0 23 5 3520 0 601 0 825 61 57 40 13 0 27 64 56 42 13 0 28 68 55 95 15 13 44 71 47 145 0 16 52 75 17 187 0 20 56 78 230 0 23 84 82 282 23 32 112 85 384 34 93 170 89 478 43 101 207 92 702 53 128 294 96 970 148 175 431 99 979 146 228 451 103 1229 203 414 616 106 1286 340 698 775 111 1881 612 972 1155

Методы.

[398] Ксенотрансплантаты опухоли инициировали в когортах из семи самок бестимусных голых мышей возрастом 5-8 недель путем подкожной инъекции 5×10⁶ человеческих клеток опухоли легкого Calu-6 (ATCC, номер по кат. HTB-56) в объеме 0,1 мл на мышь, суспендированных в 50% Матригеле (BD Biosciences, номер по кат. 356234), сделанной с минимальной поддерживающей средой Игла (ATCC, номер по кат. 30-2003), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone #SH30088.03HI) в правый бок. Введение исследуемых препаратов начинали, когда средний размер опухолей достиг 100-150 мм³, где объем опухоли вычисляли как: (мм³)=(a×b²/2), где 'b' является минимальным диаметром, и 'a' является максимальным диаметром. Объем опухоли и данные массы тела собирали два раза в неделю. Образцы крови (по 10 мкл) забирали у двух мышей в каждой группе через 30 часов после введения первой дозы и через 30 часов после введения последней (четвертой) дозы. Кровь разбавляли в 190 мкл буфера HBS-EP и сразу помещали на хранение при -80°C. Опухолевые массы собирали при вскрытии у тех же животных, у которых брали кровь, через 30 часов после введения последней (четвертой) дозы и подвергали мгновенному замораживанию.

[399] ADC X(kK183C+K290C)-vc0101 вводили внутривенно животным-опухоленосителям в дозах 6 мг/кг, 3 мг/кг, 1 мг/кг и 0,3 мг/кг в схеме дозирования Q4D×4 (четыре дозы, вводимые раз в четыре дня).

[400] ADC X-vc0101 (обычный конъюгат) вводили внутривенно животным-опухоленосителям в дозе 3 мг/кг в схеме дозирования Q4D×4 (четыре дозы, вводимые раз в четыре дня).

24.3. Фармакокинетические исследования .

[401] X-vc0101 и X (kK183C+K290C)-vc0101 показали сопоставимые профили ФК/ТК при одинаковом уровне дозы 6 мг/кг, включая Cmax, экспозицию (AUC) и период полувыведения (t_1/2) (Таблица 42). Подобные уровни экспозиции (т.е. AUC) суммарного Ат и ADC наблюдали для X-vc0101 и для X(kK183C+K290C)-vc0101 при дозе 6 мг/кг и X(kK183C+K290C)-vc0101 при дополнительных более высоких дозах 9 и 12 мг/кг, когда экспозиция достигла намного более высоких уровней. Это указывает, что ADC конъюгаты, вводимые животным, оставались по существу интактными в течение всего исследования в случае обоих соединений, и что оба соединения обладали аналогичной стабильностью in vivo.

Таблица 42: Средние фармакокинетические показатели X-vc0101 и X(kK183C+K290C)-vc0101 суммарного антитела и ADC у обезьян после в/в введения

Соединение Доза (мг/кг) Суммарное антитело Конъюгат антитела-лекарственного средства (ADC) C_max (мкг/мл) T_max (ч) AUC (мкг*ч/мл) t_1/2 (ч) C_max (мкг/мл) T_max (ч) AUC (мкг*ч/мл) t_1/2 (ч) X-vc0101 6 158 0,25 13100 77,9 160 0,25 10430 68,8 X(kK183C+K290C)-vc0101 6 157 0,25 17700 84,4 160 0,25 14500 87,7 9 233 0,25 32700 101 227 0,25 25300 72,3 12 363 0,25 55600 173 371 0,25 44400 140

C_max= Максимальная концентрация лекарственного средства; T_max= время до C_max, AUC= площадь под кривой зависимости концентрации от времени; t_1/2= период полувыведения; AUC вычисляли для 0-504 часов

Методы

[402] Экспозиция обычного (X-vc0101) или сайт-специфического (X(kK183C+K290C)-vc0101) конъюгатов антитела-лекарственного средства (ADC) определяли после в/в болюсного введения 6 мг/кг X-vc0101 или 6, 9 и 12 мг/кг X(kK183C+K290C)-vc0101) яванским макакам. Образцы плазмы забирали до введения дозы, через 0,25, 6, 24, 72, 168, 336 и 504 часа после в/в введения каждой дозы. Концентрации суммарного антитела (суммарного Ат; измерение конъюгированого мАт и неконъюгированного мАт) и ADC (мАт, которое конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой лекарственного средства) определяли при использовании анализа связывания лиганда (LBA). Фармакокинетические (ФК)/токсикокинетические (ТК) показатели для каждой дозы вычисляли на основе профилей зависимости концентрации от времени суммарного Ат и ADC для X-vc0101 и для X(kK183C+K290C)-vc0101 (Таблица 42).

24.4. Исследования токсичности

[403] В двух независимых поисковых исследованиях токсичности самкам и самцам яванских макаков в/в вводили дозу один раз в 3 недели (дни исследования 1, 22 и 43). В день исследования 46 (через 3 дня после введения 3-й дозы) животных усыпляли и забирали указанные в протоколе образцы крови и ткани. Клинические наблюдения, клиническую лабораторную диагностику, макроскопические и микроскопические лабораторные исследования проводили прижизненно и при вскрытии. Для исследования анатомической патологии степень выраженности нарушений, обнаруженных в гистопатологических исследованиях, регистрировали на субъективной, относительной, специфической для исследования основе.

[404] В одном из этих исследований яванским макакам (2/пол/группа) вводили растворитель или X-hIgG1-vc0101 в 6 мг/кг/доза. В другом исследовании обезьянам (1/пол/группа) вводили растворитель или X(kK183C+K290C)-vc0101 в 6, 9 и 12 мг/кг/доза. Одного самца и одну самку, которым вводили X-hIgG1-vc0101 в 6 мг/кг/доза, усыпляли по выбору в день исследования 11, поскольку клинические проявления и данные лабораторных исследований указывали на тяжелую фебрильную нейтропению. В отличие от этого, при таком же уровне дозы, когда наблюдали аналогичную экспозицию (см. предыдущий раздел), все яванские макаки, получавшие X(kK183C+K290C)-vc0101 выживали до запланированного вскрытия в день исследования 46. При микроскопическом исследовании в костном мозге при дозе 6 мг/кг, все яванские макаки (в общей сложности 4), которым вводили X-hIgG1-vc0101, имели связанное с лекарственным соединением минимально или умеренно пониженную насыщенность ткани клетками всех типов (миелоидными и эритроидными), тогда как при микроскопическом исследовании в костном мозге яванских макаков, которым вводили X(kK183C+K290C)-vc0101 (в общей сложности 2), не обнаружили никаких изменений. В более высоких дозах 9 и 12 мг/кг, когда наблюдали намного более высокие уровни экспозиции, лишь минимальное или умеренное увеличение миелоидно/эритроидного (М/Э) отношения, вызванное увеличением количества первичных зрелых нейтрофилов и снижением количества клеток эритроидной линии, наблюдали в костном мозге у яванских макаков, которым вводили X(kK183C+K290C)-vc0101 в 9 мг/кг/доза (в общей сложности 2), но не наблюдали у обезьян, которым вводили X(kK183C+K290C)-vc0101 в 12 мг/кг/доза (в общей сложности 2).

Таблица 43: Смертность и результаты микроскопического исследования костного мозга

X-hIgG1-vc0101 X(kK183C+K290C)-vc0101 Самцы Самки Самцы Самки Доза (мг/кг/доза) 0 6 0 6 0 6 9 12 0 6 9 12 Смертность* - 1 - 1 - - - - - - - - Результаты микроскопического исследования Костный мозг (кол-во исследованных животных) 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 Сниженная насыщенность клетками: все типы (многоочаговая или диффузная) Минимальная (1 степень) - - - 1 - - - - - - - - Легкая (2 степень) - 1 - - - - - - - - - Умеренная (3 степень) - 1 - 1 - - - - - - - - Повышенное миелоидно/эритроидное отношение Минимальное (1 степень) - - - - - - - - - - 1 - Легкое (2 степень) - - - - - - 1 - - - - - *Животных выборочно усыпляли в День 11 вследствие клинических проявлений данных лабораторных исследований, указывающих на фебрильную нейтропению -: Отсутствие связанного с тестируемым препаратом нарушения

[405] Таким образом, показатели смертности и данные микроскопических исследований продемонстрировали, что ADC конъюгат на основе технологии сайт-специфической мутации, X(kK183C+K290C)-vc0101, четко уменьшал вызванную X-hIgG1-vc0101 миелотоксичность и нейтропению.

Пример 25: Сайт-специфические ADC конъюгаты с антителом 1.1

25.1. Получение антитела 1.1 для сайт-специфического конъюгирования

[406] Способ получения антитела 1.1 для сайт-специфического конъюгирования через реакционноспособные остатки цистеина проводили в общем, как описано в публикации PCT WO2013/093809. Один остаток на константной области каппа легкой цепи (K183, при использовании схемы нумерации Кэбата) и один на константной области тяжелой цепи IgG1 (K290, при использовании EU индекса Кэбата) изменяли на остаток цистеина (C) с помощью сайт-направленного мутагенеза.

25.2. Получение стабильно трансфицированных клеток, экспрессирующих сконструированные цистеиновые варианты Her2-PT антител

[407] В целях получения 1.1-kK183C-K29°C для исследований конъюгирования, клетки CHO трансфицировали ДНК, кодирующей 1.1-kK183C-K290C, и стабильные пулы с высокой продукцией выделяли при использовании стандартных методик, известных в уровне техники. Трехколоночный процесс, т.е. аффинный захват на белке A с последующей колонкой TMAE и затем колонкой CHA-TI, использовали для выделения 1,1-kK183C-K29°C из концентрированного исходного материала пула CHO. В результате применения таких способов очистки препарат 1.1-kK183C-K29°C содержал 98,6% интересующего пика (POI), как определяли с помощью аналитической гель-фильтрационной хроматографии (Таблица 44). Результаты, показанные в Таблице 44, демонстрируют, что после элюции 1.1-κK183C+K29°C со смолы с белком A были обнаружены приемлемые уровни компонентов с высокой молекулярной массой (HMMS), и что такие нежелательные HMMS компоненты могут быть удалены при использованиии TMAE и CHA-TI хроматографии. Данные также продемонстрировали, что участок связывания белка A в константной области IgG1 человека не был изменен вследствие присутствия модифицированного остатка цистеина в положении 290 (нумерация EU индекса).

Таблица 44: Краткое описание получения антитела 1,1-kK183C-K290

Этап очистки POI HMMS ЖХ-МС Выход % aSEC % aSEC % aSEC % Белок A 95,65 4,35 0 NA TMAE 95,87 4,13 0 92%F CHA-TI 98,85 1,15 0 62% UF/DF конечный продукт 98,595 1,405 0 96%

25.3. Сайт-специфическое конъюгирование антитела 1.1

[408] Конъюгирование малеимид-функционализированного линкера-полезной нагрузки с 1.1-kK183C-K29°C проводили путем полного восстановления антитела 15-кратным молярным избытком трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорида (TCEP) в 100 мМ буфере HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), pH 7,0, и 1 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоте (DTPA) в течение 6 часов при 37°C, с последующим обессоливанием для удаления избытка TCEP. Восстановленное антитело 1.1-kK183C-K29°C инкубировали в 1,5 мМ дегидроаскорбиновой кислоте (DHA), 100 мМ HEPES, pH 7,0, и 1 мМ DTPA в течение 16 часов при 4°C для повторного образования дисульфидных связей. Требуемый линкер-полезную нагрузку добавляли к реакционной смеси при молярном отношении линкера-полезной нагрузки/антитела 7 и продолжали реакцию в течение еще 1 часа при 25°C в присутствии 15% об/об диметилацетамида (DMA). После инкубирования в течение 1 часа, добавляли 6-кратный избыток L-Cys для блокирования непрореагировавшего линкера-полезной нагрузки. Реакционную смесь очищали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) при использовании колонки с бутил-сефарозой HP (GE Lifesciences). В методике для связывания использовали 1М KPO₄, 50 мМ Трис, pH 7,0, и ADC элюировали 50 мМ Трис, pH 7,0, 10 объемами колонки. Затем проводили анализ чистоты ADC с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ЖХ-ЭРИ МС) или обращенно-фазовой хроматографии (ОФ) для вычисления отношения лекарственного средства к антителу (нагрузки или DAR). ADC конъюгаты можно сравнивать с их соответствующим антителом при вычислении относительного времени удерживания (RRT), которое является отношением времени удерживания ADC в HIC, деленного на время удерживания соответствующего антитела в HIC. Концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектрофотометра. Результаты, представленные в Таблице 45, показывают, что цистеин-модифицированное антитело 1.1-kK183C-K29°C было эффективно конъюгировано с малеимид-функционализированным линкером-полезной нагрузкой vc0101 с получением гомогенного ADC с прогнозируемым и нужным количеством молекул полезной нагрузки (т.е. DAR 3,9).

Таблица 45: Свойства сайт-специфического конъюгата 1.1-ĸK183C+K290C-vc0101

ADC DAR (ЖХ-МС) DAR
(ОФ) Свободное ЛС (мкг/мг Ат) RRT HIC % чистоты Выход, % 1.1-κK183C-K290C-hG1_mcValCitPABC_Aur0101 3,9 3,9 0,01 1,62 99,2 58,9

25.4. Биоаналитическое исследование антитела 1.1-kK183C-K29°C и ADC 1.1-kK183C-K290C-vc0101

25.4.1 Термическая стабильность

[409] Дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) использовали для определения термической стабильности антитела 1.1-kK183C-K29°C и соответствующего сайт-специфического конъюгата Aur-06380101. Для этого анализа образцы, приготовленные в 20 мМ гистидине, pH 5,8, 8,5% сахарозе, 0,05 мг/мл ЭДТА вводили в кювету для образцов MicroCal VP-Capillary DSC с помощью автодозатора (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), уравновешивали в течение 5 минут при 10°C и затем сканировали до 110°C со скоростью 100°C в час. Выбирали период фильтрации 16 секунд. Необработанные данные корректировали по нулевой линии и нормализовали концентрацию белка. Программу Origin Software 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) использовали для выравнивания данных согласно модели состояний MN2 с соответствующим количеством переходов.

[410] Антитело 1.1-kK183C-K29°C показало превосходную термическую стабильность с первым фазовым переходом в расплав (Tm1) при 72,78°C, и полученный сайт-специфический конъюгат (SSC) 1.1-kK183C-K290C-vc0101 показал хорошую и сопоставимую стабильность как с T-kK183C-K290C-vc0101, так и с EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101 SSC конъюгатами, описанными в настоящей заявке, как определено первым фазовым переходом в расплав (Tm1)>65°C (Таблица 46). В совокупности эти результаты продемонстрировали, что цистеин-модифицированное антитело 1.1-(kK183C-K94R-K290C) обладало термической стабильностью, и что сайт-специфический конъюгат 0101 с vc линкером давал конъюгат с хорошей термической стабильностью.

Таблица 46: Термическая стабильность антитела 1.1-kK183C-K29°C и соответствующего сайт-специфического конъюгата ауристатина 0101

Антитело или ADC Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm3 (°C) Кажущаяся Tm Fab (°C) 1.1-kK183C-K290C 72,78±0,09 83,02±0,64 85,60±0,21 84,9 1.1-kK183C-K290C-vc0101 65,40±0,17 82,04±0,75 85,09±0,15 84,5

25.4.2 Целостность антитела 1.1-kK183C-K29°C и соответствующего сайт-специфического конъюгата ауристатина 0101

[411] Анализ с помощью невосстанавливающего капиллярного гель-электрофореза Caliper (Caliper LabChip GXII: Perkin Elmer Waltham, MA) проводили для определения чистоты и целостности антитела 1.1-kK183C-K29°C и соответствующего vc0101 сайт-специфического конъюгата. Результаты показывают, что цистеин-модифицированное антитело 1.1-kK183C-K29°C демонстрировало хорошую целостность с %IgG >96%, при этом препарат аналогичного сайт-специфического конъюгата содержал <8% фрагментированного ADC. Целостность сайт-специфического конъюгата 1,1-kK183C-K290C-vc0101 была выше, чем наблюдали для EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101, который очищали при использовании альтернативного метода (т.е. гель-фильтрационной хроматографии, а не хроматографии гидрофобного взаимодействия), и была значительно лучше по сравнению с ADC, который получали при использовании стандартных методик конъюгирования (т.е. EDB-L19-vc-0101), как показано в Таблице 47. Эти результаты подтверждают, что сайт-специфическое конъюгирование через модифицированные цистеины K29°C и K183C в IgG1 и каппа константных областях, соответственно, дает ADC со значительно более высокой целостностью по сравнению с конъюгатом, полученным при использовании стандартных методик конъюгирования с эндогенными цистеинами в константных областях антитела.

Таблица 47: Целостность антитела 1.1-kK183C-K29°C и сайт-специфического конъюгата vc0101

Антитело или ADC % IgG % не IgG % не IgG % ЖХ-МС % HMMS 1.1-kK183C-K290C 96,77 3,23 2,18 1,05 1.1-kK183C-K290C-vc0101 93,27 6,73 6,60 0,13 EDB-(kK183C-K94R-K290C) 97,8 2,2 ND ND EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101 80,7 19,3 ND ND EDB-L19-vc-0101 1,4 98,6 ND ND

ND=Не определяли

25.5. Фармакокинетика (ФК) 1.1-kK183C-K290C-vc0101

[412] Экспозицию сайт-специфически конъюгированого ADC 1.1-ĸK183C+K290C-vc0101 определяли после в/в болюсного введения дозы 6 или 12 мг/кг яванским макакам. Концентрации суммарного антитела (суммарное Ат; измерение конъюгированного Ат и неконъюгированного Ат) и ADC (Ат, которое конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой лекарственного средства) измеряли при использовании анализа связывания лиганда (LBA).

[413] Профили зависимости концентрации от времени и фармакокинетика/токсикокинетика суммарного Ат и сайт-специфического ADC 1.1-ĸK183C+K290C-vc0101 показаны в Таблице 48. Экспозиция ADC 1.1-ĸK183C+K290C-vc0101 увеличивалась приблизительно дозозависимо. Помимо этого экспозиция ADC ĸK183C+K290C-vc0101 была подобной и сопоставимой с сайт-специфическим конъюгатом трастузумаба, T(kK183C+K290C), описанным в настоящей заявке, который имел увеличенную экспозицию и стабильность по сравнению со стандартно конъюгированым ADC (Таблица 44).

Таблица 48: Фармакокинетика

ADC Доза День Средство Cmax AUC (0-456 ч) (мг/кг) (мкг/мл) (мкг*ч/мл) 1.1 6 1 Суммарное Ат 241 20300 ADC 247 25500 12 1 Суммарное Ат 324 44700 ADC 337 55800 HER2 6 1 Суммарное Ат 187 18400 ADC 181 16600 12 1 Суммарное Ат 368 45300 ADC 352 39600

Таблица 49. Таблица нумерации остатков

Тяжелая цепь
(CH2 домен, кроме A114) Тяжелая цепь
(CH3 домен) Остаток EU индекс Нумерация Кэбата Положение в SEQ ID No: 62 Остаток EU индекс Нумерация Кэбата Положение в SEQ ID No: 62 A114 118 114 N/A E345 345 366 115 K246 246 259 16 Q347 347 368 117 D249 249 262 19 S354 354 375 124 D265 265 278 35 R355 355 376 125 S267 267 280 37 L358 358 381 128 D270 270 283 40 K360 360 383 130 N276 276 289 46 Q362 362 385 132 Y278 278 291 48 K370 370 393 140 E283 283 300 53 Y373 373 396 143 K290 290 307 60 S375 375 398 145 R292 292 309 62 D376 376 399 146 E293 293 310 63 A378 378 401 148 E294 294 311 64 E380 380 405 150 Y300 300 319 70 E382 382 407 152 V302 302 321 72 Q386 386 414 156 V303 303 322 73 E388 388 416 158 L314 314 333 84 N390 390 418 160 N315 315 334 85 K392 392 420 162 E318 318 337 88 T393 393 421 163 K320 320 339 90 D401 401 430 171 I332 332 351 102 F404 404 435 174 E333 333 352 103 T411 411 442 181 K334 334 353 104 D413 413 444 183 I336 336 355 106 K414 414 445 184 R416 416 447 186 Q418 418 449 188 Q419 419 450 189 N421 421 452 191 M428 428 459 198 A431 431 462 201 L432 432 463 202 T437 437 468 207 Q438 438 469 208 K439 439 470 209 L443 443 474 213 S444 444 475 214 Каппа легкая цепь Лямбда легкая цепь Остаток EU индекс Нумерация Кэбата Положение в SEQ ID No: 63 Остаток EU индекс Нумерация Кэбата Положение в SEQ ID No: 64 A111 111 111 4 K110 N/A 110 4 K149 149 149 42 A111 N/A 111 5 K183 183 183 76 L125 N/A 125 19 K188 188 188 81 K149 N/A 149 43 K207 207 207 100 V155 N/A 155 49 N210 210 210 103 G158 N/A 158 52 T161 N/A 161 55 P183 N/A 183 76 Q185 N/A 185 78 S188 N/A 188 81 H189 N/A 189 82 S191 N/A 191 84 T197 N/A 197 90 V205 N/A 205 96 E206 N/A 206 97 K207 N/A 207 98 T208 N/A 208 99 A210 N/A 210 101

Таблица 50: Последовательности нуклеиновых кислот

SEQ ID NO. Описание Последовательность 79 T(K290C)
ДНК константной области тяжелой цепи (против HER2) GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACATGCCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT 80 T(kK183C)
ДНК константной области легкой цепи (против HER2) CGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCTGCGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC 81 EDB-K29°C Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACATGCCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT 82 EDB-K29°C Нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACATGCCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT 83 EDB-kK183C-huKappa Нуклеотидная последовательность легкой цепи GAAATTGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTTTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGACGGGTCGTATTCCGCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCTGCGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 84 EDB-kK183C-huKappa Нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCTGCGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

[414] Различные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения, указанные в отдельных разделах выше, относятся, в соответствующих случаях, к другим разделам, с необходимыми изменениями. Следовательно, признаки, указанные в одном разделе, могут быть объединены с признаками, указанными в других разделах, в соответствующих случаях. Все источники, цитируемые в настоящем документе, включая патенты, заявки на патент, статьи, книги и приведенные номера последовательностей, а также ссылки, приведенные в указанных источниках, полностью включены в настоящий документ посредством отсылки. В том случае, когда один или более включенных литературных источников и подобных материалов отличаются или противоречат настоящей заявке, в том числе, но без ограничения, определенным терминам, применению терминов, описанным методикам и т.п., настоящая заявка должна иметь преимущественную силу.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

<120> АНТИТЕЛА И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ ДЛЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО КОНЪЮГИРОВАНИЯ

<130> PC72296A

<150> 62/260,854

<151> 2015-11-30

<150> 62/289,744

<151> 2016-02-01

<150> 62/409,323

<151> 2016-10-17

<160> 84

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 6

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 7

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 11

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 14

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 15

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Cys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 16

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Cys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 17

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 18

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 19

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 20

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 21

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 22

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 23

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 24

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 25

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 26

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 27

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly

325

<210> 28

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 29

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 30

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 31

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 32

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 33

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 34

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 35

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 36

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 37

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 38

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 39

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly

325

<210> 40

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 41

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 42

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 43

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Leu Leu Gln

100 105 110

Gly Pro Pro

115

<210> 44

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro

210 215 220

<210> 45

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

Leu Leu Gln Gly Ala

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Leu Leu Gln Gly Pro Gly

1 5

<210> 51

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

Leu Leu Gln Gly Pro Ala

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Leu Leu Gln Gly Pro

1 5

<210> 53

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 53

Leu Leu Gln Pro

1

<210> 54

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Leu Leu Gln Pro Gly Lys

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 55

Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly Lys

1 5

<210> 56

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly

1 5

<210> 57

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 57

Leu Leu Gln Gly Ala Pro

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa может быть Gly или Pro

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa может быть Ala, Gly, Pro или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa может быть Ala, Gly, Lys, Pro или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть Gly, Lys или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (8)..(8)

<223> Xaa может быть Lys или отсутствовать

<400> 58

Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 59

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой или отсутствовать

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (8)..(8)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой или отсутствовать

<400> 59

Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro

1 5

<210> 61

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 61

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 62

<211> 217

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 62

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 63

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 63

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 64

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 64

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 65

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 65

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 66

Ser Phe Ser Met Ser

1 5

<210> 67

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 67

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

1 5

<210> 68

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 68

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 69

Ser Gly Ser Ser Gly Thr

1 5

<210> 70

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 70

Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 71

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 72

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 72

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 73

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 73

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 74

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 74

Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 76

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 77

<211> 445

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 78

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 79

<211> 987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc cccgggt 987

<210> 80

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc 60

ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac 180

tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtcctgcgc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300

tccttcaacc ggggcgagtg c 321

<210> 81

<211> 1335

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agtttttcga tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gttcgggtac cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300

ccgtattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc gtcgaccaag 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacatgcccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggt 1335

<210> 82

<211> 987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987

<210> 83

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

gaaattgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctttt tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagacgggtc gtattccgcc gacgttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagct gcgcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 84

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagctgcgc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<---