ПРОТИВОЗАГРЯЗНЯЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ BACILLUS COAGULANS Российский патент 2021 года по МПК A61K8/99 A61Q19/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка представляет собой заявку PCT, испрашивающую приоритет на основании индийской предварительной заявки № 201741030867, поданной 31 августа 2017 г., подробная информация из которой включена в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к пробиотическим композициям. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим пробиотический микроорганизм Bacillus coagulans MTCC 5856, для применения в качестве противозагрязняющего агента и омолаживающего/очищающего средства для кожи.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Кожа, самый большой орган в организме млекопитающего, играет роль барьера, обеспечивая защиту от механических воздействий и давления, колебаний температуры, микроорганизмов, излучения и химических веществ. Однако кожа подвергается воздействию различных загрязняющих агентов, что вызывает преждевременное старение кожи, пигментные пятна или акне, или приводит к более серьезным дерматологическим проблемам, таким как атопический дерматит, псориаз и даже рак кожи (English, J.S., R.S. Dawe, and J. Ferguson, Environmental effects and skin disease. Br Med Bull, 2003. 68: стр. 129-42).

В недавнем отчете ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) указано, что эта проблема затрагивает почти все население, и более 3 миллионов человек в мире умирают из-за повышения уровней загрязнения. Основными источниками загрязнения являются взвешенные частицы, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), летучие органические соединения (ЛОС), оксиды азота и серы, монооксид углерода, озон и тяжелые металлы (Baudouin, C., et al., Environmental pollutants and skin cancer. Cell Biol Toxicol, 2002. 18(5): стр. 341-8). Токсичные газы (CO2, CO, SO2, NO, NO2), низкомолекулярные углеводороды, стойкие органические загрязнители (например, диоксины), тяжелые металлы (например, свинец, ртуть) и взвешенные частицы (ВЧ) представляют собой первичные загрязняющие агенты, образующиеся из источника. Вторичные загрязняющие агенты, включающие озон (O3), NO2, пероксиацетилнитрат, пероксид водорода и альдегиды, образуются в атмосфере в результате химических и фотохимических реакций с участием первичных загрязняющих агентов (Kampa, M. and E. Castanas, Human health effects of air pollution. Environ Pollut, 2008. 151(2): стр. 362-7).

Действие загрязнения на кожу является разносторонним. В присутствии загрязняющих агентов изменяется состав нормального микробиома кожи, что приводит к колонизации патогенными организмами (Jo, J.H., E.A. Kennedy, and H.H. Kong, Topographical and physiological differences of the skin mycobiome in health and disease. Virulence, 2017. 8(3): стр. 324-333). Загрязнение усиливает образование активных форм кислорода (АФК), что истощает запас антиоксидантов в коже. Это вызывает нарушение окислительно-восстановительного баланса, вызывая стресс для клеток. По мере того, как загрязняющие агенты проникают через слои кожи, они могут активировать рецептор ароматических углеводородов (AhR), опосредующий токсические действия загрязняющих агентов. Эти изменения активируют каскад воспалительных реакций, что приводит к повышению выработки провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (ИЛ-1) или ИЛ-8, что приводит к повреждениям кожи и ухудшению ее внешнего вида (Mancebo, S.E. and S.Q. Wang, Recognizing the impact of ambient air pollution on skin health. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2015. 29(12): стр. 2326-32).

Загрязняющие окружающую среду агенты, такие как УФ-A излучение, активируют образование матриксных металлопротеиназ (ММР) - ферментов, разлагающих эластин и коллаген матриксного белка, и если не предотвратить этот процесс, это может привести к заметному снижению эластичности кожи и повышению образования морщин (Risom, L., P. Moller, and S. Loft, Oxidative stress-induced DNA damage by particulate air pollution. Mutat Res, 2005. 592(1-2): стр. 119-37; Moller, P. and S. Loft, Oxidative damage to DNA and lipids as biomarkers of exposure to air pollution. Environ Health Perspect, 2010. 118(8): стр. 1126-36). УФ-А излучение способно проникать глубже в кожу по сравнению с УФ-B излучением и способствуют фотостарению, фотоканцерогенезу и фотодерматозу, а также усиливает окислительный стресс в фибробластах и клетках, находящихся в более глубоких слоях кожи. Сообщается, что синий свет (свет от экранов мобильных телефонов, телевизоров, ноутбуков/настольных компьютеров) оказывает схожее действие (Godley et al., Blue Light Induces Mitochondrial DNA Damage and Free Radical Production in Epithelial Cells, The Journal Of Biological Chemistry, 2005, 280(22):21061-21066).

Окислительный стресс определен как дисбаланс в окислительно-восстановительных характеристиках клеточного окружения, возникающий в результате (1) нарушенных биохимических процессов, приводящих к образованию реакционноспособных частиц, (2) воздействия повреждающих агентов (то есть, загрязняющих окружающую среду агентов и излучений) или (3) ограниченных возможностей эндогенных антиоксидантных систем. Известно, что активные формы кислорода и азота (АФК/АФА), образующиеся при окислительном стрессе, повреждают все клеточные биомолекулы (липиды, сахара, белки и полинуклеотиды).

Следующие документы предшествующего уровня техники подробно описывают роль АФК/АФА в патогенезе различных заболеваний:

a. Bickers D. R., Athar M “Oxidative stress in the pathogenesis of skin disease. The Journal of Investigative Dermatology. 2006; 126(12):2565-2575.

b. Franco R., Sanchez-Olea R., Reyes-Reyes E. M., Panayiotidis M. I. Environmental toxicity, oxidative stress and apoptosis: menage a trois. Mutation Research. 2009; 674(1-2):3-22.

c. Hodjat M., Rezvanfar M. A., Abdollahi M. A systematic review on the role of environmental toxicants in stem cells aging. Food and Chemical Toxicology. 2015; 86:298-308.

a. Negre-Salvayre A., Auge N., Ayala V., et al. Pathological aspects of lipid peroxidation. Free Radical Research. 2010;44(10):1125-1171.

b. Roberts R. A., Smith R. A., Safe S., Szabo C., Tjalkens R. B., Robertson F. M. Toxicological and patho-physiological roles of reactive oxygen and nitrogen species. Toxicology. 2010; 276(2):85-94.

Клеточные защитные системы, предназначенные для предотвращения неконтролируемого повышения уровней АФК, включают неферментативные молекулы (глутатион, витамины А, С и Е и некоторые антиоксиданты, присутствующие в пищевых продуктах) и ферментативные поглотители АФК, самыми известными механизмами из которых являются супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и глутатионпероксидаза (GPX).

Помимо таких клеточных защитных механизмов в данной области техники также известны вводимые извне агенты, предназначенные для модуляции клеточного окислительно-восстановительного равновесия. В Stancu CS et al, “Probiotics determine hypolipidemic and antioxidant effects in hyperlipidemic hamsters”, Mol Nutr Food Res. 2014 Mar;58(3):559-68, показано, что комбинированные схемы введения пробиотиков (например, комбинация Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium animalis) обладают антиоксидантными свойствами. Также сообщается, что пробиотики улучшают состояние кожи и оказывают защищающее от загрязнения действие:

a. Kober et al., The effect of probiotics on immune regulation, acne, and photoaging International Journal of Women's Dermatology, Volume 1, Issue 2, June 2015, стр. 85-89

b. Jeb Gleason, 2018, [in-cosmetics Global] Anti-pollution, Probiotics and UV Protection Drive Protective Skin Care, https://www.gcimagazine.com/business/rd/claims/Anti-pollution-Probiotics-and-UV-Protection-Drive-Protective-Skin-Care--482202421.html, по состоянию на 10 августа 2018 г.

c. Roudsari et al., Health Effects of Probiotics on the Skin, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Volume 55, 2015 - Issue 9

Однако существуют технические проблемы при применении пробиотических микроорганизмов в терапевтических целях из-за общего понимания того, что биологические активности пробиотиков являются штамм-специфичными. Различия в биологических активностях, специфичные для рода, вида и штамма, должны быть оценены для того, чтобы связать пробиотики с конкретными воздействиями на здоровье, а также для обеспечения достоверного надзора и эпидемиологических исследований, как указано в отчете Объединенной рабочей группы ФАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН)/ВОЗ по разработке руководящих принципов оценки пробиотиков в пище; Лондон, Онтарио, Канада, 30 апреля и 1 мая 2002 года - см. раздел 3.1. Таким образом, остается потребность в улучшенном пробиотике, способном оказывать превосходное противозагрязняющее действие и омолаживать кожу. Пробиотический микроорганизм Bacillus coagulans MTCC 5856, раскрытый в настоящем изобретении в качестве эффективного противозагрязняющего агента и превосходного антиоксиданта, решает вышеупомянутую техническую задачу.

Основная цель настоящего изобретения состоит в раскрытии противозагрязняющих действий пробиотического микроорганизма Bacillus coagulans MTCC 5856, а также его действия в качестве омолаживающего/очищающего средства для кожи.

Еще одной целью изобретения является раскрытие антиоксидантного свойства Bacillus coagulans MTCC 5856.

Настоящее изобретение решает вышеупомянутую задачу и обеспечивает дополнительные связанные преимущества.

ДЕПОНИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Депонирование биологического материала Bacillus coagulans под регистрационным номером MTCC 5856, упомянутого в настоящей заявке, было произведено 19 сентября 2013 г. в Коллекции типовых микробных культур и генном банке (MTCC), CSIR-Институт микробных технологий, сектор 39-A, Чандигарх - 160036, Индия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение раскрывает противозагрязняющие действия пробиотических бактерий Bacillus coagulans MTCC 5856 на кожу млекопитающих. В частности, изобретение раскрывает применение пробиотических бактерий Bacillus coagulans MTCC 5856 для защиты кожи от вредного воздействия УФ-излучения и различных загрязняющих окружающую среду агентов. Также раскрыто применение Bacillus coagulans MTCC 5856 в качестве антиоксиданта, омолаживающего и очищающего средства для кожи.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего более подробного описания изобретения, рассматриваемого в сочетании с сопроводительными графическими материалами, иллюстрирующими, в качестве примера, принцип изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее снижение пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 образования АФК в мышиных фибробластах, подвергнутых воздействию УФ-А излучения.

Фиг. 1b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее процент поглощения АФК пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в мышиных фибробластах, подвергнутых воздействию УФ-А излучения.

Фиг. 2а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее снижение пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 образования АФК в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-B излучения.

Фиг. 2b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее процент поглощения АФК пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-B излучения.

Фиг. 3а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее снижение пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 образования АФК в мышиных фибробластах, подвергнутых воздействию лаурилсульфата натрия.

Фиг. 3b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее процент поглощения АФК пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в мышиных фибробластах, подвергнутых воздействию лаурилсульфата натрия.

Фиг. 4а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее снижение пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 образования АФК в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию смеси тяжелых металлов.

Фиг. 4b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее процент поглощения АФК пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию смеси тяжелых металлов.

Фиг. 5а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее повышение выживаемости клеток под воздействием пробиотических бактерий Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию комбинации бензапирена (ПАУ) и УФ-излучения.

Фиг. 5b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее процент защиты от гибели клеток в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию комбинации бензапирена (ПАУ) и УФ-излучения, с помощью пробиотических бактерий Bacillus coagulans coagulans MTCC 5856.

Фиг. 6а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее повышение уровней глутатиона в клетках пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-А излучения.

Фиг. 6b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее повышение уровней глутатиона в клетках пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-B излучения.

Фиг. 7а представляет собой графическое изображение, демонстрирующее повышение активности супероксиддисмутазы в клетках пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-А излучения.

Фиг. 7b представляет собой графическое изображение, демонстрирующее повышение активности супероксиддисмутазы в клетках пробиотическими бактериями Bacillus coagulans MTCC 5856 в человеческих кератиноцитах, подвергнутых воздействию УФ-B излучения.

ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Наиболее предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композиции, содержащей пробиотические бактерии Bacillus coagulans, для защиты кожи млекопитающих от вредного воздействия УФ-излучения и загрязняющих окружающую среду агентов. В связанном варианте осуществления пробиотические бактерии Bacillus coagulans присутствуют в форме споры или жизнеспособных бацилл. В еще одном связанном варианте осуществления загрязняющие окружающую среду агенты выбраны из списка, состоящего, без ограничений, из взвешенных частиц, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), летучих органических соединений (ЛОС), моющих средств, оксидов азота и серы, монооксида углерода, озона и тяжелых металлов. В еще одном связанном варианте осуществления пробиотические бактерии обеспечивают защиту кожи путем повышения уровней антиоксидантов и снижения уровней АФК. В связанном варианте осуществления штамм Bacillus coagulans предпочтительно представляет собой Bacillus coagulans MTCC 5856. В еще одном связанном варианте осуществления в состав композиции включают фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты для ухода за кожей и вводимые местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр.

В еще одном наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает способ очищения и омоложения кожи млекопитающих, подвергшейся воздействию загрязняющих окружающую среду агентов и УФ-излучения, причем указанный способ включает этап введения эффективной дозы композиции, содержащей пробиотическую бактерию Bacillus coagulans, млекопитающим, нуждающимся в таком действии. В связанном варианте осуществления пробиотические бактерии Bacillus coagulans присутствуют в форме споры или жизнеспособных бацилл. В еще одном связанном варианте осуществления загрязняющие окружающую среду агенты выбраны из списка, состоящего, без ограничений, из взвешенных частиц, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), летучих органических соединений (ЛОС), моющих средств, оксидов азота и серы, монооксида углерода, озона и тяжелых металлов. В еще одном связанном варианте осуществления пробиотические бактерии омолаживают кожу путем повышения уровней антиоксидантов и снижения уровней АФК. В связанном варианте осуществления штамм Bacillus coagulans предпочтительно представляет собой Bacillus coagulans MTCC 5856. В еще одном связанном варианте осуществления в состав композиции включают фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты для ухода за кожей и вводимые местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретение раскрывает композицию, содержащую пробиотические бактерии Bacillus coagulans, для применения в качестве антиоксиданта. В связанном варианте осуществления композицию, содержащую пробиотические бактерии Bacillus coagulans, применяют для терапевтического контроля клеточного окислительного стресса у млекопитающих. В связанном варианте осуществления пробиотические бактерии Bacillus coagulans присутствуют в форме споры или жизнеспособных бацилл. В связанном варианте осуществления штамм Bacillus coagulans предпочтительно представляет собой Bacillus coagulans MTCC 5856. В еще одном связанном варианте осуществления в состав композиции включают фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты для ухода за кожей и вводимые перорально или местно в форме таблетки, капсулы, порошка, эмульсий, раствора, кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр, пригодных для нутрицевтических, косметических и нутрицевтически-косметических применений.

Конкретные иллюстративные примеры, раскрывающие наиболее предпочтительные варианты осуществления, приведены ниже в настоящем документе.

Испытания защищающего от загрязнения действия in vitro основаны на клеточных моделях, разработанных для воспроизведения состояния in vivo в лабораторных условиях. Они обычно проводятся с использованием линий кератиноцитов или фибробластов. Влияние загрязнения на клетки кожи и действие обработки защищающим от загрязнения агентом оценивают путем количественного определения конкретных маркеров и параметров клеток.

1. Внутриклеточное накопление АФК измеряют с использованием предфлуоресцентного зонда, который окисляется АФК с образованием флуоресцентного соединения (Rosenkranz, A.R., et al., A microplate assay for the detection of oxidative products using 2',7'-dichlorofluorescin-diacetate. J Immunol Methods, 1992. 156(1): стр. 39-45)

2. Действие обработки противозагрязняющим агентом отражается на антиоксидантной способности кожи и способности антиоксидантов нейтрализовать вредные вещества.

3. Действие обработки противозагрязняющим агентом также находит отражение в повышении количества клеточных антиоксидантных ферментов и снижении воспаления.

Пример 1. Противозагрязняющие действия Bacillus coagulans MTCC 5856

Способы

Анализ АФК: проникающий в клетки нефлуоресцентный краситель, 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетат (DCFH-DA), поступает в клетку, и ацетатная группа на DCFH-DA отщепляется клеточными эстеразами, захватывая нефлуоресцентный DCFH внутри клетки. Последующее окисление активными формами кислорода, генерируемыми в клетках сульфатом железа, обеспечивает флуоресцентный DCF, который может быть детектирован при длине волны 485/520 (возбуждение/испускание). О поглотительной активности образца свидетельствует снижение флуоресценции по сравнению с контролем без антиоксиданта.

Окисление под действием АФК

Человеческие кератиноциты линии HaCaT/мышиные фибробласты выдерживают в среде DMEM, содержащей 25 мМ глюкозы с 10 % инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки с антибиотиками при 37°C и 5 % CO₂. По достижении клетками 70-80 % конфлюэнтности их трипсинизируют, промывают и высевают в 96-луночные планшеты с плотностью 1×10⁴ клеток/лунку. Клеткам дают прикрепиться и образовать монослой в течение 24 часов. Клетки предварительно обрабатывают различными нетоксичными концентрациями Bacillus coagulans MTCC 5856 в PBS (натрий-фосфатном буфере) в течение 60 минут перед воздействием загрязняющего агента. Клетки подвергают воздействию следующих загрязняющих агентов:

УФ-А излучение интенсивностью 15 Дж/м² в течение 60 минут, затем осуществляют промывание и выдерживают в течение 6 часов

УФ-В излучение интенсивностью 4,6 Дж/м² в течение 30 минут, затем осуществляют промывание и выдерживают в течение 6 часов.

Полициклический ароматический углеводород (бензо[а]пирен (BaP) используют в количестве 0,5 мМ

Тяжелые металлы (хлорид кобальта и нитрат свинца, по 0,25 мМ каждый)

Внутриклеточные АФК определяют после 6 часов инкубации при 37°С и 5 % СО₂.

Результаты

УФ-A излучение

Мышиные фибробласты предварительно обрабатывают Bacillus coagulans MTCC 5856 при различных количествах клеток в течение одного часа, и подвергают воздействию УФ-А излучения интенсивностью 15 Дж/м2 в течение 30 минут, а затем регистрируют поглощение активных форм кислорода. Результаты свидетельствуют о том, что Bacillus coagulans MTCC 5856 обеспечивала эффективную защиту от УФ-А излучения при концентрации 500 клеток/лунка (Фиг. 1a и 1b).

УФ-В излучение

Человеческие кератиноциты подвергают воздействию УФ-B излучения интенсивностью 4,5 Дж/м2 в течение 10 минут, и регистрируют поглощение активных форм кислорода. Bacillus coagulans MTCC 5856 в концентрациях 500 клеток/лунка обеспечивала максимальную защиту путем поглощения образованных АФК на 18 % (Фиг. 2a и 2b).

Лаурилсульфат натрия

Мышиные фибробласты предварительно обрабатывают Bacillus coagulans MTCC 5856 при различных количествах клеток в течение одного часа и подвергают воздействию лаурилсульфата натрия (SLS) в количестве 300 мкМ в течение 60 минут, а затем регистрируют поглощение активных форм кислорода. Bacillus coagulans MTCC 5856 оказывала противозагрязняющее действие, поглощая АФК, образование которых было вызвано моющим средством, дозозависимым образом (Фиг. 3a). Максимальное поглощение АФК (30,6 %) наблюдалось при количестве клеток 10³ клеток/лунку (Фиг. 3b)

Тяжелые металлы

Человеческие кератиноциты подвергают воздействию тяжелых металлов (хлорида кобальта и нитрата свинца, по 0,25 мМ каждого) в присутствии различных количеств клеток Bacillus coagulans MTCC 5856. Bacillus coagulans MTCC 5856 оказывала противозагрязняющее действие, поглощая АФК, вызванные тяжелыми металлами (Фиг. 4a). Максимальное поглощение АФК, составившее 18 %, наблюдалось при плотности клеток 10² клеток/лунка (Фиг. 4b).

Защита от полициклических ароматических углеводородов в присутствии УФ-А излучения

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют собой класс мутагенных и канцерогенных загрязняющих окружающую среду агентов. ПАУ широко распространены в окружающей среде, образуясь в результате неполного сгорания природных материалов и табачного дыма (Connell, D. W.; Hawker, D. W.; Warne, M. J.; Vowles, P. P.: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). In Introduction into Environmental Chemistry (McCombs, K., and Starkweather, A. W., eds), 1997, стр. 205-217, CRC Press LLC, Boca Raton, FL. 2. Shaw, G. R.; Connell, D. W.: Prediction and monitoring of the carcinogenicity of polycyclic aromatic compounds (PACs). Rev. Environ. Contam. Toxic., 1994, 135, 1-62.) сами по себе ПАУ являются биологически инертными и требуют метаболической активации. Для проявления генотоксичности ПАУ поглощают свет в УФ-А области, реагируют с кислородом или другими молекулами с образованием реакционноспособных промежуточных соединений (Yu H, Xia Q, Yan J, et al. Photoirradiation of polycyclic aromatic hydrocarbons with UVA light - a pathway leading to the generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and dna damage. Int J Environ Res Public Health. 2006;3:348-354). Таким образом, ПАУ могут быть «активированы» при облучении светом, что вызывает фотоиндуцированную цитотоксичность. Таким образом, фотооблучение ПАУ при облучении УФ-А излучением представляет собой загрязняющий агент, вызывающий цитотоксичность и повреждение ДНК.

Человеческие кератиноциты линии HaCaT/мышиные фибробласты высевают с плотностью 1×10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Клеткам дают прикрепиться и образовать монослой в течение 24 часов. Их предварительно обрабатывают Bacillus coagulans MTCC 5856 при различных плотностях клеток в течение 60 минут, подвергают воздействию УФ-А излучения интенсивностью 15 Дж/м² в присутствии ПАУ бензопирена в количестве 0,5 мМ в течение 30 минут, промывают стерильным буфером, и добавляют свежую культуральную среду (5 % FBS (Фетальная бычья сыоротка)) с соответствующими концентрациями пробиотических бактерий Bacillus coagulans MTCC 5856 с последующей инкубацией в течение 6 часов при 37°C в CO₂-инкубаторе. К клеткам добавляют нейтральный красный (50 пг/мл) (3-амино-7-диметиламино-2-метилфеназин гидрохлорид) на 3 часа. Поглощение нейтрального красного клетками определяют путем лизиса клеток и считывания поглощения при 540 нм на спектрофотометре (Guidelines, O., Genetic Toxicology: Bacterial Reverse Mutation Assay # 471. 1997).

Bacillus coagulans MTCC 5856 оказывала противозагрязняющее действие, защищая кератиноциты от клеточно-опосредованной цитотоксичности, вызванной фотооблучением ПАУ УФ-А излучением, дозозависимым образом (Фиг. 5a). Максимальное поглощение АФК (30,6 %) наблюдалось при количестве клеток 10³ клеток/лунку (Фиг. 5b)

Пример 2: действие Bacillus coagulans MTCC 5856 на клеточные антиоксиданты

Способы

Запас клеточных антиоксидантов истощается под воздействием загрязняющих агентов. Способность Bacillus coagulans MTCC 5856 повышать количество этих антиоксидантных ферментов в клетках изучают in vitro. Уровни глутатиона (GSH) и супероксиддисмутазы (SOD) в клетках оценивают в человеческих кератиноцитах (Peskin AV, Winterbourn CC. Assay of superoxide dismutase activity in a plate assay using WST-1. Free Radic Biol Med. 2017;103:188-191.)

Анализ SOD Активность SOD измеряют способом WST-1 с использованием набора в соответствии с инструкциями производителя (Elabsciences). Ксантиноксидаза (XO) способна катализировать реакцию WST-1 с O₂ - с образованием водорастворимого красителя формазана. SOD способна катализировать диспропорционирование супероксидных анионов и поэтому может ингибировать реакцию, а активность SOD находится в отрицательной взаимосвязи с количеством красителя формазана. Следовательно, активность SOD может быть определена путем колориметрического анализа продуктов WST-1.

Содержание глутатиона (GSH): восстановленный глутатион определяют по способу Moron, Depierre. GSH измеряется посредством его реакции с DTNB (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой)), дающей комплекс желтого цвета с максимумом поглощения при 412 нм. 100 мкл тестируемого образца (клеточного лизата) смешивают с 10 мкл добавленного 50 % TCA и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. 30 мкл супернатанта смешивают с 50 мкл 0,2 М натрий-фосфатного буфера (рН 8,0) и 200 мкл свежеприготовленного 0,6 мМ DTNB, и измеряют интенсивность образования желтого цвета при 412 нм. Строят калибровочную кривую с различными концентрациями (от 1000 до 62,5 мкМ) GSH. Содержание GSH в образце рассчитывают по калибровочной кривой и выражают в мкМ/мг белка.

Результаты

Результаты показали, что Bacillus coagulans MTCC 5856 повышала содержание глутатиона дозозависимым образом (Фиг. 6a и 6b). Активность SOD также повышалась дозозависимым образом в клетках, обработанных Bacillus coagulans MTCC 5856 (Фиг. 7a и 7b), что свидетельствует о том, что Bacillus coagulans MTCC 5856 является не только эффективным антиоксидантом, но также оказывает омолаживающее действие на кожу за счет повышения содержания антиоксидантов в клетках.

Вывод

Таким образом, Bacillus coagulans MTCC 5856 оказывала противозагрязняющее действие, обеспечивая защиту от УФ-излучения и других загрязняющих агентов путем поглощения АФК, образующихся в результате воздействия этих загрязняющих агентов. Bacillus coagulans MTCC 5856 также действует как эффективный антиоксидант, а также повышает содержание антиоксидантов в клетках. В настоящем изобретении сообщается, что Bacillus coagulans MTCC 5856 может применяться не только в качестве антиоксиданта для контроля течения различных патологических состояний, но также в качестве эффективного омолаживающего и очищающего средства для кожи путем обеспечения защиты от загрязняющих агентов и повышения содержания антиоксидантов, что может найти потенциальное применение в средствах для ухода за кожей/косметической промышленности.

Пример 3: составы, содержащие Bacillus coagulans для ухода за кожей.

В состав композиции, содержащей Bacillus coagulans MTCC 5856, могут быть включены фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности, антиоксиданты и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты против старения и вводимые местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр.

В связанном аспекте один или более ингредиентов для ухода за кожей выбраны из группы, состоящей из, без ограничений, альфа-липоевой кислоты, оксиресвератрола, экстракта корня свеклы, экстракта босвеллии пильчатой, бета-босвеллиевых кислот, масла босвеллии пильчатой, экстракта центеллы азиатской, тритерпенов, экстракта гарцинии индийской, антоцианов, экстракта и сока кокосовой пальмы, экстракта колеуса форсколии, форсколина, масла колеуса форсколии, тетрагидропиперина, эллаговой кислоты, экстракта орехоподобного галла, полифенолов, экстракта калгана, глицирризиновой кислоты, экстракта зеленого чая, галлата эпигаллокатехина, экстракта из корня солодки, аммония глицирризината, лимоноидов, олеаноловой кислоты, косметических пептидов (олеаноловой кислоты, связанной с Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, олеаноловой кислоты, связанной с Lys-Val-Lys), олеуропеина, экстракта Piper longumine, пиперина, эллаговой кислоты, экстракта граната (водорастворимого), птеростильбена, ресвератрола, экстракта Pterocarpus santalinus, экстракта розмарина, розмариновой кислоты, экстракта амлы, бета-глюкогаллина, тетрагидрокуркумина, экстракта листьев шалфея лекарственного (шалфея), урсоловых кислот, сапонинов, экстракта семян кунжута индийского (кунжута), сезамина и сезамолина, масла моринги, экстракта семян моринги, экстракта конского каштана, масла витекса священного, ксимениновой кислоты, этиласкорбиновой кислоты, арганового масла, экстракта лимонной цедры, масла куркумы, бета-глюканов из ячменя, коэнзима Q10, оливкового масла, масла авокадо и масла клюквы.

В еще одном связанном аспекте один или более антиоксидантов и противовоспалительных агентов выбраны из группы, состоящей из, без ограничений, комплекса витаминов А, D, Е, К, С, В, розмариновой кислоты, альфа-липоевой кислоты, оксиресвератрола, эллаговой кислоты, глицирризиновой кислоты, эпигаллокатехин галлата, растительных полифенолов, глабридина, масла моринги, олеаноловой кислоты, олеуропеина, карнозной кислоты, урокановой кислоты, фитоена, липоевой кислоты, липоамида, ферритина, десферала, билирубина, биливердина, меланинов, убихинона, убихинола, аскорбилпальмитата, аскорбилфосфата магния, аскорбилацетата, токоферолов и производных, таких как ацетат витамина Е, мочевая кислота, α-глюкозилрутин, каллаза и супероксиддисмутаза, глутатиона, соединений селена, бутилированного гидроксианизола (ВНА), бутилированного гидрокситолуола (ВН), метабисульфита натрия (SMB), пропилгаллата (PG) и аминокислоты цистеина.

В еще одном связанном аспекте один или более усилителей биодоступности выбраны из группы, без ограничений, пиперина, тетрагидропиперина, кверцетина, экстракта чеснока, экстракт имбиря и нарингина.

В таблицах 1-4 приведены иллюстративные примеры составов для ухода за кожей, содержащих Bacillus coagulans MTCC 5856 (коммерчески доступна под наименованием LACTOSPORE).

Таблица 1: Лосьон для ухода за кожей

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: от 100 КОЕ до 2 млрд КОЕ
Тетрагидрокуркумин, экстракт из корня солодки, птеростильбен, тетрагидропиперин, экстракт калгана, никотинамид Другие ингредиенты/Вспомогательные вещества
Вода, авобензон, октилметоксициннамат, октокрилен, бензофенон-3, октилсалицилат, глицерилстеарат SE, сорбитанстеарат и сахарозы кокоат, полисорбат 20, глицерин, цетостеариловый спирт, цетеарилоливат (и) сорбитаноливат, стеариновая кислота, изопропилмиристат, масло семян гарцинии индийской, триглицерид каприловой/каприновой кислоты, пропиленгликоль, бутилоктилсалицилат, циклопентасилоксан, диметиконол, смесь кроссполимера диметикона (и) фенилтриметикона, метилизотиазолинон и феноксиэтанол, ароматизатор, циклотетрасилоксан (и) циклопентасилоксан (и) диметикон (и) трисилоксан (и) фенилтриметикон (и) изопарафиновый углеводород, диоксид титана, гидроксид алюминия, пентаэритритил-тетра-ди-трет-бутилгидроксигидроциннамат, экстракт коры птерокарпуса мешковидного, токоферилацетат, кроссполимер акрилатов/C10-30 алкилакрилата, двунатривеая соль ЭДТА

Таблица 2: увлажняющий крем для ухода за кожей

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: от 100 КОЕ до 2 млрд КОЕ
Экстракт амаранта, никотинамид, витамин Е, масло ши, оливковое масло, Д-пантенол Другие ингредиенты/Вспомогательные вещества
Усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперин (Cosmoperine^®)), ароматизаторы, загустители (производные целлюлозы или кроссполимер акрилатов)

Таблица 3: очищающее средство

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: от 100 КОЕ до 2 млрд КОЕ
Тетрагидрокуркумин, экстракт из корня солодки, птеростильбен, тетрагидропиперин, экстракт лимонной цедры, экстракт папайи Другие ингредиенты/Вспомогательные вещества
Вода, кокоилглицинат натрия, лаурилглюкозид, кокамидопропилбетаин, стеарет-21, цетиловый спирт, экстракт папайи (плодов), экстракт Citrus medica limonum (лимона), стеарет-2, дистеарат ПЭГ-150, пропиленгликоль, кроссполимер акрилатов/C10-30 алкилакрилата, полисорбат-20, ароматизатор, метилизотиазолинон и феноксиэтанол, токоферилацетат, аминометилпропанол, слюда (и) CI 77891, пентаэритритил-тетра-ди-трет-бутилгидроксигидроциннамат, динатриевая соль ЭДТА, усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперин (Cosmoperine^®)), ароматизатор, загустители (производные целлюлозы или кроссполимер акрилатов)

Таблица 4: скраб для лица

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: от 100 КОЕ до 2 млрд КОЕ
Экстракт Cocus nucifera, скраб из скорлупы грецкого ореха, масло нима, никотинамид, экстракт лимонной цедры, ацетат витамина Е Другие ингредиенты/Вспомогательные вещества
Вода, глицерин, триглицерид каприловой/каприновой кислоты, лаурилглюкозид, сорбитанстеарат и кокоат сахарозы, изопропилмиристат, изопропилпальмитат и пентаэритритилтетраизостеарат, цетилпальмитат, стеариновая кислота, цетостеариловый спирт, CI 77891, порошок скорлупы ореха грецкого (ореха), крахмал маиса (кукурузный), масло семян азадирахты индийской (нима), феноксиэтанол и метилизотиазолинон, ароматизатор, кроссполимер акрилатов/C10-30 алкилакрилата, аминометилпропанол, пентаэритритил-тетра-ди-трет-бутилгидроксигидроциннамат, токоферолацетат, ментол, динатриевая соль ЭДТА, усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперин (Cosmoperine^®)), ароматизатор, загустители (производные целлюлозы или кроссполимер акрилатов)

Пример 5: составы, содержащие Bacillus coagulans, для улучшения общего здоровья

В таблицах 5 и 6 приведены иллюстративные примеры составов, содержащих Bacillus coagulans, для применения в качестве антиоксиданта и поддержания окислительно-восстановительного баланса клеток.

Таблица 5: таблетка, содержащая Bacillus coagulans

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: 2 млрд КОЕ Вспомогательные вещества
Микрокристаллическая целлюлоза, коллоидный диоксид кремния, стеарат магния

Таблица 6: капсула, содержащая Bacillus coagulans

Активные ингредиенты
Bacillus coagulans MTCC 5856: 2 млрд КОЕ Вспомогательные вещества
Микрокристаллическая целлюлоза

Вышеуказанные составы являются лишь иллюстративными примерами; любой состав, содержащий вышеуказанный активный ингредиент, предназначенный для указанной цели, будет считаться эквивалентным.

Другие модификации и вариации изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники из приведенного выше описания и руководства. Таким образом, хотя в настоящем документе были конкретно описаны только некоторые варианты осуществления изобретения, должно быть понятно, что в них могут быть внесено множество модификаций, не выходящих за пределы сущности и объема изобретения. Объем изобретения должен интерпретироваться только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.

Группа изобретений относится к противозагрязняющему действию пробиотических бактерий Bacillus coagulans. Раскрыто применение композиции, содержащей пробиотические бактерии Bacillus coagulans MTCC 5856, для защиты кожи млекопитающих от вредного воздействия УФ-излучения и загрязняющих окружающую среду агентов. Также раскрыт способ защиты кожи млекопитающих, подвергшейся воздействию загрязняющих окружающую среду агентов и УФ-излучения. Группа изобретений обеспечивает повышение уровней антиоксидантов и снижение уровней АФК. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 табл., 5 пр., 14 ил.

1. Применение композиции, содержащей пробиотические бактерии Bacillus coagulans MTCC 5856, для защиты кожи млекопитающих от вредного воздействия УФ-излучения и загрязняющих окружающую среду агентов.

2. Применение по п. 1, где пробиотические бактерии Bacillus coagulans присутствуют в форме споры или жизнеспособных бацилл.

3. Применение по п. 1, где загрязняющие окружающую среду агенты выбраны из списка, состоящего, без ограничений, из взвешенных частиц, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), летучих органических соединений (ЛОС), моющих средств, оксидов азота и серы, монооксида углерода, озона и тяжелых металлов.

4. Применение по п. 1, где пробиотические бактерии обеспечивают защиту кожи путем повышения уровней антиоксидантов и снижения уровней АФК (Активные формы кислорода).

5. Применение по п. 1, где в состав композиции включают фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты для ухода за кожей и вводимые местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр.

6. Способ защиты кожи млекопитающих, подвергшейся воздействию загрязняющих окружающую среду агентов и УФ-излучения, где указанный способ включает этап введения эффективной дозы композиции, содержащей пробиотические бактерии Bacillus coagulans MTCC 5856, млекопитающим, нуждающимся в таком действии.

7. Способ по п. 6, где пробиотические бактерии Bacillus coagulans присутствуют в форме споры или жизнеспособных бацилл.

8. Способ по п. 6, где загрязняющие окружающую среду агенты выбраны из списка, состоящего, без ограничений, из взвешенных частиц, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), летучих органических соединений (ЛОС), моющих средств, оксидов азота и серы, монооксида углерода, озона и тяжелых металлов.

9. Способ по п. 6, где пробиотические бактерии омолаживают кожу путем повышения уровней антиоксидантов и снижения уровней АФК.

10. Способ по п. 6, где в состав композиции включают фармацевтически/косметически приемлемые вспомогательные вещества, адъюванты, основания, разбавители, носители, эмоллиенты, усилители биодоступности и консерванты, и/или композицию включают в составы, содержащие ингредиенты для ухода за кожей и вводимые местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыл, скрабов, эмульсий и компактных пудр.