МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО АРТЕМИЗИНИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА Российский патент 2021 года по МПК A61K31/335 A61K31/357 A61P1/00 A61P29/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области медицины и, в частности, в настоящем изобретении предложено новое медицинское применение четырех производных артемизинина, обладающих противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью, для лечении воспалительного заболевания кишечника. Результаты экспериментальных исследований на модели язвенного колита у мышей, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS), показали, что внутрижелудочное введение данных соединений может эффективно облегчать клинические симптомы язвенного колита в моделях на животных, такие как потеря веса, диарея, гематохезия и др., уменьшать патологическое повреждение тканей толстой кишки, ингибировать инфильтрацию воспалительных клеток в ткани толстой кишки в моделях на мышах и снижать уровень провоспалительных цитокинов. Фармакодинамические и фармакологические исследования подтвердили, что этот тип соединений обладает хорошей иммуносупрессивной активностью и высоким профилем безопасности, и подходит для применения в качестве лекарственного средства для лечения и вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника и может найти применение в медицине.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) - это идиопатическое хроническое воспалительное заболевание кишечника, затрагивающее подвзошную, прямую и толстую кишку, включающее в себя неспецифический язвенный колит (НЯК) и болезнь Крона (БК), со множественными осложнениями. В последнее время заболеваемость и распространенность таких болезней в целом увеличивается. Хронический колит и неспецифический язвенный колит являются хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями кишечника, этиология которых не ясна, а повреждения тканей образуются в прямой и толстой кишке. Эти заболевания характеризуются рецидивирующим течением, и основными клиническими проявлениями являются диарея, боль в животе и кровавый слизисто-гнойный стул. Данный тип заболеваний не только наносит ущерб качеству жизни пациентов, но и способен спровоцировать колоректальный рак. В настоящее время лекарственные средства, используемые в клиническом лечении воспалительного заболевания кишечника, в основном относятся к противовоспалительным и иммуносупрессорным соединениям или биологическим агентам, включающим аминосалициловую кислоту, гормоны, циклоспорины, моноклональные антитела к фактору некроза опухолей и тому подобное. Побочные эффекты этих лекарственных средств, такие как нефротоксичность и стероидная зависимость, привели к ограничению их клинического применения. В связи с этим разработка высокоэффективных низкотоксичных лекарственных средств для лечения воспалительного заболевания кишечника имеет широкий спектр возможных клинических применений.

Артемизинин представляет собой ингредиент с противомалярийной активностью, экстрагируемый из традиционного китайского лекарственного растения полыни однолетней (Artemisia annua L.), являющийся необычным сесквитерпеновым лактоном с пероксидной группой. Было обнаружено, что он обладает не только превосходным противомалярийным эффектом, но и хорошей противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью. С 2000 года проводится систематическое химико-биологическое исследование соединений артемизинина, направленное на изучение его иммуносупрессивной активности. Было синтезировано множество новых видов производных артемизинина и обнаружен ряд новых производных, обладающих более сильной противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью, при этом более подходящих для перорального введения. На основании этих работ были поданы две заявки, по которым были получены патенты, где в патенте Китая №200680002368.5 описаны производное артемизинина, способ его получения и применение, а также фармацевтическая композиция, содержащая указанное производное, а в патенте Китая №200680026325.0 описаны водорастворимое производное артемизинина, способ его получения, фармацевтическая композиция и их применение.

В 2006 году в ходе изучения и сравнения возможности применения серии производных артемизинина в качестве лекарственных средств с точки зрения их противовоспалительной и иммуносупрессивной активности авторы настоящего изобретения наконец обнаружили, что β-аминоартеэфира малеат (SM934) является новым перспективным лекарственным средством для лечения аутоиммунного заболевания - системной красной волчанки. SM934 представляет собой водорастворимое производное артемизинина с высокой иммуносупрессивной активностью и новым механизмом действия. SM934 обладает высокой эффективностью, низкой токсичностью, хорошим всасыванием при пероральном введении и высоким потенциалом применения в качестве лекарственного средства и, таким образом, хорошей перспективой клинического применения. На SM934 было получено два патента в Китае, два патента в США и один патент в Японии. Данное исследование привлекло внимание международного экспертного сообщества. Согласно Mini-Reviews in Medicinal Chemistry (2007, 7, 411-422) разработанное производное артемизинина обладает низкой токсичностью, вызывает меньше побочных эффектов и является перспективным иммуносупрессорным лекарственным средством, при этом механизм его действия полностью отличается от механизмов действия циклоспорина A (CsA) и такролимуса (FK506). Согласно Chemical Society Reviews (2010, 39(2): 435-454) указанное обнаружение водорастворимых артемизининов является успешным новым применением соединений артемизинина в области иммунологии. Исследования механизма действия показали, что соединения-производные артемизинина в основном воздействуют на функцию клеток Th17 (Т-хелперов 17 типа) и во взаимодействии с ними регулируют патологическую активацию пути передачи сигнала в иммунных клетках. В настоящей работе не только разрабатываются новые охраноспособные иммуносупрессорные лекарственные средства, но и обеспечивается важный научный и практический вклад в применение новых возможностей артемизинина в Китае и расширение области применения соединений артемизинина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является поиск и обеспечение применения производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает применение производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника, где указанное производное артемизинина выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:

В исследованиях, проведенных в рамках настоящего изобретения, было показано, что производные артемизинина позволяют эффективно ингибировать инфильтрацию воспалительных клеток в ткани толстой кишки, снижать уровень провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки, и их можно применять для получения лекарственного средства для лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника.

Таким образом, в настоящем изобретении также предложено применение производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающей регуляции уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки.

Согласно предпочтительному применению фармацевтически приемлемая соль производного артемизинина выбрана из группы, состоящей из следующих соединений:

Согласно предпочтительному применению лекарственное средство может представлять собой таблетку, капсулу, гранулу, жидкий состав для перорального введения или клизму, внутривенную или внутримышечную инъекцию или тому подобное.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника, состоящий в обеспечении терапевтически эффективным количеством производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли нуждающегося в этом субъекта.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающей регуляции уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки, состоящий в обеспечении терапевтически эффективной дозой производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли нуждающегося в этом субъекта.

Настоящее изобретение также относится к производному артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для применения для лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника.

Настоящее изобретение также относится к производному артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для применения для ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и снижения уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения или вспомогательной терапии воспалительного заболевания кишечника, содержащей в качестве действующего вещества производное артемизинина или его фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающей регуляции уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки, содержащей в качестве действующего вещества производное артемизинина или его фармацевтически приемлемую соль.

В настоящем изобретении воспалительные заболевания кишечника предпочтительно включают хронические воспалительные заболевания, такие как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона и хронический энтерит.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг. 1 представляет собой графики, показывающие значения индекса активности заболевания мышей из различных групп на протяжении эксперимента.

Фиг. 2А представляет собой фотографию тканей толстой кишки мышей из различных групп по окончании эксперимента.

Фиг. 2В представляет собой график, показывающий длину толстой кишки мышей из различных групп в конце эксперимента. В сравнении с модельной контрольной группой, *, р<0.05; **, р<0.01.

Фиг. 2С представляет собой фотографии патологических срезов, полученных фиксацией дистальных отделов толстой кишки, которые срезали с тканей дистального отдела толстой кишки у мышей в конце эксперимента, выдерживали в формалине, заливали парафином, делали тонкие срезы и окрашивали гематоксилин-эозином.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий результаты анализа методом проточной цитометрии, в котором суспензию отдельных клеток готовили из брыжеечных лимфатических узлов и селезенок мышей из различных групп, которые отбирали по окончании эксперимента, и клетки помечали соответствующими флуоресцентными антителами. Фиг. 3А относится к изолированным клеткам брыжеечных лимфатических узлов, а Фиг. 3В относится к изолированным лимфоцитам селезенки, они были окрашены антителами к маркерам F4/80 + антителами к CD11b (дважды позитивные клетки распознавали как макрофаги) и антителами к рецептору гранулоцитов-1 (Gr-1) + антителами к CD11b (дважды позитивные клетки распознавали как нейтрофилы), соответственно.

Фиг. 4 представляет собой фотографии, показывающие результаты фотографирования и анализа флуоресцентной конфокальной микроскопией, где после того, как были выполнены срезы замороженных тканей средних сегментов толстой кишки мышей из различных групп, ядра окрашивали антителами с флуоресцентным красителем DAPI, а одноядерные лимфоциты окрашивали антителами к CD11b.

Фиг. 5 представляет собой графики, показывающие результаты установления уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки мышей из различных групп, в сравнении с модельной контрольной группой, *, р<0.05; **, р<0.01; ***, р<0.001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР

Изучение фармакодинамики и связанных с ней механизмов для лечения хронических воспалительных заболеваний кишечника проводили на четырех производных артемизинина (SM934, SM905, SM933 и SM735).

I. Экспериментальный материал

Экспериментальные животные: инбредные мыши-альбиносы Balb/c женского пола, возрастом около 8 недель, Shanghai Slack Laboratory Animals Co., Ltd.

Реагенты: натриевая соль сульфата декстрана (DSS, MP Biomedicals Biomedical Company, USA); циклоспорин A (CsA, China National Institutes for Food and Drug Control), 5-аминосалициловая кислота (5-АСК, Sigma-Aldrich); Антитела для проточной цитометрии были заказаны в BD Pharmingen.

Подробные способы получения SM934 и SM905 описаны в предыдущих патентах авторов настоящего изобретения (CN 89109562.4, CN 93112454.9) и в публикации J. Med. Chem, 2000, 43: 1635-1640.

SM934:

Соль малеиновой кислоты. Белые кристаллы. Температура плавления: 139-141°С

Элементный анализ (C₂₁H₃₃NO₉):

Расчетное содержание: С 56,87 Н 7,50 N 3,16

Реальное содержание: С 56,84 Н 7,59 N 3,10

SM905:

Соль малеиновой кислоты. Белые кристаллы. Температура плавления: 171-173°С

Элементный анализ (C₂₆H₄₃NO₁₀):

Расчетное содержание: С 58,96 Н 8,18 N 2,64

Реальное содержание: С 58,92 Н 7,91 N 2,59

Подробные способы получения SM933 и SM735 описаны в предыдущих патентах авторов настоящего изобретения (CN 94113982,4, CN 01113407,0) и заявке CN 99807416.

SM735:

Элементный анализ (C₂₅H₃₂O9⋅1/2 Н₂О):

Расчетное содержание: С 61,84 Н 6,85

Реальное содержание: С 62,09 Н 6,86

SM933:

Элементный анализ (С₂₆Н₃₆О₈):

Расчетное содержание: С 65,53 Н 7,61

Реальное содержание: С65,46 Н 7,66

II. Способ проведения эксперимента

[1] Развитие модели DSS-индуцированного неспецифического язвенного колита у мышей и оценка фармакодинамики

1. Мышей случайным образом разделили на нормальную контрольную группу, модельную группу, группу, получающую циклоспорин A (CsA) (20 мг/кг), группу, получающую 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) (50 мг/кг) и группы, получающие производные артемизинина с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью SM934, SM905, SM933 и SM735 (10 мг/кг каждый), по 8 мышей на группу. Кроме мышей из нормальной контрольной группы, мышам из других групп, включая модельную группу, группу, получающую циклоспорин А, группу, получающую 5-аминосалициловую кислоту, и группы, получающие 4 производных артемизинина, в питьевую воду был добавлен 5% DSS в течение 7 дней для индуцирования модели воспаления кишечника.

2. С начала индуцирования и до конца эксперимента мышам из различных групп лечения давали циклоспорин А, 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) или 4 производных артемизинина (10 мг/кг) соответственно путем внутрижелудочного введения для проведения терапевтического вмешательства.

3. Оценка индекса активности болезни

На протяжении эксперимента мышей из различных групп ежедневно взвешивали и осматривали на предмет скрытой крови в фекалиях, для каждой мыши оценивали активность болезни согласно следующей таблице.

[II] Общие и микроскопические патологические изменения тканей толстой кишки у мышей

По окончании эксперимента у мышей отбирали ткани толстой кишки для измерения длины, а затем отрезали дистальный отдел толстой кишки, выдерживали в формалине, заливали парафином и делали тонкие срезы, и срезы окрашивали гематоксилин-эозином для получения патологических срезов.

[III] Обнаружение воспалительных клеток

1. По окончании эксперимента готовили суспензию отдельных клеток из селезенок и лимфатических узлов мышей и полученные клетки помечали соответствующими флуоресцентными антителами для цитометрического анализа.

2. Средний сегмент толстой кишки замораживали и делали срезы, окрашивали соответствующими флуоресцентными антителами, фотографировали под флуоресцентным конфокальным микроскопом и анализировали.

[IV] Определение уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки

1. Ткань из одного и того же сегмента толстой кишки забирали у мышей из различных групп для гомогенизации. После центрифугирования концентрацию белка в надосадочной жидкости определяли набором для определения белка с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА).

2. Для определения содержания провоспалительных цитокинов в надосадочной жидкости, выраженного в содержании цитокинов на единицу общего белка, использовали ELISA.

III. Данные эксперимента и результаты

Результаты эксперимента на Фиг. 1 показали, что внутрижелудочное введение производных артемизинина согласно настоящему изобретению может значительно облегчать признаки DSS-индуцированного воспалительного заболевания кишечника у мышей и клинические симптомы, такие как потеря веса, диарея и гематохезия. Как видно из результатов эксперимента на Фиг. 2А-2С, введение производных артемизинина согласно настоящему изобретению может в значительной степени восстанавливать длину толстой кишки и уменьшать патологическое повреждение толстой кишки, вызванное DSS-индуцированным воспалением. Окрашивание патологических срезов толстой кишки гематоксилин-эозином показало, что у мышей в модельной группе ВЗК была нарушена структура желез толстой кишки, слизистая оболочка и подслизистый слой были инфильтрированы воспалительными клетками, такими как нейтрофилы, моноциты и многоядерные клетки, слизистая оболочка была частично эрозирована и некоторые кишечные крипты были разрушены, в то время как у мышей из групп, получавших лечение, вышеперечисленные изменения были значительно меньше.

Результаты эксперимента на Фиг. 3А и 3В показали, что введение SM934 уменьшило количественное отношение макрофагов (дважды позитивных по антителам к маркерам F4/80 + антителам к CD11b клеток) и нейтрофилов (дважды позитивных по антителам к рецептору гранулоцитов-1 (Gr-1) + антителам к CD11b клеток) в брыжеечных лимфатических узлах и селезенках. Результаты эксперимента на Фиг. 4 показали, что введение SM934 уменьшило инфильтрацию тканей толстой кишки моноцитами (клетками CD11b+). Провоспалительные цитокины (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17 и др.) играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа на воспаление в кишечнике и участвуют в развитии воспалительного заболевания кишечника. Результаты эксперимента на Фиг. 5 показали, что введение SM934 уменьшило уровень провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки.

Таким образом, на основании результатов эксперимента с упомянутыми выше конкретными соединениями в модели воспалительного заболевания кишечника, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS), у мышей, было показано, что внутрижелудочное введение данных соединений может эффективно облегчать клинические симптомы колита, такие как потеря веса, диарея, гематохезия и др., уменьшать патологическое повреждение тканей толстой кишки, ингибировать инфильтрацию воспалительных клеток в ткани толстой кишки и снижать уровень провоспалительных цитокинов. Фармакодинамические и фармакологические исследования подтвердили, что этот тип соединений обладает хорошей иммуносупрессивной активностью и высоким профилем безопасности и хорошей перспективой применения для клинического лечения и вспомогательной терапии воспалительных заболеваний кишечника.

Изобретение относится к применению производного артемизинина SM934 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающей регуляции уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки. Технический результат - ингибирование инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающая регуляция уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки посредством соединения SM934. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 7 ил.

SM934

1. Применение производного артемизинина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования инфильтрации воспалительных клеток в ткани толстой кишки и понижающей регуляции уровня провоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки, где указанное производное артемизинина представляет собой следующее соединение:

2. Применение по п. 1, где указанная фармацевтически приемлемая соль производного артемизинина представляет собой следующее соединение:

.