ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ PD-L1 Российский патент 2021 года по МПК C12N15/113 A61K31/712 A61K31/7125 A61K47/50 C07H21/00 A61P37/04 A61P33/02 A61P31/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам (олигомерам), которые являются комплементарными лиганду-1 запрограммированной смерти (PD-L1), приводящим к понижению экспрессии PD-L1 в печени. Настоящее изобретение также относится к способу облегчения исчерпания Т-клеток, вызванного инфекцией печени или раком в печени. Релевантными инфекциями являются хронические инфекции HBV (вирус гепатита В), HCV (вирус гепатита С) и HDV (вирус гепатита D) и паразитарные инфекции, подобные малярии и токсоплазмозу (например, вызванные протистами Plasmodium, в частности, видами P. vivax, P. malariae и P. falciparum).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно то, что костимулирующий путь, состоящий из рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и его лиганда - PD-L1 (или B7-H1, или CD274) - непосредственно способствует исчерпанию Т-клеток, приводящему к отсутствию контроля за вирусами во время хронических инфекций печени. Путь PD-1 также играет роль в автоиммунитете, так как у мышей с нарушениями данного пути развиваются аутоиммунные заболевания.

Было показано то, что антитела, которые блокируют взаимодействие между PD-1 и PD-L1, усиливают ответы Т-клеток, в частности, ответ цитотоксических Т-клеток CD8+ (см. Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682 и Maier et al 2007 J. Immunol. Vol 178 p 2714).

В WO 2006/042237 описан способ диагностики рака посредством оценки экспрессии PD-L1 (B7-H1) в опухолях и предложена доставка пациенту агента, который препятствует взаимодействию PD-1/PD-L1. Препятствующими агентами могут быть антитела, фрагменты антител, миРНК (малая интерферирующая РНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Нет ни конкретных примеров таких препятствующих агентов, ни какого-либо упоминания хронических инфекций печени.

Опосредованное РНК-интерференцией ингибирование PD-L1 с использованием двухцепочечных молекул РНК (дцРНК, РНКи или миРНК) также было раскрыто, например, в WO 2005/007855, WO 2007/084865 и US 8507663. Ни в одной из них не описана таргетная доставка в печень.

В Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 описана доставка in vivo молекул миРНК, нацеленных на PD-L1, в клетки Купфера, усиливая, посредством этого клиренс клетками NK (природная клетка-киллер) и Т-клетками CD8+ у мышей, инфицированных MCMV (мышиный цитомегаловирус). В данной статье делается заключение о том, что молекулы миРНК, нацеленные на PD-L1, доставленные в гепатоциты, не являются эффективными в отношении усиления эффекторной функции Т-леток CD8+.

Подход с миРНК значительно отличается от подхода с одноцепочечными антисмысловыми олигонуклеотидами, так как биораспределение и механизмы действия являются совершенно разными. Как описано в Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res. Comm. том 306, страницы 712-717, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК имеют разные предпочтения в отношении сайтов-мишеней в мРНК.

В WO 2016/138278 описано ингибирование иммунных контрольных точек, включая PD-L1, с использованием двух или более чем двух одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, которые связаны на их 5'-концах. В данной заявке не упоминается HBV или таргетная доставка в печень.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении идентифицированы новые олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов, которые очень эффективно понижают уровень мРНК PD-L1 в клетках печени - как в паренхимных (например, гепатоциты), так и в непаренхимных клетках, таких как клетки Купфера и синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC). Посредством понижения или сайленсинга PD-L1 олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов уменьшают опосредованное PD-1 ингибирование и, посредством этого, активизируют иммуностимуляцию истощенных Т-клеток. Облегчение исчерпания Т-клеток при хронической патогенной инфекции печени будет приводить к возобновленному иммунному контролю и пониженным уровням вирусных антигенов в крови во время хронической патогенной инфекции печени. Клетки природные киллеры (NK) и Т-клетки природные киллеры (NKТ) также могут активироваться олигонуклеотидами и конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению.

Конъюгаты олигонуклеотидов обеспечивают местное снижение уровня PD-L1 в клетках печени и, следовательно, уменьшают риск аутоиммунных побочных эффектов, таких как пневмонит, невирусный гепатит и колит, ассоциированный с системным исчерпанием PD-L1.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам или их конъюгатам, нацеленным на нуклеиновую кислоту, способным модулировать экспрессию PD-L1 и лечить или предупреждать заболевания, связанные с функционированием PD-L1. Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, в частности, могут использоваться для лечения заболеваний, при которых был истощен иммунный ответ против инфекционного агента.

Соответственно, в первом аспекте изобретения предложены олигонуклеотиды, которые содержат непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте мишени PD-L1. Данный олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, предпочтительно с гэпмерной конструкцией. Предпочтительно данный олигонуклеотид способен ингибировать экспрессию PD-L1 посредством расщепления нуклеиновой кислоты-мишени. Расщепление предпочтительно достигается посредством рекрутирования нуклеазы.

В другом аспекте данный олигонуклеотид конъюгирован с по меньшей мере одной конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, такой как конъюгатная группировка, содержащая по меньшей мере одну N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку. Конъюгатная группировка и олигонуклеотид могут быть связаны друг с другом посредством линкера, в частности, биорасщепляемого линкера.

В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, соли и/или адъюванты.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы in vivo или in vitro для понижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, посредством введения в указанную клетку олигонуклеотида или композиции по изобретению в эффективном количестве.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, расстройства или дисфункции посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию, расстройству или дисфункции, в частности, к заболеваниям, выбранным из вирусных инфекций печени или паразитарных инфекций.

В другом аспекте олигонуклеотид, конъюгаты олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению используются для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV, или паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рака печени, или метастазов в печени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: иллюстрирует типичные конъюгаты антисмыслового олигонуклеотида, где данный олигонуклеоид либо представлен волнистой линией (А-Г), либо как «олигонуклеотид» (Д-З), либо как Т₂ (И), а конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, представляют собой трехвалентные N-ацетилгалактозаминные группировки. Соединения А-Г содержат дилизиновую разветвляющую молекулу, ПЭГ3 спейсер и три концевые GalNAc углеводные группировки. В соединении А и Б олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, без линкера. В соединении В и Г олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, через С6 линкер. Соединения Д-И содержат утраивающую разветвляющую молекулу, спейсеры варьирующей длины и структуры, и три концевые GalNAc углеводные группировки.

Фиг. 2: график, демонстрирующий ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) (А) и нокдаун PD-L1 как % от воздействия физиологическим раствором (Б) для соединений, протестированных в Примере 2, в связи с их положением на нуклеиновой кислоте-мишени. Клеточными линиями, в которых тестировали данное соединение, были и

Фиг. 3: структурная формула трехвалентного GalNAc кластера (GN2). GN2 является полезным в настоящем изобретении в качестве конъюгатной группировки. Волнистая линия иллюстрирует сайт конъюгирования данного кластера, например, с С6 аминолинкером или непосредственно с олигонуклеотидом.

Фиг. 4: структурная формула CMP ID NO 766_2.

Фиг. 5: структурная формула CMP ID NO 767_2.

Фиг. 6: структурная формула CMP ID NO 768_2.

Фиг. 7: структурная формула CMP ID NO 769_2.

Фиг. 8: структурная формула CMP ID NO 770_2.

Фиг. 9: вестерн-блот, выявляющий экспрессию белка PD-L1 в печени от животных, индуцированных поли(IC), после обработки физиологическим раствором и указанными CMP ID NO. Каждый блот показывает голый олигонуклеотид относительно версии того же самого олигонуклеотида, конъюгированной с GalNAc, блот А) CMP ID NO 744_1 и 755_2, Б) CMP ID NO 747_1 и 758_2, В) CMP ID NO 748_1 и 759_2, Г) CMP ID NO 752_1 и 763_2, и Д) CMP ID NO 753_1 и 764_2. Верхняя полоса представляет собой контроль загрузки - винкулин, нижняя полоса представляет собой белок PD-L1. Первая дорожка в каждом блоте демонстрирует мышей, обработанных физиологическим раствором, без индукции поли(IC). Данные мыши экспрессируют очень мало белка PD-L.

Фиг. 10: популяция одноядерных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО (антисмысловой олигонуклеотид) против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблица 18). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05; *** - Р меньше 0,001, и **** Р меньше 0,0001). А) представляет число Т-клеток в печени после обработки. Б) представляет долю Т-клеток CD4+, и В) представляет долю Т-клеток CD8+.

Фиг. 11: модуляция PD-L1-позитивных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 19). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05 и **** - Р меньше 0,0001). А) представляет процентную долю Т-клеток CD8+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки. Б) представляет процентную долю Т-клеток CD4+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки, и В) представляет процентную долю В-клеток, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки.

Фиг. 12: специфичные в отношении антигена HBV цитокин-секретирующие клетки CD8+ после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлены для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 20). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05). А) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ (интерферон-гамма) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки. Б) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении корового антигена HBV, после обработки, и В) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ и TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки.

Фиг. 13: ДНК HBV, HВsAg и HВeAg у мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым CMP NO: 759_2 против PD-L1, конъюгированным с GalNAc , по сравнению с носителем . Вертикальная линия показывает конец обработки.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Олигонуклеотид

Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.

Непрерывная нуклеотидная последовательность

Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Нуклеотиды

Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».

Модифицированный нуклеозид

Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья» или модифицированные «мономеры».

Модифицированная межнуклеозидная связь

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде по изобретению, например в пределах области гэпа (gap) гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.

Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.

В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).

Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.

Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)₂-S-, -O-PO(R^H)-O-, 0-PO(OCH₃)-0-, -O-PO(NR^H)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^H)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-CO-O-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^HCO-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-CO -, -CH₂-NCH₃-O-CH₂-, где R^H выбран из водорода и C1-4-алкила.

Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или немодифицированная область нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи могут быть также полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.

Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA (запертые нуклеиновые кислоты), защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.

В одном воплощении все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.

Нуклеиновое основание

Нуклеиновое основание включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.

В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.

Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, A, T, G, C или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из A, T, G, C и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.

Модифицированный олигонуклеотид

Термин «модифицированный олигонуклеотид» описывает олигонуклеотид, содержащий один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный олигонуклеотид» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов с модифицированными нуклеозидами.

Комплементарность

Термин «комплементарность» описывает способность нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (G)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность» как таковой охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).

Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием.

Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.

Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 5), который является полностью комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени (SEQ ID NO: 772).

5'gcagtagagccaatta3' (SEQ ID NO:772)

3'cgtcatctcggttaat5' (SEQ ID NO: 5)

Идентичность

Термин «идентичность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов в процентах непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде), которые в данном положении являются идентичными (т.е. по их способности образовать пары оснований по Уотсону-Крику с комплементарным нуклеозидом) непрерывной нуклеотидной последовательности в данном положении отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается посредством подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, включая пробелы, деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100.

Процент идентичности = (Соответствия × 100)/Длину выровненной области (с пробелами).

Гибридизация

Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (T_m), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях T_m не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (K_d) реакции согласно уравнению ΔG° = -RTln(K_d), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.

Нуклеиновая кислота-мишень

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PD-L1 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PD-L1. Олигонуклеотид по изобретению, например, может быть нацелен на области экзонов PD-L1 млекопитающего, или, например, может быть нацелен на область интрона пре-мРНК PD-L1 (см. Таблицу 1).

Таблица 1: экзоны и интроны человеческого PD-L1

Экзонные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1) Интронные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1) ID начало конец ID начало конец e1 1 94 i1 95 5597 e2 5598 5663 i2 5664 6576 e3 6577 6918 i3 6919 12331 e4 12332 12736 i4 12737 14996 e5 14997 15410 i5 15411 16267 e6 16268 16327 i6 16328 17337 e7 17338 20064

Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PD-L1, в частности PD-L1 млекопитающего, такой как PD-L1 человека (см., например, Таблицы 2 и 3, в которых приводится ссылка на последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего и мышиного PD-L1). В контексте настоящего изобретения пре-мРНК также считается нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих белок PD-L1 млекопитающего).

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.

Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PD-L1 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PD-L1. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PD-L1 млекопитающего, такой как человеческий PD-L1, например, последовательность пре-мРНК человеческого PD-L1, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 1, или последовательность человеческой мРНК с регистрационным номером NM_014143 NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 2 и 3.

Таблица 2: информация по геному и сборке для PD-L1 между видами.

Вид Хр. Нить Геномные координаты Сборка Номер доступа мРНК эталонной последователь-ности NCBI* Начало Конец Человек 9 прям. 5450503 5470566 GRCh38:
CM000671.2 NM_014143 Яванский макак 15 73560846 73581371 GCF_
000364345.1 XM_005581779 Мышь 19 прям. 29367455 29388095 GRCm38:
CM001012.2 NM_021893

Прям. - прямая нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность). Ссылка NCBI дает последовательность мРНК (последовательность кДНК).

* База данных эталонных последовательностей Национального центра биотехнологической информации представляет собой всеохватывающий, интегрированный, неизбыточный, хорошо аннотированный набор эталонных последовательностей, включающих геномные, последовательности транскриптов и белков. Она размещается на www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.

Таблица 3: подробности последовательностей для PD-L1 между видами.

Вид Тип РНК Длина (нт) SEQ ID NO Человек пре-мРНК 20064 1 Яванский макак пре-мРНК ссылка GCF 20261 2 Яванский макак пре-мРНК Внутренняя 20340 3 Мышь пре-мРНК 20641 4

Последовательность-мишень

Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень длиннее, чем комплементарная последовательность одного олигонуклеотида, и, например, может представлять предпочтительную область нуклеиновой кислоты-мишени, на которую могут быть нацелены несколько олигонуклеотидов по изобретению.

Последовательность-мишень может представлять собой подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени.

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из а1-а149 (см. Таблицы 4). В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из экзона мРНК PD-L1, такого как экзон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из e1, e2, e3, e4, e5, e6 и e7 (см. Таблицу 1 выше).

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из интрона мРНК PD-L1, такого как интрон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из i1, i2, i3, i4, i5 и i6 (см. Таблицу 1 выше).

Олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.

Данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 8 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется с последовательностью-мишенью, присутствующей в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. Непрерывная нуклеотидная последовательность (и, следовательно, последовательность-мишень) содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеотидов, как, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов, как, например, 12-25, как, например, 14-18 смежных нуклеотидов.

Клетка-мишень

Термин «клетка-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях клетка-мишень может находиться в условиях in vivo или in vitro. В некоторых вопощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка грызуна, как, например, клетка мыши или клетка крысы, или клетку примата, как, например, клетка обезьяны или клетка человека.

В предпочтительных воплощениях клетка-мишень экспрессирует мРНК PD-L1, такую как пре-мРНК PD-L1 или зрелая мРНК PD-L1. Поли А хвост мРНК PD-L1 типично не принимается во внимание для нацеливания антисмыслового олигонуклеотида.

Вариант, встречающийся в природе

Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам гена PD-L1 или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.

В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, 2 и 3.

В гене PD-L1 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в следующей таблице (начало/эталонная последовательность человеческой пре-мРНК представляет собой SEQ ID NO 2).

Название варианта Варианты аллелей Минорный аллель Частота минорного аллеля Начало на SEQ ID NO: 1 rs73397192 G/A A 0,10 2591 rs12342381 A/G G 0,12 308 rs16923173 G/A A 0,13 14760 rs2890658 C/A A 0,16 14628 rs2890657 G/C C 0,21 2058 rs3780395 A/G A 0,21 14050 rs147367592 AG/- - 0,21 13425 rs7023227 T/C T 0,22 6048 rs2297137 G/A A 0,23 15230 rs1329946 G/A A 0,23 2910 rs5896124 -/G G 0,23 2420 rs61061063 T/C C 0,23 11709 rs1411263 T/C C 0,23 8601 rs59906468 A/G G 0,23 15583 rs6476976 T/C T 0,24 21012 rs35744625 C/A A 0,24 3557 rs17804441 T/C C 0,24 7231 rs148602745 C/T T 0,25 22548 rs4742099 G/A A 0,25 20311 rs10815228 T/C C 0,25 21877 rs58817806 A/G G 0,26 20769 rs822342 T/C T 0,27 3471 rs10481593 G/A A 0,27 7593 rs822339 A/G A 0,28 2670 rs860290 A/C A 0,28 2696 rs822340 A/G A 0,28 2758 rs822341 T/C T 0,28 2894 rs12002985 C/G C 0,28 6085 rs822338 C/T C 0,28 1055 rs866066 C/T T 0,28 451 rs6651524 A/T T 0,28 8073 rs6415794 A/T A 0,28 8200 rs4143815 G/C C 0,28 17755 rs111423622 G/A A 0,28 24096 rs6651525 C/A A 0,29 8345 rs4742098 A/G G 0,29 19995 rs10975123 C/T T 0,30 10877 rs2282055 T/G G 0,30 5230 rs4742100 A/C C 0,30 20452 rs60520638 -/TC TC 0,30 9502 rs17742278 T/C C 0,30 6021 rs7048841 T/C T 0,30 10299 rs10815229 T/G G 0,31 22143 rs10122089 C/T C 0,32 13278 rs1970000 C/A C 0,32 14534 rs112071324 AGAGAG/- AGAGAG 0,33 16701 rs2297136 G/A G 0,33 17453 rs10815226 A/T T 0,33 9203 rs10123377 A/G A 0,36 10892 rs10123444 A/G A 0,36 11139 rs7042084 G/T G 0,36 7533 rs10114060 G/A A 0,36 11227 rs7028894 G/A G 0,36 10408 rs4742097 C/T C 0,37 5130 rs1536926 G/T G 0,37 13486 rs1411262 C/T T 0,39 8917 rs7041009 G/A A 0,45 12741

Модуляция экспрессии

Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности олигонуклеотида изменять количество PD-L1 по сравнению с количеством PD-L1 до введния данного олигонуклеотида. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный экспермент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленым олигонуклеотидом (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.

Одним типом модуляции является способность олигонуклеотида ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PD-L1, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции. Другим типом модуляции является способность олигонуклеотида восстанавливать, увеличивать или усиливать экспрессию PD-L1, например, посредством репарации сайтов сплайсинга или предотвращения сплайсинга, или устранения или блокировки ингибирующих механизмов, таких как репрессия микроРНК.

Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды

Высокоаффинный модифицированный нуклеозид преставляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (T^m). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).

Модификации сахара

Олигомер по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.

Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств олигонуклеотидов, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.

Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.

Модификации сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-OH, находящейся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.

2'-Модифицированные нуклеозиды

Нуклеозид с 2'-модифицированным сахаром представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-фтор-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.

Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)

Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).

В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:

где W выбран из -O-, -S-, -N(R^a)-, -C(R^aR^b)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;

Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;

Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;

Х обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Х выбран из группы, состоящей из: -O-, -S-, NH-, NR^aR^b, -CH₂-, CR^aR^b, -C(=CH₂)- и -C(=CR^aR^b)-.

В некоторых воплощениях Х представляет собой -О-.

Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)C(R^aR^b)C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)- и -C(R^a)=N-.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -CHR^a-, -CHCH₃-, CR^aR^b-.

или -Х-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -X-CH₂-, -X-CR^aR^b-, -X-CHR^a-, -X-C(HCH₃)^-, -O-Y-, -O-CH₂-, -S-CH₂-, -NH-CH₂-, -O-CHCH₃-, -CH₂-O-CH₂, -O-CH(CH₃CH₃)-, -O-CH₂-CH₂-, OCH₂-CH₂-CH₂-,-O-CH₂OCH₂-, -O-NCH₂-, -C(=CH₂)-CH₂-, -NR^a-CH₂-, N-O-CH₂, -S-CR^aR^b- и -S-CHR^a-.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает -O-CH₂- или -O-CH(CH₃)-,

где Z выбран из -О-, -S- и -N(R^a)-,

и R^a, и, при наличии R^b, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R^a и R^b могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН₂), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации,

где R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из С_1-6-алкила, такого как метил, и водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³ представляют собой атомы водорода, и либо R⁵, либо R^5* также представляет собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой С_1-6-алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях R^а представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R^b, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R^а и R^b представляют собой атом водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.

В некоторых воплощениях оба из R^а и R^b представляют собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены в данный документ посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -О-СН₂-СН₂-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'C-этиленовым мостиком (ENA).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b, где один или оба из R^a и R^b отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2010/077578, которая тем самым включена в данный документ посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂OCH₃)- (2'O-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂CH₃) - (2'O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CНR^a, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₂ОСН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₃)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH₂-O-CH₂- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b-, в котором ни один из R^a или R^b не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R^a, и R^b представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR^a-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R^a представляет собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -C(=CH2)-C(R^aR^b)-, как, например, -C(=CH₂)-CH₂- или -C(=CH₂)-CH(CH₃)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR^a-CH₃- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R⁵ и R^5* представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R¹, R², R³ могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-CH2- или -O-C(HCR^a)-, такого как -O-C(HCH3)-.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как O-CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.

Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.

Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.

Схема 1

Как проиллюстрировано в Примерах, в предпочтительных воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.

Деградация, опосредованная нуклеазой

Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.

Активность и рекрутирование РНКазы Н

Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).

Гэпмер

Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров, и они характеризуются по их способности рекрутировать РНКазу Н. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутстует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутстует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).

Гэпмер LNA

Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.

Гэпмер со смешанными крыльями

Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом

Термин «олигонуклеотид с разорванным гэпом» используется по отношению к гэпмеру, способному поддерживать рекрутирование РНКазы Н, даже несмотря на то, что область гэпа разрывается нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что область гэпа содержит меньше, чем 5 последовательных нуклеозидов ДНК. Нуклеозиды, не рекрутирующие РНКазу Н, представляют собой, например, нуклеозиды в 3'-эндоконформации, такие как LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, как, например, нуклеозид бета-D-окси LNA или ScET. Способность олигонуклеотида с разорванным гэпом рекрутировать РНКазу Н типично является специфичной в отношении последовательности или даже соединения - см. Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487, в которой раскрыты «олигонуклеотиды с разорванным гэпом», которые рекрутируют РНКазу Н, которые в некоторых случаях обеспечивает более специфичное расщеплениее РНК-мишени.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению представляет собой олигонуклеотид с разорванным гэпом. В некоторых воплощениях олигонуклеотид с разорванным гэпом содержит 5'-фланг (F), гэп (G) и 3'-фланг (F'), где гэп разорван нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что гэп содержит по меньшей мере 3 или 4 последовательных нуклеозида ДНК. В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой нуклеозид LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, и он размещается в пределах области гэпа таким образом, что нуклеозид LNA, разрывающий гэп, фланкирован 5' и 3' по меньшей мере 3(5') и 3(3') или по меньшей мере 3(5') и 4(3'), или по меньшей мере 4(5') и 3(3') нуклеозидами ДНК, и где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом может быть представлен следующими формулами:

F-G-E-G-F'; в частности F_1-7-G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

D'-F-G-F', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

F-G-F'-D'', в частности F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

D'-F-G-F'-D'', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

Где области D' и D'' являются такими, как описано в разделе «Конструкция гэпмера».

В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой бета-D-окси LNA или ScET, или другие нуклеозиды бета-LNA, показанные на Схеме 1).

Конъюгат

Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область), также именуемому конъюгатом олигонуклеотида.

Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка нацеливает олигонуклеотид в печень. В то же самое время конъюгат служит для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В одном воплощении изобретения конъюгат олигонуклеотида по изобретению демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию имеет улучшенное клеточное распределение между печенью и другими органами, такими как селезенка или почки (т.е. больше конъюгированного олигонуклеотида поступает в печень, чем в селезенку или в почки), по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию демонстрирует улучшенное клеточное поглощение в печень конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки). Конъюгатная группировка является по существу частью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов, которая не состоит из нуклеиновых кислот.

Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.

Линкеры

Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки (области С), к первой области, например, олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область (вторая область или область В, и/или область Y), которая располагается между олигонуклеотидом или непрерывной нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А или первая область), и конъюгатной группировкой (область С или третья область).

Область В относится к биорасщепляемым линкерам, содержащим или состоящим из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).

Область Y относится к линкерам, которые не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки (области С или третьей области) к олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (области А или первой области). Линкеры области Y могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут быть сконструированы из следующих элементов областей: A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C или A-Y-C. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу.

Лечение

Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится как к лечению существующего заболевания (например, заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе), так и к предупреждению заболевания, т.е. профилактике. Следовательно, будет понятно, что лечение в том виде, в котором на него дается ссылка в данном документе, в некоторых воплощениях может быть профилактическим.

Восстановление иммунного ответа против патогенов

Иммунный ответ подразделяется на врожденный и адаптивный иммунный ответ. Врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифичный ответ. Адаптивный иммунный ответ активируется врожденным иммунным ответом и является высокоспецифичным по отношению к конкретному патогену. При презентации антигена, происходящего из патогена, на поверхности антигенпрезентирующих клеток иммунные клетки адаптивного иммунного ответа (т.е. Т- и В-лимфоциты) активируются посредством их антигенспецифичных рецепторов, приводя к патогенспецифичному иммунному ответу и развитию иммунологической памяти. Хронические вирусные инфекции, такие как HBV и HCV, ассоциированы с исчерпанием Т-клеток, характеризуемым неотвечаемостью вирусоспецифичных Т-клеток. Исчерпание Т-клеток хорошо изучено, относительно обзора см., например, Yi et al 2010 Immunology 129, 474-481. Хронические вирусные инфекции также ассоциированы с пониженной функцией NK-клеток, которые являются врождеными иммунными клетками. Усиление иммунного ответа против вирусов является важным для клиренса хронической инфекции. Восстановление иммунного ответа против патогенов, опосредованного Т-клетками и NK-клетками, можно оценивать посредством измерения пролиферации, секреции цитокинов и цитолитической функции (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 и Пример 6 в данном документе).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению антисмысловых олигонуклеотидов, их конъюгатов и содержащих их фармацевтических композиций для восстановления иммунного ответа против патогенов, которые инфицировали животное, в частности человека. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов по настоящему изобретению являются особенно полезными против патогенов, которые инфицировали печень, в частности, против хронических инфекций печени, подобных HBV. Данные конъюгаты обеспечивают таргетное распределение олигонуклеотидов и предотвращают системный нокдаун нуклеиновой кислоты-мишени.

Олигонуклеотиды по изобретению

Данное изобретение относится к олигонуклеотидам, способным модулировать экспрессию PD-L1. Модуляция может достигаться гибридизацией с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PD-L1, или с той, которая участвует в регуляции PD-L1. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой последовательность PD-L1 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой пре-мРНК, мРНК или любую последовательность РНК, экспрессируемую из клетки млекопитающего, которая поддерживает экспрессию или регуляцию PD-L1.

Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PD-L1.

В одном аспекте изобретения олигонуклеотиды по изобретению конъюгированы с конъюгатной группировкой, в частности, с конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством осуществления ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS (липополисахарид)), более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS). В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PD-L1 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PD-L1 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. Подходящим образом в примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения РНК PD-L1 (например, Пример 1). Модуляция мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит несоответствия между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. Несмотря на несоответствия гибридизация с нуклеиновой кислотой-мишенью все еще может быть достаточной для демонстрации желательной модуляции экспрессии PD-L1. Пониженная аффинность связывания, происходящая из-за несоответствий, преимущественно может компенсироваться большим числом нуклеотидов в олигонуклеотиде и/или большим числом модифицированных нуклеозидов, способных увеличивать аффинность связывания с мишенью, таких как 2'-модифицированные нуклеозиды, включая LNA, присутствующих в пределах последовательности олигонуклеотида.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен восстанавливать патогенспецифичные Т-клетки. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны увеличивать число патогенспецифичных Т-клеток по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В одном воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HBV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. Подходящим образом, в данных примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения HBV-специфичных Т-клеток (например, пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитолитическая активность). В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HСV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HDV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен уменьшать уровни HBsAg у животного или человека. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны уменьшать уровни HВsAg по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 90% или 95% по сравнению с уровнем до обработки. Наиболее предпочтительно олигонуклеотиды по изобретению способны достигать сероконверсии HВsAg у животного или человека, иницированного HBV.

Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарным (на 100% комплементарным) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, с полной (или 100%-ной) комплементарностью с областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, где непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, выбранной из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107 и 15317-19511 на SEQ ID NO: 1. В другом воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 и 1881-19494 на SEQ ID NO: 1. В предпочтительном воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из областей от а1 до а449 в Таблице 4.

Таблица 4: области SEQ ID NO 1, на которые может осуществляться нацеливание с использованием олигонуклеотида по изобретению

Обл. a Положение в SEQ ID NO 1 Длина Обл. a Положение в
SEQ ID NO 1 Длина Обл. a Положение в
SEQ ID NO 1 Длина от до от до от до a1 51 82 32 a151 6994 7020 27 a301 13092 13115 24 a2 87 116 30 a152 7033 7048 16 a302 13117 13134 18 a3 118 133 16 a153 7050 7066 17 a303 13136 13169 34 a4 173 206 34 a154 7078 7094 17 a304 13229 13249 21 a5 221 287 67 a155 7106 7122 17 a305 13295 13328 34 a6 304 350 47 a156 7123 7144 22 a306 13330 13372 43 a7 354 387 34 a157 7146 7166 21 a307 13388 13406 19 a8 389 423 35 a158 7173 7193 21 a308 13408 13426 19 a9 425 440 16 a159 7233 7291 59 a309 13437 13453 17 a10 452 468 17 a160 7300 7333 34 a310 13455 13471 17 a11 470 484 15 a161 7336 7351 16 a311 13518 13547 30 a12 486 500 15 a162 7353 7373 1 a312 13565 13597 33 a13 503 529 27 a163 7375 7412 38 a313 13603 13620 18 a14 540 574 35 a164 7414 7429 16 a314 13630 13663 34 a15 576 649 74 a165 7431 7451 21 a315 13665 13679 15 a16 652 698 47 a166 7453 7472 20 a316 13706 13725 20 a17 700 750 51 a167 7474 7497 24 a317 13727 13774 48 a18 744 758 15 a168 7517 7532 16 a318 13784 13821 38 a19 774 801 28 a169 7547 7601 55 a319 13831 13878 48 a20 805 820 16 a170 7603 7617 15 a320 13881 13940 60 a21 827 891 65 a171 7632 7647 16 a321 13959 14013 55 a22 915 943 29 a172 7649 7666 18 a322 14015 14031 17 a23 950 982 33 a173 7668 7729 62 a323 14034 14049 16 a24 984 1000 17 a174 7731 7764 34 a324 14064 14114 51 a25 1002 1054 53 a175 7767 7817 51 a325 14116 14226 111 a26 1060 1118 59 a176 7838 7860 23 a326 14229 14276 48 a27 1124 1205 82 a177 7862 7876 15 a327 14292 14306 15 a28 1207 1255 49 a178 7880 7944 65 a328 14313 14384 72 a29 1334 1349 16 a179 7964 8012 49 a329 14386 14408 23 a30 1399 1425 27 a180 8028 8072 45 a330 14462 14481 20 a31 1437 1458 22 a181 8086 8100 15 a331 14494 14519 26 a32 1460 1504 45 a182 8102 8123 22 a332 14557 14577 21 a33 1548 1567 20 a183 8125 8149 25 a333 14608 14628 21 a34 1569 1586 18 a184 8151 8199 49 a334 14646 14668 23 a35 1608 1662 55 a185 8218 8235 18 a335 14680 14767 88 a36 1677 1700 24 a186 8237 8276 40 a336 14765 14779 15 a37 1702 1721 20 a187 8299 8344 46 a337 14815 14844 30 a38 1723 1745 23 a188 8346 8436 91 a338 14848 14925 78 a39 1768 1794 27 a189 8438 8470 33 a339 14934 14976 43 a40 1820 1835 16 a190 8472 8499 28 a340 14978 15009 32 a41 1842 1874 33 a191 8505 8529 25 a341 15013 15057 45 a42 1889 1979 91 a192 8538 8559 22 a342 15064 15091 28 a43 1991 2011 21 a193 8562 8579 18 a343 15094 15140 47 a44 2013 2038 26 a194 8581 8685 105 a344 1514 15165 17 a45 2044 2073 30 a195 8688 8729 42 a345 15162 15182 21 a46 2075 2155 81 a196 8730 8751 22 a346 15184 15198 15 a47 2205 2228 24 a197 8777 8800 24 a347 15200 15221 22 a48 2253 2273 21 a198 8825 8865 41 a348 15232 15247 16 a49 2275 2303 29 a199 8862 8894 33 a349 15250 15271 22 a50 2302 2333 32 a200 8896 8911 16 a350 15290 15334 45 a51 2335 2366 32 a201 8938 8982 45 a351 15336 15369 34 a52 2368 2392 25 a202 8996 9045 50 a352 15394 15416 23 a53 2394 2431 38 a203 9048 9070 23 a353 15433 15451 19 a54 2441 2455 15 a204 9072 9139 68 a354 15453 15491 39 a55 2457 2494 38 a205 9150 9168 19 a355 15496 15511 16 a56 2531 2579 49 a206 9170 9186 17 a356 15520 15553 34 a57 2711 2732 22 a207 9188 9202 15 a357 15555 15626 72 a58 2734 2757 24 a208 9204 9236 33 a358 15634 15652 19 a59 2772 2786 15 a209 9252 9283 32 a359 15655 15688 34 a60 2788 2819 32 a210 9300 9331 32 a360 15690 15735 46 a61 2835 2851 17 a211 9339 9354 16 a361 15734 15764 31 a62 2851 2879 29 a212 9370 9398 29 a362 15766 15787 22 a63 2896 2912 17 a213 9400 9488 89 a363 15803 15819 17 a64 2915 2940 26 a214 9490 9537 48 a364 15846 15899 54 a65 2944 2973 30 a215 9611 9695 85 a365 15901 15934 34 a66 2973 2992 20 a216 9706 9721 16 a366 15936 15962 27 a67 2998 3016 19 a217 9723 9746 24 a367 15964 15985 22 a68 3018 3033 16 a218 9748 9765 18 a368 15987 16023 37 a69 3036 3051 16 a219 9767 9788 22 a369 16025 16061 37 a70 3114 3139 26 a220 9794 9808 15 a370 16102 16122 21 a71 3152 3173 22 a221 9812 9859 48 a371 16134 16183 50 a72 3181 3203 23 a222 9880 9913 34 a372 16185 16281 97 a73 3250 3271 22 a223 9923 9955 33 a373 16283 16298 16 a74 3305 3335 31 a224 9966 10007 42 a374 16305 16323 19 a75 3346 3363 18 a225 10009 10051 43 a375 16325 16356 32 a76 3391 3446 56 a226 10053 10088 36 a376 16362 16404 43 a77 3448 3470 23 a227 10098 10119 22 a377 16406 16456 51 a78 3479 3497 19 a228 10133 10163 31 a378 16494 16523 30 a79 3538 3554 17 a229 10214 10240 27 a379 16536 16562 27 a80 3576 3597 22 a230 10257 10272 16 a380 16564 16580 17 a81 3603 3639 37 a231 10281 10298 18 a381 16582 16637 56 a82 3663 3679 17 a232 10300 10318 19 a382 16631 16649 19 a83 3727 3812 86 a233 10339 10363 25 a383 16655 16701 47 a84 3843 3869 27 a234 10409 10426 18 a384 16737 16781 45 a85 3874 3904 31 a235 10447 10497 51 a385 16783 16804 22 a86 3926 3955 30 a236 10499 10529 31 a386 16832 16907 76 a87 3974 3993 20 a237 10531 10546 16 a387 16934 16965 32 a88 3995 4042 48 a238 10560 10580 21 a388 16972 17035 64 a89 4053 4073 21 a239 10582 10596 15 a389 17039 17069 31 a90 4075 4123 49 a240 10600 10621 22 a390 17072 17109 38 a91 4133 4157 25 a241 10623 10664 42 a391 17135 17150 16 a92 4158 4188 31 a242 10666 10685 20 a392 17167 17209 43 a93 4218 4250 33 a243 10717 10773 57 a393 17211 17242 32 a94 4277 4336 60 a244 10775 10792 18 a394 17244 17299 56 a95 4353 4375 23 a245 10794 10858 65 a395 17304 17344 41 a96 4383 4398 16 a246 10874 10888 15 a396 17346 17400 55 a97 4405 4446 42 a247 10893 10972 80 a397 17447 17466 20 a98 4448 4464 17 a248 10974 10994 21 a398 17474 17539 66 a99 4466 4493 28 a249 10996 11012 17 a399 17561 17604 44 a100 4495 4558 64 a250 11075 11097 23 a400 17610 17663 54 a101 4571 4613 43 a251 11099 11124 26 a401 17681 17763 83 a102 4624 4683 60 a252 11140 11157 18 a402 17793 17810 18 a103 4743 4759 17 a253 11159 11192 34 a403 17812 17852 41 a104 4761 4785 25 a254 11195 11226 32 a404 17854 17928 75 a105 4811 4858 48 a255 11235 11261 27 a405 17941 18005 65 a106 4873 4932 60 a256 11279 11337 59 a406 18007 18035 29 a107 4934 4948 15 a257 11344 11381 38 a407 18041 18077 37 a108 4955 4974 20 a258 11387 11411 25 a408 18085 18146 62 a109 4979 5010 32 a259 11427 11494 68 a409 18163 18177 15 a110 5012 5052 41 a260 11496 11510 15 a410 18179 18207 29 a111 5055 5115 61 a261 11512 11526 15 a411 18209 18228 20 a112 5138 5166 29 a262 11528 11551 24 a412 18230 18266 37 a113 5168 5198 31 a263 11570 11592 23 a413 18268 18285 18 a114 5200 5222 23 a264 11594 11634 41 a414 18287 18351 65 a115 5224 5284 61 a265 11664 11684 21 a415 18365 18395 31 a116 5286 5302 17 a266 11699 11719 21 a416 18402 18432 31 a117 5317 5332 16 a267 11721 11746 26 a417 18434 18456 23 a118 5349 5436 88 a268 11753 11771 19 a418 18502 18530 29 a119 5460 5512 53 a269 11787 11873 87 a419 18545 18590 46 a120 5514 5534 21 a270 11873 11905 33 a420 18603 18621 19 a121 5548 5563 16 a271 11927 11942 16 a421 18623 18645 23 a122 5565 5579 15 a272 11946 11973 28 a422 18651 18708 58 a123 5581 5597 17 a273 11975 11993 19 a423 18710 18729 20 a124 5600 5639 40 a274 12019 12114 96 a424 18731 18758 28 a125 5644 5661 18 a275 12116 12135 20 a425 18760 18788 29 a126 5663 5735 73 a276 12137 12158 22 a426 18799 18859 61 a127 5737 5770 34 a277 12165 12192 28 a427 18861 18926 66 a128 5778 5801 24 a278 12194 12216 23 a428 18928 18980 53 a129 5852 5958 107 a279 12218 12246 29 a429 19001 19018 18 a130 6007 6041 35 a280 12262 12277 16 a430 19034 19054 21 a131 6049 6063 15 a281 12283 12319 37 a431 19070 19092 23 a132 6065 6084 20 a282 12334 12368 35 a432 19111 19154 44 a133 6086 6101 16 a283 12370 12395 26 a433 19191 19213 23 a134 6119 6186 68 a284 12397 12434 38 a434 19215 19240 26 a135 6189 6234 46 a285 12436 12509 74 a435 19255 19356 102 a136 6236 6278 43 a286 12511 12543 33 a436 19358 19446 89 a137 6291 6312 22 a287 12545 12565 21 a437 19450 19468 19 a138 6314 6373 60 a288 12567 12675 109 a438 19470 19512 43 a139 6404 6447 44 a289 12677 12706 30 a439 19514 19541 28 a140 6449 6482 34 a290 12708 12724 17 a440 19543 19568 26 a141 6533 6555 23 a291 12753 12768 16 a441 19570 19586 17 a142 6562 6622 61 a292 12785 12809 25 a442 19588 19619 32 a143 6624 6674 51 a293 12830 12859 30 a443 19683 19739 57 a144 6679 6762 84 a294 12864 12885 22 a444 19741 19777 37 a145 6764 6780 17 a295 12886 12916 31 a445 19779 19820 42 a146 6782 6822 41 a296 12922 12946 25 a446 19822 19836 15 a147 6824 6856 33 a297 12948 12970 23 a447 19838 19911 74 a148 6858 6898 41 a298 12983 13003 21 a448 19913 19966 54 a149 6906 6954 49 a299 13018 13051 34 a449 19968 20026 59 a150 6969 6992 24 a300 13070 13090 21

В некотором воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последователность является комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени, где данная область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 и a438.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a160, a180, a221, a269 и a360.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 8-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 9 до 30, как, например, от 10 до 22, как, например, от 11 до 20, как, например, от 12 до 18, как, например, от 13 до 17 или от 14 до 16 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов в длину. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если говорится то, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включены и 10, и 30 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 5.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 5).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 и 771.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 287.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 342.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 640.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 466.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 566.

В воплощениях, где олигонуклеотид длиннее, чем непрерывная нуклеотидная последовательность (которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени), мотивы последоваельностей в Таблице 5 образуют часть непрерывной нуклеотидной последовательности антисмысловых олигонуклеотидов по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательности (например, если не добавляются биорасщепляемые линкеры).

Понятно то, что непрерывные последовательности из нуклеиновых оснований (мотив последовательности) могут быть модифицированы, например, для увеличения устойчивости к нуклеазе и/или аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Модификации описываются в определениях и в разделе «Конструкция олигонуклеотидов». В Таблице 5 перечислены предпочтительные конструкции каждого мотива последовательности.

Конструкция олигонуклеотида

Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность, модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении олигонуклеотид содержит от 1 до 10 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов, как, например, 3, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2' сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).

В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 6 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, от 4 до 6 нуклеозидов LNA или 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеозидов LNA. В некоторых воплощениях по меньшей мере 75% модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA, как, например, 80%, как, например, 85%, как, например, 90% модифицированных нуклеозидов представляют собой нуклеозиды LNA В еще одном другом воплощении все модифицированные нуклеозиды в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении олигонуклеотид может содержать и бета-D-окси-LNA, и один или более чем один из следующих нуклеозидов LNA: тио-LNA, амино-LNA, окси-LNA и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В другом воплощении все цитозиновые звенья LNA представляют собой 5-метилцитозин. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 1 нуклеозид LNA на 5'-конце и по меньшей мере 2 нуклеозида LNA на 3'-конце нуклеотидной последовательности.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, который представляет собой нуклеозид 2'-MOE-РНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-MOE-РНК. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеозидов представляет собой 2'-фтор-ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-фтор-ДНК.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид содержит и нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром, и звенья ДНК. Предпочтительно олигонуклеотид содержит и нуклеотиды (звенья) LNA, и ДНК. Предпочтительно объединенное общее число звеньев LNA и ДНК составляет 8-30, как, например, 10-25, предпочтительно 12-22, как, например, 12-18, даже более предпочтительно 11-16. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотидная последовательность олигонуклеотида, такая как непрерывная нуклеотидная последовательность, состоит из по меньшей мере из одного или двух нуклеотидов LNA, и остальные нуклеозилы представляют собой звенья ДНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит только нуклеозиды LNA и встречающиеся в природе нуклеозиды (такие как нуклеозиды РНК или ДНК, наиболее предпочтительно нуклеозиды ДНК), возможно с модифицированными межнуклеозидными связями, такими как фосфоротиоатная.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.

Структурная конструкция олигонуклеотида по изобретению может быть выбрана из гэпмеров, олигонуклеотидов с разорванным гэпом, хэдмеров и тэйлмеров.

Конструкция гэпмера

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5 -> 3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. Нуклеозиды, которые способны рекрутировать нуклеазу, в частности РНКазу Н, могут быть выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-окси-LNA, 2'-фтор-ANA и UNA. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'- фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу.

Область F

Область F (5'-фланг или 5'-крыло), присоединенная к '5-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-5 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В другом воплощении область F содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. В одном воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 3 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК. Такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 5'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности.

Область G

Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из по меньшей мере 4, как, например, из по меньшей мере 5, как, например, из по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 последовательных нуклеозидов, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу, в частности РНКазу Н. В другом воплощении область G включает, содержит или состоит из от 5 до 12 или от 6 до 10, или от 7 до 9, как, например, из 8 последовательных нуклеотидных звеньев, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу.

Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированой ДНК (как описано в PCT/EP2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено ДНК, как, например, от 1 до 18 звеньев ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 звеньев ДНК, предпочтительно от 2 до 17 звеньев ДНК, как, например, от 3 до 16 звеньев ДНК, как, например, от 4 до 15 звеньев ДНК, как, например, от 5 до 14 звеньев ДНК, как, например, от 6 до 13 звеньев ДНК, как, например, от 7 до 12 звеньев ДНК, как, например, от 8 до 11 звеньев ДНК, более предпочтительно от 8 до 17 звеньев ДНК или от 9 до 16 звеньев ДНК, от 10 до 15 звеньев ДНК или от 11 до 13 звеньев ДНК, как, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.

В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н. Область G может состоять из по меньшей мере 50% ДНК, более предпочтительно - из 60%, 70% или 80% ДНК, и даже более предпочтительно из 90% или 95% ДНК.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено альфа-L-LNA, как, например, по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев альфа-L-LNA. В другом воплощении область G содержит по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, которое представляет собой звено альфа-L-окси-LNA. В другом воплощении область G содержит комбинацию нуклеозидных звеньев ДНК и альфа-L-LNA.

В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.

В некоторых воплощениях область G может содержать нуклеозид, разрывающий гэп, приводящий к олигонуклеотиду с разорванным гэпом, который способен рекрутировать РНКазу Н.

Область F'

Область F' (3'-фланг или 3'-крыло), присоединенная к '3-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.

В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды. В другом воплощении область F' содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце (смежном с областью G) и 3'-конце области F'. В одном воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 4 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F' чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК, причем такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 3'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F' с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении модифицированные нуклеозиды в области F' выбраны из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' имеет по меньшей мере 2 звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности.

Область D' и D''

Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно. Область D' или D'' является опцией.

Область D' и D'' может независимо содержать от 0 до 5, как, например, от 1 до 5, как, например, от 2 до 4, как, например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'' на 5'- или 3'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности. В другом воплощении область D' и/или D'' состоит из 1-5 нуклеозидов ДНК или РНК, связанных фосфодиэфирными связями, которые не являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени.

Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:

3'-F-G-F'-3'; в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-D'-F-G-F'-3', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-F-G-F'-D''-3', в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

5'-D'-F-G-F'-D'-3'', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению имеют область С, ковалентно присоединенную либо к 5'-, либо к 3'-концу олигонуклеотида, в частности гэпмерных олигонуклеотидов, представленных выше.

В одном воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит олигонуклеотид с формулой 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и область D' или D'' содержит 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. Предпочтительно область D' или D'' присутствует в конце олигонуклеотида, где рассматривается конъюгирование с конъюгатной группировкой.

Примеры олигонуклеотидов с флангами с чередованием могут быть представлены следующими формулами:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-F'

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N_1-2-2'_1-2-G_6-12-F'

где фланг указан F или F', если он содержит только 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как нуклеозиды LNA. Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях с чередованием и области F, G и F', D' и D'' были описаны выше.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1, и область D' состоит из 2 ДНК, связанных фосфодиэфирной связью.

В других воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеозных звеньев, таких как нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-O-метоксиэтил-рибозу (2'-MOE), или нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и/или звенья LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеозидных звеньев, таких как звенья ДНК или другие нуклеозиды, рекрутирующие нуклеазу, такие как L-LNA или смесь нуклеозидов ДНК и нуклеозидов, рекрутирующих нуклеазу.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из двух звеньев LNA, и область G состоит из 12, 13, 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 2-12-2, 2-13-2 и 2-14-2.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из трех звеньев LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 3-8-3, 3-9-3 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 и 3-14-3.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из четырех звеньев LNA, и область G состоит из 8 или 9, 10, 11 или 12 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 6 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 и 4-6-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 7 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 и 4-7-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 8 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, , 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 и 4-8-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 9 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 и 4-9-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 10 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 и 4-10-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 11 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 и 4-11-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 12 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 13 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 и 4-13-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 14 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 и 4-14-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 15 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 и 3-15-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 16 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 и 3-16-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 17 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 и 3-17-2.

Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК, таких как 2 звена ДНК, связанных 2-фосфодиэфиром. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G предпочтительно представляют собой немодифицированные нуклеозиды.

При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.

В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.

Для конкретных гэпмеров, как раскрыто в данном документе, при аннотации остатков цитозина (С) как 5-метил-цитозин в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированный остаток С.

В конкретном воплощении гэпмер представляет собой так называемый шортмер, как описано в WO2008/113832, включенной в данный документ посредством ссылки.

Дополнительные конструкции гэпмеров раскрыты в WO2004/046160, WO2007/146511 и включены посредством ссылки.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO от 5_1 до 743_1 и 771_1.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1, and 735_1.

В одном предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 287_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 342_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 640_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 466_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 566_1.

В другом воплощении изобретения непрерывная нуклеотидная последовательность олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидных соединений по изобретению содержит от двух до четырех дополнительных нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, на 5'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности (например, области D'). В одном воплощении нуклеозиды служат в качестве биорасщепляемого линкера (см. раздел «Биорасщепляемые линкеры»). В предпочтительном воплощении динуклеотид са (цитидин-аденозин) связан с 5'-концом непрерывной нуклеотидной последовательности (т.е. с любым из мотивов последовательностей или олигонуклеотидных соединений, перечисленных в Таблице 5) посредством фосфодиэфирной связи. В предпочтительном воплощении динуклеотид са не является комплементарным последовательности-мишени в положении, где остальная часть непрерывного нуклеотида является комплементарной.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеотидных мотивов с SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 и 770.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

Углеводные конъюгатные группировки

Углеводные конъюгатные группировки включают галактозу, лактозу, N-ацетилгалактозамин, маннозу и моннозо-6-фосфат, но не ограничиваются ими. Углеводные конъюгаты могут использоваться для увеличения доставки или активности в целом ряде тканей, таких как печень и/или мышцы. См., например, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.

В некоторых воплощениях углеводные конъюгатные группировки являются многовалентными, таким образом, что, например, 2, 3 или 4 идентичные или неидентичные углеводные группировки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидом, возможно через линкер или линкеры. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат, содержащий олигонуклеотид по изобретению и углеводную конъюгатную группировку. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка представляет собой или может содержать маннозу или маннозо-6-фосфат. Это особенно полезно для нацеливания в мышечные клетки, см., например, US 2012/122801.

Конъюгатные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr) являются особенно полезными для нацеливания в гепатоциты в печени. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат олигонуклеотида, содержащий олигонуклеотид по изобретению и конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина. Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит одну или более чем одну углеводную группировку, способную к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (углеводные группировки, связывающиеся с ASGPr) с аффинностью, равной или большей, чем аффинность галактозы. Аффинности многочисленных производных галактозы в отношении рецептора асиалогликопротеина были исследованы (см., например, Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) или легко определяются с использованием способов, типичных в данной области.

Одним аспектом настоящего изобретения является конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий а) олигонуклеотид (область А), содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1; и б) по меньшей мере одну конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина (область С), ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду в а). Олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность может быть такой, как описано в любом из разделов «Олигонуклеотиды по изобретению», «Конструкция олигонуклеотидов» и «Конструкция гэпмеров».

В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, связывающуюся с ASPGr, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной (т.е. содержащей 1, 2, 3 или 4 концевые углеводные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина). Предпочтительно конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является двухвалентной, даже более предпочтительно она является трехвалентной. В предпочтительном воплощении конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит 1-3 группировки N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (также именуемая GalNAc конъюгат). В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида содержит конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, которая является трехвалентной N-ацетилгалактозаминной (GalNAc) группировкой. GalNAc конъюгаты использовали с фосфодиэфирными, метилфосфонатными и PNA антисмысловыми олигонуклеотидами (например, US 5994517 и Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792, и Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 ) и миРНК (например, WO 2009/126933, WO 2012/089352 и WO 2012/083046) и с модифицированными нуклеозидами LNA и 2'-MOE (WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620, включенные тем самым посредством ссылки).

Для получения конъюгатной группировки, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr (предпочтительно GalNAc), присоединяются к разветвляющей молекуле через C-1 углероды сахаридов. Углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно связываются с разветвляющей молекулой через спейсеры. Предпочтительным спейсером является гибкий гидрофильный спейсер (патент США 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Предпочтительным гибким гидрофильным спейсером является ПЭГ (полиэтиленгликоль) спейсер. Предпочтительным ПЭГ спейсером является ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). Разветвляющей молекулой может быть любая маленькая молекула, которая допускает присоединение двух или трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, и дополнительно обеспечивает присоединение точки разветвления к олигонуклеотиду. Типичной разветвляющей молекулой является дилизин. Молекула дилизина содержит три аминогруппы, посредством которых три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, могут быть присоединены к карбоксильной реакционноспособной группе, через которую дилизин может быть присоединен к олигонуклеотиду. Альтернативными разветвляющими молекулами могут быть удвоитель или утроитель, такие как поставляемые Glen Research. В некоторых воплощениях разветвляющая молекула может быть выбрана из группы, состоящей из 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)] фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1920-xx), три-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1922-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'- диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита и 1-[5-(4,4'-диметокси-тритилокси)пентиламидо]-3-[5-флюоренометокси-карбонил-окси-пентиламидо]-пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1925-xx). В WO 2014/179620 и заявке PCT № PCT/EP2015/073331 описано получение разных конъюгатных группировок GalNAc (включенных тем самым посредством ссылки). Между разветвляющей молекулой и олигонуклеотидом может быть вставлен один или более чем один линкер. В предпочтительном воплощении линкер представляет собой биорасщепляемый линкер. Линкер может быть выбран из линкеров, описанных в разделе «Линкеры» и его подразделах.

Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, в частности, конъюгатная группировка GalNAc, может быть присоединена к 3'- или 5'-концу олигонуклеотида с использованием способов, известных в данной области. В предпочтительных воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, связывается с 5'-концом олигонуклеотида.

Модуляторы фармакокинетики в отношении доставки миРНК были описаны в WO 2012/083046 (включенной тем самым посредством ссылки). В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит модулятор фармакокинетики, выбранный из группы, состоящей из гидрофобной группы, имеющей 16 или более атомов углерода, гидрофобной группы, имеющей 16-20 атомов углерода, пальмитоила, гексадек-8-еноила, олеила, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноила, диоктаноила, С16-С20-ацила и холестерина. В предпочтительном воплощении углеводная конъюгатная группировка, содержащая модулятор фармакокинетики, представляет собой GalNAc конъюгат.

Предпочтительные углеводные конъюгатные группировки содержат от одной до трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, предпочтительно группировку(ки) N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно N-ацетилгалактозаминные группировки, связанные через спейсер с разветвляющей молекулой. Спейсерная молекула может иметь длину от 8 до 30 атомов. Предпочтительная углеводная конъюгатная группировка содержит три концевые GalNAc группировки, связанные через ПЭГ спейсер с разветвляющей молекулой дилизином. Предпочтительно ПЭГ спейсер представляет собой 3ПЭГ. Подходящие конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, показаны на Фиг. 1. Предпочтительная конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, показана на Фиг. 3.

Другие GalNAc конъюгатные группировки могут включать, например, маленькие пептиды с присоединенными GalNAc группировками, такие как Tyr-Glu-Glu-(аминогексил-GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; гликотрипептид, который связывается с рецептором асиалогликопротеина на гепатоцитах, см., например, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); галактозные кластеры на основе лизина (например, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); и галактозные кластеры на основе холана (например, мотив распознавания углевода для рецептора асиалогликопротеина).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат антисмыслового олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из следующих CPM ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

В предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 4.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 5.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 6.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 7.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 8.

Линкеры

Биорасщепляемые линкеры (область В)

Применение конъюгата часто ассоциировано с улучшенными фармакокинетическими или фармакодинамическими свойствами. Однако присутствие конъюгатной группировки может препятствовать активности олигонуклеотида против намеченной мишени, например посредством стерического препятствия, предотвращающего гибридизацию или рекрутирование нуклеазы (например, РНКазы Н). Применение физиологически лабильной связи (биорасщепляемого линкера) между олигонуклеотидом (область А или первая область) и конъюгатной группировкой (область С или третья область) обеспечивает улучшенне свойства из-за присутствия конъюгатной группировки при обеспечении того, что при нахождении в ткани-мишени конъюгатная группа не предотвращает эффективную активность олигонуклеотида.

Расщепление физиологически лабильной связи происходит спонтанно при достижении молекулой, содержащей лабильную связь, подходящей внутри- и/или внеклеточной среды. Например, рН-лабильная связь может расщепляться при поступлении молекулы в подкисленную эндосому. Таким образом, рН-лабильная связь может рассматриваться как связь, расщепляемая в эндосоме. Связи, расщепляемые ферментом, могут расщепляться при воздействии ферментов, таких как ферметы, присутствующие в эндосоме или в лизосоме, или в цитоплазме. Дисульфидная связь может расщепляться при поступлении молекулы в более восстанавливающую среду цитоплазмы клетки. Таким образом, дисульфид может рассматриваться как связь, расщепляемая в цитоплазме. рН-лабильная связь в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой лабильную связь, которая селективно расщепляется при кислотных условиях (рН меньше 7). Такие связи также могут называться эндосомно-лабильными связыми, так как клеточные эндосомы и лизосомы имеют рН меньше, чем 7.

Для биорасщепляемых линкеров, ассоциированных с конъюгатной группировкой для таргетной доставки, предпочтительным является то, что скорость расщепления, наблюдаемая в ткани-мишени (например, в мышце, печени, почке или опухоли), была больше, чем наблюдающаяся в сыворотке крови. Подходящие способы для определения уровня (%) расщепления в ткани-мишени относительно сыворотки или расщепления нуклеазой S1 описываются в разделе «Материаы и методы». В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер (также именуемый физиологически лабильный линкер или нуклеазочувствительный линкер, или область В) в конъюгате по изобретению расщепляется по меньшей мере примерно на 20%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 30%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 40%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 50%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 60%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 70%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 75% по сравнению со стандартом.

В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит три области: i) первую область (область А), которая содержит 10-25 смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени; ii) вторую область (область В), которая содержит биорасщепляемый линкер, и iii) третью область (область С), которая содержит конъюгатную группировку, такую как конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, где третья область ковалентно связана со второй областью, которая ковалентно связана с первой областью.

В одном воплощении настоящего изобретения конъюгат олигонуклеотида содержит биорасщепляемый линкер (область В) между непрерывной нуклеотидной последовательностью (область А) и конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина (область С).

В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер может находиться или на 5'-конце и/или на 3'-конце смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени (область А). В предпочтительном воплощении биорасщепляемый линкер находится на 5'-конце.

В некоторых воплощениях расщепляемый линкер является чувствительным к нуклеазе(зам), которые, например, могут экспрессироваться в клетке-мишени. В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей. Данный линкер может представлять собой короткую область (например, из 1-10, как подробно описано в определении линкеров) нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. В некоторых воплощениях нуклеозиды в области В биорасщепляемого линкера (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из нуклеозидов ДНК и РНК или их модификаций, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению. Модификации нуклеозидов ДНК и РНК, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению, могут представлять собой не встречающиеся в природе нуклеиновые основания. Некоторые нуклеозиды с модифицированным сахаром также могут обеспечивать нуклеазное расщепление, как, например, альфа-L-окси-LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды области В содержат (возможно независимо) либо сахар 2'-OH-рибозу (РНК), либо 2'-H сахар - т.е. РНК или ДНК. В предпочтительном воплощении по меньшей мере два последовательных нуклеозида области В представляют собой нуклеозиды ДНК или РНК (как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных нуклеозидов ДНК или РНК). В даже более предпочтительном воплощении нуклеозиды области В представляют собой нуклеозиды ДНК. Предпочтительно область В состоит из от 1 до 5 или от 1 до 4, как, например, из 2, 3, 4 последовательных нуклеозидов ДНК, связанных фосфодиэфирной связью. В предпочтительных воплощениях область В является такой короткой, что она не рекрутирует РНКазуН. В некоторых воплощениях область В содержит не больше, чем 3 или больше, чем 4 последовательных нуклеозида ДНК и/или РНК, связанных фосфодиэфирной связью (таких как нуклеозиды ДНК).

Когда область В состоит из нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, область А и В могут вместе образовать олигонуклеотид, который связан с областью С. В данном контексте область А может отличаться от области В тем, что область А начинается с по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух модифицированных нуклеозидов с повышенной аффинностью связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, LNA или нуклеозиды с 2'-замещенной сахарной группировкой), и область А сама по себе способна к модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в релевантной линии клеток. Кроме того, если область А содержит нуклеозиды ДНК или РНК, они связаны нуклеазоустойчивой межнуклеозидной связью, такой как фосфоротиоатная или боранофосфатная. Область В, с другой стороны, содержит фосфодиэфирные связи между нуклеозидами ДНК или РНК. В некоторых воплощениях область В не является комплементарной или содержит по меньшей мере 50% несоответствий с нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях область В не является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или смежным нуклеотидам, комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени в области А.

В некоторых воплощениях область В является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В данном отношении области А и В вместе могут образовать одну непрерывную последовательность, которая является комплементарной последовательности-мишени.

В некоторых аспектах изобретения межнуклеозидная связь между первой (область А) и второй областью (область В) может рассматриваться как часть второй области.

В некоторых воплощениях последовательность оснований в области В выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой на основе преобладающих эндонуклеазных расщепляющих ферментов, присутствующих в ткани-мишени или в клетке-мишени, или в субклеточном компартменте-мишени. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из тканей-мишеней и тканей, не являющихся мишенями, могут быть выбраны последовательности расщепления эндонуклеазой для применения в области В на основе предпочтительной расщепляющей активности в желательной клетке-мишени (например, печени/гепатоцитах) по сравнению с клеткой, не являющейся мишенью (например, почки). В данном отношении эффективность соединения в отношении понижающей регуляции мишени может быть оптимизирована для желательной ткани/клетки.

В некоторых воплощениях область В содержит динуклеотид последовательности AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, или GG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидная связь представляет собой фосфодиэфирную связь. В некоторых воплощениях область В содержит тринуклеотид последовательности AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. В некоторых воплощениях область В содержит тетрануклеотид последовательности AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где Х может быть выбран из группы, состоящей из A, T, U, G, C и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. Будет понятно то, что при ссылке на (встречающиеся в природе) нуклеиновые основания A, T, U, G, C они могут быть заменены аналогами нуклеиновых оснований, которые функционируют как эквивалент природных нуклеиновых оснований (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).

Другие линкеры (область Y)

Линкер может иметь по меньшей мере две функциональные группы: одну для присоединения олигонуклеотида и другую - для присоединения конъюгатной группировки. Типичные функциональные группы линкера могут быть электрофильными для осуществления реакции с нуклеофильными группами на олигонуклеотиде или конъюгатной группировке или нуклеофильными для осуществления реакции с электрофильными группами. В некоторых воплощениях функциональные группы линкера включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, фосфорамидат, фосфоротиоат, фосфат, фосфит, ненасыщенные группы (например, с двойными или тройными связями) и тому подобное. Некоторые типичные линкеры (область Y) включают 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбоксилат (SMCC), 6- аминогексановую кислоту (AHEX или AHA), 6-аминогексилокси, 4-аминомасляную кислоту, 4-аминоциклогексилкарбоновую кислоту, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбокси-(6-амидо-капроат) (LCSMCC), сукцинимидил-м-малеимидо-бензоилат (MBS), сукцинимидил-N-e-малеимидо-капроилат (EMCS), сукцинимидил-6-(бета-малеимидо-пропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-N-(a-малеимидоацетат) (AMAS), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB), бета-аланин (бета-ALA), фенилглицин (PHG), 4-аминоциклогексановую кислоту (ACHC), бета-(циклопропил)аланин (бета-CYPR), аминододекановую кислоту (ADC), алилендиолы, полиэтиленгликоли, аминокислоты и тому подобное. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу. Аминоалкильная группа может быть добавлена к олигонуклеотиду (область А или область А-В) в качестве части стандартного синтеза олигонуклеотида, например, с использованием (например, защищенного) аминоалкилфосфорамидита. Связывающая группа между аминоалкилом и олигонуклеотдом может представлять собой, например, фосфоротиоат или фосфодиэфир, или одну из других нуклеозидных связывающих групп, на которые дается ссылка в данном документе. Аминоалкильная группа квалентно связывается с 5' или 3'-концом олигонуклеотида. Имеющиеся в продаже аминоалкильные линкеры представляют собой, например, 3'-аминомодифицирующий реактив для связывания на 3'-конце олигонуклеотида, и для связывания на 5'-конце олигонуклеотида доступен 5'-аминомодификатор С6. Данные реактивы доступны у Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Данные соединения или аналогичные соединения были использованы Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 для связывания флюоресцеина с 5'-концом олигонуклеотида. В данной области известен широкий спектр других линкерных групп, и они могут быть полезными при присоединении конъюгатных группировок к олигонуклеотидам. Обзор многих полезных линкерных групп можно найти, например, в Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Другие соединения, такие как акридин, присоединяли к 3'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида посредством полиметиленовой связи (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). Любую из приведенных выше групп можно использовать в качестве одиночного линкера (область Y) или в комбинации с одним или более чем одним другим линкером (область Y-Y' или область Y-B, или B-Y).

Линкеры и их применение в получении конъюгатов олигонуклеотидов приводятся во всей данной области, как, например, в WO 96/11205 и WO 98/52614 и в патентах США № 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432 и 6335437, WO 2012/083046, каждая из которых включена посредством ссылки во всей ее полноте.

Способ изготовления

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы изготовления олигонуклеотидов по изобретению, включающие проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев и, посредством этого, образование ковалентно связанных смежных нуклеотидных звеньев, содержащихся в олигонуклеотиде. Предпочтительно в данном способе используется фосфорамидитная химия (см., например, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology том 154, страницы 287-313). В другом воплощении данный способ дополнительно включает проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с конъюгируемой группировкой (лигандом). В другом аспекте предложен способ изготовления композиции по изобретению, включающий смешивание олигонуклеотида или конъюгированного олигонуклеотида по изобретению с фармацевтически приемлемым разбавителем, растворителем, носителем, солью и/или адъювантом.

Фармацевтическая композиция

В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из вышеупомянутых олигонуклеотидов и/или конъюгатов олигонуклеотидов и фармацевтически приемлемый разбавитель, растворитель, носитель, соль и/или адъювант. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), а фармацевтически приемлемые соли включают натриевые и калиевые соли, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильный фосфатно-солевой буферный раствор. В некоторых воплощениях олигонуклеотид используется в фармацевтически приемлемом разбавителе в виде раствора в концентрации 50-300 мкМ.

Подходящие препараты для применения в настоящем изобретении находятся в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Относительно краткого обзора способов доставки лекарственного средства, см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). В WO 2007/031091 предложены дполнительные подходящие и предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей и адъювантов (включенные тем самым посредством ссылки). Подходящие дозировки, препараты, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, препараты пролекарств также приводятся в WO 2007/031091.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для приготовления фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы для приготовления фармацевтических композиций зависят от целого ряда критериев, включающих путь введения, степень заболевания или дозу, подлежащую введению, но не ограничивающихся ими.

Данные композиции можно стерилизовать традиционными методиками стерилизации, или они могут подвергаться стерилизующему фильтрованию. Образующиеся водные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в котором они находятся, или лиофилизируются, причем лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором перед введением. рН препаратов типично будет составлять от 3 до 11, более предпочтительно - от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно - от 7 до 8, как, например, от 7 до 7,5. Образующиеся композиции в твердой форме можно упаковывать в многочисленные единичные стандартные дозы, причем каждая из них содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов, как, например, в запечатанной упаковке или таблетках, или капсулах. Композицию в твердой форме также можно упаковывать в контейнер для гибкого количества, такой как поддающийся выдавливанию тюбик, разработанный для местно наносимого крема или мази.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида по изобретению представляет собой пролекарство. В частности, в отношении конъюгатов олигонуклеотидов конъюгатная группировка отщепляется от олигонуклеотида, как только пролекарство доставляется к месту действия, например, в клетку-мишень.

Применения

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут использоваться в качестве исследовательских реактивов, например, для диагностики, терапии и профилактики.

В исследовании такие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов можно использовать для специфичной модуляции синтеза белка PD-L1 в клетках (например, в культурах клеток in vitro) и в экспериментальных животных, облегчая, посредством этого, функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Типично модуляция мишени достигается посредством осуществления деградации или ингибирования мРНК, продуцирующей белок, предотвращая, посредством этого, образование белка, или посредством осуществления деградации или ингибирования модулятора гена или мРНК, продуцирующей белок.

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, полученную из ДНК или РНК.

Согласно настоящему изобретению предложен способ in vivo или in vitro модуляции экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, причем указанный способ включает введение в указанную клетку олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по изобретению в эффективном количестве.

В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, в частности, человеческую клетку. Клетка-мишень может представлять собой культуру клеток in vitro или клетку in vivo, образующую часть ткани млекопитающего. В предпочтительных воплощениях клетка-мишень присутствует в печени. Клетка-мишень печени может быть выбрана из паренхимных клеток (например, гепатоцитов) и непаренхимных клеток, таких как клетки Купфера, LSEC, звездчатые клетки (или клетки Ито), холангиоциты и лейкоциты, ассоциированные с печенью (включающие Т-клетки и NK-клетки). В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку. Антигенпрезентирующие клетки подвергают дисплею чужеродные антигены, образующие комплекс с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I или класса II на их поверхностях. В некоторых воплощениях антигенпрезентирующие клетки экспрессируют МНС класса II (т.е. профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги и В-клетки).

При диагностике данные олигонуклеотиды могут быть использованы для выявления и количественного измерения экспрессии PD-L1 в клетке и тканях посредством норзерн-блоттинга, гибридизации in situ или аналогичных методик.

Для терапии олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению или их фармацевтические копозиции могут вводиться животному или человеку, у которого подозревается наличие заболевания или расстройства, которое может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1, в частности, посредством уменьшения экспрессии PD-L1 в клетках-мишенях печени.

Согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, включающие введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

Данное изобретение также относится к олигонуклеотиду, конъюгату олигонуклеотида или фармацевтической композиции согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическую композицию согласно изобретению типично вводят в эффективном количестве.

Согласно изобретению также предложено применение олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида, или фармацевтической композиции по изобретению, как описано, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе. В одном воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении данное изобретение относится к олигонуклеотидам, конъюгатам олигонуклеотидов или фармацевтическим композициям для применения в лечении заболеваний или расстройств, выбранных из вирусных или паразитарных инфекций. В другом воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

Заболевание или расстройство, на которые дается ссылка в данном документе, ассоциировано с истощением иммунной системы. В частности, данное заболевание или расстройство ассоциировано с истощением вирусоспецифичных ответов Т-клеток. В некоторых воплощениях заболевание или расстройство может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1.

Способы по изобретению предпочтительно используют для лечения или профилактики против заболеваний, ассоциированных с истощением иммунной системы.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против патогена. В некоторых воплощениях патоген может находиться в печени. Данными патогенами могут быть вирус или паразит, в частности, вирусы или паразиты, описанные в данном документе. В предпочтительном воплощении патоген представляет собой HBV.

Данное изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции, как определено в данном документе, для изготовления лекарственного средства для восстановления иммунитета против вирусной или паразитарной инфекции, как упомянуто в данном документе.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении вирусных инфекций, в частности, вирусных инфекций в печени, где подвержен влиянию путь PD-1 (см., например, Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585 и Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458). Вирусные инфекции печени могут быть выбраны из группы, состоящей из вирусов гепатита, в частности HBV, HCV и HDV, в частности, хронических форм данных инфекций. В одном воплощении олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению используются для лечения HBV, в частности, хронического HBV. Показателями хронических инфекций HBV являются высокие уровни вирусной нагрузки (ДНК HBV) и даже более высокие уровни пустых частиц HВsAg (более чем 100-кратный избыток относительно вирионов) в системе кровообращения.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению также можно использовать для лечения вирусных инфекций печени, которые наблюдаются в качестве сопутствующих инфекций ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Другими вирусными инфекциями, которые можно лечить олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов, или фармацевтическими композициями по настоящему изобретению, являются lcmv (вирус лимфоцитарного хориоменингита) и ВИЧ в качестве моноинфекции, HSV-1 и -2, и другие герпесвирусы. Данные вирусы не являются гепатотрофическими, однако, они могут быть чувствительными к понижающей регуляции PD-L1.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета или иммунного ответа включает улучшение ответа Т-клеток и/или NK-клеток, и/или ослабление исчерпания Т-клеток, в частности, восстанавливается HBV-специфичный Т-клеточный ответ, HСV-специфичный Т-клеточный ответ и HDV-специфичный Т-клеточный ответ. Улучшение Т-клеточного ответа, например, можно оценивать как увеличение уровня Т-клеток в печени, в частности, увеличение уровня Т-клеток CD8+ и/или CD4+ по сравнению с контролем (т.е. уровнем до обработки или уровнем у субъекта, обработанного носителем). В другом воплощении восстанавливается или возрастает именно уровень вирусоспецифичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем, в частности, восстанавливается или возрастает уровень HBV-специфичных Т-клеток CD8+ или HСV-специфичных Т-клеток CD8+, или HDV-специфичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем. В предпочтительном воплощении возрастает уровень Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена s HBV (HВsAg) и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена e HBV (HBeAg), и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена кора HBV (HBсAg), у субъектов, обработанных олигонуклеотидом, конъюгатом олигонуклеотида или фармацевтической композицией по настоящему изобретению по сравнению с контролем. Предпочтительно Т-клетки CD8+, специфичные в отношении антигена HBV, продуцируют один или более чем один цитокин, такой как интерферон-гамма (IFN-γ) или фактор некроза опухолей альфа (TNF-α). Увеличение уровня Т-клеток CD8+, описанных выше, в частности, наблюдается в печени. Описанное в данном документе увеличение должно быть статистически значимым по сравнению с контролем. Предпочтительно данное увеличение составляет по меньшей мере 20%, как, например, 25%, как, например, 50%, как, например, 75% по сравнению с контролем. В другом воплощении олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению активируются природные клетки-киллеры (NK) и/или природные Т-клетки-киллеры (NKТ).

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении паразитарных инфекций, в частности, паразитарных инфекций, где подвергается влиянию путь PD-1 (см., например, Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 pp 5542-5550; Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115; Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881; Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64; Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249). Паразитарные инфекции могут быть выбраны из группы, состоящей из малярии, токсоплазмоза, лейшманиоза и трипаносомоза. Малярийная инфекция вызвана протистом рода Plasmodium, в частности вида P. vivax, P. malariae и P. falciparum. Токсоплазмоз представляет собой паразитарное заболевание, вызванное Toxoplasma gondii. Лейшманиоз представляет собой заболевание, вызванное протозойными паразитами рода Leishmania. Трипаносомоз вызван простейшим рода Trypanosoma. Болезнь Чагаса, которая является тропической формой, вызывается видом Trypanosoma cruzi, а расстройство сна вызывается видом Trypanosoma brucei.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета включает восстановление ответа паразитоспецифичных Т-клеток и NK-клеток, в частности, ответа Plasmodium-специфичных Т-клеток, ответа Toxoplasma gondii-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Leishmania-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Trypanosoma cruzi-специфичных Т-клеток и NK-клеток или ответа Trypanosoma brucei-специфичных Т-клеток и NK-клеток. В другом воплощении восстанавливается именно ответ паразитоспецифичных Т-клеток CD8+ и NK-клеток.

Введение

Олигонуклеотиды или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить местно (как, например, на кожу, посредством ингаляции, в глаз или в ухо), энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт) или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или подоболочечно).

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся посредством парентрального пути, включающего внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, внутриоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитреальное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится внутривенно. В другом воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится подкожно.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению вводится в дозе 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,1-10 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-10 мг/кг, как, например, 0,1-5 мг/кг, как, например, 0,2-5 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.

Комбинированные терапии

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению предназначены для применения в комбинированном лечении с другим терапевтическим агентом. Данный терапевтический агент может представлять собой, например, стандарт лечения для описанных выше заболеваний или расстройств.

Для лечения хронических инфекций HBV в качестве стандарта лечения рекомендуется комбинация противовирусных лекарственных средств и модуляторов иммунной системы. Эффективными противовирусными лекарственными средствами против HBV являются, например, аналоги нуклеоз(т)идов. Имеется пять аналогов нуклеоз(т)идов, лицензированных для терапии HBV, а именно: ламивудин (эпивир), адефовир (гепсера), тенофовир (виреад), телбивудин (тизека), энтекавир (бараклуд). Они являются эффективными в подавлении вирусной репликации (ДНК HBV), но не имеют влияния на уровни HВsAg. Другие антивирусные лекарственные средства включают рибавирин и терапию антителом против HBV (моноклональным или поликлональным). Модуляторами иммунной системы могут быть, например, интерферон-альфа-2а и ПЭГилированный интерферон-альфа-2а (пегасис) или агонисты TLR7 (например, GS-9620), или терапевтические вакцины. Лечение IFN-α демонстрирует лишь очень умеренный эффект в уменьшении вирусной нагрузки, но приводит к некоторому снижению уровня HВsAg, хотя и очень не эффективно (меньше 10% после 48 недель терапии).

Олигонуклеотид или конъюгаты олигонуклеотида по настоящему изобретению также могут быть объединены с другими противовирусными лекарственными средствами, эффективными против HBV, такими как антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в WO2012/145697 и WO 2014/179629, или молекулы миРНК, описанные в WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520 и WO 2013/159109.

При введении олигонуклеотидов или конъюгатов олигонуклеотидов по данному изобретению в комбинированных терапиях с другими агентами, они могут вводиться индивиду последовательно или сопутствующе. В качестве альтернативы, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать комбинацию олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по настоящему изобретению в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, как описано в данном документе, и с другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в данной области.

ВОПЛОЩЕНИЯ

Следующие воплощения настоящего изобретения можно использовать в комбинации с любыми другими воплощениями, описанными в данном документе.

1. Антисмысловой олигонуклеотид, который содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, способный уменьшать экспрессию PD-L1.

2. Олигонуклеотид по воплощению 1, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1.

3. Олигонуклеотид по воплощению 1 или 2, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.

4. Олигонуклеотид по воплощениям 1-3, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна области в пределах положения 1 и 15720 на SEQ ID NO: 1.

5. Олигонуклеотид по воплощениям 1-4, где данный олигонуклеотид способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, с ΔG° меньше -41,8 кДж.

6. Олигонуклеотид по воплощениям 1-5, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107, 15317-15720, 15317-18083, 15317-19511 и 18881-19494 на SEQ ID NO: 1.

7. Олигонуклеотид по воплощению 6, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

8. Олигонуклеотид по воплощениям 2-7, в котором нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.

9. Олигонуклеотид по воплощению 8, где РНК представляет собой мРНК.

10. Олигонуклеотид по воплощению 9, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.

11. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из по меньшей мере 14 непрерывных нуклеотидов, в частности, из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 непрерывных нуклеотидов.

12. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов.

13. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 14-35 нуклеотидов в длину.

14. Олигонуклеотид по воплощению 13, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 18-22 нуклеотидов в длину.

15. Олигонуклеотид по воплощениям 1-14, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.

16. Олигонуклеотид по воплощениям 1-15, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A7, A26, A43, A119, A142, A159, A160, A163, A169, A178, A179, A180, A189, A201, A202, A204, A214, A221, A224, A226, A243, A254, A258, 269, A274, A350, A360, A364, A365, A370, A372, A381, A383, A386, A389, A400, A427, A435 и A438.

17. Олигонуклеотид по воплощению 16, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A221, A360, A180, A160 и A269.

18. Олигонуклеотид по воплощениям 1-17, где данный олигонуклеотид не является миРНК и не является комплементарным самому себе.

19. Олигонуклеотид по воплощениям 1-18, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5-743 или 771.

20. Олигонуклеотид по воплощениям 1-19, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

21. Олигонуклеотид по воплощениям 1-20, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 466, 640, 342, 287 и 566.

22. Олигонуклеотид по воплощениям 1-21, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.

23. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

24. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет два несоответствия по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

25. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

26. Олигонуклеотид по воплощениям 1-25, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.

27. Олигонуклеотид по воплощению 26, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинные модифицированные нуклеозиды.

28. Олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

29. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбран из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA и LNA.

30. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид LNA.

31. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.

32. Олигонуклеотид по воплощению 31, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой бета-D-окси-LNA.

33. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой тио-LNA.

34. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой амино-LNA.

35. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой сЕТ.

36. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой ENA.

37. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.

38. Олигонуклеотид по воплощениям 30-37, в котором, помимо модифицированного нуклеозида LNA, имеется по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

39. Олигонуклеотид по воплощению 38, в котором 2'-замещенный модифицированный нуклеозид выбран из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA.

40. Олигонуклеотид по любому из воплощений 1-39, где данный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

41. Олигонуклеотид по воплощению 40, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является устойчивой к нуклеазе.

42. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи или боранофосфатные межнуклеозидные связи.

43. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

44. Олигонуклеотид по воплощениям 1-43, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

45. Олигонуклеотид по воплощению 44, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.

46. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', где области F и F' независимо содержат или состоят из 1-7 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н.

47. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где гэпмер имеет формулу 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и области D' или D'' содержат 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

48. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором D' или D'' являются опционными.

49. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором область D' состоит из двух нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

50. Олигонуклеотид по воплощению 49, в котором нуклеозиды, связанные фосфодиэфирной связью, представляют собой са (цитидин-аденозин).

51. Олигонуклеотид по воплощению 46 или 47, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и LNA.

52. Олигонуклеотид по воплощениям 46-51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.

53. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.

54. Олигонуклеотид по воплощению 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.

55. Олигонуклеотид по воплощениям 52-54, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды окси-LNA.

56. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором по меньшей мере одна из областей F и F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.

57. Олигонуклеотид по воплощениям 46-56, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н, в области G независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированной ДНК, ANA, 2'-F-ANA и UNA.

58. Олигонуклеотид по воплощению 57, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК и/или альфа-L-LNA.

59. Олигонуклеотид по воплощению 57 или 58, в котором область G состоит из по меньшей мере 75% нуклеозидов ДНК.

60. Олигонуклеотид по воплощениям 1-59, где данный олигонуклеотид выбран из любого олигонуклеотида CMP ID NO: от 5_1 до 743_1 и 771_1 (Таблица 5).

61. Олигонуклеотид по воплощениям 1-60, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 и 735_1.

62. Олигонуклеотид по воплощениям 1-61, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 287_1, 342_1, 466_1, 640_1, 566_1, 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

63. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий:

а. олигонуклеотид по любому из воплощений 1-62 (область А); и

б. по меньшей мере одну конъюгатную группировку (область С), ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.

64. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.

65. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63 или 64, в котором конъюгатная группировка представляет собой углеводсодержащую группировку.

66. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 65, в котором углеводная конъюгатная группировка содержит по меньшей мере одну группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду по любому из пп. 1-62.

67. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина.

68. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66 или 67, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной.

69. Конъюгат олигомера по воплощению 68, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, состоит из двух-четырех концевых GalNAc группировок, ПЭГ спейсера, связывающего каждую GalNAc группировку с разветвляющей молекулой.

70. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-69, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, представляет собой трехвалентную N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку.

71. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-70, в котором конъюгатная группировка выбрана из одной из трехвалентных GalNAc группировок на Фиг. 1.

72. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 71, в котором конъюгатная группировка представляет собой трехвалентную GalNAc группировку на Фиг. 3.

73. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63-72, в котором присутствует линкер между олигонуклеотидом или непрерывной олигонуклеотидной последовательностью и конъюгатной группировкой.

74. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 73, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер (область В).

75. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.

76. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74 или 75, в котором физиологически лабильный линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей.

77. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 76, в котором физиологически лабильный линкер является эквивалентным области D' или D'', присутствующей в воплощении 47-50.

78. Конъюгат олигонуклеотида по любому из воплощений 63-77, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из CMP ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

79. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 78, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из конъюгата олигонуклеотида, представленного на Фиг. 4, 5, 6, 7 и 8.

80. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 63-76, который демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени или улучшенное клеточное распределение между печенью и селезенкой, или улучшенное клеточное поглощение в печени конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

81. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.

82. Способ изготовления олигонуклеотида по воплощению 1-62, включающий проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев, образуя, посредством этого, ковалентно связанные смежные нуклеотидные звенья, содержащиеся в олигонуклеотиде.

83. Способ по воплощению 82, дополнительно включающий проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с ненуклеотидной конъюгатной группировкой.

84. Способ изготовления композиции по воплощению 81, включающий смешивание олигонуклеотида с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью и/или адъювантом.

85. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспресирует PD-L1, причем указанный способ включает введение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 в эффективном количестве в указанную клетку.

86. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

87. Способ восстановления иммунитета против вируса или паразита, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества конъюгата олигонуклеотида по воплощениям 63-80 или олигонуклеотида по воплощениям 1-62, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, инфицированному вирусом или паразитом.

88. Способ по воплощению 87, причем восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

89. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

90. Применение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

91. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

92. Применение по воплощению 91, где восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

93. Применение по воплощению 92, где антиген HBV представляет собой HBsAg.

94. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-93, где заболевание ассоциировано с активностью PD-L1 in vivo.

95. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-94, где заболевание ассоциировано с повышенной экспрессией PD-L1 в антигенпрезентирующей клетке.

96. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 95, где экспрессия PD-L1 снижается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без обработки или до обработки олигонуклеотидом по воплощениям 1-62 или конъюгатом по воплощениям 63-80, или фармацевтической композицией по воплощению 81.

97. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание выбрано из вирусной инфекции печени или паразитарных инфекций.

98. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где вирусная инфекция представляет собой HBV, HCV или HDV.

99. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание представляет собой хроническую инфекцию HBV.

100. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где паразитарная инфекция представляет собой малярию, токсоплазмоз, лейшманиоз или трипаносомоз.

101. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-100, где субъект представляет собой млекопитающее.

102. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 101, где млекопитающее представляет собой человека.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Мотивы последовательностей и олигонуклеотидные соединения

Таблица 5: список последовательностей олигонуклеотидных мотивов (указанных по SEQ ID NO), нацеленных на транскрипт человеческого PD-L1 (SEQ ID NO: 1), их конструкции, а также специфичные антисмысловые олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе мотива последовательности.

SEQ ID NO Мотив последовательности Конструкция Олигонуклеотидное соединение CMP ID NO ID NO начала: 1 dG 5 taattggctctactgc 2-11-3 TAattggctctacTGC 5_1 236 -20 6 tcgcataagaatgact 4-10-2 TCGCataagaatgaCT 6_1 371 -19 7 tgaacacacagtcgca 2-12-2 TGaacacacagtcgCA 7_1 382 -19 8 ctgaacacacagtcgc 3-10-3 CTGaacacacagtCGC 8_1 383 -22 9 tctgaacacacagtcg 3-11-2 TCTgaacacacagtCG 9_1 384 -19 10 ttctgaacacacagtc 3-11-2 TTCtgaacacacagTC 10_1 385 -17 11 acaagtcatgttacta 2-11-3 ACaagtcatgttaCTA 11_1 463 -16 12 acacaagtcatgttac 2-12-2 ACacaagtcatgttAC 12_1 465 -14 13 cttacttagatgctgc 2-11-3 CTtacttagatgcTGC 13_1 495 -20 14 acttacttagatgctg 2-11-3 ACttacttagatgCTG 14_1 496 -18 15 gacttacttagatgct 3-11-2 GACttacttagatgCT 15_1 497 -19 16 agacttacttagatgc 2-11-3 AGacttacttagaTGC 16_1 498 -18 17 gcaggaagagacttac 3-10-3 GCAggaagagactTAC 17_1 506 -20 18 aataaattccgttcagg 4-9-4 AATAaattccgttCAGG 18_1 541 -22 19 gcaaataaattccgtt 3-10-3 GCAaataaattccGTT 19_2 545 -18 19 gcaaataaattccgtt 4-8-4 GCAAataaattcCGTT 19_1 545 -20 20 agcaaataaattccgt 4-9-3 AGCAaataaattcCGT 20_1 546 -20 21 cagagcaaataaattcc 4-10-3 CAGAgcaaataaatTCC 21_1 548 -21 22 tggacagagcaaataaat 4-11-3 TGGAcagagcaaataAAT 22_1 551 -19 23 atggacagagcaaata 4-8-4 ATGGacagagcaAATA 23_1 554 -20 24 cagaatggacagagca 2-11-3 CAgaatggacagaGCA 24_1 558 -21 25 ttctcagaatggacag 3-11-2 TTCtcagaatggacAG 25_1 562 -17 26 ctgaactttgacatag 4-8-4 CTGAactttgacATAG 26_1 663 -20 27 aagacaaacccagactga 2-13-3 AAgacaaacccagacTGA 27_1 675 -21 28 tataagacaaacccagac 4-10-4 TATAagacaaacccAGAC 28_1 678 -22 29 ttataagacaaacccaga 4-10-4 TTATaagacaaaccCAGA 29_1 679 -23 30 tgttataagacaaaccc 4-10-3 TGTTataagacaaaCCC 30_1 682 -22 31 tagaacaatggtacttt 4-9-4 TAGAacaatggtaCTTT 31_1 708 -20 32 gtagaacaatggtact 4-10-2 GTAGaacaatggtaCT 32_1 710 -19 33 aggtagaacaatggta 3-10-3 AGGtagaacaatgGTA 33_1 712 -19 34 aagaggtagaacaatgg 4-9-4 AAGAggtagaacaATGG 34_1 714 -21 35 gcatccacagtaaatt 2-12-2 GCatccacagtaaaTT 35_1 749 -17 36 gaaggttatttaattc 2-11-3 GAaggttatttaaTTC 36_1 773 -13 37 ctaatcgaatgcagca 4-9-3 CTAAtcgaatgcaGCA 37_1 805 -22 38 tacccaatctaatcga 3-10-3 TACccaatctaatCGA 38_1 813 -20 39 tagttacccaatctaa 3-10-3 TAGttacccaatcTAA 39_1 817 -19 40 catttagttacccaat 3-10-3 CATttagttacccAAT 40_1 821 -18 41 tcatttagttacccaa 3-10-3 TCAtttagttaccCAA 41_1 822 -19 42 ttcatttagttaccca 2-10-4 TTcatttagttaCCCA 42_1 823 -22 43 gaattaatttcatttagt 4-10-4 GAATtaatttcattTAGT 43_1 829 -19 44 cagtgaggaattaattt 4-9-4 CAGTgaggaattaATTT 44_1 837 -20 45 ccaacagtgaggaatt 4-8-4 CCAAcagtgaggAATT 45_1 842 -21 46 cccaacagtgaggaat 3-10-3 CCCaacagtgaggAAT 46_1 843 -22 47 tatacccaacagtgagg 2-12-3 TAtacccaacagtgAGG 47_1 846 -21 48 ttatacccaacagtgag 2-11-4 TTatacccaacagTGAG 48_1 847 -21 49 tttatacccaacagtga 3-11-3 TTTatacccaacagTGA 49_1 848 -21 50 cctttatacccaacag 3-10-3 CCTttatacccaaCAG 50_1 851 -23 51 taacctttatacccaa 4-8-4 TAACctttatacCCAA 51_1 854 -22 52 aataacctttataccca 3-10-4 AATaacctttataCCCA 52_1 855 -23 53 gtaaataacctttata 3-11-2 GTAaataacctttaTA 53_1 859 -14 54 actgtaaataacctttat 4-10-4 ACTGtaaataacctTTAT 54_1 860 -20 55 atatatatgcaatgag 3-11-2 ATAtatatgcaatgAG 55_1 903 -14 56 agatatatatgcaatg 2-12-2 AGatatatatgcaaTG 56_1 905 -12 57 gagatatatatgcaat 3-10-3 GAGatatatatgcAAT 57_1 906 -15 58 ccagagatatatatgc 2-11-3 CCagagatatataTGC 58_1 909 -19 59 caatattccagagatat 4-9-4 CAATattccagagATAT 59_1 915 -20 60 gcaatattccagagata 4-10-3 GCAAtattccagagATA 60_1 916 -22 61 agcaatattccagagat 3-11-3 AGCaatattccagaGAT 61_1 917 -22 62 cagcaatattccagag 3-9-4 CAGcaatattccAGAG 62_1 919 -22 63 aatcagcaatattccag 4-9-4 AATCagcaatattCCAG 63_1 921 -23 64 acaatcagcaatattcc 4-9-4 ACAAtcagcaataTTCC 64_1 923 -21 65 actaagtagttacacttct 2-14-3 ACtaagtagttacactTCT 65_1 957 -20 66 ctaagtagttacacttc 4-11-2 CTAAgtagttacactTC 66_1 958 -18 67 gactaagtagttacactt 3-12-3 GACtaagtagttacaCTT 67_1 959 -20 68 tgactaagtagttaca 3-9-4 TGActaagtagtTACA 68_1 962 -19 69 ctttgactaagtagtta 4-10-3 CTTTgactaagtagTTA 69_1 964 -19 70 ctctttgactaagtag 3-10-3 CTCtttgactaagTAG 70_1 967 -19 71 gctctttgactaagta 4-10-2 GCTCtttgactaagTA 71_1 968 -21 72 ccttaaatactgttgac 2-11-4 CCttaaatactgtTGAC 72_1 1060 -20 73 cttaaatactgttgac 2-12-2 CTtaaatactgttgAC 73_1 1060 -13 74 tccttaaatactgttg 3-10-3 TCCttaaatactgTTG 74_1 1062 -18 75 tctccttaaatactgtt 4-11-2 TCTCcttaaatactgTT 75_1 1063 -19 76 tatcatagttctcctt 2-10-4 TAtcatagttctCCTT 76_1 1073 -21 77 agtatcatagttctcc 3-10-3 AGTatcatagttcTCC 77_1 1075 -22 78 gagtatcatagttctc 2-11-3 GAgtatcatagttCTC 78_1 1076 -18 79 agagtatcatagttct 2-10-4 AGagtatcatagTTCT 79_1 1077 -18 79 agagtatcatagttct 3-10-3 AGAgtatcatagtTCT 79_2 1077 -19 80 cagagtatcatagttc 3-10-3 CAGagtatcatagTTC 80_1 1078 -18 81 ttcagagtatcatagt 4-10-2 TTCAgagtatcataGT 81_1 1080 -18 82 cttcagagtatcatag 3-9-4 CTTcagagtatcATAG 82_1 1081 -19 83 ttcttcagagtatcata 4-11-2 TTCTtcagagtatcaTA 83_1 1082 -19 84 tttcttcagagtatcat 3-10-4 TTTcttcagagtaTCAT 84_1 1083 -20 85 gagaaaggctaagttt 4-9-3 GAGAaaggctaagTTT 85_1 1099 -19 86 gacactcttgtacatt 2-10-4 GAcactcttgtaCATT 86_1 1213 -19 87 tgagacactcttgtaca 2-13-2 TGagacactcttgtaCA 87_1 1215 -18 88 tgagacactcttgtac 2-11-3 TGagacactcttgTAC 88_1 1216 -18 89 ctttattaaactccat 2-10-4 CTttattaaactCCAT 89_1 1266 -18 90 accaaactttattaaa 4-10-2 ACCAaactttattaAA 90_1 1272 -14 91 aaacctctactaagtg 4-10-2 AAACctctactaagTG 91_1 1288 -16 92 agattaagacagttga 2-11-3 AGattaagacagtTGA 92_1 1310 -16 93 aagtaggagcaagaggc 2-12-3 AAgtaggagcaagaGGC 93_1 1475 -22 94 aaagtaggagcaagagg 4-10-3 AAAGtaggagcaagAGG 94_1 1476 -20 95 gttaagcagccaggag 2-12-2 GTtaagcagccaggAG 95_1 1806 -20 96 agggtaggatgggtag 2-12-2 AGggtaggatgggtAG 96_1 1842 -20 97 aagggtaggatgggta 3-11-2 AAGggtaggatgggTA 97_1 1843 -20 98 caagggtaggatgggt 2-12-2 CAagggtaggatggGT 98_2 1844 -20 98 caagggtaggatgggt 3-11-2 CAAgggtaggatggGT 98_1 1844 -21 99 ccaagggtaggatggg 2-12-2 CCaagggtaggatgGG 99_1 1845 -22 100 tccaagggtaggatgg 2-12-2 TCcaagggtaggatGG 100_1 1846 -20 101 cttccaagggtaggat 4-10-2 CTTCcaagggtaggAT 101_1 1848 -21 102 atcttccaagggtagga 3-12-2 ATCttccaagggtagGA 102_1 1849 -22 103 agaagtgatggctcatt 2-11-4 AGaagtgatggctCATT 103_1 1936 -21 104 aagaagtgatggctcat 3-10-4 AAGaagtgatggcTCAT 104_1 1937 -21 105 gaagaagtgatggctca 3-11-3 GAAgaagtgatggcTCA 105_1 1938 -21 106 atgaaatgtaaactggg 4-9-4 ATGAaatgtaaacTGGG 106_1 1955 -21 107 caatgaaatgtaaactgg 4-10-4 CAATgaaatgtaaaCTGG 107_1 1956 -20 108 gcaatgaaatgtaaactg 4-10-4 GCAAtgaaatgtaaACTG 108_1 1957 -20 109 agcaatgaaatgtaaact 4-10-4 AGCAatgaaatgtaAACT 109_1 1958 -20 110 gagcaatgaaatgtaaac 4-10-4 GAGCaatgaaatgtAAAC 110_1 1959 -19 111 tgaattcccatatccga 2-12-3 TGaattcccatatcCGA 111_1 1992 -22 112 agaattatgaccatat 2-11-3 AGaattatgaccaTAT 112_1 2010 -15 113 aggtaagaattatgacc 3-10-4 AGGtaagaattatGACC 113_1 2014 -21 114 tcaggtaagaattatgac 4-10-4 TCAGgtaagaattaTGAC 114_1 2015 -22 115 cttcaggtaagaattatg 4-10-4 CTTCaggtaagaatTATG 115_1 2017 -21 116 tcttcaggtaagaatta 4-9-4 TCTTcaggtaagaATTA 116_1 2019 -20 117 cttcttcaggtaagaat 4-9-4 CTTCttcaggtaaGAAT 117_1 2021 -21 118 tcttcttcaggtaagaa 4-10-3 TCTTcttcaggtaaGAA 118_1 2022 -20 119 tcttcttcaggtaaga 3-10-3 TCTtcttcaggtaAGA 119_1 2023 -20 120 tggtctaagagaagaag 3-10-4 TGGtctaagagaaGAAG 120_1 2046 -20 121 gttggtctaagagaag 4-9-3 GTTGgtctaagagAAG 121_1 2049 -19 123 cagttggtctaagagaa 2-11-4 CAgttggtctaagAGAA 123_1 2050 -20 124 gcagttggtctaagagaa 3-13-2 GCAgttggtctaagagAA 124_1 2050 -22 122 agttggtctaagagaa 3-9-4 AGTtggtctaagAGAA 122_1 2050 -20 126 gcagttggtctaagaga 2-13-2 GCagttggtctaagaGA 126_1 2051 -21 125 cagttggtctaagaga 4-10-2 CAGTtggtctaagaGA 125_1 2051 -21 127 gcagttggtctaagag 2-11-3 GCagttggtctaaGAG 127_1 2052 -21 128 ctcatatcagggcagt 2-10-4 CTcatatcagggCAGT 128_1 2063 -24 129 cacacatgttctttaac 4-11-2 CACAcatgttctttaAC 129_1 2087 -18 130 taaatacacacatgttct 3-11-4 TAAatacacacatgTTCT 130_1 2092 -19 131 gtaaatacacacatgttc 4-11-3 GTAAatacacacatgTTC 131_1 2093 -19 132 tgtaaatacacacatgtt 4-10-4 TGTAaatacacacaTGTT 132_1 2094 -22 133 gatcatgtaaatacacac 4-10-4 GATCatgtaaatacACAC 133_1 2099 -20 134 agatcatgtaaatacaca 4-10-4 AGATcatgtaaataCACA 134_1 2100 -21 135 caaagatcatgtaaatacac 4-12-4 CAAAgatcatgtaaatACAC 135_1 2101 -19 136 acaaagatcatgtaaataca 4-12-4 ACAAagatcatgtaaaTACA 136_1 2102 -20 137 gaatacaaagatcatgta 4-10-4 GAATacaaagatcaTGTA 137_1 2108 -20 138 agaatacaaagatcatgt 4-10-4 AGAAtacaaagatcATGT 138_1 2109 -20 139 cagaatacaaagatcatg 4-10-4 CAGAatacaaagatCATG 139_1 2110 -21 140 gcagaatacaaagatca 4-9-4 GCAGaatacaaagATCA 140_1 2112 -22 141 aggcagaatacaaagat 4-11-2 AGGCagaatacaaagAT 141_1 2114 -19 142 aaggcagaatacaaaga 4-10-3 AAGGcagaatacaaAGA 142_1 2115 -19 143 attagtgagggacgaa 3-10-3 ATTagtgagggacGAA 143_1 2132 -18 144 cattagtgagggacga 2-11-3 CAttagtgagggaCGA 144_1 2133 -20 145 gagggtgatggattag 2-11-3 GAgggtgatggatTAG 145_1 2218 -19 146 ttaggagtaataaagg 2-10-4 TTaggagtaataAAGG 146_1 2241 -14 147 ttaatgaatttggttg 3-11-2 TTAatgaatttggtTG 147_1 2263 -13 148 ctttaatgaatttggt 2-12-2 CTttaatgaatttgGT 148_1 2265 -14 149 catggattacaactaa 4-10-2 CATGgattacaactAA 149_1 2322 -16 150 tcatggattacaacta 2-11-3 TCatggattacaaCTA 150_1 2323 -16 151 gtcatggattacaact 3-11-2 GTCatggattacaaCT 151_1 2324 -18 152 cattaaatctagtcat 2-10-4 CAttaaatctagTCAT 152_1 2335 -16 153 gacattaaatctagtca 4-10-3 GACAttaaatctagTCA 153_1 2336 -19 154 agggacattaaatcta 4-10-2 AGGGacattaaatcTA 154_1 2340 -18 155 caaagcattataacca 4-9-3 CAAAgcattataaCCA 155_1 2372 -18 156 acttactaggcagaag 2-10-4 ACttactaggcaGAAG 156_1 2415 -19 157 cagagttaactgtaca 4-10-2 CAGAgttaactgtaCA 157_1 2545 -20 158 ccagagttaactgtac 4-10-2 CCAGagttaactgtAC 158_1 2546 -20 159 gccagagttaactgta 2-12-2 GCcagagttaactgTA 159_1 2547 -20 160 tgggccagagttaact 2-12-2 TGggccagagttaaCT 160_1 2550 -21 161 cagcatctatcagact 2-12-2 CAgcatctatcagaCT 161_1 2576 -19 162 tgaaataacatgagtcat 3-11-4 TGAaataacatgagTCAT 162_1 2711 -19 163 gtgaaataacatgagtc 3-10-4 GTGaaataacatgAGTC 163_1 2713 -19 164 tctgtttatgtcactg 4-10-2 TCTGtttatgtcacTG 164_1 2781 -20 165 gtctgtttatgtcact 4-10-2 GTCTgtttatgtcaCT 165_1 2782 -22 166 tggtctgtttatgtca 2-10-4 TGgtctgtttatGTCA 166_1 2784 -21 167 ttggtctgtttatgtc 4-10-2 TTGGtctgtttatgTC 167_1 2785 -20 168 tcacccattgtttaaa 2-12-2 TCacccattgtttaAA 168_1 2842 -15 169 ttcagcaaatattcgt 2-10-4 TTcagcaaatatTCGT 169_1 2995 -17 170 gtgtgttcagcaaatat 3-10-4 GTGtgttcagcaaATAT 170_1 2999 -21 171 tctattgttaggtatc 3-10-3 TCTattgttaggtATC 171_1 3053 -18 172 attgcccatcttactg 2-12-2 ATtgcccatcttacTG 172_1 3118 -19 173 tattgcccatcttact 3-11-2 TATtgcccatcttaCT 173_1 3119 -21 174 aaatattgcccatctt 2-11-3 AAatattgcccatCTT 174_1 3122 -17 175 ataaccttatcataca 3-11-2 ATAaccttatcataCA 175_1 3174 -16 176 tataaccttatcatac 2-11-3 TAtaaccttatcaTAC 176_1 3175 -14 177 ttataaccttatcata 3-11-2 TTAtaaccttatcaTA 177_1 3176 -14 178 tttataaccttatcat 3-10-3 TTTataaccttatCAT 178_1 3177 -16 179 actgctattgctatct 2-11-3 ACtgctattgctaTCT 179_1 3375 -19 180 aggactgctattgcta 2-11-3 AGgactgctattgCTA 180_1 3378 -21 181 gaggactgctattgct 3-11-2 GAGgactgctattgCT 181_1 3379 -22 182 acgtagaataataaca 2-12-2 ACgtagaataataaCA 182_1 3561 -11 183 ccaagtgatataatgg 2-10-4 CCaagtgatataATGG 183_1 3613 -19 184 ttagcagaccaagtga 2-10-4 TTagcagaccaaGTGA 184_1 3621 -21 185 gtttagcagaccaagt 2-12-2 GTttagcagaccaaGT 185_1 3623 -19 186 tgacagtgattatatt 2-12-2 TGacagtgattataTT 186_1 3856 -13 187 tgtccaagatattgac 4-10-2 TGTCcaagatattgAC 187_1 3868 -18 188 gaatatcctagattgt 3-10-3 GAAtatcctagatTGT 188_1 4066 -18 189 caaactgagaatatcc 2-11-3 CAaactgagaataTCC 189_1 4074 -16 190 gcaaactgagaatatc 3-11-2 GCAaactgagaataTC 190_1 4075 -16 191 tcctattacaatcgta 3-11-2 TCCtattacaatcgTA 191_1 4214 -19 192 ttcctattacaatcgt 4-10-2 TTCCtattacaatcGT 192_1 4215 -19 193 actaatgggaggattt 2-12-2 ACtaatgggaggatTT 193_1 4256 -15 194 tagttcagagaataag 2-12-2 TAgttcagagaataAG 194_1 4429 -13 195 taacatatagttcaga 2-11-3 TAacatatagttcAGA 195_1 4436 -15 196 ataacatatagttcag 3-11-2 ATAacatatagttcAG 196_1 4437 -14 197 cataacatatagttca 2-12-2 CAtaacatatagttCA 197_1 4438 -13 198 tcataacatatagttc 2-12-2 TCataacatatagtTC 198_1 4439 -12 199 tagctcctaacaatca 4-10-2 TAGCtcctaacaatCA 199_1 4507 -22 200 ctccaatctttgtata 4-10-2 CTCCaatctttgtaTA 200_1 4602 -20 201 tctccaatctttgtat 4-10-2 TCTCcaatctttgtAT 201_1 4603 -19 202 tctatttcagccaatc 2-12-2 TCtatttcagccaaTC 202_1 4708 -17 203 cggaagtcagagtgaa 3-10-3 CGGaagtcagagtGAA 203_1 4782 -19 204 ttaagcatgaggaata 4-10-2 TTAAgcatgaggaaTA 204_1 4798 -16 205 tgattgagcacctctt 3-10-3 TGAttgagcacctCTT 205_1 4831 -22 206 gactaattatttcgtt 3-11-2 GACtaattatttcgTT 206_1 4857 -15 207 tgactaattatttcgt 3-10-3 TGActaattatttCGT 207_1 4858 -17 208 gtgactaattatttcg 3-10-3 GTGactaattattTCG 208_1 4859 -17 209 ctgcttgaaatgtgac 4-10-2 CTGCttgaaatgtgAC 209_1 4870 -20 210 cctgcttgaaatgtga 2-11-3 CCtgcttgaaatgTGA 210_1 4871 -21 211 atcctgcttgaaatgt 2-10-4 ATcctgcttgaaATGT 211_1 4873 -20 212 attataaatctattct 3-10-3 ATTataaatctatTCT 212_1 5027 -13 213 gctaaatactttcatc 2-11-3 GCtaaatactttcATC 213_1 5151 -16 214 cattgtaacataccta 2-10-4 CAttgtaacataCCTA 214_1 5251 -19 215 gcattgtaacatacct 2-12-2 GCattgtaacatacCT 215_1 5252 -18 216 taatattgcaccaaat 2-12-2 TAatattgcaccaaAT 216_1 5295 -13 217 gataatattgcaccaa 2-11-3 GAtaatattgcacCAA 217_1 5297 -16 218 agataatattgcacca 2-12-2 AGataatattgcacCA 218_1 5298 -16 219 gccaagaagataatat 2-10-4 GCcaagaagataATAT 219_1 5305 -17 220 cacagccacataaact 4-10-2 CACAgccacataaaCT 220_1 5406 -21 221 ttgtaattgtggaaac 2-12-2 TTgtaattgtggaaAC 221_1 5463 -12 222 tgacttgtaattgtgg 2-11-3 TGacttgtaattgTGG 222_1 5467 -18 223 tctaactgaaatagtc 2-12-2 TCtaactgaaatagTC 223_1 5503 -13 224 gtggttctaactgaaa 3-11-2 GTGgttctaactgaAA 224_1 5508 -16 225 caatatgggacttggt 2-12-2 CAatatgggacttgGT 225_1 5522 -18 226 atgacaatatgggact 3-11-2 ATGacaatatgggaCT 226_1 5526 -17 227 tatgacaatatgggac 4-10-2 TATGacaatatgggAC 227_1 5527 -17 228 atatgacaatatggga 4-10-2 ATATgacaatatggGA 228_1 5528 -17 229 cttcacttaataatta 2-11-3 CTtcacttaataaTTA 229_1 5552 -13 230 ctgcttcacttaataa 4-10-2 CTGCttcacttaatAA 230_1 5555 -18 231 aagactgcttcactta 2-11-3 AAgactgcttcacTTA 231_1 5559 -17 232 gaatgccctaattatg 4-10-2 GAATgccctaattaTG 232_1 5589 -19 233 tggaatgccctaatta 3-11-2 TGGaatgccctaatTA 233_1 5591 -19 234 gcaaatgccagtaggt 3-11-2 GCAaatgccagtagGT 234_1 5642 -23 235 ctaatggaaggatttg 3-11-2 CTAatggaaggattTG 235_1 5673 -15 236 aatatagaacctaatg 2-12-2 AAtatagaacctaaTG 236_1 5683 -10 237 gaaagaatagaatgtt 3-10-3 GAAagaatagaatGTT 237_1 5769 -12 238 atgggtaatagattat 3-11-2 ATGggtaatagattAT 238_1 5893 -15 239 gaaagagcacagggtg 2-12-2 GAaagagcacagggTG 239_1 6103 -18 240 ctacatagagggaatg 4-10-2 CTACatagagggaaTG 240_1 6202 -18 241 gcttcctacatagagg 2-10-4 GCttcctacataGAGG 241_1 6207 -24 242 tgcttcctacatagag 4-10-2 TGCTtcctacatagAG 242_1 6208 -22 243 tgggcttgaaatatgt 2-11-3 TGggcttgaaataTGT 243_1 6417 -19 244 cattatatttaagaac 3-11-2 CATtatatttaagaAC 244_1 6457 -11 245 tcggttatgttatcat 2-10-4 TCggttatgttaTCAT 245_1 6470 -19 246 cactttatctggtcgg 2-10-4 CActttatctggTCGG 246_1 6482 -22 247 aaattggcacagcgtt 3-10-3 AAAttggcacagcGTT 247_1 6505 -18 248 accgtgacagtaaatg 4-9-3 ACCGtgacagtaaATG 248_1 6577 -20 249 tgggaaccgtgacagta 2-13-2 TGggaaccgtgacagTA 249_1 6581 -22 250 ccacatataggtcctt 2-11-3 CCacatataggtcCTT 250_1 6597 -21 251 catattgctaccatac 2-11-3 CAtattgctaccaTAC 251_1 6617 -18 252 tcatattgctaccata 3-10-3 TCAtattgctaccATA 252_1 6618 -19 253 caattgtcatattgct 4-8-4 CAATtgtcatatTGCT 253_1 6624 -21 254 cattcaattgtcatattg 3-12-3 CATtcaattgtcataTTG 254_1 6626 -18 255 tttctactgggaatttg 4-9-4 TTTCtactgggaaTTTG 255_1 6644 -20 256 caattagtgcagccag 3-10-3 CAAttagtgcagcCAG 256_1 6672 -21 257 gaataatgttcttatcc 4-10-3 GAATaatgttcttaTCC 257_1 6704 -20 258 cacaaattgaataatgttct 4-13-3 CACAaattgaataatgtTCT 258_1 6709 -20 259 catgcacaaattgaataat 4-11-4 CATGcacaaattgaaTAAT 259_1 6714 -20 260 atcctgcaatttcacat 3-11-3 ATCctgcaatttcaCAT 260_1 6832 -22 261 ccaccatagctgatca 2-12-2 CCaccatagctgatCA 261_1 6868 -22 262 accaccatagctgatca 2-12-3 ACcaccatagctgaTCA 262_1 6868 -23 263 caccaccatagctgatc 2-13-2 CAccaccatagctgaTC 263_1 6869 -21 264 tagtcggcaccaccat 2-12-2 TAgtcggcaccaccAT 264_1 6877 -22 265 cttgtagtcggcaccac 1-14-2 CttgtagtcggcaccAC 265_1 6880 -21 266 cttgtagtcggcacca 1-13-2 CttgtagtcggcacCA 266_1 6881 -21 267 cgcttgtagtcggcac 2-12-2 CGcttgtagtcggcAC 267_1 6883 -21 268 tcaataaagatcaggc 3-11-2 TCAataaagatcagGC 268_1 6942 -17 269 tggacttacaagaatg 2-12-2 TGgacttacaagaaTG 269_1 6986 -14 270 atggacttacaagaat 3-11-2 ATGgacttacaagaAT 270_1 6987 -15 271 gctcaagaaattggat 4-10-2 GCTCaagaaattggAT 271_1 7073 -19 272 tactgtagaacatggc 4-10-2 TACTgtagaacatgGC 272_1 7133 -21 273 gcaattcatttgatct 4-9-3 GCAAttcatttgaTCT 273_1 7239 -20 274 tgaagggaggagggacac 2-14-2 TGaagggaggagggacAC 274_1 7259 -20 275 agtggtgaagggaggag 2-13-2 AGtggtgaagggaggAG 275_1 7265 -21 276 tagtggtgaagggaggag 2-14-2 TAgtggtgaagggaggAG 276_1 7265 -21 277 atagtggtgaagggaggag 1-16-2 AtagtggtgaagggaggAG 277_1 7265 -20 278 tagtggtgaagggagga 2-13-2 TAgtggtgaagggagGA 278_1 7266 -21 279 atagtggtgaagggagga 2-14-2 ATagtggtgaagggagGA 279_1 7266 -21 280 tagtggtgaagggagg 3-11-2 TAGtggtgaagggaGG 280_1 7267 -21 281 atagtggtgaagggagg 3-12-2 ATAgtggtgaagggaGG 281_1 7267 -22 282 gatagtggtgaagggagg 2-14-2 GAtagtggtgaagggaGG 282_1 7267 -21 283 atagtggtgaagggag 4-10-2 ATAGtggtgaagggAG 283_1 7268 -20 284 gatagtggtgaagggag 2-12-3 GAtagtggtgaaggGAG 284_1 7268 -21 285 gagatagtggtgaagg 2-10-4 GAgatagtggtgAAGG 285_1 7271 -20 286 catgggagatagtggt 4-10-2 CATGggagatagtgGT 286_1 7276 -22 287 acaaataatggttactct 4-10-4 ACAAataatggttaCTCT 287_1 7302 -20 288 acacacaaataatggtta 4-10-4 ACACacaaataatgGTTA 288_1 7306 -20 289 gagggacacacaaataat 3-11-4 GAGggacacacaaaTAAT 289_1 7311 -21 290 atatagagaggctcaa 4-8-4 ATATagagaggcTCAA 290_1 7390 -21 291 ttgatatagagaggct 2-10-4 TTgatatagagaGGCT 291_1 7393 -20 292 gcatttgatatagaga 4-9-3 GCATttgatatagAGA 292_1 7397 -20 293 tttgcatttgatatag 2-11-3 TTtgcatttgataTAG 293_1 7400 -15 294 ctggaagaataggttc 3-11-2 CTGgaagaataggtTC 294_1 7512 -17 295 actggaagaataggtt 4-10-2 ACTGgaagaataggTT 295_1 7513 -18 296 tactggaagaataggt 4-10-2 TACTggaagaatagGT 296_1 7514 -18 297 tggcttatcctgtact 4-10-2 TGGCttatcctgtaCT 297_1 7526 -25 298 atggcttatcctgtac 2-10-4 ATggcttatcctGTAC 298_1 7527 -22 299 tatggcttatcctgta 4-10-2 TATGgcttatcctgTA 299_1 7528 -22 300 gtatggcttatcctgt 3-10-3 GTAtggcttatccTGT 300_1 7529 -23 301 atgaatatatgcccagt 2-11-4 ATgaatatatgccCAGT 301_1 7547 -22 302 gatgaatatatgccca 2-10-4 GAtgaatatatgCCCA 302_1 7549 -22 303 caagatgaatatatgcc 3-10-4 CAAgatgaatataTGCC 303_1 7551 -21 304 gacaacatcagtataga 4-9-4 GACAacatcagtaTAGA 304_1 7572 -22 305 caagacaacatcagta 4-8-4 CAAGacaacatcAGTA 305_1 7576 -20 306 cactcctagttccttt 3-10-3 CACtcctagttccTTT 306_1 7601 -22 307 aacactcctagttcct 3-10-3 AACactcctagttCCT 307_1 7603 -22 308 taacactcctagttcc 2-11-3 TAacactcctagtTCC 308_1 7604 -20 309 ctaacactcctagttc 2-12-2 CTaacactcctagtTC 309_1 7605 -18 310 tgataacataactgtg 2-12-2 TGataacataactgTG 310_1 7637 -13 311 ctgataacataactgt 2-10-4 CTgataacataaCTGT 311_1 7638 -18 312 tttgaactcaagtgac 4-10-2 TTTGaactcaagtgAC 312_1 7654 -16 313 tcctttacttagctag 4-9-3 TCCTttacttagcTAG 313_1 7684 -23 314 gagtttggattagctg 2-11-3 GAgtttggattagCTG 314_1 7764 -20 315 tgggatatgacaggga 2-11-3 TGggatatgacagGGA 315_1 7838 -21 316 tgtgggatatgacagg 4-10-2 TGTGggatatgacaGG 316_1 7840 -22 317 atatggaagggatatc 4-10-2 ATATggaagggataTC 317_1 7875 -17 318 acaggatatggaaggg 3-10-3 ACAggatatggaaGGG 318_1 7880 -21 319 atttcaacaggatatgg 4-9-4 ATTTcaacaggatATGG 319_1 7885 -20 320 gagtaatttcaacagg 2-11-3 GAgtaatttcaacAGG 320_1 7891 -17 321 agggagtaatttcaaca 4-9-4 AGGGagtaatttcAACA 321_1 7893 -22 322 attagggagtaatttca 4-9-4 ATTAgggagtaatTTCA 322_1 7896 -21 323 cttactattagggagt 2-10-4 CTtactattaggGAGT 323_1 7903 -20 324 cagcttactattaggg 2-11-3 CAgcttactattaGGG 324_1 7906 -20 326 atttcagcttactattag 3-11-4 ATTtcagcttactaTTAG 326_1 7908 -20 325 tcagcttactattagg 3-10-3 TCAgcttactattAGG 325_1 7907 -20 327 ttcagcttactattag 2-10-4 TTcagcttactaTTAG 327_1 7908 -17 328 cagatttcagcttact 4-10-2 CAGAtttcagcttaCT 328_1 7913 -21 329 gactacaactagaggg 3-11-2 GACtacaactagagGG 329_1 7930 -19 330 agactacaactagagg 4-10-2 AGACtacaactagaGG 330_1 7931 -19 331 aagactacaactagag 2-12-2 AAgactacaactagAG 331_1 7932 -13 332 atgatttaattctagtcaaa 4-12-4 ATGAtttaattctagtCAAA 332_1 7982 -20 333 tttaattctagtcaaa 3-10-3 TTTaattctagtcAAA 333_1 7982 -12 334 gatttaattctagtca 4-8-4 GATTtaattctaGTCA 334_1 7984 -20 771 tgatttaattctagtca 3-10-4 TGAtttaattctaGTCA 771_1 7984 -20 335 atgatttaattctagtca 4-11-3 ATGAtttaattctagTCA 335_1 7984 -20 336 gatgatttaattctagtca 4-13-2 GATGatttaattctagtCA 336_1 7984 -20 337 gatttaattctagtca 2-10-4 GAtttaattctaGTCA 337_1 7984 -18 338 gatgatttaattctagtc 4-11-3 GATGatttaattctaGTC 338_1 7985 -20 339 tgatttaattctagtc 2-12-2 TGatttaattctagTC 339_1 7985 -13 340 gagatgatttaattcta 4-9-4 GAGAtgatttaatTCTA 340_1 7988 -20 341 gagatgatttaattct 3-10-3 GAGatgatttaatTCT 341_1 7989 -16 342 cagattgatggtagtt 4-10-2 CAGAttgatggtagTT 342_1 8030 -19 343 ctcagattgatggtag 2-10-4 CTcagattgatgGTAG 343_1 8032 -20 344 gttagccctcagattg 3-10-3 GTTagccctcagaTTG 344_1 8039 -23 345 tgtattgttagccctc 2-10-4 TGtattgttagcCCTC 345_1 8045 -24 346 acttgtattgttagcc 2-10-4 ACttgtattgttAGCC 346_1 8048 -22 347 agccagtatcagggac 3-11-2 AGCcagtatcagggAC 347_1 8191 -23 348 ttgacaatagtggcat 2-10-4 TTgacaatagtgGCAT 348_1 8213 -20 349 acaagtggtatcttct 3-10-3 ACAagtggtatctTCT 349_1 8228 -19 350 aatctactttacaagt 4-10-2 AATCtactttacaaGT 350_1 8238 -16 351 cacagtagatgcctgata 2-12-4 CAcagtagatgcctGATA 351_1 8351 -24 352 gaacacagtagatgcc 2-11-3 GAacacagtagatGCC 352_1 8356 -21 353 cttggaacacagtagat 4-11-2 CTTGgaacacagtagAT 353_1 8359 -20 354 atatcttggaacacag 3-10-3 ATAtcttggaacaCAG 354_1 8364 -18 355 tctttaatatcttggaac 3-11-4 TCTttaatatcttgGAAC 355_1 8368 -19 356 tgatttctttaatatcttg 2-13-4 TGatttctttaatatCTTG 356_1 8372 -19 357 tgatgatttctttaatatc 2-13-4 TGatgatttctttaaTATC 357_1 8375 -18 358 aggctaagtcatgatg 3-11-2 AGGctaagtcatgaTG 358_1 8389 -19 359 ttgatgaggctaagtc 4-10-2 TTGAtgaggctaagTC 359_1 8395 -19 360 ccaggattatactctt 3-11-2 CCAggattatactcTT 360_1 8439 -20 361 gccaggattatactct 2-10-4 GCcaggattataCTCT 361_1 8440 -23 362 ctgccaggattatact 3-11-2 CTGccaggattataCT 362_1 8442 -21 363 cagaaacttatactttatg 4-13-2 CAGAaacttatactttaTG 363_1 8473 -19 364 aagcagaaacttatact 4-9-4 AAGCagaaacttaTACT 364_1 8478 -20 365 gaagcagaaacttatact 3-11-4 GAAgcagaaacttaTACT 365_1 8478 -20 366 tggaagcagaaacttatact 3-15-2 TGGaagcagaaacttataCT 366_1 8478 -21 367 tggaagcagaaacttatac 3-13-3 TGGaagcagaaacttaTAC 367_1 8479 -20 368 aagcagaaacttatac 2-11-3 AAgcagaaacttaTAC 368_1 8479 -13 369 tggaagcagaaacttata 3-11-4 TGGaagcagaaactTATA 369_1 8480 -21 370 aagggatattatggag 4-10-2 AAGGgatattatggAG 370_1 8587 -18 371 tgccggaagatttcct 2-12-2 TGccggaagatttcCT 371_1 8641 -21 372 atggattgggagtaga 4-10-2 ATGGattgggagtaGA 372_1 8772 -21 373 agatggattgggagta 2-12-2 AGatggattgggagTA 373_1 8774 -18 374 aagatggattgggagt 3-11-2 AAGatggattgggaGT 374_1 8775 -18 375 acaagatggattggga 2-10-4 ACaagatggattGGGA 375_1 8777 -20 375 acaagatggattggga 2-12-2 ACaagatggattggGA 375_2 8777 -17 376 agaaggttcagacttt 3-9-4 AGAaggttcagaCTTT 376_1 8835 -20 377 gcagaaggttcagact 2-11-3 GCagaaggttcagACT 377_1 8837 -21 377 gcagaaggttcagact 3-11-2 GCAgaaggttcagaCT 377_2 8837 -22 378 tgcagaaggttcagac 4-10-2 TGCAgaaggttcagAC 378_1 8838 -22 379 agtgcagaaggttcag 2-11-3 AGtgcagaaggttCAG 379_1 8840 -20 379 agtgcagaaggttcag 4-10-2 AGTGcagaaggttcAG 379_2 8840 -21 380 aagtgcagaaggttca 4-10-2 AAGTgcagaaggttCA 380_1 8841 -20 381 taagtgcagaaggttc 2-10-4 TAagtgcagaagGTTC 381_1 8842 -19 382 tctaagtgcagaaggt 2-10-4 TCtaagtgcagaAGGT 382_1 8844 -21 383 ctcaggagttctacttc 3-12-2 CTCaggagttctactTC 383_1 8948 -20 384 ctcaggagttctactt 3-10-3 CTCaggagttctaCTT 384_1 8949 -21 385 atggaggtgactcaggag 1-15-2 AtggaggtgactcaggAG 385_1 8957 -20 386 atggaggtgactcagga 2-13-2 ATggaggtgactcagGA 386_1 8958 -21 387 atggaggtgactcagg 2-11-3 ATggaggtgactcAGG 387_1 8959 -21 388 tatggaggtgactcagg 2-12-3 TAtggaggtgactcAGG 388_1 8959 -21 389 atatggaggtgactcagg 2-14-2 ATatggaggtgactcaGG 389_1 8959 -21 390 tatggaggtgactcag 4-10-2 TATGgaggtgactcAG 390_1 8960 -21 391 atatggaggtgactcag 2-11-4 ATatggaggtgacTCAG 391_1 8960 -22 392 catatggaggtgactcag 2-14-2 CAtatggaggtgactcAG 392_1 8960 -20 393 atatggaggtgactca 3-10-3 ATAtggaggtgacTCA 393_1 8961 -20 394 catatggaggtgactca 2-12-3 CAtatggaggtgacTCA 394_1 8961 -21 395 catatggaggtgactc 2-10-4 CAtatggaggtgACTC 395_1 8962 -20 396 gcatatggaggtgactc 2-13-2 GCatatggaggtgacTC 396_1 8962 -21 397 tgcatatggaggtgactc 2-14-2 TGcatatggaggtgacTC 397_1 8962 -21 398 ttgcatatggaggtgactc 1-16-2 TtgcatatggaggtgacTC 398_1 8962 -20 399 tttgcatatggaggtgactc 1-17-2 TttgcatatggaggtgacTC 399_1 8962 -21 400 gcatatggaggtgact 2-12-2 GCatatggaggtgaCT 400_1 8963 -20 401 tgcatatggaggtgact 2-13-2 TGcatatggaggtgaCT 401_1 8963 -20 402 ttgcatatggaggtgact 3-13-2 TTGcatatggaggtgaCT 402_1 8963 -22 403 tttgcatatggaggtgact 1-16-2 TttgcatatggaggtgaCT 403_1 8963 -20 404 tgcatatggaggtgac 3-11-2 TGCatatggaggtgAC 404_1 8964 -20 405 ttgcatatggaggtgac 3-11-3 TTGcatatggaggtGAC 405_1 8964 -21 406 tttgcatatggaggtgac 4-12-2 TTTGcatatggaggtgAC 406_1 8964 -21 407 tttgcatatggaggtga 4-11-2 TTTGcatatggaggtGA 407_1 8965 -21 408 tttgcatatggaggtg 2-10-4 TTtgcatatggaGGTG 408_1 8966 -21 409 aagtgaagttcaacagc 2-11-4 AAgtgaagttcaaCAGC 409_1 8997 -20 410 tgggaagtgaagttca 2-10-4 TGggaagtgaagTTCA 410_1 9002 -20 411 atgggaagtgaagttc 2-11-3 ATgggaagtgaagTTC 411_1 9003 -17 412 gatgggaagtgaagtt 4-9-3 GATGggaagtgaaGTT 412_1 9004 -21 413 ctgtgatgggaagtgaa 3-11-3 CTGtgatgggaagtGAA 413_1 9007 -20 414 attgagtgaatccaaa 3-10-3 ATTgagtgaatccAAA 414_1 9119 -14 415 aattgagtgaatccaa 2-10-4 AAttgagtgaatCCAA 415_1 9120 -16 416 gataattgagtgaatcc 4-10-3 GATAattgagtgaaTCC 416_1 9122 -20 417 gtgataattgagtgaa 3-10-3 GTGataattgagtGAA 417_1 9125 -16 418 aagaaaggtgcaataa 3-10-3 AAGaaaggtgcaaTAA 418_1 9155 -14 419 caagaaaggtgcaata 2-10-4 CAagaaaggtgcAATA 419_1 9156 -15 420 acaagaaaggtgcaat 4-10-2 ACAAgaaaggtgcaAT 420_1 9157 -16 421 atttaaactcacaaac 2-12-2 ATttaaactcacaaAC 421_1 9171 -10 422 ctgttaggttcagcga 2-10-4 CTgttaggttcaGCGA 422_1 9235 -24 423 tctgaatgaacatttcg 4-9-4 TCTGaatgaacatTTCG 423_1 9260 -20 424 ctcattgaaggttctg 2-10-4 CTcattgaaggtTCTG 424_1 9281 -20 425 ctaatctcattgaagg 3-11-2 CTAatctcattgaaGG 425_1 9286 -17 426 cctaatctcattgaag 2-12-2 CCtaatctcattgaAG 426_1 9287 -16 427 actttgatctttcagc 3-10-3 ACTttgatctttcAGC 427_1 9305 -20 428 actatgcaacactttg 2-12-2 ACtatgcaacacttTG 428_1 9315 -15 429 caaatagctttatcgg 3-10-3 CAAatagctttatCGG 429_1 9335 -17 430 ccaaatagctttatcg 2-10-4 CCaaatagctttATCG 430_1 9336 -19 431 tccaaatagctttatc 4-10-2 TCCAaatagctttaTC 431_1 9337 -18 432 gatccaaatagcttta 4-10-2 GATCcaaatagcttTA 432_1 9339 -18 433 atgatccaaatagctt 2-10-4 ATgatccaaataGCTT 433_1 9341 -19 434 tatgatccaaatagct 4-10-2 TATGatccaaatagCT 434_1 9342 -18 435 taaacagggctgggaat 4-9-4 TAAAcagggctggGAAT 435_1 9408 -22 436 acttaaacagggctgg 2-10-4 ACttaaacagggCTGG 436_1 9412 -21 437 acacttaaacagggct 2-10-4 ACacttaaacagGGCT 437_1 9414 -22 438 gaacacttaaacaggg 4-8-4 GAACacttaaacAGGG 438_1 9416 -20 439 agagaacacttaaacag 4-9-4 AGAGaacacttaaACAG 439_1 9418 -20 440 ctacagagaacactta 4-8-4 CTACagagaacaCTTA 440_1 9423 -20 441 atgctacagagaacact 3-10-4 ATGctacagagaaCACT 441_1 9425 -22 442 ataaatgctacagagaaca 4-11-4 ATAAatgctacagagAACA 442_1 9427 -20 443 agataaatgctacagaga 2-12-4 AGataaatgctacaGAGA 443_1 9430 -20 444 tagagataaatgctaca 4-9-4 TAGAgataaatgcTACA 444_1 9434 -21 445 tagatagagataaatgct 4-11-3 TAGAtagagataaatGCT 445_1 9437 -20 446 caatatactagatagaga 4-10-4 CAATatactagataGAGA 446_1 9445 -21 447 tacacaatatactagatag 4-11-4 TACAcaatatactagATAG 447_1 9448 -21 448 ctacacaatatactag 3-10-3 CTAcacaatatacTAG 448_1 9452 -16 449 gctacacaatatacta 4-8-4 GCTAcacaatatACTA 449_1 9453 -21 450 atatgctacacaatatac 4-10-4 ATATgctacacaatATAC 450_1 9455 -20 451 tgatatgctacacaat 4-8-4 TGATatgctacaCAAT 451_1 9459 -20 452 atgatatgatatgctac 4-9-4 ATGAtatgatatgCTAC 452_1 9464 -21 453 gaggagagagacaataaa 4-10-4 GAGGagagagacaaTAAA 453_1 9495 -20 454 ctaggaggagagagaca 3-11-3 CTAggaggagagagACA 454_1 9500 -22 455 tattctaggaggagaga 4-10-3 TATTctaggaggagAGA 455_1 9504 -21 456 ttatattctaggaggag 4-10-3 TTATattctaggagGAG 456_1 9507 -21 457 gtttatattctaggag 3-9-4 GTTtatattctaGGAG 457_1 9510 -20 458 tggagtttatattctagg 2-12-4 TGgagtttatattcTAGG 458_1 9512 -22 459 cgtaccaccactctgc 2-11-3 CGtaccaccactcTGC 459_1 9590 -25 460 tgaggaaatcattcattc 4-10-4 TGAGgaaatcattcATTC 460_1 9641 -22 461 tttgaggaaatcattcat 4-10-4 TTTGaggaaatcatTCAT 461_1 9643 -20 462 aggctaatcctatttg 4-10-2 AGGCtaatcctattTG 462_1 9657 -22 463 tttaggctaatcctat 4-8-4 TTTAggctaatcCTAT 463_1 9660 -22 464 tgctccagtgtaccct 3-11-2 TGCtccagtgtaccCT 464_1 9755 -27 465 tagtagtactcgatag 2-10-4 TAgtagtactcgATAG 465_1 9813 -18 466 ctaattgtagtagtactc 3-12-3 CTAattgtagtagtaCTC 466_1 9818 -20 467 tgctaattgtagtagt 2-10-4 TGctaattgtagTAGT 467_1 9822 -19 468 agtgctaattgtagta 4-10-2 AGTGctaattgtagTA 468_1 9824 -19 469 gcaagtgctaattgta 4-10-2 GCAAgtgctaattgTA 469_1 9827 -20 470 gaggaaatgaactaattta 4-13-2 GAGGaaatgaactaattTA 470_1 9881 -18 471 caggaggaaatgaacta 4-11-2 CAGGaggaaatgaacTA 471_1 9886 -19 472 ccctagagtcatttcc 2-11-3 CCctagagtcattTCC 472_1 9902 -24 473 atcttacatgatgaagc 3-11-3 ATCttacatgatgaAGC 473_1 9925 -20 475 agacacactcagatttcag 2-15-2 AGacacactcagatttcAG 475_1 9967 -20 474 gacacactcagatttcag 3-13-2 GACacactcagatttcAG 474_1 9967 -20 476 aagacacactcagatttcag 3-15-2 AAGacacactcagatttcAG 476_1 9967 -21 477 agacacactcagatttca 2-13-3 AGacacactcagattTCA 477_1 9968 -20 478 aagacacactcagatttca 3-13-3 AAGacacactcagattTCA 478_1 9968 -21 479 aaagacacactcagatttca 2-14-4 AAagacacactcagatTTCA 479_1 9968 -20 480 gaaagacacactcagatttc 3-14-3 GAAagacacactcagatTTC 480_1 9969 -20 481 aagacacactcagatttc 4-11-3 AAGAcacactcagatTTC 481_1 9969 -21 482 aaagacacactcagatttc 4-11-4 AAAGacacactcagaTTTC 482_1 9969 -20 483 tgaaagacacactcagattt 4-14-2 TGAAagacacactcagatTT 483_1 9970 -20 484 tgaaagacacactcagatt 2-13-4 TGaaagacacactcaGATT 484_1 9971 -21 485 tgaaagacacactcagat 3-12-3 TGAaagacacactcaGAT 485_1 9972 -20 486 attgaaagacacactca 4-10-3 ATTGaaagacacacTCA 486_1 9975 -19 487 tcattgaaagacacact 2-11-4 TCattgaaagacaCACT 487_1 9977 -18 488 ttccatcattgaaaga 3-9-4 TTCcatcattgaAAGA 488_1 9983 -18 489 ataataccacttatcat 4-9-4 ATAAtaccacttaTCAT 489_1 10010 -20 490 ttacttaatttctttgga 2-12-4 TTacttaatttcttTGGA 490_1 10055 -20 491 ttagaactagctttatca 3-12-3 TTAgaactagctttaTCA 491_1 10101 -20 492 gaggtacaaatatagg 3-10-3 GAGgtacaaatatAGG 492_1 10171 -18 493 cttatgatacaactta 3-10-3 CTTatgatacaacTTA 493_1 10384 -15 494 tcttatgatacaactt 2-11-3 TCttatgatacaaCTT 494_1 10385 -15 495 ttcttatgatacaact 3-11-2 TTCttatgatacaaCT 495_1 10386 -15 496 cagtttcttatgatac 2-11-3 CAgtttcttatgaTAC 496_1 10390 -16 497 gcagtttcttatgata 3-11-2 GCAgtttcttatgaTA 497_1 10391 -19 498 tacaaatgtctattaggtt 4-12-3 TACAaatgtctattagGTT 498_1 10457 -21 499 tgtacaaatgtctattag 4-11-3 TGTAcaaatgtctatTAG 499_1 10460 -20 500 agcatcacaattagta 3-11-2 AGCatcacaattagTA 500_1 10535 -18 501 ctaatgatagtgaagc 3-11-2 CTAatgatagtgaaGC 501_1 10548 -17 502 agctaatgatagtgaa 3-11-2 AGCtaatgatagtgAA 502_1 10550 -16 503 atgccttgacatatta 4-10-2 ATGCcttgacatatTA 503_1 10565 -20 504 ctcaagattattgacac 4-9-4 CTCAagattattgACAC 504_1 10623 -20 505 acctcaagattattga 2-10-4 ACctcaagattaTTGA 505_2 10626 -18 505 acctcaagattattga 3-9-4 ACCtcaagattaTTGA 505_1 10626 -20 506 aacctcaagattattg 4-10-2 AACCtcaagattatTG 506_1 10627 -17 507 cacaaacctcaagattatt 4-13-2 CACAaacctcaagattaTT 507_1 10628 -20 508 gtacttaattagacct 3-9-4 GTActtaattagACCT 508_1 10667 -21 509 agtacttaattagacc 4-9-3 AGTActtaattagACC 509_1 10668 -20 510 gtatgaggtggtaaac 4-10-2 GTATgaggtggtaaAC 510_1 10688 -18 511 aggaaacagcagaagtg 2-11-4 AGgaaacagcagaAGTG 511_1 10723 -21 512 gcacaacccagaggaa 2-12-2 GCacaacccagaggAA 512_1 10735 -20 513 caagcacaacccagag 3-11-2 CAAgcacaacccagAG 513_1 10738 -20 514 ttcaagcacaacccag 3-10-3 TTCaagcacaaccCAG 514_1 10740 -21 515 aattcaagcacaaccc 2-10-4 AAttcaagcacaACCC 515_1 10742 -20 516 taataattcaagcacaacc 4-13-2 TAATaattcaagcacaaCC 516_1 10743 -20 517 actaataattcaagcac 4-9-4 ACTAataattcaaGCAC 517_1 10747 -20 518 ataatactaataattcaagc 4-12-4 ATAAtactaataattcAAGC 518_1 10749 -19 519 tagatttgtgaggtaa 2-10-4 TAgatttgtgagGTAA 519_1 11055 -18 520 agccttaattctccat 4-10-2 AGCCttaattctccAT 520_1 11091 -24 521 aatgatctagagcctta 4-9-4 AATGatctagagcCTTA 521_1 11100 -22 522 ctaatgatctagagcc 3-10-3 CTAatgatctagaGCC 522_1 11103 -22 523 actaatgatctagagc 3-9-4 ACTaatgatctaGAGC 523_1 11104 -21 524 cattaacatgttcttatt 3-11-4 CATtaacatgttctTATT 524_1 11165 -19 525 acaagtacattaacatgttc 4-12-4 ACAAgtacattaacatGTTC 525_1 11170 -22 526 ttacaagtacattaacatg 4-11-4 TTACaagtacattaaCATG 526_1 11173 -20 527 gctttattcatgtttat 4-9-4 GCTTtattcatgtTTAT 527_1 11195 -22 528 gctttattcatgttta 3-11-2 GCTttattcatgttTA 528_1 11196 -18 529 agagctttattcatgttt 3-13-2 AGAgctttattcatgtTT 529_1 11197 -20 530 ataagagctttattcatg 4-10-4 ATAAgagctttattCATG 530_1 11200 -21 531 cataagagctttattca 4-9-4 CATAagagctttaTTCA 531_1 11202 -21 532 agcataagagctttat 4-8-4 AGCAtaagagctTTAT 532_1 11205 -22 533 tagattgtttagtgca 3-10-3 TAGattgtttagtGCA 533_1 11228 -20 534 gtagattgtttagtgc 2-10-4 GTagattgtttaGTGC 534_1 11229 -21 535 gacaattctagtagatt 4-9-4 GACAattctagtaGATT 535_1 11238 -21 536 ctgacaattctagtag 3-9-4 CTGacaattctaGTAG 536_1 11241 -20 537 gctgacaattctagta 4-10-2 GCTGacaattctagTA 537_1 11242 -21 538 aggattaagatacgta 2-12-2 AGgattaagatacgTA 538_1 11262 -15 539 caggattaagatacgt 2-11-3 CAggattaagataCGT 539_1 11263 -17 540 tcaggattaagatacg 3-11-2 TCAggattaagataCG 540_1 11264 -16 541 ttcaggattaagatac 2-10-4 TTcaggattaagATAC 541_1 11265 -15 542 aggaagaaagtttgattc 4-10-4 AGGAagaaagtttgATTC 542_1 11308 -21 543 tcaaggaagaaagtttga 4-10-4 TCAAggaagaaagtTTGA 543_1 11311 -20 544 ctcaaggaagaaagtttg 4-10-4 CTCAaggaagaaagTTTG 544_1 11312 -20 545 tgctcaaggaagaaagt 3-10-4 TGCtcaaggaagaAAGT 545_1 11315 -21 546 aattatgctcaaggaaga 4-11-3 AATTatgctcaaggaAGA 546_1 11319 -20 547 taggataccacattatga 4-12-2 TAGGataccacattatGA 547_1 11389 -22 548 cataatttattccattcctc 2-15-3 CAtaatttattccattcCTC 548_1 11449 -22 549 tgcataatttattccat 4-10-3 TGCAtaatttattcCAT 549_1 11454 -22 550 actgcataatttattcc 4-10-3 ACTGcataatttatTCC 550_1 11456 -21 551 ctaaactgcataatttatt 4-11-4 CTAAactgcataattTATT 551_1 11458 -20 552 ataactaaactgcata 2-10-4 ATaactaaactgCATA 552_1 11465 -16 553 ttattaataactaaactgc 3-12-4 TTAttaataactaaaCTGC 553_1 11468 -19 554 tagtacattattaataact 4-13-2 TAGTacattattaataaCT 554_1 11475 -18 555 cataactaaggacgtt 4-10-2 CATAactaaggacgTT 555_1 11493 -17 556 tcataactaaggacgt 2-11-3 TCataactaaggaCGT 556_1 11494 -16 557 cgtcataactaaggac 4-10-2 CGTCataactaaggAC 557_1 11496 -17 558 tcgtcataactaagga 2-12-2 TCgtcataactaagGA 558_1 11497 -16 559 atcgtcataactaagg 2-10-4 ATcgtcataactAAGG 559_1 11498 -17 560 gttagtatcttacatt 2-11-3 GTtagtatcttacATT 560_1 11525 -15 561 ctctattgttagtatc 3-10-3 CTCtattgttagtATC 561_1 11532 -17 562 agtatagagttactgt 3-10-3 AGTatagagttacTGT 562_1 11567 -19 563 ttcctggtgatacttt 4-10-2 TTCCtggtgatactTT 563_1 11644 -21 564 gttcctggtgatactt 4-10-2 GTTCctggtgatacTT 564_1 11645 -21 565 tgttcctggtgatact 2-12-2 TGttcctggtgataCT 565_1 11646 -20 566 ataaacatgaatctctcc 2-12-4 ATaaacatgaatctCTCC 566_1 11801 -20 567 ctttataaacatgaatctc 3-12-4 CTTtataaacatgaaTCTC 567_1 11804 -19 568 ctgtctttataaacatg 3-10-4 CTGtctttataaaCATG 568_1 11810 -19 569 ttgttataaatctgtctt 2-12-4 TTgttataaatctgTCTT 569_1 11820 -18 570 ttaaatttattcttggata 3-12-4 TTAaatttattcttgGATA 570_1 11849 -19 571 cttaaatttattcttgga 2-12-4 CTtaaatttattctTGGA 571_1 11851 -19 572 cttcttaaatttattcttg 4-13-2 CTTCttaaatttattctTG 572_1 11853 -18 573 tatgtttctcagtaaag 4-9-4 TATGtttctcagtAAAG 573_1 11877 -19 574 gaattatctttaaacca 3-10-4 GAAttatctttaaACCA 574_1 11947 -18 575 cccttaaatttctaca 3-11-2 CCCttaaatttctaCA 575_1 11980 -20 576 acactgctcttgtacc 4-10-2 ACACtgctcttgtaCC 576_1 11995 -23 577 tgacaacactgctctt 3-10-3 TGAcaacactgctCTT 577_1 12000 -21 578 tacatttattgggctc 4-10-2 TACAtttattgggcTC 578_1 12081 -19 579 gtacatttattgggct 2-10-4 GTacatttattgGGCT 579_1 12082 -23 580 ttggtacatttattgg 3-10-3 TTGgtacatttatTGG 580_1 12085 -18 581 catgttggtacatttat 4-10-3 CATGttggtacattTAT 581_1 12088 -21 582 aatcatgttggtacat 4-10-2 AATCatgttggtacAT 582_1 12092 -16 583 aaatcatgttggtaca 2-12-2 AAatcatgttggtaCA 583_1 12093 -14 584 gacaagtttggattaa 3-11-2 GACaagtttggattAA 584_1 12132 -14 585 aatgttcagatgcctc 2-10-4 AAtgttcagatgCCTC 585_1 12197 -21 586 gcttaatgttcagatg 2-12-2 GCttaatgttcagaTG 586_1 12201 -17 587 cgtacatagcttgatg 4-10-2 CGTAcatagcttgaTG 587_1 12267 -20 588 gtgaggaattaggata 3-11-2 GTGaggaattaggaTA 588_1 12753 -17 589 gtaacaatatggtttg 3-11-2 GTAacaatatggttTG 589_1 12780 -15 590 gaaatattgtagacta 2-11-3 GAaatattgtagaCTA 590_1 13151 -14 591 ttgaaatattgtagac 3-11-2 TTGaaatattgtagAC 591_1 13153 -12 592 aagtctagtaatttgc 2-10-4 AAgtctagtaatTTGC 592_1 13217 -17 593 gctcagtagattataa 4-10-2 GCTCagtagattatAA 593_1 13259 -17 594 catacactgttgctaa 3-10-3 CATacactgttgcTAA 594_1 13296 -19 595 atggtctcaaatcatt 3-10-3 ATGgtctcaaatcATT 595_1 13314 -17 596 caatggtctcaaatca 4-10-2 CAATggtctcaaatCA 596_1 13316 -18 597 ttcctattgattgact 4-10-2 TTCCtattgattgaCT 597_1 13568 -20 598 tttctgttcacaacac 4-10-2 TTTCtgttcacaacAC 598_1 13600 -17 599 aggaacccactaatct 2-11-3 AGgaacccactaaTCT 599_1 13702 -20 600 taaatggcaggaaccc 3-11-2 TAAatggcaggaacCC 600_1 13710 -19 601 gtaaatggcaggaacc 4-10-2 GTAAatggcaggaaCC 601_1 13711 -20 602 ttgtaaatggcaggaa 2-11-3 TTgtaaatggcagGAA 602_1 13713 -16 603 ttatgagttaggcatg 2-10-4 TTatgagttaggCATG 603_1 13835 -19 604 ccaggtgaaactttaa 3-11-2 CCAggtgaaactttAA 604_1 13935 -17 605 cccttagtcagctcct 3-10-3 CCCttagtcagctCCT 605_1 13997 -30 606 acccttagtcagctcc 2-10-4 ACccttagtcagCTCC 606_1 13998 -27 607 cacccttagtcagctc 2-11-3 CAcccttagtcagCTC 607_1 13999 -24 608 tctcttactaggctcc 3-10-3 TCTcttactaggcTCC 608_1 14091 -24 609 cctatctgtcatcatg 2-11-3 CCtatctgtcatcATG 609_1 14178 -20 610 tcctatctgtcatcat 3-11-2 TCCtatctgtcatcAT 610_1 14179 -20 611 gagaagtgtgagaagc 3-11-2 GAGaagtgtgagaaGC 611_1 14808 -19 612 catccttgaagtttag 4-10-2 CATCcttgaagtttAG 612_1 14908 -19 613 taataagatggctccc 3-10-3 TAAtaagatggctCCC 613_1 15046 -21 614 caaggcataataagat 3-11-2 CAAggcataataagAT 614_1 15053 -14 615 ccaaggcataataaga 2-10-4 CCaaggcataatAAGA 615_1 15054 -18 616 tgatccaattctcacc 2-12-2 TGatccaattctcaCC 616_1 15151 -19 617 atgatccaattctcac 3-10-3 ATGatccaattctCAC 617_1 15152 -19 618 cgcttcatcttcaccc 3-11-2 CGCttcatcttcacCC 618_1 15260 -26 619 tatgacactgcatctt 2-10-4 TAtgacactgcaTCTT 619_1 15317 -19 620 gtatgacactgcatct 3-10-3 GTAtgacactgcaTCT 620_1 15318 -21 621 tgtatgacactgcatc 2-10-4 TGtatgacactgCATC 621_1 15319 -20 622 ttctcttctgtaagtc 4-10-2 TTCTcttctgtaagTC 622_1 15363 -19 623 ttctacagaggaacta 2-10-4 TTctacagaggaACTA 623_1 15467 -17 624 actacagttctacaga 3-10-3 ACTacagttctacAGA 624_1 15474 -19 625 ttcccacaggtaaatg 4-10-2 TTCCcacaggtaaaTG 625_1 15561 -21 626 attatttgaatatactcatt 4-12-4 ATTAtttgaatatactCATT 626_1 15594 -20 627 tgggaggaaattatttg 4-10-3 TGGGaggaaattatTTG 627_1 15606 -20 628 tgactcatcttaaatg 4-10-2 TGACtcatcttaaaTG 628_1 15621 -17 629 ctgactcatcttaaat 3-11-2 CTGactcatcttaaAT 629_1 15622 -16 630 tttactctgactcatc 3-10-3 TTTactctgactcATC 630_1 15628 -17 631 tattggaggaattatt 3-11-2 TATtggaggaattaTT 631_1 15642 -14 632 gtattggaggaattat 3-11-2 GTAttggaggaattAT 632_1 15643 -16 633 tggtatacttctctaagtat 2-15-3 TGgtatacttctctaagTAT 633_1 15655 -22 634 gatctcttggtatact 4-10-2 GATCtcttggtataCT 634_1 15666 -20 635 cagacaactctatacc 2-12-2 CAgacaactctataCC 635_1 15689 -18 636 aacatcagacaactcta 4-9-4 AACAtcagacaacTCTA 636_1 15693 -21 637 taacatcagacaactc 4-10-2 TAACatcagacaacTC 637_1 15695 -16 638 tttaacatcagacaactc 4-10-4 TTTAacatcagacaACTC 638_1 15695 -20 639 atttaacatcagacaa 2-12-2 ATttaacatcagacAA 639_1 15698 -11 640 cctatttaacatcagac 2-11-4 CCtatttaacatcAGAC 640_1 15700 -20 641 tccctatttaacatca 3-10-3 TCCctatttaacaTCA 641_1 15703 -21 642 tcaacgactattggaat 4-9-4 TCAAcgactattgGAAT 642_1 15737 -20 643 cttatattctggctat 4-9-3 CTTAtattctggcTAT 643_1 15850 -20 644 atccttatattctggc 4-10-2 ATCCttatattctgGC 644_1 15853 -23 645 gatccttatattctgg 2-10-4 GAtccttatattCTGG 645_1 15854 -21 646 tgatccttatattctg 3-10-3 TGAtccttatattCTG 646_1 15855 -19 647 attgaaacttgatcct 4-8-4 ATTGaaacttgaTCCT 647_1 15864 -21 648 actgtcattgaaactt 2-10-4 ACtgtcattgaaACTT 648_1 15870 -16 649 tcttactgtcattgaa 3-11-2 TCTtactgtcattgAA 649_1 15874 -16 650 aggatcttactgtcatt 2-11-4 AGgatcttactgtCATT 650_1 15877 -21 651 gcaaatcaactccatc 3-10-3 GCAaatcaactccATC 651_1 15896 -20 652 gtgcaaatcaactcca 3-10-3 GTGcaaatcaactCCA 652_1 15898 -22 653 caattatttctttgtgc 4-10-3 CAATtatttctttgTGC 653_1 15910 -21 654 tggcaacaattatttctt 3-11-4 TGGcaacaattattTCTT 654_1 15915 -21 655 gctggcaacaattatt 3-9-4 GCTggcaacaatTATT 655_1 15919 -21 656 atccatttctactgcc 4-10-2 ATCCatttctactgCC 656_1 15973 -24 657 taatatctattgatttcta 4-11-4 TAATatctattgattTCTA 657_1 15988 -20 658 tcaatagtgtagggca 2-12-2 TCaatagtgtagggCA 658_1 16093 -18 659 ttcaatagtgtagggc 3-11-2 TTCaatagtgtaggGC 659_1 16094 -19 660 aggttaattaattcaatag 4-11-4 AGGTtaattaattcaATAG 660_1 16102 -21 661 catttgtaatccctag 3-10-3 CATttgtaatcccTAG 661_2 16163 -20 661 catttgtaatccctag 3-9-4 CATttgtaatccCTAG 661_1 16163 -22 662 acatttgtaatcccta 3-10-3 ACAtttgtaatccCTA 662_1 16164 -20 663 aacatttgtaatccct 2-10-4 AAcatttgtaatCCCT 663_2 16165 -21 663 aacatttgtaatccct 3-9-4 AACatttgtaatCCCT 663_1 16165 -22 664 taaatttcaagttctg 2-11-3 TAaatttcaagttCTG 664_1 16184 -14 665 gtttaaatttcaagttct 3-11-4 GTTtaaatttcaagTTCT 665_1 16185 -19 666 ccaagtttaaatttcaag 4-10-4 CCAAgtttaaatttCAAG 666_1 16189 -21 667 acccaagtttaaatttc 4-9-4 ACCCaagtttaaaTTTC 667_1 16192 -22 668 catacagtgacccaagttt 2-14-3 CAtacagtgacccaagTTT 668_1 16199 -23 669 acatcccatacagtga 2-11-3 ACatcccatacagTGA 669_1 16208 -21 670 agcacagctctacatc 2-10-4 AGcacagctctaCATC 670_1 16219 -22 671 atatagcacagctcta 3-9-4 ATAtagcacagcTCTA 671_1 16223 -21 672 tccatatagcacagct 3-11-2 TCCatatagcacagCT 672_1 16226 -22 673 atttccatatagcaca 3-9-4 ATTtccatatagCACA 673_1 16229 -20 674 tttatttccatatagca 4-9-4 TTTAtttccatatAGCA 674_1 16231 -22 675 tttatttccatatagc 3-10-3 TTTatttccatatAGC 675_1 16232 -18 676 aaggagaggagattatg 4-9-4 AAGGagaggagatTATG 676_1 16409 -21 677 agttcttgtgttagct 3-11-2 AGTtcttgtgttagCT 677_1 16456 -21 678 gagttcttgtgttagc 2-12-2 GAgttcttgtgttaGC 678_1 16457 -20 679 attaattatccatccac 3-10-4 ATTaattatccatCCAC 679_1 16590 -21 680 atcaattaattatccatc 3-11-4 ATCaattaattatcCATC 680_1 16593 -19 681 agaatcaattaattatcc 3-12-3 AGAatcaattaattaTCC 681_1 16596 -18 682 tgagataccgtgcatg 2-12-2 TGagataccgtgcaTG 682_1 16656 -18 683 aatgagataccgtgca 2-10-4 AAtgagataccgTGCA 683_1 16658 -21 684 ctgtggttaggctaat 3-11-2 CTGtggttaggctaAT 684_1 16834 -19 685 aagagtaagggtctgtggtt 1-17-2 AagagtaagggtctgtggTT 685_1 16842 -21 686 gatgggttaagagtaa 4-9-3 GATGggttaagagTAA 686_1 16854 -19 687 agcagatgggttaaga 3-11-2 AGCagatgggttaaGA 687_1 16858 -20 688 tgtaaacatttgtagc 2-10-4 TGtaaacatttgTAGC 688_1 16886 -19 689 cctgcttataaatgta 3-11-2 CCTgcttataaatgTA 689_1 16898 -19 690 tgccctgcttataaat 4-10-2 TGCCctgcttataaAT 690_1 16901 -23 691 tcttcttagttcaata 2-12-2 TCttcttagttcaaTA 691_1 16935 -15 692 tggtttctaactacat 2-10-4 TGgtttctaactACAT 692_1 16980 -18 693 agtttggtttctaacta 2-12-3 AGtttggtttctaaCTA 693_1 16983 -19 694 gaatgaaacttgcctg 3-10-3 GAAtgaaacttgcCTG 694_1 17047 -18 695 attatccttacatgat 3-10-3 ATTatccttacatGAT 695_1 17173 -17 696 gtacccaattatcctt 2-11-3 GTacccaattatcCTT 696_1 17180 -21 697 tgtacccaattatcct 3-10-3 TGTacccaattatCCT 697_1 17181 -24 698 ttgtacccaattatcc 2-11-3 TTgtacccaattaTCC 698_1 17182 -20 699 tttgtacccaattatc 3-11-2 TTTgtacccaattaTC 699_1 17183 -17 700 agcagcaggttatatt 4-10-2 AGCAgcaggttataTT 700_1 17197 -22 701 tgggaagtggtctggg 3-10-3 TGGgaagtggtctGGG 701_1 17292 -25 702 ctggagagtgataata 3-11-2 CTGgagagtgataaTA 702_1 17322 -17 703 aatgctggattacgtc 4-10-2 AATGctggattacgTC 703_1 17354 -19 704 caatgctggattacgt 2-11-3 CAatgctggattaCGT 704_1 17355 -19 705 ttgttcagaagtatcc 2-10-4 TTgttcagaagtATCC 705_1 17625 -19 706 gatgatttgcttggag 2-10-4 GAtgatttgcttGGAG 706_1 17646 -21 707 gaaatcattcacaacc 3-10-3 GAAatcattcacaACC 707_1 17860 -17 708 ttgtaacatctactac 3-10-3 TTGtaacatctacTAC 708_1 17891 -16 709 cattaagcagcaagtt 3-11-2 CATtaagcagcaagTT 709_1 17923 -17 710 ttactagatgtgagca 3-11-2 TTActagatgtgagCA 710_1 17942 -18 711 tttactagatgtgagc 2-11-3 TTtactagatgtgAGC 711_1 17943 -18 712 gaccaagcaccttaca 3-11-2 GACcaagcaccttaCA 712_1 17971 -22 713 agaccaagcaccttac 3-10-3 AGAccaagcacctTAC 713_1 17972 -22 714 atgggttaaataaagg 2-10-4 ATgggttaaataAAGG 714_1 18052 -15 715 tcaaccagagtattaa 2-12-2 TCaaccagagtattAA 715_1 18067 -13 716 gtcaaccagagtatta 3-11-2 GTCaaccagagtatTA 716_1 18068 -18 717 attgtaaagctgatat 2-11-3 ATtgtaaagctgaTAT 717_1 18135 -14 718 cacataattgtaaagc 2-10-4 CAcataattgtaAAGC 718_1 18141 -16 719 gaggtctgctatttac 2-11-3 GAggtctgctattTAC 719_1 18274 -19 720 tgtagattcaatgcct 2-11-3 TGtagattcaatgCCT 720_1 18404 -20 721 cctcattatactatga 2-11-3 CCtcattatactaTGA 721_1 18456 -19 722 ccttatgctatgacac 2-12-2 CCttatgctatgacAC 722_1 18509 -18 723 tccttatgctatgaca 4-10-2 TCCTtatgctatgaCA 723_1 18510 -22 724 aagatgtttaagtata 3-10-3 AAGatgtttaagtATA 724_1 18598 -13 725 ctgattattaagatgt 2-10-4 CTgattattaagATGT 725_1 18607 -17 726 tggaaaggtatgaatt 2-12-2 TGgaaaggtatgaaTT 726_1 18808 -13 727 acttgaatggcttgga 2-12-2 ACttgaatggcttgGA 727_1 18880 -18 728 aacttgaatggcttgg 3-10-3 AACttgaatggctTGG 728_1 18881 -19 729 caatgtgttactattt 4-10-2 CAATgtgttactatTT 729_1 19004 -16 730 acaatgtgttactatt 3-10-3 ACAatgtgttactATT 730_1 19005 -15 731 catctgctatataaga 4-10-2 CATCtgctatataaGA 731_1 19063 -18 732 cctagagcaaatactt 4-10-2 CCTAgagcaaatacTT 732_1 19223 -20 733 cagagttaataataag 3-10-3 CAGagttaataatAAG 733_1 19327 -13 734 gttcaagcacaacgaa 4-10-2 GTTCaagcacaacgAA 734_1 19493 -18 735 agggttcaagcacaac 2-11-3 AGggttcaagcacAAC 735_1 19496 -18 736 tgttggagacactgtt 2-12-2 TGttggagacactgTT 736_1 19677 -17 737 aaggaggagttaggac 3-11-2 AAGgaggagttaggAC 737_1 19821 -18 738 ctatgccatttacgat 4-10-2 CTATgccatttacgAT 738_1 19884 -21 739 tcaaatgcagaattag 2-12-2 TCaaatgcagaattAG 739_1 19913 -12 740 agtgacaatcaaatgc 2-10-4 AGtgacaatcaaATGC 740_1 19921 -18 741 aagtgacaatcaaatg 2-11-3 AAgtgacaatcaaATG 741_1 19922 -12 742 gtgtaccaagtaacaa 3-11-2 GTGtaccaagtaacAA 742_1 19978 -16 743 tgggatgttaaactga 3-10-3 TGGgatgttaaacTGA 743_1 20037 -20

Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 6: олигонуклеотиды, нацеленные на мышиный транскрипт PD-L1 (SEQ ID NO: 4), их конструкция, а также специфичные олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе последовательности мотива.

SEQ ID NO Мотив последова-тельности Конс-трук-ция Олигонуклеотид-ное соединение CMP ID NO Начало на SEQ ID NO: 4 dG 744 agtttacattttctgc 3-10-3 AGTttacattttcTGC 744_1 4189 -20 745 tatgtgaagaggagag 3-10-3 TATgtgaagaggaGAG 745_1 7797 -19 746 cacctttaaaacccca 3-10-3 CACctttaaaaccCCA 746_1 9221 -23 747 tcctttataatcacac 3-10-3 TCCtttataatcaCAC 747_1 10386 -19 748 acggtattttcacagg 3-10-3 ACGgtattttcacAGG 748_1 12389 -21 749 gacactacaatgagga 3-10-3 GACactacaatgaGGA 749_1 15088 -20 750 tggtttttaggactgt 3-10-3 TGGtttttaggacTGT 750_1 16410 -21 751 cgacaaattctatcct 3-10-3 CGAcaaattctatCCT 751_1 18688 -20 752 tgatatacaatgctac 3-10-3 TGAtatacaatgcTAC 752_1 18735 -16 753 tcgttgggtaaattta 3-10-3 TCGttgggtaaatTTA 753_1 19495 -17 754 tgctttataaatggtg 3-10-3 TGCtttataaatgGTG 754_1 19880 -19

Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 7: последовательности олигонуклеотидных мотивов и антисмысловые соединения с 5'-ca биорасщепляемым линкером.

SEQ ID NO мотив последовательности олигонуклеотидное соединение с линкером са CMP ID NO 755 caagtttacattttctgc c_oa_oAGTttacattttcTGC 755_1 756 catatgtgaagaggagag c_oa_oTATgtgaagaggaGAG 756_1 757 cacctttaaaacccca c_oa_oCACctttaaaaccCCA 757_1 758 catcctttataatcacac c_oa_oTCCtttataatcaCAC 758_1 759 caacggtattttcacagg c_oa_oACGgtattttcacAGG 759_1 760 cagacactacaatgagga c_oa_oGACactacaatgaGGA 760_1 761 catggtttttaggactgt c_oa_oTGGtttttaggacTGT 761_1 762 cacgacaaattctatcct c_oa_oCGAcaaattctatCCT 762_1 763 catgatatacaatgctac c_oa_oTGAtatacaatgcTAC 763_1 764 catcgttgggtaaattta c_oa_oTCGttgggtaaatTTA 764_1 765 catgctttataaatggtg c_oa_oTGCtttataaatgGTG 765_1 766 caacaaataatggttactct c_oa_oACAAataatggttaCTCT 766_1 767 cacagattgatggtagtt c_oa_oCAGAttgatggtagTT 767_1 768 cacctatttaacatcagac c_oa_oCCtatttaacatcAGAC 768_1 769 cactaattgtagtagtactc c_oa_oCTAattgtagtagtaCTC 769_1 770 caataaacatgaatctctcc c_oa_oATaaacatgaatctCTCC 770_1

Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ _o представляет фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 8: антисмысловые олигонуклеотидные соединения, конъюгированные с GalNAc

конъюгат антисмыслового олигонуклеотида CMP ID NO GN2-C6_oc_oa_oAGTttacattttcTGC 755_2 GN2-C6_oc_oa_oTATgtgaagaggaGAG 756_2 GN2-C6_oc_oa_oCACctttaaaaccCCA 757_2 GN2-C6_oc_oa_oTCCtttataatcaCAC 758_2 GN2-C6_oc_oa_oACGgtattttcacAGG 759_2 GN2-C6_oc_oa_oGACactacaatgaGGA 760_2 GN2-C6_oc_oa_oTGGtttttaggacTGT 761_2 GN2-C6_oc_oa_oCGAcaaattctatCCT 762_2 GN2-C6_oc_oa_oTGAtatacaatgcTAC 763_2 GN2-C6_oc_oa_oTCGttgggtaaatTTA 764_2 GN2-C6_oc_oa_oTGCtttataaatgGTG 765_2 GN2-C6_oc_oa_oACAAataatggttaCTCT 766_2 GN2-C6_oc_oa_oCAGAttgatggtagTT 767_2 GN2-C6_oc_oa_oCCtatttaacatcAGAC 768_2 GN2-C6_oc_oa_oCTAattgtagtagtaCTC 769_2 GN2-C6_oc_oa_oATaaacatgaatctCTCC 770_2

GN2 представляет трехвалентный GalNAc кластер, показанный на Фиг. 3, С6 представляет аминоалкильную группу с 6 атомами углерода, заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ _o представляет фосфодиэфирную нуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи. Химические формулы, представляющие некоторые из данных молекул, показаны на Фиг. 4-8.

Мышиные модели AAV/HBV

Модель Пастера:

В Институте Пастера создали и разводили трансгенных по HLA-A2.1-/HLA-DR1 нокаутированных по H-2 класса I-/класса II мышей (именуемых в данном документе HLA-A2/DR1). Данные мыши представляют собой экспериментальную модель in vivo для исследований человеческой иммунной функции без какого-либо мешающего влияния ответа мышиного МНС (главный комплекс гистосовместиости) (Pajot et al 2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9.

В данных исследованиях использовали вектор на основе аденосателлитного вируса (AAV) серотипа AAV 2/8, несущий компетентный к репликации ДНК-геном HBV. Вектор AAV-HBV (партия GVPN #6163) разводили в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с достижением титра 5×10¹¹ вг (геном вектора)/мл. Мышам внутривенно (в.в.) инъецировали 100 мкл данного разведенного раствора (доза/мышь: 5×10¹⁰ вг) в хвостовую вену. В крови мышей-носителей HBV выявляли полные вирусные частицы, содержащие ДНК HBV. HBcAg выявляли в течение вплоть до одного года в печени, наряду с циркулирующими белками HBV - HBeAg и HBsAg - в крови. У всех мышей, трансдуцированных AAV2/8-HBV, HBsAg, HBeAg и ДНК HBV сохранялись в сыворотке в течение по меньшей мере одного года (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).

Шанхайская модель:

В данной модели у мышей, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), поддерживается стабильная виремия и антигенимия в течение больше, чем 30 недель (Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78).

Самцов мышей C57BL/6 (4-6-недельных), не содержащих специфических патогенов, приобретали в SLAC (Центр животных Шанхайской лаборатории Китайской академии наук) и содержали в виварии в индивидуально вентилируемых клетках. Следовали руководствам по уходу и применению животных, как указывается WuXi IACUC (Институциональный комитет по уходу и применению животных, номер потокола WUXI IACUC R20131126-мышь). Мышам давали акклиматизироваться к новым условиям в течение 3 суток и группировали их согласно схеме экперимента.

Рекомбинантный AAV-HBV разводили в PBS, 200 мкл на инъекцию. Данный рекомбинантный вирус несет 1,3 копии генома HBV (генотип D, серотип ayw).

В сутки 0 всем мышам инъецировали через хвостовую вену 200 мкл AAV-HBV. В сутки 6, 13 и 20 после инъекции AAV всем мышам делали подчелюстное кровопускание (0,1 мл крови/мышь) для отбора сыворотки. В сутки 22 после инъекции мыши со стабильной виремией были готовы для обработки олигонуклеотидами. Данные олигонуклеотиды могут быть неконъюгированными или конъюгированными с GalNAc.

ДНК-вакцина

Плазмидная ДНК не содержала эндотоксинов и была изготовлена Plasmid-Factory (Германия). pCMV-S2.S ayw кодирует домены preS2 и S HBsAg (генотип D), и их экспрессия контролируется немедленным ранним промотором гена цитомегаловируса (Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311). pCMV-HBc кодирует капсид HBV, несущий Ag (антиген) кора вируса гепатита (HBc) (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).

Обработку ДНК-вакциной проводили, как описано в данном документе. За пять суток до вакцинации в мышцы мышей инъецировали кардиотоксин (CaTx, латоксан реф. L81-02, 50 мкл/мышцу). CaTx деполяризует мышечные волокна с индукцией дегенерации клеток, через 5 суток после инъекции появятся новые мышечные волокна, и они будут получать ДНК-вакцину для лучшей эффективности трансфекции. Каждый из pCMV-S2.S ayw и pCMVCore в концентрации 1 мг/мл смешивали в равном количестве, и каждая мышь получала всего 100 мкг двухсторонней внутримышечной инъекции в обработанные кардиотоксином передние большеберцовые мышцы, как было описано ранее в Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311, под анестезией (100 мкл 12,5 мг/мл кетамина, 1,25 мг/мл ксилазина).

Антитело против PD-L1

Это мышиное антитело IgG1 против мышиного PD-L1 клона 6Е11, произведенное внутри Genetech. Оно представляет собой имитирующее антитело, которое перекрестно блокирует атезолизумаб, и имеет аналогичную активность, блокирующую in vitro атезолизумаб, произведенный внутри Roche. Данное антитело вводили внутрибрюшинной инъекцией (в.б.) в дозе 12,5 мкг/г.

Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов обычно известен в данной области. Ниже представлен протокол, который можно применять. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению возможно были получены слегка отличными способами в показателях использованных прибора, подложки и концентраций.

Олигонуклеотиды синтезируются на уридиновых универсальных подложках с использованием фосфорамидитного подхода на Oligomaker 48 в масштабе 1 мкмоль. В конце синтеза олигонуклеотиды отщепляются от твердой подложки с использованием водного аммиака в течение 5-16 часов при 60°С. Олигонуклеотиды очищаются посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) или посредством экстракций твердой фазы и характеризуются посредством СВЭЖХ (сверхэффективная жидкостная хроматография), и далее подтверждается молекулярная масса посредством МС-ЭРИ (масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией).

Элонгация олигонуклеотида:

Связывание β-цианоэтил-фосфорамидитов (ДНК-А(Bz), ДНК-G(ibu), ДНК-C(Bz), ДНК-Т, LNA-5-метил-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) или LNA-T) проводится посредством применения раствора 0,1 М амидита, защищенного 5'-O-DMT, в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Для последнего цикла может быть использован фосфорамидит с желательными модификациями, например, С6-линкер для присоединения конъюгатной группы или конъюгатная группа как таковая. Тиолирование для введения фосфортиоатных связей проводится с использованием ксантангидрида (0,01 М в ацетонитриле/пиридине 9:1). Фосфодиэфирные связи могут вводиться с использованием 0,02 М йода в THF/пиридине/воде 7:2:1. Остальными реактивами являются реактивы, типично используемые для синтеза олигонуклеотидов.

Для конъюгирования после твердофазного синтеза можно использовать имеющийся в продаже С6 аминолинкер фосфорамидит в последнем цикле твердофазного синтеза, и после снятия защиты и отщепления от твердой подложки выделяется связанный аминолинкером олигонуклеотид со снятой защитой. Конъюгаты вводятся через активацию функциональной группы с использованием стандартных способов синтеза.

В качестве альтернативы, конъюгатную группировку можно добавлять к олигонуклеотиду, в то время как он все еще находится на твердой подложке с использованием фосфорамидита с GalNAc или с кластером GalNAc, как описано в PCT/EP2015/073331 или в заявке EP № 15194811.4.

Очистка посредством ВЭЖХ-ОФ:

Неочищенные соединения очищают препаративной ВЭЖХ-ОФ на колонке Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150×10 мм. В качестве буферов используют 0,1 М ацетат аммония, рН 8, и ацетонитрил при скорости тока 5 мл/мин. Отобранные фракции лиофилизируют с получением очищенного соединения - типично в виде белого твердого вещества.

Сокращения:

DCI: 4,5-дицианоимидазол DCM: дихлорметан DMF: диметилформамид DMT: 4,4'-диметокситритил THF: тетрагидрофуран Bz: бензоил Ibu: изобутирил

ВЭЖХ-ОФ: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой

Анализ T_m

Дуплексы олигонуклеотида и РНК-мишени (связанной фосфатом - РО) разводят до 3 мМ в 500 мл воды, не содержащей РНКазы, и смешивают с 500 мл 2× T_m-буфера (200 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 20 мМ фосфат Na, pH 7,0). Данный раствор нагревают до 95°С в течение 3 мин и затем дают осуществляться отжигу при комнатной температуре в течение 30 мин. Температуры плавления дуплекса (T_m) измеряют на спектрофотометре Lambda 40, работающем в ультрафиолетовой/видимой области, оснащенном программатором температуры Пелетье РТР6, используя программу PE Templab (Perkin Elmer). Температура повышается от 20°С до 95°С и затем снижается до 25°С, с записью поглощения при 260 нм. Для оценки T_m дуплекса используются первая производная и локальные максимумы как плавления, так и отжига.

Анализ тканеспецифичного расщепления линкера in vitro

Меченные FAM олигонуклеотиды с биорасщепляемым линкером, подлежащие тестированию (например, фосфодиэфирный линкер ДНК (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro с использованием гомогенатов релевантных тканей (например, печени или почки) и сыворотки.

Образцы ткани и сыворотки отбирают у подходящего животного (например, мыши, обезьяны, свиньи или крысы) и гомогенизируют в гомогенизационном буфере (0,5% Igepal CA-630, 25 мМ Tris, рН 8,0, 100 мМ NaCl, pH 8,0 (доведенный 1 н. NaOH). В гомогенаты ткани и сыворотку впрыскивают олигонуклеотид до концентраций 200 мкг/г ткани. Образцы инкубируются в течение 24 часов при 37°С, и затем данные образцы подвергают экстракции фенолом-хлороформом. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО (высокоэффективная жидкостная хроматография на анионообменной колонке) на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.

Анализ расщепления нуклеазой S1

Меченные FAM олигонуклеотиды с линкерами, чувствительными к нуклеазе S1 (например, фосфодиэфирный ДНК-линкер (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro в экстракте нуклеазы S1 или сыворотке.

100 мкМ олигонуклеотидов подвергаются расщеплению in vitro нуклеазой S1 в буфере для нуклеазы (60 U на 100 мкл) в течение 20 и 120 минут. Ферментативную активность останавливают добавлением в раствор буфера EDTA. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.

Получение одноядерных клеток печени

Клетки печени от мышей AAV/HBV получали, как описано ниже, и согласно способу, описанному Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417:185-201, с небольшими модификациями. После умерщвления мышей осуществляли перфузию печени 10 мл стерильного PBS через портальную вену печени с использованием шприца с иглой калибра 25. Когда орган становлся бледным, данный орган отбирали в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) плюс 5 % фетальной телячьей сыворотки с удаленным комплементом (FCS). Отобранную печень аккуратно продавливали через 100 мкм клеточное сито (BD Falcon, 352360), и клетки суспендировали в 30 мл HBSS плюс 5% FCS. Суспензию клеток центрифугировали при 50 g в течение 5 мин. Супернатанты затем центрифугировали при 289 g в течение 10 мин при 4°С. После центрифугирования супернатанты отбрасывали, и осадки ресуспендировали в 15 мл при комнатной температуре в 35%-ном изотоничном растворе перколла (Percoll от GE Healthcare #17-0891-01, разведенный в RPMI 1640 (GIBCO, 31870)) и переносили в 15 мл пробирку. Клетки далее центрифугировали при 1360 g в течение 25 мин при комнатной тмпературе. Супернатант отбрасывали отсасыванием, и осадок, содержащий одноядерные клетки, дважды промывали HBSS плюс 5% FCS.

Клетки культивировали в полной среде (α-минимальная незаменимая среда (Gibco, 22571), дополненная 10% FCS (Hyclone, # SH30066, партия APG21570), 100 U/мл пенициллина плюс 100 мкг/мл стрептомицина плюс 0,3 мг/мл L-глутамина (Gibco, 10378), 1× заменимыми аминокислотами (Gibco, 11140), 10 мМ Hepes (Gibco, 15630), 1 мМ пируватом натрия (Gibco, 11360) и 50 мкM β-меркаптоэтанолом (LKB, 1830)).

Поверхностное мечение клеток

Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном и промывали PBS для FACS (флуоресцентная сортировка клеток) (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия). Клетки инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего моноклональные антитела (Mab) против NK P46 BV421 (крысиное Mab против мышиного NK P46, Biolegend, 137612) и F4/80 (крысиное Mab против мышиного F4/80, конъюгированное с FITC (флюоресцеинизотиоцианат), BD Biolegend, 123108), и также добавляли два дополнительных поверхностных маркера: PD1 (крысиное Mab против мышиного PD1, конъюгированное с PE (фосфоэстераза), BD Biosciences, 551892) и PDL1 (крысиное Mab против мышиного PDL1 BV711, Biolegend, 124319).

Анализ внутриклеточного окрашивания на цитокины (ICS)

Анализы ICS проводили и на спленоцитах, и на одноядерных клетках печени. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи при 37° либо в одной полной среде в качестве негативного контроля, либо с пептидами, описанными в Таблице 9, в концентрации 2 мкг/мл. После одного часа инкубации добавляли брефельдин А (Sigma, B6542) в концентрации 2 мкг/мл.

После культуры в течение ночи клетки промывали PBS для FACS и инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего Mab. Смесь состояла из моноклональных антител против CD3 (Mab хомяка против мышиного CD3-PerCP, BD Biosciences, 553067), против CD8 (крысиное Mab против мышиного CD8-APC-H7, BD Biosciences, 560182), против CD4 (крысиное Mab против мышиного CD4-РЕ-Cy7, BD Biosciences, 552775) и против NK-клеток (крысиное Mab против мышиных NK P46 BV421, Biolegend, 137612). Клетки фиксировали после нескольких промывок и делали проницаемыми в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре с использованием Cytofix/Cytoperm, промывали раствором Perm/Wash (BD Biosciences, 554714) при 4°С.

Внутриклеточное окрашивание на цитокины с использованием антител против IFNγ (интерферон-гамма) (крысиное Mab против мышиного IFNγ-APC, клон XMG1.2, BD Biosciences, 554413) и фактора некроза опухолей-альфа (TNFα) (крысиное Mab против мышиного TNFα-FITC, клон MP6-XT22; 1/250 (BD Biosciences 554418) проводили в течение 30 мин в темноте при 4°С. Перед анализом посредством проточной цитометрии с использованием анализатора MACSQuant клетки промывали Perm/Wash и ресуспендировали в PBS для FACS, содержащем 1% формальдегида.

Живые клетки CD3+CD8+CD4- и CD3+CD8-CD4+ сортировали и представляли на точечном графке. Определяли две области для сортировки позитивных клеток в отношении каждого цитокина. Число событий, обнаруженное при данных сортировках, делили на общее число событий в родительской популяции для получения процентных содержаний отвечающих Т-клеток. Для каждой мыши процентная доля, полученная в одной среде, рассматривалась как фон и вычиталась из процентной доли, полученной при стимулированиях пептидами.

Порог позитивности определяли согласно фону эксперимента, т.е. средней процентной доле окрашенных клеток, полученной для каждой группы в условиях одной среды, плюс два стандартных отклонения. Только процентная доля цитокина, представленного по меньшей мере в 5 событиях, считалась позитивной.

Таблица 9: эпитопы, ограниченные HLA-A2/DR1, содержащиеся в коровом белке HBV и доменах оболочки HВsAg (S2+S).

Белок Положение начала Положение конца Последовательность Ограничение
HLA Ссылки Ядро 18 27 FLPSDFFPSV
(SEQ ID NO: 773) A2 Bertoletti et al
Gastroenterology 1997;112:193-199 111 125 GRETVLEYLVSFGVW
(SEQ ID NO: 774) DR1 (Bertoletti et al
Gastroenterology 1997;112:193-199 Оболочка (S2+S) 114 128 TTFHQTLQDPRVRGL
(SEQ ID NO: 775) DR1 Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790. 179 194 QAGFFLLTRILTIPQS
(SEQ ID NO: 776) A2 + DR1 Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790. 183 191 FLLTRILTI
(SEQ ID NO: 777) A2 Sette et al J Immunol
1994;153:5586-5592. 200 214 TSLNFLGGTTVCLGQ
(SEQ ID NO: 778) A2 + DR1 Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790. 204 212 FLGGTTVCL
(SEQ ID NO: 779) A2 Rehermann et al J Exp Med 1995;181: 1047-1058. 335 343 WLSLLVPFV
(SEQ ID NO: 780) A2 Nayersina et alJ Immunol 1993;150: 4659-4671. 337 357 SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV
(SEQ ID NO: 781) A2 + DR1 Loirat et al J Immunol 2000;165: 4748-4755 348 357 GLSPTVWLSV
(SEQ ID NO: 782) A2 Loirat et al J Immunol 2000;165: 4748-4755 370 379 SILSPFLPLL
(SEQ ID NO: 783) A2 Mizukoshi et al J Immunol 2004;173: 5863-5871.

Пример 1. Тестирование эффективности in vitro

Проводили прогулку по гену по человеческому транскрипту PD-L1, используя, главным образом, 16-20-мерные гэпмеры. Тестирование эффективности проводили в эксперименте in vitro в моноцитарной линии клеток человеческого лейкоза ТНР1 и в линии клеток человеческой неходжкинской лимфомы K (KARPAS-299).

Линии клеток

Линию клеток ТНР1 и Karpas-299 исходно приобретали в Европейской коллекции аутентичных культур клеток (ЕСАСС) и поддерживали, как рекомендовано поставщиком, в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂.

Эффективность олигонуклеотидов

Клетки ТНР-1 (3×10⁴ в RPMI-Glutamax, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) добавляли к олигонуклеотидам (4-5 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 6 суток в конечном объеме 100 мкл/лунку. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в одной единственной концентрации (20 мкМ) и в интервале дозы-концентрациях от 25 мкМ до 0,004 мкМ (разведение 1:3 в воде). Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ (количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) с использованием набора TaqMan RNA-to-ct 1-Step (Thermo Fisher Scientific) на приборе QuantStudio (Applied Biosystems) с предварительно сконструированными праймерами Taqman, нацеленными на человеческий PD-L1 и ACTB, используемый в качестве эндогенного контроля (Thermo Fisher Scientific). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 рассчитывали с использованием способа 2(-дельта дельта С(Т)), а процентную долю ингибирования выражали в % по сравнению с контрольным образцом (необработанные клетки).

Клетки Karpas-299 культивировали в RPMI 1640, 2 мМ глутамине и 20% FBS (Sigma). Клетки, посеянные в количестве 10000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 24 часов перед добавлением олигонуклеотидов, растворенных в PBS. Конечная концентрация олигонуклеотидов была в одной дозе 5 мкМ в конечном объеме культуры 100 мкл/лунку, или их добавляли в дозе, варьирующей от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ в объеме культуры 100 мкл. Клетки отбирали через 3 суток после добавления олигонуклеотидных соединений, и РНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфат) (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализов PD-L1 (Applied Biosystems; Hs01125299_m1) и TBP (Applied Biosystems; 4325803). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % от контрольного образца (клетки, обработанные PBS).

Таблица 10: эффективность in vitro соединений против PD-L1 в линиях клеток ТНР1 и KARPAS-299 (среднее из экспериментов с n, равным 3). Уровни мРНК PD-L1 нормировали к ТВР в клетках KARPAS-299 или к АСТВ в клетках ТНР1, и они показаны как % от контроля (клетки, обработанные PBS).

CMP ID NO Клетки KARPAS-299
5 мкМ CMP Клетки THP1
20 мкМ CMP Соединение (CMP) Начало на SEQ ID NO 1 % мРНК от контроля sd % мРНК от контроля sd 4_1 50 1 32 11 TAattggctctacTGC 236 5_1 25 5 9 6 TCGCataagaatgaCT 371 6_1 29 2 15 5 TGaacacacagtcgCA 382 7_1 27 7 3 1 CTGaacacacagtCGC 383 8_1 23 4 11 3 TCTgaacacacagtCG 384 9_1 32 3 19 6 TTCtgaacacacagTC 385 10_1 57 5 39 16 ACaagtcatgttaCTA 463 11_1 75 5 37 12 ACacaagtcatgttAC 465 12_1 22 2 10 3 CTtacttagatgcTGC 495 13_1 33 4 23 11 ACttacttagatgCTG 496 14_1 33 7 21 6 GACttacttagatgCT 497 15_1 41 6 18 10 AGacttacttagaTGC 498 16_1 96 14 40 7 GCAggaagagactTAC 506 17_1 22 2 9 3 AATAaattccgttCAGG 541 18_1 34 6 21 9 GCAAataaattcCGTT 545 18_2 51 4 27 11 GCAaataaattccGTT 545 19_1 38 5 23 7 AGCAaataaattcCGT 546 20_1 73 8 56 15 CAGAgcaaataaatTCC 548 21_1 83 8 65 10 TGGAcagagcaaataAAT 551 22_1 86 6 80 8 ATGGacagagcaAATA 554 23_1 44 4 30 2 CAgaatggacagaGCA 558 24_1 63 10 40 11 TTCtcagaatggacAG 562 25_1 31 1 39 5 CTGAactttgacATAG 663 26_1 60 4 56 19 AAgacaaacccagacTGA 675 27_1 36 4 34 10 TATAagacaaacccAGAC 678 28_1 40 4 28 13 TTATaagacaaaccCAGA 679 29_1 30 2 18 6 TGTTataagacaaaCCC 682 30_1 77 3 67 10 TAGAacaatggtaCTTT 708 31_1 81 17 20 14 GTAGaacaatggtaCT 710 32_1 29 5 14 8 AGGtagaacaatgGTA 712 33_1 32 1 43 20 AAGAggtagaacaATGG 714 34_1 70 4 35 13 GCatccacagtaaaTT 749 35_1 83 2 66 21 GAaggttatttaaTTC 773 36_1 18 2 15 5 CTAAtcgaatgcaGCA 805 37_1 64 7 35 10 TACccaatctaatCGA 813 38_1 69 1 49 13 TAGttacccaatcTAA 817 39_1 49 5 26 9 CATttagttacccAAT 821 40_1 23 7 8 2 TCAtttagttaccCAA 822 41_1 24 6 12 3 TTcatttagttaCCCA 823 42_1 51 7 40 5 GAATtaatttcattTAGT 829 43_1 71 9 45 3 CAGTgaggaattaATTT 837 44_1 60 5 45 17 CCAAcagtgaggAATT 842 45_1 63 1 37 15 CCCaacagtgaggAAT 843 46_1 31 3 29 12 TAtacccaacagtgAGG 846 47_1 44 3 27 0 TTatacccaacagTGAG 847 48_1 38 3 26 6 TTTatacccaacagTGA 848 49_1 20 4 7 1 CCTttatacccaaCAG 851 50_1 22 3 6 2 TAACctttatacCCAA 854 51_1 28 1 29 16 AATaacctttataCCCA 855 52_1 80 11 48 10 GTAaataacctttaTA 859 53_1 54 4 37 14 ACTGtaaataacctTTAT 860 54_1 81 4 53 15 ATAtatatgcaatgAG 903 55_1 86 12 70 15 AGatatatatgcaaTG 905 56_1 56 8 27 7 GAGatatatatgcAAT 906 57_1 28 7 13 5 CCagagatatataTGC 909 58_1 88 13 69 23 CAATattccagagATAT 915 59_1 29 3 14 6 GCAAtattccagagATA 916 60_1 25 3 14 3 AGCaatattccagaGAT 917 61_1 29 4 17 2 CAGcaatattccAGAG 919 62_1 27 3 14 3 AATCagcaatattCCAG 921 63_1 23 6 12 6 ACAAtcagcaataTTCC 923 64_1 53 9 43 15 ACtaagtagttacactTCT 957 65_1 32 5 14 6 CTAAgtagttacactTC 958 66_1 35 4 31 6 GACtaagtagttacaCTT 959 67_1 64 10 55 14 TGActaagtagtTACA 962 68_1 62 11 57 16 CTTTgactaagtagTTA 964 69_1 42 9 59 13 CTCtttgactaagTAG 967 70_1 81 6 56 12 GCTCtttgactaagTA 968 71_1 27 3 39 9 CCttaaatactgtTGAC 1060 72_1 75 5 36 7 CTtaaatactgttgAC 1060 73_1 35 6 43 13 TCCttaaatactgTTG 1062 74_1 57 4 79 25 TCTCcttaaatactgTT 1063 75_1 53 6 28 6 TAtcatagttctCCTT 1073 76_1 26 4 9 2 AGTatcatagttcTCC 1075 77_1 74 5 39 12 GAgtatcatagttCTC 1076 78_1 49 5 35 6 AGagtatcatagTTCT 1077 78_2 74 6 36 8 AGAgtatcatagtTCT 1077 79_1 19 2 19 13 CAGagtatcatagTTC 1078 80_1 23 2 26 2 TTCAgagtatcataGT 1080 81_1 35 3 36 11 CTTcagagtatcATAG 1081 82_1 24 6 20 7 TTCTtcagagtatcaTA 1082 83_1 20 2 16 2 TTTcttcagagtaTCAT 1083 84_1 33 4 37 10 GAGAaaggctaagTTT 1099 85_1 42 2 35 18 GAcactcttgtaCATT 1213 86_1 50 4 54 8 TGagacactcttgtaCA 1215 87_1 50 8 28 8 TGagacactcttgTAC 1216 88_1 61 4 33 6 CTttattaaactCCAT 1266 89_1 71 8 43 12 ACCAaactttattaAA 1272 90_1 62 5 42 9 AAACctctactaagTG 1288 91_1 22 3 12 5 AGattaagacagtTGA 1310 92_1 46 3 ND - не определяется ND AAgtaggagcaagaGGC 1475 93_1 42 4 60 24 AAAGtaggagcaagAGG 1476 94_1 86 15 46 10 GTtaagcagccaggAG 1806 95_1 66 6 82 27 AGggtaggatgggtAG 1842 96_1 83 19 62 36 AAGggtaggatgggTA 1843 97_1 60 9 69 5 CAAgggtaggatggGT 1844 97_2 76 13 34 7 CAagggtaggatggGT 1844 98_1 65 8 76 28 CCaagggtaggatgGG 1845 99_1 61 2 75 17 TCcaagggtaggatGG 1846 100_1 83 4 82 13 CTTCcaagggtaggAT 1848 101_1 45 3 52 14 ATCttccaagggtagGA 1849 102_1 29 2 17 7 AGaagtgatggctCATT 1936 103_1 26 3 22 1 AAGaagtgatggcTCAT 1937 104_1 34 6 22 2 GAAgaagtgatggcTCA 1938 105_1 41 5 21 5 ATGAaatgtaaacTGGG 1955 106_1 40 8 29 6 CAATgaaatgtaaaCTGG 1956 107_1 24 3 16 4 GCAAtgaaatgtaaACTG 1957 108_1 30 4 20 6 AGCAatgaaatgtaAACT 1958 109_1 44 4 34 14 GAGCaatgaaatgtAAAC 1959 110_1 18 1 13 3 TGaattcccatatcCGA 1992 111_1 69 8 35 8 AGaattatgaccaTAT 2010 112_1 77 7 38 10 AGGtaagaattatGACC 2014 113_1 97 10 56 13 TCAGgtaagaattaTGAC 2015 114_1 69 8 54 21 CTTCaggtaagaatTATG 2017 115_1 91 7 115 42 TCTTcaggtaagaATTA 2019 116_1 88 6 104 36 CTTCttcaggtaaGAAT 2021 117_1 85 6 118 17 TCTTcttcaggtaaGAA 2022 118_1 105 14 102 9 TCTtcttcaggtaAGA 2023 119_1 37 2 76 18 TGGtctaagagaaGAAG 2046 120_1 46 6 81 11 GTTGgtctaagagAAG 2049 121_1 74 11 64 4 AGTtggtctaagAGAA 2050 122_1 74 9 55 21 CAgttggtctaagAGAA 2050 123_1 65 9 95 21 GCAgttggtctaagagAA 2050 124_1 63 7 ND ND CAGTtggtctaagaGA 2051 125_1 65 6 ND ND GCagttggtctaagaGA 2051 126_1 67 14 104 34 GCagttggtctaaGAG 2052 127_1 22 6 10 3 CTcatatcagggCAGT 2063 128_1 50 4 46 9 CACAcatgttctttaAC 2087 129_1 22 4 12 12 TAAatacacacatgTTCT 2092 130_1 24 2 43 28 GTAAatacacacatgTTC 2093 131_1 33 3 20 12 TGTAaatacacacaTGTT 2094 132_1 73 17 57 21 GATCatgtaaatacACAC 2099 133_1 47 5 28 14 AGATcatgtaaataCACA 2100 134_1 35 6 26 11 CAAAgatcatgtaaatACAC 2101 135_1 30 2 14 3 ACAAagatcatgtaaaTACA 2102 136_1 52 6 24 18 GAATacaaagatcaTGTA 2108 137_1 33 5 20 6 AGAAtacaaagatcATGT 2109 138_1 37 1 22 15 CAGAatacaaagatCATG 2110 139_1 85 6 53 8 GCAGaatacaaagATCA 2112 140_1 79 4 40 6 AGGCagaatacaaagAT 2114 141_1 56 2 53 20 AAGGcagaatacaaAGA 2115 142_1 28 5 20 5 ATTagtgagggacGAA 2132 143_1 26 2 22 10 CAttagtgagggaCGA 2133 144_1 29 6 16 4 GAgggtgatggatTAG 2218 145_1 45 6 22 5 TTaggagtaataAAGG 2241 146_1 65 7 44 9 TTAatgaatttggtTG 2263 147_1 84 8 43 10 CTttaatgaatttgGT 2265 148_1 32 0 15 3 CATGgattacaactAA 2322 149_1 33 2 20 4 TCatggattacaaCTA 2323 150_1 29 1 11 3 GTCatggattacaaCT 2324 151_1 64 2 40 9 CAttaaatctagTCAT 2335 152_1 97 8 63 22 GACAttaaatctagTCA 2336 153_1 92 7 ND ND AGGGacattaaatcTA 2340 154_1 35 4 25 15 CAAAgcattataaCCA 2372 155_1 34 3 24 6 ACttactaggcaGAAG 2415 156_1 102 6 113 18 CAGAgttaactgtaCA 2545 157_1 102 10 103 15 CCAGagttaactgtAC 2546 158_1 88 7 95 18 GCcagagttaactgTA 2547 159_1 78 10 ND ND TGggccagagttaaCT 2550 160_1 59 5 26 5 CAgcatctatcagaCT 2576 161_1 78 8 42 10 TGAaataacatgagTCAT 2711 162_1 31 6 ND ND GTGaaataacatgAGTC 2713 163_1 18 2 11 3 TCTGtttatgtcacTG 2781 164_1 56 5 29 9 GTCTgtttatgtcaCT 2782 165_1 37 8 12 5 TGgtctgtttatGTCA 2784 166_1 39 1 19 3 TTGGtctgtttatgTC 2785 167_1 41 3 35 14 TCacccattgtttaAA 2842 168_1 18 3 14 4 TTcagcaaatatTCGT 2995 169_1 36 8 13 2 GTGtgttcagcaaATAT 2999 170_1 18 2 11 4 TCTattgttaggtATC 3053 171_1 67 4 26 12 ATtgcccatcttacTG 3118 172_1 71 2 33 9 TATtgcccatcttaCT 3119 173_1 47 4 20 5 AAatattgcccatCTT 3122 174_1 74 4 34 7 ATAaccttatcataCA 3174 175_1 98 19 44 12 TAtaaccttatcaTAC 3175 176_1 100 10 64 11 TTAtaaccttatcaTA 3176 177_1 72 38 28 5 TTTataaccttatCAT 3177 178_1 47 6 34 6 ACtgctattgctaTCT 3375 179_1 41 3 23 6 AGgactgctattgCTA 3378 180_1 32 6 27 7 GAGgactgctattgCT 3379 181_1 83 1 46 20 ACgtagaataataaCA 3561 182_1 94 4 52 9 CCaagtgatataATGG 3613 183_1 49 2 16 3 TTagcagaccaaGTGA 3621 184_1 96 3 26 5 GTttagcagaccaaGT 3623 185_1 78 3 46 10 TGacagtgattataTT 3856 186_1 88 5 45 21 TGTCcaagatattgAC 3868 187_1 46 6 23 6 GAAtatcctagatTGT 4066 188_1 79 3 45 14 CAaactgagaataTCC 4074 189_1 63 5 27 8 GCAaactgagaataTC 4075 190_1 77 9 37 11 TCCtattacaatcgTA 4214 191_1 74 10 36 9 TTCCtattacaatcGT 4215 192_1 91 8 51 28 ACtaatgggaggatTT 4256 193_1 95 14 67 24 TAgttcagagaataAG 4429 194_1 86 5 47 16 TAacatatagttcAGA 4436 195_1 87 4 81 20 ATAacatatagttcAG 4437 196_1 101 6 67 20 CAtaacatatagttCA 4438 197_1 91 6 60 13 TCataacatatagtTC 4439 198_1 61 3 31 10 TAGCtcctaacaatCA 4507 199_1 79 12 49 11 CTCCaatctttgtaTA 4602 200_1 74 2 58 13 TCTCcaatctttgtAT 4603 201_1 53 3 33 10 TCtatttcagccaaTC 4708 202_1 25 4 30 9 CGGaagtcagagtGAA 4782 203_1 32 5 21 7 TTAAgcatgaggaaTA 4798 204_1 34 10 26 11 TGAttgagcacctCTT 4831 205_1 81 12 62 12 GACtaattatttcgTT 4857 206_1 57 7 37 7 TGActaattatttCGT 4858 207_1 26 5 21 6 GTGactaattattTCG 4859 208_1 48 3 33 13 CTGCttgaaatgtgAC 4870 209_1 32 1 34 13 CCtgcttgaaatgTGA 4871 210_1 60 5 50 19 ATcctgcttgaaATGT 4873 211_1 111 8 110 26 ATTataaatctatTCT 5027 212_1 107 1 67 12 GCtaaatactttcATC 5151 213_1 26 3 19 6 CAttgtaacataCCTA 5251 214_1 33 2 20 4 GCattgtaacatacCT 5252 215_1 89 8 53 16 TAatattgcaccaaAT 5295 216_1 25 2 29 9 GAtaatattgcacCAA 5297 217_1 27 1 27 6 AGataatattgcacCA 5298 218_1 79 6 45 11 GCcaagaagataATAT 5305 219_1 159 16 68 14 CACAgccacataaaCT 5406 220_1 90 2 72 12 TTgtaattgtggaaAC 5463 221_1 10 2 11 5 TGacttgtaattgTGG 5467 222_1 82 1 67 18 TCtaactgaaatagTC 5503 223_1 30 1 32 9 GTGgttctaactgaAA 5508 224_1 53 7 53 15 CAatatgggacttgGT 5522 225_1 44 1 33 10 ATGacaatatgggaCT 5526 226_1 49 1 41 14 TATGacaatatgggAC 5527 227_1 77 1 54 15 ATATgacaatatggGA 5528 228_1 100 3 98 29 CTtcacttaataaTTA 5552 229_1 90 12 80 19 CTGCttcacttaatAA 5555 230_1 91 0 79 23 AAgactgcttcacTTA 5559 231_1 49 8 77 34 GAATgccctaattaTG 5589 232_1 17 7 88 33 TGGaatgccctaatTA 5591 233_1 40 5 35 10 GCAaatgccagtagGT 5642 234_1 81 6 72 25 CTAatggaaggattTG 5673 235_1 97 17 87 25 AAtatagaacctaaTG 5683 236_1 98 4 83 21 GAAagaatagaatGTT 5769 237_1 93 2 102 26 ATGggtaatagattAT 5893 238_1 110 24 44 14 GAaagagcacagggTG 6103 239_1 66 5 36 10 CTACatagagggaaTG 6202 240_1 70 4 34 8 GCttcctacataGAGG 6207 241_1 64 NA - не анализировали 33 6 TGCTtcctacatagAG 6208 242_1 30 NA 19 7 TGggcttgaaataTGT 6417 243_1 88 6 69 15 CATtatatttaagaAC 6457 244_1 8 2 5 2 TCggttatgttaTCAT 6470 245_1 18 9 12 4 CActttatctggTCGG 6482 246_1 37 2 19 5 AAAttggcacagcGTT 6505 247_1 46 12 29 8 ACCGtgacagtaaATG 6577 248_1 31 2 25 2 TGggaaccgtgacagTA 6581 249_1 17 2 23 9 CCacatataggtcCTT 6597 250_1 15 6 23 7 CAtattgctaccaTAC 6617 251_1 4 2 9 2 TCAtattgctaccATA 6618 252_1 65 12 85 14 CAATtgtcatatTGCT 6624 253_1 20 2 51 7 CATtcaattgtcataTTG 6626 254_1 48 8 91 41 TTTCtactgggaaTTTG 6644 255_1 11 5 23 8 CAAttagtgcagcCAG 6672 256_1 43 7 62 13 GAATaatgttcttaTCC 6704 257_1 28 2 36 19 CACAaattgaataatgtTCT 6709 258_1 64 4 78 22 CATGcacaaattgaaTAAT 6714 259_1 53 8 104 73 ATCctgcaatttcaCAT 6832 260_1 54 5 59 14 CCaccatagctgatCA 6868 261_1 42 8 52 22 ACcaccatagctgaTCA 6868 262_1 68 5 118 66 CAccaccatagctgaTC 6869 263_1 40 2 73 20 TAgtcggcaccaccAT 6877 264_1 64 6 72 35 CttgtagtcggcaccAC 6880 265_1 56 4 82 35 CttgtagtcggcacCA 6881 266_1 41 5 46 21 CGcttgtagtcggcAC 6883 267_1 51 4 33 14 TCAataaagatcagGC 6942 268_1 61 2 49 10 TGgacttacaagaaTG 6986 269_1 45 7 40 9 ATGgacttacaagaAT 6987 270_1 51 12 36 12 GCTCaagaaattggAT 7073 271_1 17 0 14 5 TACTgtagaacatgGC 7133 272_1 15 3 11 3 GCAAttcatttgaTCT 7239 273_1 64 11 ND ND TGaagggaggagggacAC 7259 274_1 52 6 50 28 AGtggtgaagggaggAG 7265 275_1 79 7 ND ND TAgtggtgaagggaggAG 7265 276_1 81 6 ND ND AtagtggtgaagggaggAG 7265 277_1 70 9 ND ND TAgtggtgaagggagGA 7266 278_1 84 9 ND ND ATagtggtgaagggagGA 7266 279_1 40 6 64 53 TAGtggtgaagggaGG 7267 280_1 42 10 ND ND ATAgtggtgaagggaGG 7267 281_1 63 7 ND ND GAtagtggtgaagggaGG 7267 282_1 27 7 38 11 ATAGtggtgaagggAG 7268 283_1 60 22 ND ND GAtagtggtgaaggGAG 7268 284_1 23 3 97 54 GAgatagtggtgAAGG 7271 285_1 51 6 72 19 CATGggagatagtgGT 7276 286_1 7 1 21 9 ACAAataatggttaCTCT 7302 287_1 66 8 48 20 ACACacaaataatgGTTA 7306 288_1 67 6 58 20 GAGggacacacaaaTAAT 7311 289_1 46 2 50 21 ATATagagaggcTCAA 7390 290_1 22 6 ND ND TTgatatagagaGGCT 7393 291_1 11 2 17 3 GCATttgatatagAGA 7397 292_1 70 18 44 8 TTtgcatttgataTAG 7400 293_1 30 1 30 9 CTGgaagaataggtTC 7512 294_1 53 5 42 10 ACTGgaagaataggTT 7513 295_1 56 2 41 15 TACTggaagaatagGT 7514 296_1 80 8 53 13 TGGCttatcctgtaCT 7526 297_1 73 6 52 14 ATggcttatcctGTAC 7527 298_1 75 7 89 25 TATGgcttatcctgTA 7528 299_1 52 5 50 11 GTAtggcttatccTGT 7529 300_1 27 3 31 6 ATgaatatatgccCAGT 7547 301_1 41 8 33 9 GAtgaatatatgCCCA 7549 302_1 8 2 ND ND CAAgatgaatataTGCC 7551 303_1 32 5 37 14 GACAacatcagtaTAGA 7572 304_1 28 5 30 23 CAAGacaacatcAGTA 7576 305_1 47 5 41 9 CACtcctagttccTTT 7601 306_1 39 6 33 7 AACactcctagttCCT 7603 307_1 68 3 42 14 TAacactcctagtTCC 7604 308_1 115 5 69 22 CTaacactcctagtTC 7605 309_1 97 16 57 14 TGataacataactgTG 7637 310_1 36 1 23 10 CTgataacataaCTGT 7638 311_1 38 5 24 5 TTTGaactcaagtgAC 7654 312_1 42 3 39 5 TCCTttacttagcTAG 7684 313_1 15 2 14 3 GAgtttggattagCTG 7764 314_1 49 28 ND ND TGggatatgacagGGA 7838 315_1 34 6 ND ND TGTGggatatgacaGG 7840 316_1 47 3 37 8 ATATggaagggataTC 7875 317_1 11 3 ND ND ACAggatatggaaGGG 7880 318_1 48 4 ND ND ATTTcaacaggatATGG 7885 319_1 18 2 16 4 GAgtaatttcaacAGG 7891 320_1 74 6 44 5 AGGGagtaatttcAACA 7893 321_1 38 5 56 28 ATTAgggagtaatTTCA 7896 322_1 66 9 32 11 CTtactattaggGAGT 7903 323_1 13 1 15 5 CAgcttactattaGGG 7906 324_1 26 4 20 9 TCAgcttactattAGG 7907 325_1 43 4 17 2 ATTtcagcttactaTTAG 7908 326_1 54 5 57 16 TTcagcttactaTTAG 7908 327_1 28 3 8 2 CAGAtttcagcttaCT 7913 328_1 43 4 37 16 GACtacaactagagGG 7930 329_1 45 12 36 10 AGACtacaactagaGG 7931 330_1 99 8 94 32 AAgactacaactagAG 7932 331_1 59 4 52 19 ATGAtttaattctagtCAAA 7982 332_1 100 2 84 23 TTTaattctagtcAAA 7982 333_1 91 9 60 19 GATTtaattctaGTCA 7984 771_1 74 6 50 5 TGAtttaattctaGTCA 7984 334_1 73 5 54 12 ATGAtttaattctagTCA 7984 335_1 15 1 26 3 GATGatttaattctagtCA 7984 336_1 71 22 49 16 GAtttaattctaGTCA 7984 337_1 43 5 30 11 GATGatttaattctaGTC 7985 338_1 98 5 90 27 TGatttaattctagTC 7985 339_1 87 21 86 2 GAGAtgatttaatTCTA 7988 340_1 92 5 85 27 GAGatgatttaatTCT 7989 341_1 7 1 7 1 CAGAttgatggtagTT 8030 342_1 7 2 24 11 CTcagattgatgGTAG 8032 343_1 3 1 14 9 GTTagccctcagaTTG 8039 344_1 14 5 20 7 TGtattgttagcCCTC 8045 345_1 10 2 11 5 ACttgtattgttAGCC 8048 346_1 52 4 52 17 AGCcagtatcagggAC 8191 347_1 33 3 18 8 TTgacaatagtgGCAT 8213 348_1 7 2 13 5 ACAagtggtatctTCT 8228 349_1 63 8 44 15 AATCtactttacaaGT 8238 350_1 36 2 ND ND CAcagtagatgcctGATA 8351 351_1 24 2 30 9 GAacacagtagatGCC 8356 352_1 23 4 103 14 CTTGgaacacagtagAT 8359 353_1 20 2 45 2 ATAtcttggaacaCAG 8364 354_1 25 3 24 6 TCTttaatatcttgGAAC 8368 355_1 39 2 41 10 TGatttctttaatatCTTG 8372 356_1 54 5 88 43 TGatgatttctttaaTATC 8375 357_1 31 4 45 27 AGGctaagtcatgaTG 8389 358_1 18 3 43 20 TTGAtgaggctaagTC 8395 359_1 6 2 11 2 CCAggattatactcTT 8439 360_1 43 5 40 14 GCcaggattataCTCT 8440 361_1 56 8 73 13 CTGccaggattataCT 8442 362_1 23 1 33 7 CAGAaacttatactttaTG 8473 363_1 49 8 45 14 AAGCagaaacttaTACT 8478 364_1 39 6 37 4 GAAgcagaaacttaTACT 8478 365_1 26 4 45 13 TGGaagcagaaacttataCT 8478 366_1 21 4 44 5 TGGaagcagaaacttaTAC 8479 367_1 97 4 70 22 AAgcagaaacttaTAC 8479 368_1 34 3 32 11 TGGaagcagaaactTATA 8480 369_1 71 7 46 19 AAGGgatattatggAG 8587 370_1 51 9 79 38 TGccggaagatttcCT 8641 371_1 45 6 52 25 ATGGattgggagtaGA 8772 372_1 27 7 30 8 AGatggattgggagTA 8774 373_1 13 3 28 6 AAGatggattgggaGT 8775 374_1 42 10 44 11 ACaagatggattGGGA 8777 374_2 41 3 45 14 ACaagatggattggGA 8777 375_1 83 9 88 32 AGAaggttcagaCTTT 8835 376_1 40 5 33 3 GCAgaaggttcagaCT 8837 376_2 28 5 20 4 GCagaaggttcagACT 8837 377_1 70 2 43 8 TGCAgaaggttcagAC 8838 378_1 23 3 55 17 AGtgcagaaggttCAG 8840 378_2 51 6 41 8 AGTGcagaaggttcAG 8840 379_1 34 6 35 7 AAGTgcagaaggttCA 8841 380_1 44 11 24 6 TAagtgcagaagGTTC 8842 381_1 37 5 45 9 TCtaagtgcagaAGGT 8844 382_1 75 5 147 26 CTCaggagttctactTC 8948 383_1 90 10 141 55 CTCaggagttctaCTT 8949 384_1 73 8 234 116 AtggaggtgactcaggAG 8957 385_1 33 4 42 7 ATggaggtgactcagGA 8958 386_1 24 3 29 14 ATggaggtgactcAGG 8959 387_1 37 2 65 15 TAtggaggtgactcAGG 8959 388_1 50 10 81 19 ATatggaggtgactcaGG 8959 389_1 42 5 61 10 TATGgaggtgactcAG 8960 390_1 36 2 76 50 ATatggaggtgacTCAG 8960 391_1 52 6 64 6 CAtatggaggtgactcAG 8960 392_1 63 5 57 6 ATAtggaggtgacTCA 8961 393_1 53 7 64 12 CAtatggaggtgacTCA 8961 394_1 51 5 56 24 CAtatggaggtgACTC 8962 395_1 23 3 41 34 GCatatggaggtgacTC 8962 396_1 34 3 54 10 TGcatatggaggtgacTC 8962 397_1 54 5 71 24 TtgcatatggaggtgacTC 8962 398_1 61 11 59 13 TttgcatatggaggtgacTC 8962 399_1 25 2 30 6 GCatatggaggtgaCT 8963 400_1 34 4 25 9 TGcatatggaggtgaCT 8963 401_1 25 4 31 20 TTGcatatggaggtgaCT 8963 402_1 51 6 37 11 TttgcatatggaggtgaCT 8963 403_1 26 1 33 5 TGCatatggaggtgAC 8964 404_1 25 2 69 19 TTGcatatggaggtGAC 8964 405_1 26 4 24 4 TTTGcatatggaggtgAC 8964 406_1 19 3 20 7 TTTGcatatggaggtGA 8965 407_1 16 5 46 16 TTtgcatatggaGGTG 8966 408_1 9 2 9 6 AAgtgaagttcaaCAGC 8997 409_1 26 8 109 52 TGggaagtgaagTTCA 9002 410_1 31 5 24 5 ATgggaagtgaagTTC 9003 411_1 49 9 19 10 GATGggaagtgaaGTT 9004 412_1 28 10 17 9 CTGtgatgggaagtGAA 9007 413_1 54 4 34 8 ATTgagtgaatccAAA 9119 414_1 11 1 14 2 AAttgagtgaatCCAA 9120 415_1 58 6 14 2 GATAattgagtgaaTCC 9122 416_1 5 1 16 3 GTGataattgagtGAA 9125 417_1 73 5 61 14 AAGaaaggtgcaaTAA 9155 418_1 86 6 64 13 CAagaaaggtgcAATA 9156 419_1 75 19 64 14 ACAAgaaaggtgcaAT 9157 420_1 75 8 50 13 ATttaaactcacaaAC 9171 421_1 21 8 23 6 CTgttaggttcaGCGA 9235 422_1 54 10 30 5 TCTGaatgaacatTTCG 9260 423_1 11 4 15 5 CTcattgaaggtTCTG 9281 424_1 87 3 52 8 CTAatctcattgaaGG 9286 425_1 95 1 85 13 CCtaatctcattgaAG 9287 426_1 31 7 22 7 ACTttgatctttcAGC 9305 427_1 64 7 49 16 ACtatgcaacacttTG 9315 428_1 18 6 21 3 CAAatagctttatCGG 9335 429_1 19 6 17 4 CCaaatagctttATCG 9336 430_1 35 4 27 8 TCCAaatagctttaTC 9337 431_1 75 8 43 7 GATCcaaatagcttTA 9339 432_1 67 11 32 8 ATgatccaaataGCTT 9341 433_1 53 5 43 6 TATGatccaaatagCT 9342 434_1 97 9 66 29 TAAAcagggctggGAAT 9408 435_1 58 12 44 17 ACttaaacagggCTGG 9412 436_1 58 10 30 12 ACacttaaacagGGCT 9414 437_1 87 38 41 3 GAACacttaaacAGGG 9416 438_1 70 4 59 33 AGAGaacacttaaACAG 9418 439_1 83 17 28 9 CTACagagaacaCTTA 9423 440_1 49 12 27 4 ATGctacagagaaCACT 9425 441_1 53 10 24 13 ATAAatgctacagagAACA 9427 442_1 23 6 20 10 AGataaatgctacaGAGA 9430 443_1 48 6 27 7 TAGAgataaatgcTACA 9434 444_1 51 3 32 8 TAGAtagagataaatGCT 9437 445_1 38 5 ND ND CAATatactagataGAGA 9445 446_1 52 3 31 1 TACAcaatatactagATAG 9448 447_1 65 6 48 11 CTAcacaatatacTAG 9452 448_1 67 9 29 2 GCTAcacaatatACTA 9453 449_1 103 17 65 15 ATATgctacacaatATAC 9455 450_1 71 13 129 22 TGATatgctacaCAAT 9459 451_1 19 4 9 1 ATGAtatgatatgCTAC 9464 452_1 75 10 45 21 GAGGagagagacaaTAAA 9495 453_1 68 6 43 10 CTAggaggagagagACA 9500 454_1 72 7 79 25 TATTctaggaggagAGA 9504 455_1 31 3 29 9 TTATattctaggagGAG 9507 456_1 38 5 62 17 GTTtatattctaGGAG 9510 457_1 15 6 15 8 TGgagtttatattcTAGG 9512 458_1 34 3 21 3 CGtaccaccactcTGC 9590 459_1 41 5 55 22 TGAGgaaatcattcATTC 9641 460_1 81 8 47 22 TTTGaggaaatcatTCAT 9643 461_1 76 8 39 5 AGGCtaatcctattTG 9657 462_1 93 12 216 12 TTTAggctaatcCTAT 9660 463_1 15 6 30 9 TGCtccagtgtaccCT 9755 464_1 27 3 25 6 TAgtagtactcgATAG 9813 465_1 9 2 7 3 CTAattgtagtagtaCTC 9818 466_1 52 3 32 6 TGctaattgtagTAGT 9822 467_1 68 11 36 16 AGTGctaattgtagTA 9824 468_1 35 6 32 3 GCAAgtgctaattgTA 9827 469_1 91 9 ND ND GAGGaaatgaactaattTA 9881 470_1 92 5 ND ND CAGGaggaaatgaacTA 9886 471_1 67 5 42 6 CCctagagtcattTCC 9902 472_1 35 5 20 8 ATCttacatgatgaAGC 9925 473_1 13 1 20 5 GACacactcagatttcAG 9967 474_1 24 4 20 2 AGacacactcagatttcAG 9967 475_1 25 4 24 7 AAGacacactcagatttcAG 9967 476_1 26 6 19 4 AGacacactcagattTCA 9968 477_1 28 4 32 13 AAGacacactcagattTCA 9968 478_1 31 8 37 6 AAagacacactcagatTTCA 9968 479_1 63 7 51 26 GAAagacacactcagatTTC 9969 480_1 37 10 ND ND AAGAcacactcagatTTC 9969 481_1 41 4 ND ND AAAGacacactcagaTTTC 9969 482_1 19 5 48 14 TGAAagacacactcagatTT 9970 483_1 60 8 68 10 TGaaagacacactcaGATT 9971 484_1 42 8 63 22 TGAaagacacactcaGAT 9972 485_1 48 9 41 20 ATTGaaagacacacTCA 9975 486_1 27 6 27 12 TCattgaaagacaCACT 9977 487_1 88 13 121 33 TTCcatcattgaAAGA 9983 488_1 80 12 ND ND ATAAtaccacttaTCAT 10010 489_1 13 4 27 15 TTacttaatttcttTGGA 10055 490_1 32 5 60 24 TTAgaactagctttaTCA 10101 491_1 58 10 55 17 GAGgtacaaatatAGG 10171 492_1 4 1 12 3 CTTatgatacaacTTA 10384 493_1 37 6 35 5 TCttatgatacaaCTT 10385 494_1 30 0 27 6 TTCttatgatacaaCT 10386 495_1 27 8 18 3 CAgtttcttatgaTAC 10390 496_1 25 10 25 6 GCAgtttcttatgaTA 10391 497_1 77 6 72 29 TACAaatgtctattagGTT 10457 498_1 66 5 69 17 TGTAcaaatgtctatTAG 10460 499_1 27 10 20 4 AGCatcacaattagTA 10535 500_1 31 10 25 5 CTAatgatagtgaaGC 10548 501_1 21 7 30 8 AGCtaatgatagtgAA 10550 502_1 35 5 39 8 ATGCcttgacatatTA 10565 503_1 64 11 79 26 CTCAagattattgACAC 10623 504_2 25 4 83 32 ACctcaagattaTTGA 10626 504_1 94 7 22 6 ACCtcaagattaTTGA 10626 505_1 31 6 34 10 AACCtcaagattatTG 10627 506_1 55 6 62 17 CACAaacctcaagattaTT 10628 507_1 66 12 40 4 GTActtaattagACCT 10667 508_1 78 5 80 10 AGTActtaattagACC 10668 509_1 36 5 42 15 GTATgaggtggtaaAC 10688 510_1 40 4 48 22 AGgaaacagcagaAGTG 10723 511_1 27 7 13 6 GCacaacccagaggAA 10735 512_1 54 5 ND ND CAAgcacaacccagAG 10738 513_1 35 7 ND ND TTCaagcacaaccCAG 10740 514_1 49 6 52 15 AAttcaagcacaACCC 10742 515_1 72 4 106 49 TAATaattcaagcacaaCC 10743 516_1 43 4 57 21 ACTAataattcaaGCAC 10747 517_1 37 3 60 12 ATAAtactaataattcAAGC 10749 518_1 9 3 6 1 TAgatttgtgagGTAA 11055 519_1 59 10 31 5 AGCCttaattctccAT 11091 520_1 41 4 34 9 AATGatctagagcCTTA 11100 521_1 34 6 34 7 CTAatgatctagaGCC 11103 522_1 52 6 52 17 ACTaatgatctaGAGC 11104 523_1 60 4 54 10 CATtaacatgttctTATT 11165 524_1 57 4 55 8 ACAAgtacattaacatGTTC 11170 525_1 53 6 44 5 TTACaagtacattaaCATG 11173 526_1 54 11 49 17 GCTTtattcatgtTTAT 11195 527_1 34 7 17 5 GCTttattcatgttTA 11196 528_1 11 2 21 4 AGAgctttattcatgtTT 11197 529_1 22 4 33 7 ATAAgagctttattCATG 11200 530_1 30 5 32 15 CATAagagctttaTTCA 11202 531_1 77 8 24 4 AGCAtaagagctTTAT 11205 532_1 8 3 15 6 TAGattgtttagtGCA 11228 533_1 4 2 10 2 GTagattgtttaGTGC 11229 534_1 41 6 33 11 GACAattctagtaGATT 11238 535_1 50 1 37 7 CTGacaattctaGTAG 11241 536_1 49 7 36 6 GCTGacaattctagTA 11242 537_1 59 2 42 11 AGgattaagatacgTA 11262 538_1 28 11 28 4 CAggattaagataCGT 11263 539_1 96 5 20 6 TCAggattaagataCG 11264 540_1 70 11 59 11 TTcaggattaagATAC 11265 541_1 53 5 28 4 AGGAagaaagtttgATTC 11308 542_1 92 13 59 12 TCAAggaagaaagtTTGA 11311 543_1 44 3 67 7 CTCAaggaagaaagTTTG 11312 544_1 43 4 32 4 TGCtcaaggaagaAAGT 11315 545_1 41 7 44 20 AATTatgctcaaggaAGA 11319 546_1 11 4 26 8 TAGGataccacattatGA 11389 547_1 25 4 26 12 CAtaatttattccattcCTC 11449 548_1 64 6 ND ND TGCAtaatttattcCAT 11454 549_1 48 17 49 7 ACTGcataatttatTCC 11456 550_1 91 10 92 15 CTAAactgcataattTATT 11458 551_1 85 8 38 9 ATaactaaactgCATA 11465 552_1 86 4 ND ND TTAttaataactaaaCTGC 11468 553_1 91 13 92 21 TAGTacattattaataaCT 11475 554_1 50 4 37 7 CATAactaaggacgTT 11493 555_1 41 5 30 7 TCataactaaggaCGT 11494 556_1 80 7 55 13 CGTCataactaaggAC 11496 557_1 86 3 59 11 TCgtcataactaagGA 11497 558_1 51 9 33 12 ATcgtcataactAAGG 11498 559_1 91 6 65 26 GTtagtatcttacATT 11525 560_1 30 3 41 8 CTCtattgttagtATC 11532 561_1 59 8 18 6 AGTatagagttacTGT 11567 562_1 65 11 41 11 TTCCtggtgatactTT 11644 563_1 57 13 45 13 GTTCctggtgatacTT 11645 564_1 57 15 30 7 TGttcctggtgataCT 11646 565_1 17 4 35 4 ATaaacatgaatctCTCC 11801 566_1 16 3 30 4 CTTtataaacatgaaTCTC 11804 567_1 60 5 45 11 CTGtctttataaaCATG 11810 568_1 20 2 19 5 TTgttataaatctgTCTT 11820 569_1 68 9 44 4 TTAaatttattcttgGATA 11849 570_1 76 8 48 12 CTtaaatttattctTGGA 11851 571_1 62 5 66 5 CTTCttaaatttattctTG 11853 572_1 28 4 44 10 TATGtttctcagtAAAG 11877 573_1 29 6 36 11 GAAttatctttaaACCA 11947 574_1 74 6 34 7 CCCttaaatttctaCA 11980 575_1 37 8 30 9 ACACtgctcttgtaCC 11995 576_1 45 14 27 6 TGAcaacactgctCTT 12000 577_1 2 1 12 5 TACAtttattgggcTC 12081 578_1 65 14 39 9 GTacatttattgGGCT 12082 579_1 34 4 53 12 TTGgtacatttatTGG 12085 580_1 41 7 35 6 CATGttggtacattTAT 12088 581_1 11 4 12 5 AATCatgttggtacAT 12092 582_1 96 16 48 9 AAatcatgttggtaCA 12093 583_1 71 15 42 13 GACaagtttggattAA 12132 584_1 46 34 39 6 AAtgttcagatgCCTC 12197 585_1 37 26 28 12 GCttaatgttcagaTG 12201 586_1 75 8 43 12 CGTAcatagcttgaTG 12267 587_1 41 10 28 5 GTGaggaattaggaTA 12753 588_1 41 5 27 9 GTAacaatatggttTG 12780 589_1 67 10 37 7 GAaatattgtagaCTA 13151 590_1 97 10 80 12 TTGaaatattgtagAC 13153 591_1 64 10 47 9 AAgtctagtaatTTGC 13217 592_1 84 7 60 9 GCTCagtagattatAA 13259 593_1 42 8 32 9 CATacactgttgcTAA 13296 594_1 101 6 79 17 ATGgtctcaaatcATT 13314 595_1 53 14 46 7 CAATggtctcaaatCA 13316 596_1 47 6 36 6 TTCCtattgattgaCT 13568 597_1 97 12 41 6 TTTCtgttcacaacAC 13600 598_1 85 1 49 11 AGgaacccactaaTCT 13702 599_1 56 3 34 7 TAAatggcaggaacCC 13710 600_1 15 4 24 8 GTAAatggcaggaaCC 13711 601_1 40 6 26 8 TTgtaaatggcagGAA 13713 602_1 59 12 26 6 TTatgagttaggCATG 13835 603_1 62 2 42 10 CCAggtgaaactttAA 13935 604_1 77 9 55 18 CCCttagtcagctCCT 13997 605_1 82 13 42 11 ACccttagtcagCTCC 13998 606_1 74 1 39 10 CAcccttagtcagCTC 13999 607_1 76 9 30 8 TCTcttactaggcTCC 14091 608_1 82 5 50 13 CCtatctgtcatcATG 14178 609_1 82 1 48 12 TCCtatctgtcatcAT 14179 610_1 41 6 50 13 GAGaagtgtgagaaGC 14808 611_1 70 5 84 19 CATCcttgaagtttAG 14908 612_1 64 14 61 16 TAAtaagatggctCCC 15046 613_1 85 2 51 14 CAAggcataataagAT 15053 614_1 47 1 35 10 CCaaggcataatAAGA 15054 615_1 74 8 53 11 TGatccaattctcaCC 15151 616_1 63 4 41 11 ATGatccaattctCAC 15152 617_1 46 7 42 9 CGCttcatcttcacCC 15260 618_1 104 4 15 4 TAtgacactgcaTCTT 15317 619_1 8 3 8 5 GTAtgacactgcaTCT 15318 620_1 21 3 27 10 TGtatgacactgCATC 15319 621_1 37 7 38 11 TTCTcttctgtaagTC 15363 622_1 49 7 36 11 TTctacagaggaACTA 15467 623_1 47 1 32 10 ACTacagttctacAGA 15474 624_1 78 8 69 6 TTCCcacaggtaaaTG 15561 625_1 70 7 ND ND ATTAtttgaatatactCATT 15594 626_1 73 7 49 25 TGGGaggaaattatTTG 15606 627_1 80 5 64 11 TGACtcatcttaaaTG 15621 628_1 71 6 66 19 CTGactcatcttaaAT 15622 629_1 31 6 41 6 TTTactctgactcATC 15628 630_1 88 2 68 18 TATtggaggaattaTT 15642 631_1 53 2 27 6 GTAttggaggaattAT 15643 632_1 23 3 39 7 TGgtatacttctctaagTAT 15655 633_1 42 9 33 3 GATCtcttggtataCT 15666 634_1 38 1 30 16 CAgacaactctataCC 15689 635_1 10 2 19 3 AACAtcagacaacTCTA 15693 636_1 13 1 11 3 TAACatcagacaacTC 15695 637_1 14 2 27 2 TTTAacatcagacaACTC 15695 638_1 101 14 81 16 ATttaacatcagacAA 15698 639_1 14 1 17 1 CCtatttaacatcAGAC 15700 640_1 65 2 ND ND TCCctatttaacaTCA 15703 641_1 41 6 42 12 TCAAcgactattgGAAT 15737 642_1 37 2 29 5 CTTAtattctggcTAT 15850 643_1 31 7 35 4 ATCCttatattctgGC 15853 644_1 13 3 8 1 GAtccttatattCTGG 15854 645_1 25 5 20 4 TGAtccttatattCTG 15855 646_1 33 6 54 10 ATTGaaacttgaTCCT 15864 647_1 43 3 27 6 ACtgtcattgaaACTT 15870 648_1 54 7 32 12 TCTtactgtcattgAA 15874 649_1 12 1 25 2 AGgatcttactgtCATT 15877 650_1 13 4 11 3 GCAaatcaactccATC 15896 651_1 10 5 16 3 GTGcaaatcaactCCA 15898 652_1 7 0 36 18 CAATtatttctttgTGC 15910 653_1 21 3 31 7 TGGcaacaattattTCTT 15915 654_1 75 9 73 24 GCTggcaacaatTATT 15919 655_1 21 6 39 6 ATCCatttctactgCC 15973 656_1 25 3 38 8 TAATatctattgattTCTA 15988 657_1 14 2 11 5 TCaatagtgtagggCA 16093 658_1 11 4 10 3 TTCaatagtgtaggGC 16094 659_1 18 1 32 12 AGGTtaattaattcaATAG 16102 660_1 33 7 25 10 CATttgtaatccCTAG 16163 660_2 64 14 31 8 CATttgtaatcccTAG 16163 661_1 48 6 34 6 ACAtttgtaatccCTA 16164 662_2 29 6 23 5 AAcatttgtaatCCCT 16165 662_1 30 6 18 6 AACatttgtaatCCCT 16165 663_1 49 1 26 6 TAaatttcaagttCTG 16184 664_1 17 3 30 10 GTTtaaatttcaagTTCT 16185 665_1 22 7 40 9 CCAAgtttaaatttCAAG 16189 666_1 89 11 ND ND ACCCaagtttaaaTTTC 16192 667_1 60 16 87 8 CAtacagtgacccaagTTT 16199 668_1 65 9 50 12 ACatcccatacagTGA 16208 669_1 83 8 103 4 AGcacagctctaCATC 16219 670_1 80 9 150 36 ATAtagcacagcTCTA 16223 671_1 57 14 ND ND TCCatatagcacagCT 16226 672_1 53 10 106 8 ATTtccatatagCACA 16229 673_1 78 3 96 14 TTTAtttccatatAGCA 16231 674_1 77 9 31 7 TTTatttccatatAGC 16232 675_1 32 6 ND ND AAGGagaggagatTATG 16409 676_1 32 5 24 6 AGTtcttgtgttagCT 16456 677_1 19 4 17 4 GAgttcttgtgttaGC 16457 678_1 14 3 25 3 ATTaattatccatCCAC 16590 679_1 11 2 20 6 ATCaattaattatcCATC 16593 680_1 31 5 40 11 AGAatcaattaattaTCC 16596 681_1 8 3 30 10 TGagataccgtgcaTG 16656 682_1 11 3 ND ND AAtgagataccgTGCA 16658 683_1 15 3 33 10 CTGtggttaggctaAT 16834 684_1 45 7 38 7 AagagtaagggtctgtggTT 16842 685_1 24 5 ND ND GATGggttaagagTAA 16854 686_1 11 2 ND ND AGCagatgggttaaGA 16858 687_1 ND ND 51 7 TGtaaacatttgTAGC 16886 688_1 83 1 54 11 CCTgcttataaatgTA 16898 689_1 103 4 73 14 TGCCctgcttataaAT 16901 690_1 104 2 64 22 TCttcttagttcaaTA 16935 691_1 ND ND 60 9 TGgtttctaactACAT 16980 692_1 ND ND 94 22 AGtttggtttctaaCTA 16983 693_1 8 2 17 5 GAAtgaaacttgcCTG 17047 694_1 98 6 51 9 ATTatccttacatGAT 17173 695_1 48 4 18 4 GTacccaattatcCTT 17180 696_1 94 2 48 9 TGTacccaattatCCT 17181 697_1 31 5 42 13 TTgtacccaattaTCC 17182 698_1 41 4 39 6 TTTgtacccaattaTC 17183 699_1 63 0 28 12 AGCAgcaggttataTT 17197 700_1 99 6 43 12 TGGgaagtggtctGGG 17292 701_1 103 2 28 5 CTGgagagtgataaTA 17322 702_1 52 6 27 9 AATGctggattacgTC 17354 703_1 67 3 37 7 CAatgctggattaCGT 17355 704_1 36 10 80 12 TTgttcagaagtATCC 17625 705_1 19 9 47 9 GAtgatttgcttGGAG 17646 706_1 44 NA 60 9 GAAatcattcacaACC 17860 707_1 46 9 32 9 TTGtaacatctacTAC 17891 708_1 56 0 79 17 CATtaagcagcaagTT 17923 709_1 30 9 46 7 TTActagatgtgagCA 17942 710_1 29 4 36 6 TTtactagatgtgAGC 17943 711_1 41 13 41 6 GACcaagcaccttaCA 17971 712_1 36 19 49 11 AGAccaagcacctTAC 17972 713_1 30 6 34 7 ATgggttaaataAAGG 18052 714_1 70 2 24 8 TCaaccagagtattAA 18067 715_1 11 4 26 8 GTCaaccagagtatTA 18068 716_1 126 56 26 6 ATtgtaaagctgaTAT 18135 717_1 73 1 42 10 CAcataattgtaAAGC 18141 718_1 23 9 55 18 GAggtctgctattTAC 18274 719_1 50 1 42 11 TGtagattcaatgCCT 18404 720_1 79 3 39 10 CCtcattatactaTGA 18456 721_1 27 6 30 8 CCttatgctatgacAC 18509 722_1 26 7 50 13 TCCTtatgctatgaCA 18510 723_1 59 1 48 12 AAGatgtttaagtATA 18598 724_1 54 2 50 13 CTgattattaagATGT 18607 725_1 92 10 84 19 TGgaaaggtatgaaTT 18808 726_1 24 8 61 16 ACttgaatggcttgGA 18880 727_1 8 4 51 14 AACttgaatggctTGG 18881 728_1 35 4 35 10 CAATgtgttactatTT 19004 729_1 36 9 53 11 ACAatgtgttactATT 19005 730_1 70 2 41 11 CATCtgctatataaGA 19063 731_1 38 NA 42 9 CCTAgagcaaatacTT 19223 732_1 102 15 15 4 CAGagttaataatAAG 19327 733_1 37 10 8 5 GTTCaagcacaacgAA 19493 734_1 13 1 38 11 AGggttcaagcacAAC 19496 735_1 49 NA 36 11 TGttggagacactgTT 19677 736_1 48 NA 32 10 AAGgaggagttaggAC 19821 737_1 36 NA 64 11 CTATgccatttacgAT 19884 738_1 105 19 66 19 TCaaatgcagaattAG 19913 739_1 44 NA 41 6 AGtgacaatcaaATGC 19921 740_1 107 NA 68 18 AAgtgacaatcaaATG 19922 741_1 102 4 27 6 GTGtaccaagtaacAA 19978 742_1 110 10 30 16 TGGgatgttaaacTGA 20037

Пример 2 - тестирование эффективности in vitro в кривой доза-ответ

Набор олигонуклеотидов из Таблицы 10 тестировали в клетках KERPAS-299 с использованием полу-log серийных разведений в PBS (от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ олигонуклеотида) в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).

Расчеты ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 11 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).

Таблица 11: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток KARPAS-299.

CMP ID NO Макс. ингибирование
(% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором) EC50 (мкM) Соединение CMP Начало на SEQ ID NO: 1 Средн. SD Средн. SD 6_1 11 3,3 0,69 0,11 TCGCataagaatgaCT 371 8_1 29 1,7 0,06 0,01 CTGaacacacagtCGC 383 9_1 19 1,7 0,23 0,02 TCTgaacacacagtCG 384 13_1 14 4,7 0,45 0,12 CTtacttagatgcTGC 495 41_1 10 1,8 0,19 0,02 TCAtttagttaccCAA 822 42_1 17 1,3 0,19 0,02 TTcatttagttaCCCA 823 58_1 23 1,5 0,17 0,01 CCagagatatataTGC 909 77_1 24 2,4 0,16 0,02 AGTatcatagttcTCC 1075 92_1 12 2,4 0,25 0,03 AGattaagacagtTGA 1310 111_1 3 2,0 0,27 0,03 TGaattcccatatcCGA 1992 128_1 11 1,8 0,25 0,03 CTcatatcagggCAGT 2063 151_1 16 2,7 0,28 0,05 GTCatggattacaaCT 2324 164_1 19 1,6 0,15 0,01 TCTGtttatgtcacTG 2781 166_1 36 1,7 0,11 0,02 TGgtctgtttatGTCA 2784 169_1 10 1,6 0,22 0,02 TTcagcaaatatTCGT 2995 171_1 12 2,0 0,21 0,02 TCTattgttaggtATC 3053 222_1 1 2,0 0,21 0,02 TGacttgtaattgTGG 5467 233_1 1 4,3 0,89 0,17 TGGaatgccctaatTA 5591 245_1 4 2,0 0,17 0,02 TCggttatgttaTCAT 6470 246_1 7 2,1 0,25 0,03 CActttatctggTCGG 6482 250_1 0 2,5 0,23 0,03 CCacatataggtcCTT 6597 251_1 0 2,8 0,75 0,10 CAtattgctaccaTAC 6617 252_1 3 2,2 0,19 0,02 TCAtattgctaccATA 6618 256_1 5 2,2 0,32 0,03 CAAttagtgcagcCAG 6672 272_1 1 3,2 0,69 0,10 TACTgtagaacatgGC 7133 273_1 3 2,8 0,28 0,04 GCAAttcatttgaTCT 7239 287_1 1 1,4 0,13 0,01 ACAAataatggttaCTCT 7302 292_1 2 2,1 0,21 0,02 GCATttgatatagAGA 7397 303_1 0 1,2 0,21 0,01 CAAgatgaatataTGCC 7551 314_1 3 2,1 0,39 0,04 GAgtttggattagCTG 7764 318_1 3 1,4 0,14 0,01 ACAggatatggaaGGG 7880 320_1 2 2,4 0,22 0,03 GAgtaatttcaacAGG 7891 324_1 0 2,4 0,44 0,05 CAgcttactattaGGG 7906 336_1 0 2,5 0,21 0,03 GATGatttaattctagtCA 7984 342_1 1 2,2 0,12 0,01 CAGAttgatggtagTT 8030 343_1 4 1,8 0,11 0,01 CTcagattgatgGTAG 8032 344_1 0 0,9 0,12 0,01 GTTagccctcagaTTG 8039 345_1 0 2,3 0,36 0,04 TGtattgttagcCCTC 8045 346_1 1 2,1 0,22 0,02 ACttgtattgttAGCC 8048 349_1 4 2,9 0,21 0,03 ACAagtggtatctTCT 8228 359_1 6 2,9 0,39 0,05 TTGAtgaggctaagTC 8395 360_1 0 1,7 0,18 0,02 CCAggattatactcTT 8439 374_1 5 1,7 0,33 0,03 AAGatggattgggaGT 8775 408_1 3 1,8 0,21 0,02 TTtgcatatggaGGTG 8966 409_1 0 1,8 0,21 0,02 AAgtgaagttcaaCAGC 8997 415_1 0 1,4 0,23 0,02 AAttgagtgaatCCAA 9120 417_1 7 0,9 0,15 0,01 GTGataattgagtGAA 9125 424_1 6 3,2 0,19 0,03 CTcattgaaggtTCTG 9281 429_1 5 2,5 0,48 0,05 CAAatagctttatCGG 9335 430_1 1 2,7 0,68 0,09 CCaaatagctttATCG 9336 458_1 0 4,1 0,35 0,07 TGgagtttatattcTAGG 9512 464_1 0 4,1 0,56 0,10 TGCtccagtgtaccCT 9755 466_1 1 2,1 0,21 0,02 CTAattgtagtagtaCTC 9818 474_1 0 2,4 0,27 0,03 GACacactcagatttcAG 9967 490_1 0 1,9 0,29 0,03 TTacttaatttcttTGGA 10055 493_1 3 1,8 0,20 0,02 CTTatgatacaacTTA 10384 512_1 0 3,3 0,63 0,10 GCacaacccagaggAA 10735 519_1 5 1,5 0,15 0,01 TAgatttgtgagGTAA 11055 529_1 0 2,7 0,24 0,03 AGAgctttattcatgtTT 11197 533_1 6 1,5 0,14 0,01 TAGattgtttagtGCA 11228 534_1 5 0,9 0,06 0,00 GTagattgtttaGTGC 11229 547_1 1 1,6 0,26 0,02 TAGGataccacattatGA 11389 566_1 0 3,0 0,40 0,06 ATaaacatgaatctCTCC 11801 567_1 2 2,5 0,34 0,04 CTTtataaacatgaaTCTC 11804 578_1 2 1,3 0,09 0,01 TACAtttattgggcTC 12081 582_1 1 1,6 0,20 0,02 AATCatgttggtacAT 12092 601_1 1 2,1 0,47 0,05 GTAAatggcaggaaCC 13711 619_1 4 3,4 0,44 0,08 TAtgacactgcaTCTT 15317 620_1 1 1,2 0,12 0,01 GTAtgacactgcaTCT 15318 636_1 0 1,3 0,19 0,01 AACAtcagacaacTCTA 15693 638_1 0 2,2 0,36 0,04 TAACatcagacaacTC 15695 637_1 0 2,1 0,21 0,02 TTTAacatcagacaACTC 15695 640_1 2 3,3 0,42 0,06 CCtatttaacatcAGAC 15700 645_1 1 2,9 0,34 0,04 GAtccttatattCTGG 15854 650_1 0 2,4 0,24 0,03 AGgatcttactgtCATT 15877 651_1 4 3,4 0,33 0,05 GCAaatcaactccATC 15896 652_1 0 1,3 0,16 0,01 GTGcaaatcaactCCA 15898 653_1 4 2,0 0,09 0,01 CAATtatttctttgTGC 15910 658_1 3 1,6 0,32 0,02 TCaatagtgtagggCA 16093 659_1 5 1,4 0,20 0,01 TTCaatagtgtaggGC 16094 660_1 4 2,1 0,22 0,02 AGGTtaattaattcaATAG 16102 665_1 3 1,8 0,18 0,02 GTTtaaatttcaagTTCT 16185 678_1 3 2,1 0,43 0,04 GAgttcttgtgttaGC 16457 679_1 0 3,5 0,31 0,05 ATTaattatccatCCAC 16590 680_1 4 1,6 0,12 0,01 ATCaattaattatcCATC 16593 682_1 3 2,4 0,27 0,03 TGagataccgtgcaTG 16656 683_1 0 3,2 0,16 0,03 AAtgagataccgTGCA 16658 684_1 2 2,3 0,25 0,03 CTGtggttaggctaAT 16834 687_1 5 1,3 0,13 0,01 AGCagatgggttaaGA 16858 694_1 0 1,7 0,16 0,02 GAAtgaaacttgcCTG 17047 706_1 15 3,6 0,27 0,06 GAtgatttgcttGGAG 17646 716_1 10 2,1 0,15 0,02 GTCaaccagagtatTA 18068 728_1 5 1,2 0,09 0,01 AACttgaatggctTGG 18881 733_1 0 12,7 8,01 3,62 CAGagttaataatAAG 19327 734_1 0 14,6 3,49 2,39 GTTCaagcacaacgAA 19493 735_1 0 2,5 0,30 0,04 AGggttcaagcacAAC 19496

Набор олигонуклеотидов из Таблицы 6 тестировали в клетках ТНР-1 с использованием серийного разведения 1:3 в воде от 25 мкМ до 0,004 мкМ в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).

Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 12 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).

Таблица 12: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток ТНР1.

CMP ID NO Макс. ингибирование
(% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором) EC50 (мкM) Соединение СМР Начало на SEQ ID NO: 1 Средн. SD Средн. SD 6_1 12 11,5 0,73 0,38 TCGCataagaatgaCT 371 8_1 6 5,6 0,11 0,04 CTGaacacacagtCGC 383 9_1 1 14,3 0,36 0,27 TCTgaacacacagtCG 384 13_1 2 12,4 0,49 0,31 CTtacttagatgcTGC 495 41_1 14 14,6 0,38 0,27 TCAtttagttaccCAA 822 42_1 21 10,4 0,22 0,10 TTcatttagttaCCCA 823 58_1 6 19,8 0,97 0,81 CCagagatatataTGC 909 77_1 5 4,8 0,14 0,04 AGTatcatagttcTCC 1075 92_1 0 12,9 0,57 0,39 AGattaagacagtTGA 1310 128_1 15 10,1 0,23 0,13 CTcatatcagggCAGT 2063 151_1 9 14,4 0,18 0,15 GTCatggattacaaCT 2324 164_1 16 22,0 0,57 0,60 TCTGtttatgtcacTG 2781 166_1 13 11,9 0,17 0,11 TGgtctgtttatGTCA 2784 169_1 0 9,3 0,22 0,11 TTcagcaaatatTCGT 2995 171_1 11 12,9 0,28 0,20 TCTattgttaggtATC 3053 222_1 16 19,7 0,68 0,64 TGacttgtaattgTGG 5467 245_1 14 6,1 0,26 0,08 TCggttatgttaTCAT 6470 246_1 28 7,3 0,10 0,20 CActttatctggTCGG 6482 252_1 19 8,0 0,29 0,12 TCAtattgctaccATA 6618 272_1 3 9,7 0,25 0,14 TACTgtagaacatgGC 7133 314_1 13 9,6 0,31 0,15 GAgtttggattagCTG 7764 344_1 11 8,0 0,14 0,06 GTTagccctcagaTTG 8039 349_1 12 12,5 0,18 0,14 ACAagtggtatctTCT 8228 415_1 11 9,6 0,26 0,12 AAttgagtgaatCCAA 9120 493_1 15 16,5 0,48 0,34 CTTatgatacaacTTA 10384 512_1 43 14,1 0,31 0,68 GCacaacccagaggAA 10735 519_1 9 12,2 0,45 0,26 TAgatttgtgagGTAA 11055 533_1 11 13,6 0,29 0,21 TAGattgtttagtGCA 11228 534_1 9 6,5 0,09 0,03 GTagattgtttaGTGC 11229 582_1 0 12,3 0,33 0,23 AATCatgttggtacAT 12092 619_1 8 10,4 0,32 0,18 TAtgacactgcaTCTT 15317 620_1 12 24,6 1,10 1,08 GTAtgacactgcaTCT 15318 638_1 2 5,4 0,00 0,00 TAACatcagacaacTC 15695 645_1 20 29,6 1,10 1,50 GAtccttatattCTGG 15854 651_1 0 11,2 0,14 0,09 GCAaatcaactccATC 15896 658_1 11 13,8 0,48 0,32 TCaatagtgtagggCA 16093 659_1 0 8,2 0,11 0,06 TTCaatagtgtaggGC 16094 733_1 0 69,6 11,03 26,95 CAGagttaataatAAG 19327 734_1 36 16,8 2,84 2,12 GTTCaagcacaacgAA 19493

Результаты в Таблицах 7 и 8 также показаны на Фиг. 2 в связи с их положением, где они нацелены на пре-мРНК PD-L1 SEQ ID NO: 1.

Из этого можно видеть то, что почти все из соединений имеют значения ЕС50 меньше 1 мкМ и целевой нокдаун меньше 25% от уровня экспрессии PD-L1 в контрольных клетках (обработанных физиологическим раствором).

Пример 3 - активность и эффективность in vitro и снижение уровня PD-L1 in vivo у мышей, индуцированных поли(I:C), с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1

Тестирование эффективности и активности проводили в эксперименте in vitro в исследованиях доза-ответ в клетках МСР-11 с использованием олигонуклеотидов в Таблице 6. Те же самые олигонуклеотиды, а также версии, конъюгированные с GalNAc (Таблица 8, CMP ID NO 755_2-765_2), тестировали in vivo у самок мышей C57BL/6J, индуцированных поли(I:C), на их способность уменьшать экспрессию мРНК и белка PD-L1.

Анализ in vitro

Клетки МСР-11 (исходно купленные в АТСС (Американская коллекция типовых клеточных культур)), суспендированные в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) (кат. № Sigma D0819), дополненной 10% лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамином, 0,025 мг/мл гентамицином и 1 мМ пируватом натрия, добавляли при плотности 8000 клеток/лунку к олигонуклеотидам (10 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 3 суток в конечном объеме 200 мкл/лунку в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в интервале концентраций (50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ).

Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 9 как % остаточной экспрессии PD-L1 в % от контрольных образцов с PBS (клетки, обработанные PBS). Расчеты ЕС50 проводили в GraphPadPrism6. ЕС50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 13 как % от контрольных (PBS) клеток.

Анализ in vivo

Самкам мышей C57BL/6J (20-23 г; 5 мышей на группу) п.к. инъецировали 5 мг/кг неконъюгированных олигонуклеотидов к мышиному PD-L1 или 2,8 мг/кг конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов к мышиному PD-L1. Через трое суток мышам в.в. инъецировали 10 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Мышей умерщвляли через 5 ч после инъекции поли(I:C), и образцы печени помещали в RNAlater (Thermo Fisher Scientific) для экстракции РНК или замораживали на сухом льду для экстракции белка.

Общую мРНК экстрагировали из гомогенизированных образцов печени с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan® Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа мРНК PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 13 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).

Гомогенаты печени получали посредством проведения гомогенизации образцов печени в 2 мл на 100 мг ткани реактива для эктракции тканевого белка T-PER® (Thermo Fisher Scientific), смешанного с 1× смесью ингибиторов протеаз Halt, не содержащей EDTA (Thermo Fisher Scientific). Концентрации белка в гомогенатах печени измеряли с использованием реактива для анализа кумасси плюс (Бредфорд) (Thermo Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Гомогенаты печени (40 мкг белка) разделяли на 4-12%-ных Bis-Tris Plus полиакриламидных гелях (Thermo Fisher Scientific) в 1× электродном буфере MOPS и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы блоттинга iBLOT Dry (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Каждый блот разрезали горизонтально на две части по полосе 64 кДа. После блокирования в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20, мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим моноклональным антителом против винкулина (Abcam, кат. № ab129002), разведенным 1:10000 (верхние мембраны), или с поликлональным антителом козы против mPD-L1 (R&D Systems, кат. № AF1019), разведенным 1:1000 (нижние мембраны) в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. Мембраны промывали в TBS, содержащем 0,05% Tween 20, и подвергали воздействию в течение 1 ч при комнатной температуре свиного антитела против IgG кролика, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена) (DAKO), разведенного 1:3000 (верхние мембраны), или кроличьего антитела против IgG козы, конъюгированного с HRP (DAKO), разведенного 1:2000 в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. После промывки мембран реактивность выявляли с использованием ECL select (Amersham GE Healthcare). Для каждой группы мышей, обработанных олигонуклеотидами, оценивали интенсивность полос PD-L1 по отношению к полосам винкулина посредством сравнения с интенсивностями полос PD-L1/винкулин мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C) (контроль). Результаты показаны в Таблице 13, и вестерн-блоты с парами голых и конъюгированных олигонуклеотидов показаны на Фиг. 9А-Д.

Таблица 13: эффективность in vitro и in vivo олигонуклеотидов к мышиному PD-L1.

CMP ID NO Соединение CMP Макс. ингибирование (% от PBS) EC50 (мкM) мРНК PD-L1
(% от контроля) Белок PD-L1
(относительно контроля) 744_1 AGTttacattttcTGC 9,1 0,56 86 ++ 746_1 CACctttaaaaccCCA 5,0 0,46 181 nd 747_1 TCCtttataatcaCAC 4,4 0,52 104 ++ 748_1 ACGgtattttcacAGG 1,8 0,26 102 +++ 749_1 GACactacaatgaGGA 7,6 1,21 104 nd 750_1 TGGtttttaggacTGT 12,4 0,74 84 nd 751_1 CGAcaaattctatCCT 9,9 0,69 112 nd 752_1 TGAtatacaatgcTAC 10,5 1,11 142 +++ 753_1 TCGttgggtaaatTTA 5,7 0,53 116 +++ 754_1 TGCtttataaatgGTG 5,2 0,35 98 nd 755_2 5'-GN2-C6-caAGTttacattttcTGC nd nd 58 + 757_2 5'-GN2-C6-caCACctttaaaaccCCA nd nd 62 nd 758_2 5'-GN2-C6-caTCCtttataatcaCAC nd nd 53 + 759_2 5'-GN2-C6-caACGgtattttcacAGG nd nd 66 + 760_2 5'-GN2-C6-caGACactacaatgaGGA nd nd 101 nd 761_2 5'-GN2-C6-caTGGtttttaggacTGT nd nd 99 nd 762_2 5'-GN2-C6-caCGAcaaattctatCCT nd nd 84 nd 763_2 5'-GN2-C6-caTGAtatacaatgcTAC nd nd 93 +++ 764_2 5'-GN2-C6-caTCGttgggtaaatTTA nd nd 53 + 765_2 5'-GN2-C6-caTGCtttataaatgGTG nd nd 106 nd

+++: аналогичная интенсивности полосы PD-L1/винкулина контроля; ++: слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; +: значительно слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; nd - не определяется.

Из данных Таблицы 13 можно видеть то, что конъюгирование олигонуклеотидов с GalNAc явно улучшает уменьшение уровня PD-L1 in vivo. Уменьшение уровня мРНК обычно коррелирует с уменьшением уровня белка PD-L1. За исключением CMP ID NO: 754_1, низкое значение ЕС50 in vitro обычно отражает хорошее снижение уровня мРНК PD-L1 in vivo, если только олигонуклеотид конъюгирован с GalNAc.

Пример 4 - PK (фармакокинетика)/PD (фармакодинамика) in vivo в сортированных гепатоцитах и непаренхимных клетках от мышей, индуцированных поли(I:C)

Исследовали распределение голых и конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов, а также уменьшение уровня мРНК PD-L1 в гепатоцитах и непаренхимных клетках, выделенных из мышей, индуцированных поли(I:C).

Самкам мышей C57BL/6J (n равно 3 на группу) п.к. (подкожно) инъецировали 5 мг/кг неконъюгированного олигонуклеотида (748_1) или 7 мг/кг олигонуклеотидов, конъюгированных с GalNAc (759_2), нацеленных на мышиную мРНК PD-L1. Через двое суток мышам в.б. (внутрибрюшинно) инъецировали 15 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Через 18-20 ч после инъекции поли(I:C) мышей анестезировали, и подвергали печень перфузии при скорости тока 7 мл в мин через полую вену с использованием сбалансированного солевого раствора Хэнкса, содержащего 15 мМ Hepes и 0,38 мM EGTA, в течение 5 мин, с последующей перфузией раствором коллагеназы (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, содержащий 0,17 мг/мл коллагеназы типа 2 (Worthington 4176), 0,03% BSA, 3,2 мM CaCl₂ и 1,6 г/л NaHCO₃) в течение 12 мин. После перфузии печень удаляли и открывали капсулу печени, суспензию печени фильтровали через 70 мкм клеточное сито с использованием среды William E, и аликвоту клеточной суспензии (смешанные клетки печени) удаляли для более позднего анализа. Остаток клеточной суспензии центрифугировали в течение 3 мин при 50 g. Супернатант отбирали для более поздней очистки непаренхимных клеток. Осадок ресуспендировали в 25 мл среды William E (Sigma, кат. № W1878, дополненная 1× пенициллином/стрептомицином, 2 мМ L-глутамином и 10% FBS (ATCC #30-2030)), смешивали с 25 мл среды William E, содержащей 90% перколла, и гепатоциты осаждали центрифугированием при 50 g в течение 10 мин. После 2-кратной промывки в среде William E осажденные гепатоциты ресуспендировали в среде William E. Супернатант, содержащий непаренхимные клетки, центрифугировали при 500 g 7 мин, и данные клетки ресуспендировали в 4 мл среды RPMI и центрифугировали через два слоя перколла (25% и 50% перколла) при 1800 g в течение 30 мин. После отбора непаренхимных клеток между двумя слоями перколла, данные клетки промывали и ресуспендировали в среде RPMI.

Общую мРНК экстрагировали из очищенных гепатоцитов, непаренхимных клеток и общей суспензии печени (нефракционированные клетки печени) с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).

Анализ содержания олигонуклеотидов проводили с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием биотинилированного захватывающего зонда с последовательностью 5'-TACCGT-s-Bio-3' и выявляющего зонда, конъюгированного с дигоксигенином, с последовательностью 5'- DIG-C12-S1-CCTGTG - 3'. Данные зонды состояли только из LNA с фосфодиэфирной связью. Образцы печени (приблизительно 50 мг) гомогенизировали в 1,4 мл буфера для лизиса MagNa pure (Roche, кат. № 03604721001) в 2 мл пробирке Эппендорфа, содержащей один 5 мм шарик из нержавеющей стали. Образцы гомогенизировали на гомогенизаторе Retsch MM400 (Merck Eurolab), пока не был получен однородный лизат. Образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Стандарты получали впрыскиванием неконъюгированного антисмыслового олигонуклеотидного соединения (CMP ID NO 748_1) в определенных концентрациях в образец необработанной печени, и обрабатывали их также, как и образцы. Впрыснутые концентрации выбирали так, чтобы они соответствовали ожидаемому содержанию олигонуклеотидов в образце (в пределах ~10-кратных отличий).

Гомогенизированные образцы разводили минимум в 10 раз в 5 × буфере SSCT (750 мМ NaCl и 75 мМ цитрат натрия, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,0), и делали серию 6 разведений в 2 раза с использованием раствора для захвата-выявления (35 нМ захватывающий зонд и 35 нМ выявляющий зонд в 5 × буфере SSCT) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы переносили в 96-луночный планшет, покрытый стрептавидином (Nunc, кат. № 436014), по 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. В каждой лунке была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, было добавлено 100 мкл фрагмента Fab против DIG-AP (Roche Applied Science, кат. № 11093274910), разведенного 1:4000 в PBST (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,2, свежеприготовленный), и проведена инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, и было добавлено 100 мкл раствора субстрата щелочной фосфатазы (АР) (субстрат Blue Phos, KPL, код продукта 50-88-00, свежеприготовленный). Интенсивность окрашивания измеряли спектрофотометрически при 615 нм после 30-минутной инкубации с легким встряхиванием. Необработанные данные экспортировали из ридеров (программа Gen5 2.0) в формат Excel и далее анализировали в Excel. Стандартные кривые получали с использованием программы GraphPadPrism 6 и логистической регрессионной модели 4PL.

Таблица 14: экспрессия PD-L1 и содержание олигонуклеотидов в общей суспензии печени, гепатоцитах и непаренхимных клетках от поли(I:C) мышей, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 3.

Тип клеток CMP ID no Экспрессия PD-L1
(% от физиологического раствора-поли(I:C)) Содержание олигонуклеотидов
(нг/10⁵ клеток) Среднее SD Среднее SD Общая печень 748_1 31 12,4 2,3 0,3 759_2 28 5,3 8,3 1,1 Гепатоциты 748_1 33 8,0 5,1 3,7 759_2 7 1,0 43,8 18,9 Непаренхимные клетки 748_1 31 10,1 2,2 0,7 759_2 66 1,6 1,7 0,9

Результаты показывают то, что голые (CMP ID NO: 748_1) и конъюгированные (CMP ID NO: 759_2) олигонуклеотиды одинаково хорошо снижают уровень мРНК PD-L1 в общих клетках печени. В выделенных гепатоцитах эффект конъюгированного олигонуклеотида почти в 5 раз сильнее, чем эффект голого олигонуклеотида, тогда как голые олигонуклеотиды демонстрировали в два раза более сильный эффект, чем олигонуклеотиды, конъюгированные с GalNAc, в непаренхимных клетках. В гепатоцитах и непаренхимных клетках уменьшение экспрессии мРНК PD-L1 в некоторой степени коррелирует с содержанием олигонуклеотидов в данных типах клеток.

Пример 5 - нокдаун PD-L1 in vivo у мышей AAV/HBV с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV обрабатывали голыми или конъюгированными с GalNAc антисмысловыми олигонуклеотидами против PD-L1, и оценивали в печени экспрессию мРНК PD-L1 и экспрессию генов HBV.

Самок мышей HLA-A2/DR1 5-8-недельного возраста (5 животных на группу) предобрабатывали в неделю -1 носителем (физиологический раствор), голыми антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1 (CMP ID NO 752_1 п.к. в дозе 5 мг/кг) и антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1, конъюгированными с GalNAc (CMP ID NO 763_2 п.к. в дозе 7 мг/кг), данные дозы соответствуют эквимолярным концентрациям олигонуклеотидов. Данных мышей трансдуцировали 5×10¹⁰ вг AAV-HBV в неделю 0 (относительно дополнительных подробностей см. описание мышиной модели AAV/HBV в разделе Материалы и методы). С W1 (неделя 1) после трансдукции AAV-HBV до W4 мыши получали 4 дополнительные п.к. инъекции олигонуклеотидов к PD-L1 или носителя (физиологический раствор), которые давали с интервалом в одну неделю.

Образцы крови отбирали за одну неделю до трансдукции и через одну неделю после каждой инъекции.

Мышей умерщвляли через две недели после последних инъекций, и их печень удаляли после перфузии PBS. Печень разрезали на меньшие куски и прямо замораживали.

Для измерения экспрессии генов HBV ДНК экстрагировали из сыворотки с использованием Qiagen Biorobot, используя QIAamb One для всего набора нуклеиновых кислот, кат. № 965672, сыворотку разводили 1:20 в PBS, всего 100 мкл лизировали в 200 мкл буфера AL. ДНК элюировали из набора в 100 мкл.

Для кПЦР в реальном времени использовали мастер-микс для экспрессии генов TaqMan (кат. № 4369016, Applied Biosystems) вместе со смесью праймеров, приготовленной посредством добавления 1:1:0,5 следующих праймеров: F3_core, R3_core, P3_core (Integrated DNA Technologies, все разведены до концентрации 100 мкМ каждый):

Прямой (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)

Обратный (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)

Зонд (P3_core): 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)

Получали стандартную кривую с использованием плазмиды HBV (генотип D, GTD), используя 10-кратные разведения, начиная с 1×10⁹ копий/мкл вплоть до 1 копии/мкл, и использовали в 5 мкл на реакцию.

Для каждой реакции добавляли 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов, 4,5 мкл воды, 0,5 мкл смеси праймеров и 5 мкл образца или стандарта, и проводили кПЦР.

Для анализа рассчитывали число копий/мл/лунку с использованием стандартной кривой. Результаты показаны в Таблице 15.

Экспрессию мРНК PD-L1 измеряли с использованием кПЦР.

мРНК экстрагировали из замороженных кусков печени, которые добавляли в 2 мл пробирки, содержащие керамические шарики (пробирки Lysing Matrix D, 116913500, mpbio) и 1 мл тризола.

Кусок печени гомогенизировали с использованием дезинтегратора тканей Precellys. В гомогенат добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали на вибромешалке и центрифугировали при 4°С в течение 20 мин при 10000 об./мин. Прозрачную фазу, содержащую РНК (около 500 мкл) переносили в свежую пробирку, и добавляли такой же объем 70%-ного EtOH. После хорошего перемешивания данный раствор переносили на колонку RNeasy spin, и РНК далее экстрагировали, следуя руководству набора RNeasy для мининабора RNeasy, кат. № 74104, Qiagen (включающего расщепление РНК, набор ДНКазы, не содержащий РНКазу, кат. № 79254). Элюирование осуществляли в 50 мкл Н₂О. Конечную концентрацию РНК измеряли и доводили до 100 нг/мкл для всех образцов.

кПЦР проводили на 7,5 мкл РНК с использованием набора RNA-to-ct 1-step от Taqman, кат. № 4392938, Thermo Fisher, согласно инструкциям изготовителя. Использованные смешанные праймеры содержали PD-L1_1-3 (номер праймера Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 и Mm03048248_m1) и эндогенные контроли (ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126_s1 и GUSB Mm01197698_m1).

Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Для расчета значений dct использовали среднее всех четырех эндогенных контролей. Экспрессию PD-L1 выражали относительно среднего значения для эндогенных контролей и в % от физиологического раствора.

Таблица 15: экспрессия мРНК PD-L1 и ДНК HBV у мышей AAV/HBV, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 5.

CMP ID no Экспрессия мРНК PD-L1
(% от физиологического раствора) Экспрессия ДНК HBV
(% от физиологического раствора) Средн. SD Средн. SD Голый 752_1 55 35 72 16 Конъюгированный с GalNAc 763_2 34 3 79 9

Из данных результатов можно видеть то, что и голые, и конъюгированные с GalNAc олигонуклеотиды способны понижать экспрессию мРНК PD-L1 в печени мыши AAV/HBV, причем олигонуклеотид, конъюгированный с GalNAc, является в некоторой степени лучшим. Оба олигонуклеотида также приводили в некоторому снижению уровня ДНК HBV в сыворотке.

Пример 6 - влияние in vivo на ответ Т-клеток у мышей AAV/HBV

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV из модели Пастера обрабатывали антителом или антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на PD-L1. Антисмысловые олигонуклеотиды были либо голыми, либо конъюгированными с GalNAc. Во время обработки животные были иммунизированы ДНК-вакциной против антигенов HBs и HBc (см. раздел Материалы и методы) для обеспечения эффективного примирования Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Оценивали, как данная обработка влияла на популяцию клеток в печени и селезенке, а также на экспрессию PD-L1 в данных популяциях и то, мог ли быть идентифицирован HBV-специфичный ответ Т-клеток.

Протокол обработки:

Самок мышей HLA-A2/DR1 обрабатывали согласно протоколам, приведенным ниже. Данное исследование проводили в двух отдельных подисследованиях с небольшими различиями в схемах введения, как показано в Таблице 16 и 17 ниже.

ДНК-вакцину и антитело против PD-L1 вводили, как описано в разделе Материалы и методы. Использованными антисмысловыми олигонуклеотидами были CMP ID NO 748_1 (голый) в дозе 5 мг/кг и CMP ID NO: 759_2 (конъюгированный с GalNAc) в дозе 7 мг/кг, которые оба вводили в виде подкожных инъекций (п.к.).

Таблица 16: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс антителом против PD-L1, 6 мышей в каждой группе

Сутки Носитель
(Группа 10) ДНК-вакцина
(Группа 11) ДНК-вакцина + Ab против PD-L1
(Группа 13) 0 AAV/HBV 29* Рандомизация животных 34 Физ. р-р + изотипическое - Ab 41 Физ. р-р + изотипическое - Ab 48 Физ. р-р + изотипическое - Ab 50 - CaTx CaTx 55* PBS + изотипическое ДНК ДНК+Ab 62 Физ. р-р + изотипическое - Ab 69 PBS + изотипическое ДНК ДНК+Ab 76* Физ. р-р + изотипическое - Ab 83 Физ. р-р + изотипическое - Ab 97* Умерщвление

Изотипическое - мышиное контрольное Ab IgG, CaTx - кардиотоксин, ДНК - ДНК-вакцина, Ab - антитело против PD-L1, и * - отбор сыворотки.

Таблица 17: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс голым или конъюгированным олигонуклеотидом к PD-L1 (ASO), 7 мышей в каждой группе

Сутки Носитель
(Группа 1) ДНК-вакцина
(Группа 2) ДНК-вакцина + ASO к PD-L1
(Группа 7) ДНК-вакцина + GN- ASO к PD-L1
(Группа 8) 0 AAV/HBV 29* Рандомизация животных 39 Физ. р-р Физ. р-р 41 Физ. р-р ASO GN-ASO 46 Физ. р-р Физ. р-р 49 Физ. р-р ASO GN-ASO 53 Физ. р-р Физ. р-р 55 CaTx CaTx CaTx CaTx 56 Физ. р-р ASO GN-ASO 59 PBS+ физ. р-р ДНК+PBS ДНК ДНК 62* Физ. р-р ASO GN-ASO 67 Физ. р-р Физ. р-р 70 Физ. р-р ASO GN-ASO 74 PBS+ физ. р-р ДНК+PBS ДНК ДНК 77 Физ. р-р ASO GN-ASO 81 Физ. р-р Физ. р-р 84* Физ. р-р ASO GN-ASO 88 Физ. р-р Физ. р-р 91 Физ. р-р ASO GN-ASO 102 Умерщвление

ДНК - ДНК-вакцина, CaTx - кардиотоксин, Ab - антитело против PD-L1, ASO - голый олигонуклеотид к PD-L1, GN-ASO - конъюгированный с GalNAc олигонуклеотид к PD-L1 и * - отбор сыворотки.

В момент умерщвления отбирали одноядерные клетки крови, селезенки и печени каждой мыши из каждой группы, и обедняли эритроцитами (лизирующий буфер, BD biosciences, 555899). Одноядерные клетки печени требуют специфического приготовления, как описано в разделе Материалы и методы.

Популяции клеток:

В печени популяцию клеток анализировали поверхностным мечением на одноядерные клетки печени (см. Материалы и методы) с использованием цитометрии.

Не отмечали значимых изменений в частотах NK-клеток в селезенке и печени обработанных мышей по сравнению с контрольными группами (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК). В Таблице 18 показано то, что в печени группы, обработанные голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), имели значимое увеличение числа Т-клеток по сравнению с каждой из контрольных групп (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК), также представленных на Фиг. 10А. Данное увеличение было обусловлено увеличением обеих популяций Т-клеток: CD4+ и CD8+ (Таблица 18 и Фиг. 10Б и 10В соответственно).

Таблица 18: Т-клетки в печени после обработки, в миллионах клеток

T-клетки
(миллионы) T-клетки CD4+ (миллионы) T-клетки CD8+ (миллионы) Средн. Std Средн. Std Средн. Std Носитель (Группа 1) 0,77 0,44 0,51 0,35 0,11 0,05 ДНК-вакцина (Группа 2) 0,90 0,24 0,58 0,16 0,16 0,08 ДНК-вакцина +
Ab против PD-L1 (Группа 13) 1,98 0,90 1,40 0,81 0,41 0,23 Носитель (Группа 10) 1,73 0,87 1,13 0,55 0,40 0,25 ДНК-вакцина (Группа 11) 1,27 0,97 0,79 0,58 0,32 0,32 ДНК-вакцина +
ASO к PD-L1 (Группа 7) 3,78 1,31 2,46 0,72 0,79 0,39 ДНК-вакцина +
ASO GN-PD-L1 (Группа 8) 3,33 0,66 2,18 0,40 0,67 0,17

Экспрессия PD-L1:

Экспрессию белка PD-L1 оценивали на макрофагах, В- и Т-клетках из селезенки и печени во время умерщвления. Присутствие антитела против PD-L1 в смеси антител, метящих поверхность (см. Материалы и методы), обеспечивало количественное измерение клеток, экспрессирующих PD-L1, посредством цитометрии.

В селезенке не наблюдали значимого различия между обработками в % макрофагов, В-клеток и Т-клеток CD4+, экспрессирующих PD-L1. % Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1, был ниже у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), по сравнению с другими обработками (данные не показаны).

В печени PD-L1 экспрессировался, главным образом, на Т-клетках CD8+ со средней частотой 32% и 41% в контрольных группах (две группы носителя и комбинированные группы с ДНК-вакцинацией соответственно, Фиг. 11А). Обработка голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 приводила к уменьшению частоты Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1 (см. Таблицу 19, Фиг. 11А). Значимые различия в % клеток, экспрессирующих PD-L1, также были отмечены для В-клеток и Т-клеток CD4+ после обработки ASO, хотя данные типы клеток экспрессируют значимо меньше PD-L1, чем Т-клетки CD8+ (см. Таблицу 19 и Фиг. 11Б и В). Обработка Ab против PD-L1 также приводила к кажущемуся снижению в экспрессии PD-L1 во всех типах клеток. Однако возможно то, что данное снижение частично обусловлено блокадой эпитопа PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, таким образом, что предотвращается связывание с PD-L1 антитела, выявляющего PD-L1, в смеси антител для мечения поверхности. Следовательно, то, что проявляется как понижающая регуляция PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, может быть результатом конкуренции за эпитоп между антителом для обработки и выявляющим антителом.

Таблица 19: % популяции клеток печени с экспрессией PD-L1

% T-клеток CD8+ % T-клеток CD4+ % B-клеток Средн. Std Средн. Std Средн. Std Носитель (Группа 10) 35,5 4,7 0,75 0,52 5,9 1,5 ДНК-вакцина
(Группа 11) 36,8 7,7 0,61 0,08 5,5 1,1 ДНК-вакцина +
Ab против PD-L1
(Группа 13) 18,6 12,3 0,33 0,10 2,9 1,7 Носитель
(Группа 1) 28,5 11,5 0,64 0,21 5,9 1,7 ДНК-вакцина
(Группа 2) 44,9 14,4 1,43 0,69 8,7 3,1 ДНК-вакцина +
ASO к PD-L1
(Группа 7) 9,6 2,4 0,37 0,21 2,9 0,8 ДНК-вакцина +
ASO GN-PD-L1
(Группа 8) 14,6 3,3 0,31 0,11 2,8 0,8

Ответ HBV-специфичных Т-клеток:

NK-клетки и Т-клетки CD4+ и CD8+, продуцирующие провоспалительные цитокины, выявляли с использованием анализов окрашивания на внутриклеточные цитокины (см. раздел Материалы и методы), выявляющих продукцию IFNγ и TNFα.

В селезенке на выявлялись NK-клетки, секретирующие IFNγ и TNFα, и выявлялось мало Т-клеток CD4+, секретирующих IFNγ и TNFα, (частота меньше 0,1%) в момент умерщвления. IFNγ-продуцирующие Т-клетки CD8+, нацеленные на два антигена HBV, выявлялись у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1, а также у мышей из данного исследования, которые получали только ДНК-вакцину (данные не показаны).

В печени иммунизированных ДНК мышей-носителей HBV не выявляли NK-клеток, продуцирующих IFNγ, в момент умерщвления, тогда как секретирующие IFNγ Т-клетки CD4+, специфичные в отношении кора или S2+S, выявляли в печени немногих иммунизированных ДНК мышей с низкой частотой (меньше 0,4%, данные не показаны). Специфичные в отношении S2+S HBV T-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, выявляли у большинства мышей, иммунизированных ДНК. Частота Т-клеток CD8+, секретирующих IFNγ, возрастала у мышей, обработанных комбинацией ДНК-вакцины и голого олигонуклеотида к PD-L1 или конъюгированного с GalNAc олигонуклеотида к PD-L1, тогда как обработка антителом против PD-L1 не добавляла какого-либо кажущегося дополнительного эффекта к вакцинации ДНК (Фиг. 12). Т-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, нацеленные на антигены оболочки и кора, были выявлены у большинства групп, иммунизированных ДНК (за исключением антитела против PD-L1) (Фиг. 12Б). Большинство S2-S-специфичных Т-клеток продуцировали и IFNγ, и TNFα (Фиг. 12В). Данные результаты также показаны в Таблице 20.

Таблица 20: % Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена HBV (S2-S или кора) из общей популяции клеток, продуцирующих IFNγ или IFNγ плюс TNFα

ПреS2-S-специфичные Т-клетки
(% клеток, секретирующих IFNγ) Т-клетки, специфичные в отношении кора
(% клеток, секретирующих IFNγ) S2-S-специфичные Т-клетки
(% клеток, секретирующих IFNγ плюс TNFα) Средн. Std Средн. Std Средн. Std Носитель
(Группа 10) 0,15 0,37 0,18 0,43 0,00 0,00 ДНК-вакцина
(Группа 11) 1,48 1,10 0,47 0,53 0,42 1,02 ДНК-вакцина +
Ab против-PD-L1 1,18 0,95 0 0 0,38 0,49 Носитель
(Группа 1) 0,17 0,45 0,11 0,28 0,00 0,00 ДНК-вакцина
(Группа 2) 1,70 1,02 0,27 0,51 0,98 0,90 ДНК-вакцина +
ASO PD-L1 2,56 1,60 0,78 0,80 1,44 1,55 ДНК-вакцина +
ASO GN-PD-L1 3,83 2,18 0,68 1,16 2,62 1,62

Пример 7 - влияние in vivo на антиген HBV и ДНК HBV в сыворотке мышей AAV/HBV

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV модели Шанхай (см. раздел Материалы и методы) обрабатывали конъюгированным с GalNAc антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 CMP ID NO 759_2.

Оценивали, как данная обработка влияла на уровни антигенов HBe и HBs, и ДНК HBV в сыворотке по сравнению с животными, обработанными носителем.

Протокол обработки:

В данном исследовании использовали самцов мышей C57BL/6, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), как описано в Шанхайской модели в разделе Материалы и методы. Мышам (6 мышей на группу) один раз в неделю в течение 8 недель инъецировали антисмысловой олигонуклеотид CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг или носитель (физиологический раствор), причем и тот, и другой вводили в виде подкожных инъекций (п.к.). Образцы крови отбирали каждую неделю на протяжении обработки, а также 6 недель после обработки. Уровни ДНК HBV, HВsAg и HВeAg измеряли в образцах сыворотки, как описано ниже. Результаты для первых 10 недель показаны в Таблице 21 и на Фиг. 13. Данное исследование все еще продолжалось во время подачи заявки, поэтому данные для остающихся 4 недель не были получены.

Выявление HBsAg и HBeAg:

Сывороточные уровни HBsAg и HBeAg определяли в сыворотке инфицированных мышей AAV-HBV с использованием хемолюминисцентного иммуноанализа HBsAg (CLIA) и набора для CLIA HBеAg (Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, Китай, кат. № CL0310-2 и CL0312-2 соответственно) согласно протоколу изготовителя. Вкратце, 50 мкл сыворотки переносили в планшет для микротитрования, покрытый соответствующим антителом, и добавляли 50 мкл реактива с конъюгированным ферментом. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед промывкой всех лунок шесть раз промывочным буфером с использованием автоматической промывающей машины. В каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата А и затем 25 мкл субстрата Б. Планшет инкубировали в течение 10 мин при RT (комнатная температура) перед измерением люминисценции с использованием люминисцентного ридера Envision. HBsAg приводится в единицах IU (международные единицы)/мл, где 1 нг HBsAg соответствует 1,14 IU. HBeAg приводится в единицах NCU (национальная клиническая единица)/мл сыворотки.

Экстракция ДНК HBV и кПЦР:

Исходную сыворотку мышей разводили в 10 раз (1:10) фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). ДНК экстрагировали с использованием робота MagNA Pure 96 (Roche). 50 мкл разведенной сыворотки смешивали в картридже для обработки с 200 мкл внешнего лизирующего буфера MagNA Pure 96 (Roche, кат. № 06374913001) и инкубировали в течение 10 минут. ДНК затем экстрагировали с использованием «Набора для маленького объема ДНК и вирусных нуклеиновых кислот MagNA Pure 96» (Roche, кат. № 06543588001) и протокола «Вирусная NA плазма SV внешний лизис 2.0». Объем элюции ДНК составлял 50 мкл.

Количественное измерение экстрагированной ДНК HBV проводили с использованием прибора для кПЦР Taqman (Vii7, Life technologies). Каждый образец ДНК тестировали в ПЦР в двойной повторности. 5 мкл образца ДНК добавляли к 15 мкл мастер-микса для ПЦР, содержащего 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, кат. № 4369016), 0,5 мкл праймера/зонда для кПЦР PrimeTime XL (IDT) и 4,5 мкл дистиллированной воды, в 384-луночный планшет, и ПЦР проводили с использованием следующих установок: инкубация UDG (2 мин, 50°С), ферментативная активация (10 мин, 95°С) и ПЦР (40 циклов по 15 с, 95°С для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и элонгации). Число копий ДНК рассчитывали из значений C_t на основе стандартной кривой плазмидной ДНК HBV, полученной программой ViiA7.

Последовательности праймеров и зондов TaqMan (IDT):

Прямой праймер к кору (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)

Обратный праймер (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)

Зонд Taqman (P3_core): 56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ (SEQ ID NO: 786).

Таблица 21: уровни ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке от мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1, конъюгированным с GalNAc.

Физиологический раствор CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг   ДНК HBV HBsAg HBeAg ДНК HBV HBsAg HBeAg Сутки Средн. Std Средн. Std Средн. Std Средн. Std Средн. Std Средн. Std 0 7,46 0,35 3,96 0,48 3,23 0,14 7,44 0,29 3,87 0,40 3,17 0,13 7 7,53 0,23 4,17 0,45 3,35 0,10 7,53 0,20 3,91 0,42 3,19 0,18 14 7,57 0,24 4,12 0,49 3,19 0,11 7,45 0,22 3,90 0,50 2,99 0,27 21 7,47 0,27 3,93 0,51 3,12 0,05 7,33 0,47 3,71 0,76 2,78 0,26 28 7,68 0,26 3,88 0,67 3,18 0,13 7,45 0,46 3,65 0,93 2,67 0,38 35 7,69 0,21 4,03 0,54 2,95 0,08 7,13 0,75 2,98 1,05 2,04 0,38 42 7,58 0,23 3,89 0,65 3,34 0,10 6,69 0,89 2,60 1,05 1,98 0,45 49 7,77 0,17 3,54 1,06 3,08 0,26 6,56 1,26 2,19 0,70 1,47 0,37 56 7,71 0,24 3,99 0,86 3,28 0,05 6,21 1,48 2,28 0,84 1,38 0,30 63 7,59 0,28 3,67 1,07 3,25 0,13 6,08 1,39 2,08 0,71 1,35 0,30

Из данного исследования можно видеть то, что конъюгированный с GalNAc антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 CMP NO 759_2 имеет значимое влияние на уменьшение уровней ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке после 6 недель обработки, и влияние, которое поддерживается в течение по меньшей мере 2 недель после завершения обработки.

Пример 8 - нокдаун PD-L1 in vitro в человеческих первичных гепатоцитах с использованием олигонуклеотидов к PD-L1, конъюгированных с GalNAc

Способность антисмысловых олигонуклеотидных соединений к PD-L1, конъюгированных с GalNAc, уменьшать уровень транскрипта PD-L1 в первичных человеческих гепатоцитах исследовали с использованием геномики.

Культура клеток

Криоконсервированные человеческие гепатоциты суспендировали в WME, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл) и L-глутамином (0,292 мг/мл), при плотности приблизительно 5×10⁶ клеток/мл и высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты (Becton Dickinson AG, Allschwil, Швейцария) в плотности 2×10⁵ клеток/лунку. Клетки предкультивировали в течение 4 ч, обеспечивая прикрепление к чашкам для культуры клеток до начала обработки олигонуклеотидами в конечной концентрации 100 мкМ. Использованные олигонуклеотиды показаны в Таблице 21 и Таблице 8, носителем был PBS. Среду для посева заменяли 315 мкл бессывороточной WME (дополненной пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл), L-глутамином (0,292 мг/мл)), и в клеточную культуру добавляли 35 мкл 1 мМ маточных растворов олигонуклеотидов в PBS, и оставляли на клетках на 24 часа или 66 часов.

Получение библиотеки

Профилирование экспрессии транскриптов проводили с использованием химии Illumina Stranded mRNA на платформе для секвенирования Illumina с использованием стратегии секвенирования 2×51 п.о. парных концевых считываемых фрагментов и минимальной глубины считывания 30М на образец (Q в квадрате ЕА). Клетки лизировали в лунках посредством добавления 350 мкл буфера RLT от Qiagen, и присваивали им номер доступа по рандомизированной схеме.

мРНК очищали с использованием мининабора Rneasy от Qiagen. мРНК количественно измеряли, и оценивали целостность с использованием биоанализатора Agilent. При исходной оценке качества выделенной РНК наблюдали то, что все образцы удовлетворяли входному показателю качества 100 нг с баллами RIN (число целостности РНК) больше 7,0.

Для всех образцов получали секвенированные библиотеки с использованием препарата библиотеки Illumina TrueSeq Stranded mRNA, начиная со 100 нг общей РНК. Конечные библиотеки кДНК анализировали на распределение размеров с использованием биоанализатора Agilent (набор DNA 1000), количественно измеряли посредством кПЦР (набор KAPA Library Quant) и нормировали к 2 нМ в препарате для секвенирования. Для связывания библиотек кДНК с поверхностью проточной ячейки использовали набор для получения стандартных кластеров v5, а cBot использовали изотермически для амплификации присоединеных конструкций кДНК вплоть до клональных кластеров, каждый из которых состоит из ~1000 копий. Последовательность ДНК определяли технологией секвенирования посредством синтеза с использованием набора TruSeq SBS.

Обработка данных

Считываемые фрагменты секвенирования с парными концами Illumina длиной 2×51 п.о. картировали на человеческом эталонном геноме hg19 с использованием программы для выравнивания коротких считываемых фрагментов GSNAP. Выравнивания в формате SAM превращали в сортированные файлы выравнивания в формате ВАМ с использованием программы SAMTOOLS. Числа считываемых генов оценивали для PD-L1 на основе аннотации экзонов из RefSeq NCBI, определенной соответствующим файлом GTF для hg19. Стадию нормирования, учитывающую разный размер библиотеки каждого образца, применяли с использованием пакета R DESeq2.

Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после инкубирования с антисмысловыми олигонуклеотидными соединениями к PD-L1, конъюгированными с GalNAc, показаны в Таблице 22.

Таблица 22: Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 в человеческих первичных гепатоцитах после обработки олигонуклеотидами, конъюгированными с GalNAc, n равно 4.

Соединение Уровень экспрессии PD-L1 после 24 ч
(числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки) Уровень экспрессии PD-L1 после 66 ч
(числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки) Носитель 259 156 159 168 192 136 202 211 767_2 7 7 11 14 22 9 28 15 766_2 16 13 15 10 17 11 29 13 769_2 15 21 18 18 25 18 26 25 768_2 41 25 27 48 31 25 34 22 770_2 21 16 44 62 67 51 38 63

Все пять антисмысловых соединений, конъюгированных с GalNAc, демонстрировали значимое уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после 24 и 66 часов инкубации по сравнению с образцами, обработанными носителем.

Пример 9 - ЕС50 конъюгированных и голых антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV

Эффективность двух голых и эквивалентных конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 сравнивали в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV.

Линия клеток

Клетки HepaRG (Biopredic International, Saint-Gregoire, Франция) культивировали в среде Williams E (дополненной 10% ростовой добавки HepaRG (Biopredic)). Из данной линии клеток получали линию клеток HepaRG, стабильно сверхэкспрессирующую человеческий ASGPR1 и ASGPR2, с использованием лентивирусного способа. Пролиферирующие клетки HepaRG трансдуцировали при MOI (множественность заражения) 300 с использованием лентивируса, произведенного по требованию Sirion biotech (CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro), кодирующего человеческий ASGPR1 и 2 под контролем промотора CMV (цитомегаловирус) и ген устойчивости к пуромицину. Трансдуцированные клетки подвергали селекции с 1 мкг/мл пуромицина в течение 11 суток и затем поддерживали при такой же концентрации антибиотика для обеспечения стабильной экспрессии трансгенов. Сверхэкспрессию ASGPR1/2 подтверждали как на уровне мРНК посредством кПЦР-ОТ (ASGPR1: 8560 раз по сравнению с нетрансдуцированными, ASGPR2: 2389 раз по сравнению с нетрансдуцированными), так и на уровне белка посредством анализа проточной цитометрией.

Клетки дифференцировались с использованием 1,8% DMSO в течение по меньшей мере 2 недель до инфекции. HBV генотипа D получали из супернатанта культуры клеток HepG2.2.15 и концентрировали с использованием осаждения с ПЭГ. Для оценки активности тестируемых соединений против HBV дифференцированные клетки ASGPR-HepaRG в 96-луночных планшетах инфицировали HBV при МОI от 20 до 30 в течение 20 ч до того, как клетки были промыты 4 раза PBS для удаления инокулума HBV.

Эффективность олигонуклеотида

Следующие олигонуклеотиды:

Голый ASO к PD-L1 Эквивалентный конъюгированный с GalNAc ASO к PD-L1 CPM ID NO: 640_1 CPM ID NO: 768_2 CPM ID NO: 466_1 CPM ID NO: 769_2

добавляли к клеткам ASGPR-HepaRG, инфицированным HBV, в сутки 7 и сутки 10 после инфекции с использованием серийных разведений от 25 мкМ до 0,4 нМ (разведения 1:4 в PBS). Клетки отбирали в сутки 13 после инфекции.

Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ, как описано в Примере 5.

Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Актин В использовали в качестве эндогенного контроля для расчета значений dct. Экспрессия PD-L1 приводится относительно эндгенных контролей и относительно солевого носителя.

Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6, и они показаны в Таблице 23.

Таблица 23: ЕС50 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV, n равно 4.

CMP ID NO EC50 (мкM) 640_1 2,25 768_2 0,10 466_1 5,82 769_2 0,13

Эти данные явно показывают то, что конъюгирование с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 значительно улучшает значения ЕС50.

Пример 10 - стимулирование функции Т-клеток в РВМС, полученных от пациентов с хронической инфекцией HBV

Исследовали, могли ли голые антисмысловые соединения к PD-L1 увеличивать функцию Т-клеток пациентов, хронически инфицированных HBV (CHB), после стимулирования одноядерных клеток периферической крови (РВМС) ex vivo антигеном HBV.

Замороженные РВМС от трех пациентов, хронически инфицированных HBV, оттаивали и высевали при плотности 200000 клеток/лунку в 100 мкл среды (RPMI1640 плюс GlutaMax плюс 8% человеческой сыворотки плюс 25 мМ Hepes плюс 1% пенициллин/стрептомицин). На следующие сутки клетки стимулировали 1 мкМ белковой смесью большого белка оболочки HBV или 1 мкМ белковой смесью белка кора HBV (см. Таблицу 9) с 5 мкМ CMP ID NO: 466_1 или CMP ID NO: 640_1 или без них в 100 мкл среды, содержащей 100 пг/мл IL-12 (интерлейкин-12) и 5 нг/мл IL-7 (стимулирование конканавалином применяли только в сутки 8). Через четверо суток обработку антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 обновляли с использованием среды, содержащей 50 IU IL-2. В сутки 8 после первой стимуляции клетки повторно стимулировали белковой смесью или 5 мкг/мл конканавалина А плюс антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 в течение 24 ч. В течение последних 5 ч стимулирования добавляли 0,1 мкл брефельдина А, 0,1 мкл моненсина и 3 мкл антитела против человеческого CD-107 (APC).

Через 24 ч клетки промывали буфером для окрашивания (PBS плюс 1% BSA плюс 0,09% азид натрия плюс EDTA), и применяли окрашивание поверхности в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого CD3 (BV 605), антитело против человеческого CD4 (FITC), антитело против человеческого CD8 (BV711), антитело против человеческого PDL1 (BV421), антитело против человеческого PD1 (PerCP-Cy5.5) и окрашивание на живые и мертвые клетки (BV510) (BD Biosciences)]. Клетки фиксировали в фиксирующем буфере BD в течение 15 мин при 4°С. На следующее утро клетки пермеабилизировали буфером для пермеабилизации/промывки BD в течение 15 мин при 4°С, и осуществляли внутриклеточное окрашивание в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого IFNγ (PE)]. После промывки в буфере для пермеабилизации/промывки клетки растворяли в 250 мкл буфера для окрашивания.

Измерения FACS проводили на BD Fortessa (BD Biosciences). Для анализа всю популяцию клеток сначала сортировали на живые клетки (окрашивание на живые и мертвые, BV510) и затем на клетки CD3+ (BV605). Клетки CD3+ затем обозначали на графике как CD107+ (APC) относительно IFNγ+ (PE). Результаты показаны в Таблице 24.

Таблица 24: эффект обработки ASO к PD-L1 на Т-клетки CD3+ из РВМС, выделенных от трех пациентов, хронически инфицированных HBV.

Без стимуляции антигеном Антиген оболочки Антиген кора Физ.
р-р CMP 466_1 CMP 640_1 Физ.
р-р CMP 466_1 CMP 640_1 Физ.
р-р CMP 466_1 CMP 640_1 INFγ-/
CD107+ 1,16 4,95 4,81 4,7 9,12 8,62 3,84 9,66 7,31 2,7 3,59 2,74 2,57 3,69 3,2 3,25 3,34 2,92 3 3,87 3,98 4,59 12,5 10,9 9,23 6,11 6,88 INFγ+/
CD107+ 0,12 1,03 1,15 3,19 17,3 18,9 2,38 15,1 5,75 0,49 3,12 1,75 2,73 7 5,34 1,63 2,35 1,9 0,24 1,13 1,5 1,6 8,16 3,06 1,68 1,9 1,91 INFγ+/
CD107- 0,33 1,43 1,08 5,11 7,74 9,47 3,14 7,76 2,83 0,61 2,9 2,26 7,84 5,79 5,78 2,33 2,82 2,95 0,17 1,57 1,72 1,22 2,58 0,99 0,1 0,61 1,04

Из этих данных можно видеть то, что сама по себе стимуляция антигеном способна индуцировать активацию Т-клеток (увеличение % клеток CD3+, экспрессирующих IFNγ и/или CD107a) в РВМС пациентов СНВ (n равно 3). Добавление антисмыслового олигонуклеотида к PD-L1 CMP 466_1 или 640_1 приводило к дополнительному увеличению ответа Т-клеток CD3+. Данное увеличение, главным образом, наблюдали в группе, стимулированной оболочкой HBV.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.Хоффманн-ля Рош АГ

Рош Инновейшен Сентер Копенгаген A/С

<120> ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ PD-L1

<130> P33358-WO

<160> 786

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20064

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 1

ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60

gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcaggtaggg agcgttgttc ctccgcgggt 120

gcccacggcc cagtatctct ggctagctcg ctgggcactt taggacggag ggtctctaca 180

ccctttcttt gggatggaga gaggagaagg gaaagggaac gcgatggtct agggggcagt 240

agagccaatt acctgttggg gttaataaga acaggcaatg catctggcct tcctccaggc 300

gcgattcagt tttgctctaa aaataattta tacctctaaa aataaataag ataggtagta 360

taggataggt agtcattctt atgcgactgt gtgttcagaa tatagctctg atgctaggct 420

ggaggtctgg acacgggtcc aagtccaccg ccagctgctt gctagtaaca tgacttgtgt 480

aagttatccc agctgcagca tctaagtaag tctcttcctg cgctaagcag gtccaggatc 540

cctgaacgga atttatttgc tctgtccatt ctgagaaccc aaaggagtcc taaaagagga 600

atggaggagc ctaagaataa aaatagtata ataaaacatt tcttagacac attgaccttg 660

gcctatgtca aagttcagtc tgggtttgtc ttataacaca aggagtaaaa gtaccattgt 720

tctacctctt tttttaatac ttgaaaaaaa tttactgtgg atgcttttct atgaattaaa 780

taaccttcta aaaaatgttt tcattgctgc attcgattag attgggtaac taaatgaaat 840

taattcctca ctgttgggta taaaggttat ttacagtggt tctgtcttag ccattcactg 900

aactcattgc atatatatct ctggaatatt gctgattgtt tccttcaagt aaacttagaa 960

gtgtaactac ttagtcaaag agcctgaata ttttaaaggc cttttgaaga aaactgaaaa 1020

tgctttccag aaaggatgta tcagttgaca atgacagtcg tcaacagtat ttaaggagaa 1080

ctatgatact ctgaagaaaa acttagcctt tctcagtaaa agtaggtagg cagaggccac 1140

atgacagcag ttagagtgtg gtcttcaagg aagtcacaga aatactgtgg ggaattgaaa 1200

ccccatgtgg aaaatgtaca agagtgtctc agtgtgactg agaaggaggt tgggcatggg 1260

gtttcatgga gtttaataaa gtttggtcac ttagtagagg tttaataaat caactgtctt 1320

aatctttgat cctacttaag aatttttttt ttgtttttgt agagatgggg ctcttgttat 1380

gttgcccagg ctgttctcga actcctagcc tcaggcgatc ctccctcctc aggctccaga 1440

agtcctggga ttactggcgg gagccaccat gcaggcctct tgctcctact tttgagaaag 1500

gaagtttaac cggttttttt tgtctttttt tttttttttt tgagacagag tctcactctg 1560

ttgcccatgc tggagtgcag tggtgcaatc tcagctcact gcctcccggg ttcaagtgat 1620

tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg actacaggca cctgccacca cgcccagcta 1680

atttttgtat ttttagtaga aatggggttt caccatattg gccaggctga tctcgaactc 1740

ctgacctcag gtgatccgcc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc 1800

cactgctcct ggctgcttaa ctttttctct atctcatcct cctacccatc ctacccttgg 1860

aagatagaga agtagtatta gttccatagt gttatactgg gcttccccca gggacaaacc 1920

cacttcccca acctgaatga gccatcactt cttccccagt ttacatttca ttgctcttta 1980

aatgtctcca ttcggatatg ggaattcaca tatggtcata attcttacct gaagaagatg 2040

tcagtcttct tctcttagac caactgccct gatatgaggt ttagaggtta aagaacatgt 2100

gtgtatttac atgatctttg tattctgcct tttcgtccct cactaatgac agctgcaccc 2160

caaggaaatg gagctgtgga agagagggtt tgataagaaa ttaagtaaat attggatcta 2220

atccatcacc ctccaggaag cctttattac tcctaaaaat ttcaaccaaa ttcattaaag 2280

gacaagaact ccaccagagt aggccataaa cattggcaaa attagttgta atccatgact 2340

agatttaatg tccctttgtt ttattcccat atggttataa tgctttgctt ggcattaggg 2400

gtattttaag ttttcttctg cctagtaagt gaatttgtgt ttataataca ataatcataa 2460

aatatcacat taatatttta taactgtaca gttataaaat attttataag taatatttat 2520

attttataag taatatttta taactgtaca gttaactctg gcccaaggaa aagatagtct 2580

gatagatgct gcagccccat tttagcaaat gtgacctcac aggcctgaat gccatcgcta 2640

ttccacatct acaggataga cggaaaggaa agaaataaaa aaataggtac ctaacactgg 2700

caagaggatg atgactcatg ttatttcact taaccttttt atcttttaac atgaaggact 2760

catacaggtt gataagaaac cagtgacata aacagaccaa aaaatgatca gatctttcaa 2820

attagcaaaa aaataatatt ttttaaacaa tgggtgaaaa tacagtgtaa cagtaccaat 2880

tatcaacatg tgttgagaac cagaaaaatg ttctttttct ttgatcagca acactatttg 2940

ggaaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gccctggcac acagtaggca ctcaacgaat 3000

atttgctgaa cacacaaata cttatgatat tttaaaaaat tggcaacaat ctgataccta 3060

acaatagagg gattaaatat tatggaactg ttaaataaga tgcttatgaa taccatgcag 3120

taagatgggc aatatttatg ccataagctt taatgaaaca aatgggtatt aaatgtatga 3180

taaggttata aattactttt taaaagatta cagggaaaaa aattgaaaga tatacactga 3240

aatgtttttt gctcacagtg gtgacaaggt ttctcagcac tggcactgtt gacgttttag 3300

gctgtatgtc tttgctgtgg gaggctggcc tgtgcactgc agggtgtttg gcagcactct 3360

tggcctctgc ccctagatag caatagcagt cctccctcaa ccagcccaat tttgacaacc 3420

aaaaatgttt ccaggcatca ccagatgctc cctgggtgag agtgatgaaa tagtagggga 3480

ttttcccctt cttttcttat tttctgtaat tccattatat tactttaata ataaagaaaa 3540

aaacataaaa aataaacgaa tgttattatt ctacgtcagt ttggatgttt ggactccatt 3600

ttggggttct ttccattata tcacttggtc tgctaaacat tctacggttt ggtaaggtga 3660

agtgattcat gaaattttgg ttttattttt ttcctgatac taaaaataaa acattctttc 3720

acttggaaat ttggacacag aacaccaaaa aaaatccata atctcatctc tctttttctg 3780

tcttttcctt ccttttttcc ctttaaaaac aataaagagt gaaacctacc tgttctccct 3840

ctaatttaat tcctaaatat aatcactgtc aatatcttgg acatttcctg tgtctaaaca 3900

cacacacaca cttttttttt tcagcaaaag tggatttctg ctacatgtag tgttctgcaa 3960

cttactttct atgtgtttac aaaatcagta catgtacata tgctgaattc agtccttaat 4020

ggtattatat tttgtgaata taccaaaatt tgtttaacca cttagacaat ctaggatatt 4080

ctcagtttgc tgttatgagc aatgctcttc ctttacatat acagacatat atatatatat 4140

gtgtgtgtgt gtgtttttgt tttagtagga tagatttcta ggagagggtg aaaggtctta 4200

tgacatccgc atttacgatt gtaataggaa gtatcaaagt gccccctaaa gaaaaaaatc 4260

ctcccattag tgggtaagaa agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga 4320

aatatttaca attgtggtca agctcataag tgaaaatggt atttcatatc ttatattttt 4380

tattgtgaga ttgaacatct ttcatatgtt tacatgtcac ctgtatttct tattctctga 4440

actatatgtt atgacctttc actttttttc ctcatgggtt atgtgtagtt tgtatagttg 4500

tcttattgat tgttaggagc tatttatata ttaggaacat taatctcctg tcttatatat 4560

acgtggcatc gattagttga tcatttgtga gttcatgtct gtatacaaag attggagagg 4620

cactaagagg gaaaacttac ctctttctta tcaaagtttg taaatatatg tataacagaa 4680

gagggagaaa atattaataa atgcacagat tggctgaaat agagtataaa tcttttactc 4740

ccctacttca acataaactg caaaaggaga gtgacttttc tttcactctg acttccgtat 4800

tcctcatgct taaaatagtg cctagcacag aagaggtgct caatcagtgt ttgctaaacg 4860

aaataattag tcacatttca agcaggatga ctaaatgaag aatagaatct aggcagatac 4920

tctggaagag tggctgtgag tcattcatat cttagtatga attagtcaaa tccaactctc 4980

tccccttccc actccccact gttagtagaa gaatctgttt attgagagaa tagatttata 5040

atttagaata agtgagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga 5100

ctagcatggc tgagacagtg aagtggaagc cttgaatagc taaagggtaa gatgaaagta 5160

tttagctgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaaag taaaagtcag attctccttg 5220

ctctgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga 5280

aataattgag aggaatttgg tgcaatatta tcttcttggc ttcttttgag tgggcagatt 5340

tttttcacgg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc 5400

acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaagatat tgaacttcca attccctgtt 5460

gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt cagttagaac 5520

caccaagtcc catattgtca tattgtatgt ttaattatta agtgaagcag tcttcttttc 5580

gtgttttcca taattagggc attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcat 5640

gacctactgg catttgctga acggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt 5700

aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgatcattt aaaatgcatg caattttctt 5760

atagagagaa cattctattc tttcttctac tttacacaat ggcaaagtct tctttctact 5820

ttacgcaatg ataaagttac ctgtgtcatt ttgtaaaaat atagagaata tagacaaatt 5880

gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg 5940

aaatggcctg tatgtataca tttatttgtt tgctttcaac aaggccaaga tcctttgatc 6000

tttcagtctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga ggatacttta aggaagaatt 6060

gtaagataca tggaaaatgt caggctaaca cagtactggc atcaccctgt gctctttcct 6120

gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa 6180

gagatgactg ttagaatcta ccattccctc tatgtaggaa gcaaataggt gtcctgtcaa 6240

aggacattct ggggatgtct acatgaaacc aagtctccct ggttgtaagg actccatctc 6300

catataatat ttatacagta atatatgttt ataaattgtg ggggcaactt gtttagctaa 6360

ttttattatt ctgctattgg gacactgtgt ctcagcatga gatatagtgt cccaaaacat 6420

atttcaagcc cattggataa aatatgtgtt tagcaagttc ttaaatataa tgataacata 6480

accgaccaga taaagtgatt tataaacgct gtgccaattt tgtaaatgtt tcgaggaatt 6540

ttcccttttc tgaagattgt ccttctttct ttttagcatt tactgtcacg gttcccaagg 6600

acctatatgt ggtagagtat ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaaa 6660

aacaattaga cctggctgca ctaattgtct attgggaaat ggaggataag aacattattc 6720

aatttgtgca tggagaggaa gacctgaagg ttcagcatag tagctacaga cagagggccc 6780

ggctgttgaa ggaccagctc tccctgggaa atgctgcact tcagatcaca gatgtgaaat 6840

tgcaggatgc aggggtgtac cgctgcatga tcagctatgg tggtgccgac tacaagcgaa 6900

ttactgtgaa agtcaatggt aagaattatt atagatgaga ggcctgatct ttattgaaaa 6960

catattccaa gtgttgaaga cttttcattc ttgtaagtcc atacttattt tcaaacagaa 7020

cagcatagtc tgttcattca ttcattcaat tcatgaattc attcacataa ttatccaatt 7080

tcttgagcac ctatttgata gtcactggaa atccagagac aaacaacaca gagccatgtt 7140

ctacagtatg tacagttttc caaaaagaat ttctagtctt tactttttta ttacaaatgg 7200

aatacgtata cttgcaaata attcagatac tgtggaagag atcaaatgaa ttgcaaaagt 7260

gtccctcctc ccttcaccac tatctcccat ggcatgcaga gagagtaacc attatttgtg 7320

tgtccctcca gaaatttttt tattcaacta ctattttttt attttattag gtccgtcagt 7380

tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gcaaataaat atattcagaa caaaccccac 7440

tgtaaggttc acattaaaaa agacttgaag tcaccctatg aagacaaaaa ataatcacat 7500

taagtgtgaa agaacctatt cttccagtac aggataagcc atacttactg ggcatatatt 7560

catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga aaaggaacta ggagtgttag 7620

ttcctcggta ttgacccaca gttatgttat caggtcactt gagttcaaag ttttgtgttg 7680

gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcac agaattgaga 7740

gctgaaagga tcccaggcag gagcagctaa tccaaactcc cacaaagaac aaaaatcccc 7800

cagaggatct tctgttctta tatttcctgc aatggcgtcc ctgtcatatc ccacaatggc 7860

ctccctgcca tttggatatc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta atagtaagct 7920

gaaatctgcc cctctagttg tagtcttggg attatttcat ttacatgatg accttttaat 7980

atttgactag aattaaatca tctccccttg gtctttccat tcctgggcta actaccatca 8040

atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtatacattt gtcactgatc actgatcaat 8100

tattaatcaa tgatcactga taactataaa ctcaaaaaca aaatcatgtg gggattaaga 8160

gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgata ctggctcagg taatgccact 8220

attgtcaaga agataccact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt taccatatgc 8280

ttctccattc atgacatctc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt ttctccagtc 8340

catccgcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca tcatgactta 8400

gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaggaa gagtataatc ctggcagtca 8460

ggaagaaggc agcataaagt ataagtttct gcttccaaaa aaggtctctc atcagcctgt 8520

agggagtgtg tagggaaggg acagctgtcc ttgtagtagg gaagggtttt attcaggtcg 8580

tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga tcaacacaat 8640

aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcctgga gcaaagcaaa 8700

tgaccaacca ggtttgagga cctgatttgt ttgacaattc cattttgtat tgtaaattac 8760

ttaattggca ttctactccc aatccatctt gtcatttgca tacagtggtt ttgggattga 8820

gttcagctat accaaaagtc tgaaccttct gcacttagaa caaggcaacc accaagcttc 8880

acttgcactg aggccgtgtc tccaatggaa atgaggcagc tggcttgcag gagcttccca 8940

actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa atgatttcac agtaatgctg 9000

ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agcttcccca caggagttta 9060

ctcaccatgg tattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt 9120

tggattcact caattatcac tatcacttcg ggtgttattg cacctttctt gtttgtgagt 9180

ttaaatgcca gactctcagg ccactaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcgctg 9240

aacctaacag cagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt cagaaccttc aatgagatta 9300

ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tgtcccgata aagctatttg gatcatatgg 9360

accaaatcga ctgctgtcat tccccaccaa ccccatctct ccccaaaatt cccagccctg 9420

tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat atcatatcat 9480

acttttctgt tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac aagcacaaag 9540

atttgggcct gttttataat attgttgcat ccccagggcc tgatatacag cagagtggtg 9600

gtacgaaaag agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga tttcctcaaa 9660

taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagatttgg atatgtgaaa atttatttcc 9720

agactgttca tcaggaactg ttagcagctt ctaaagggta cactggagca gcagtagtaa 9780

aaggaggaag aggagcagct ctgctactgc tactatcgag tactactaca attagcactt 9840

gcttattctg tgtgttaggc cctgtactga acactctgtc taaattagtt catttcctcc 9900

tggaaatgac tctagggggt aagtgcttca tcatgtaaga tgagtatttt tcacattttg 9960

ttgtgtctga aatctgagtg tgtctttcaa tgatggaatc tttgattcca tgataagtgg 10020

tattattccc attttaagga tgaggaaact gaggtccaaa gaaattaagt aatttgccca 10080

aattcaccca gcctagaaaa tgataaagct agttctaaac ccaagcagat tagctctgaa 10140

gtctgggccc ttaataacca ctttttattg cctatatttg tacctctggt gtacgtatca 10200

agttatatgt tgacttcaaa actatcatga ccttttcttg gttttgattg tccaacatta 10260

gtatagtgtt ctgggtctgc aaaaattttg attactcatc tcatctgtaa aacattttga 10320

actcgtgtgt ttgtgcatgc acatttgtgt gtaattataa aaattttact ttctgttaat 10380

atataagttg tatcataaga aactgccgtt tttgaagagc aaaaaaaggt tgaatgttac 10440

cagttacatc tggttcaacc taatagacat ttgtacaaaa acagacattt taagaggttg 10500

aaataaaaat ttaataaaca atattttcag tttttactaa ttgtgatgct tcactatcat 10560

tagctaatat gtcaaggcat aatatacctt agggtgaact ttatcattaa caaaggtgga 10620

tggtgtcaat aatcttgagg tttgtgtttt tttatataac actgcgaggt ctaattaagt 10680

acttactgtt taccacctca tacagtggcc gataaaaagt gtcacttctg ctgtttcctc 10740

tgggttgtgc ttgaattatt agtattatct tcagtcctca gtttctttgt gggaaacttt 10800

ttaattagtt gtttaatttt gtaagatggt tagtttagtc aaaattagat aagagaattt 10860

gaaaatccgt agctacccca aagcaaccta cacataagaa ctattatttt tgtgttttga 10920

aatcataatt ttattgattt ccagtgtttc cactggtagt ggtttcattg atataggagt 10980

atcaaaacat cactcattat ttatttcagt ttcatttgat cctagccgtt ttgtattaac 11040

tctctgtgaa gaaattacct cacaaatcta ttgctgtcct tggtaaagga atggagaatt 11100

aaggctctag atcattagtg gttacactat agtattagaa gtaaaaaaaa gattatacca 11160

acaaaataag aacatgttaa tgtacttgta atgaataaac atgaataaag ctcttatgct 11220

atataggtgc actaaacaat ctactagaat tgtcagcaaa ctacgtatct taatcctgaa 11280

agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattactt 11340

aaatgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tgtaaatatc ataatgtggt 11400

atcctagata gcatcccaga acagaaaaag gatattaggg aaaaactgga ggaatggaat 11460

aaattatgca gtttagttat taataatgta ctaacgtcct tagttatgac gattgtacca 11520

tggtaatgta agatactaac aatagaggaa accgggtaag gagtatacag taactctata 11580

ctatctttgc aacttttttg taaatttaaa acttctaaaa taaagaacaa atttaaacat 11640

taaaaagtat caccaggaac atatatcact gtttacagat gaaatactat gtattttcat 11700

atctaatttc tgatcattga cttcaaatca gaaaagtgaa tgacacctca aaatcaggtt 11760

ttctgtttac tgaagtctaa gaaaagaaag cataccagct ggagagattc atgtttataa 11820

agacagattt ataacaacaa aaataaaata tccaagaata aatttaagaa gaagcacttt 11880

actgagaaac atatgaaaac ctgaacaaat ggagagggat attttgtatt tgaatagaaa 11940

gacttctggt ttaaagataa ttctctttaa attatttttt gtagaaattt aaggggtaca 12000

agagcagtgt tgtcacatgg atatattaca tagtggtgaa gtctggggtt ttagtgtaaa 12060

ttaatcttta cattttgttt gagcccaata aatgtaccaa catgattttt atagaaagat 12120

agtcattcct attaatccaa acttgtccca actttgaatt gaattgaggc agagctagca 12180

ggtgttcccc acggctgagg catctgaaca ttaagcatat ccctctgaga accagcctgc 12240

attgatactc tttctaatgt ggacagcatc aagctatgta cgtagttctg tgctcagcaa 12300

aagccctgac ttctttttgt ttatgtccta gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt 12360

ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc 12420

aaggccgaag tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc 12480

accaattcca agagagagga gaagcttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca 12540

acaactaatg agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca 12600

gctgaattgg tcatcccagg taatattctg aatgtgtcca ttaaaatatg tctaacactg 12660

tcccctagca cctagcatga tgtctgccta tcatagtcat tcagtgattg ttgaataaat 12720

gaatgaatga ataacactat gtttacaaaa tatatcctaa ttcctcacct ccattcatcc 12780

aaaccatatt gttacttaat aaacattcag cagatattta tggaatatac cttttgttcc 12840

atgcattgta gtactcattg gatacacata gaataataag actcagttca cactcttcag 12900

gaaacagata aaaaactaag aaacaaacaa aaaacaggca atccaacacc atgtgggaaa 12960

tgctttcata gccgggaaac ctggggaata cctgagagga atactcaatt caggccttgt 13020

ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag ctgcttccct ctttccaggg tggcaggaaa 13080

taaatggaac atatttttct atcttatgcc aaacatgagg gaccctttct ccccggtgcc 13140

tctcccaagg tagtctacaa tatttcaact ctagcagtct gcttagtgca tagaacatga 13200

ggctgtgtgt ccctgggcaa attactagac ttctgtgtgc ttcactttcc ctgtaggatt 13260

ataatctact gagcaagctt attgtaaggg tcagattagc aacagtgtat gaaaatgatt 13320

tgagaccatt gcctgcacaa attcaactat ttttttttat ctcactactc tacagaagta 13380

ggtagggtgg gagacagagt ctgatgagag gctcagaatg tgaaagaaag tgaggcgagt 13440

gagcatgata tttaatataa acacaaagat attctgagaa gagctgctca ctgccccctc 13500

ccccaataca tgttgatagg aaaatgccac gtacttcagc aaaaacaact gaaaaattag 13560

atagaaaagt caatcaatag gaaaagataa tccaggacgg tgttgtgaac agaaagaggg 13620

ggaaaaaact ttagaaaatg atggggatgc tcttactggg gtacgagtcc tcaggtattg 13680

aactggcttt cagtaaaagc tagattagtg ggttcctgcc atttacaagc tgttttatga 13740

caacttactt gttgggtggc ctacagtaac tcacctaact gcactgagtc tgtttcctca 13800

tctgtaaatt ggggattttt ttttaaatac ctggcatgcc taactcataa agttgttctg 13860

aaactgaaat aaaacatacg tgaacaggca ttgtaaactg taagttacgg aaaaagctgg 13920

ctgttgttgt gtctttaaag tttcacctgg gtagtcaaag atggatcatg ggtctcagtg 13980

gagagctgag ccaggcagga gctgactaag ggtgagaggt gggagttagc agcctctgaa 14040

catctgtgta ccatgggacc ccctttcctc ctgcatggta ccccagacaa ggagcctagt 14100

aagagatact aatggcttgt tgtccagaga tgttcaaact gcagagaaag ataagacaac 14160

aagcattggc ctccaatcat gatgacagat aggaggaggt gggagctcct tagcagtgct 14220

ggttggcctt ccatgttcta ctgtgggcca tctctgccat gtactgtagg ctactagctt 14280

ctatattaaa gaatgcaaga ggggccagga gcggaggctc atgcctgtaa tctcagcact 14340

ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt ttgtgaccag cctggccaac 14400

atggtgaaac tctgccttta ctaaaaatat aaaaattagc tgggtgtggt ggtgtgcacc 14460

tgtaatccca gctactcggg agactgaggc acaagaattg cttgaacctg ggaggcggaa 14520

gttgcagtga gcccagattg cgccactgca ctccaccctg ggcaacagag aaagactctg 14580

cctcaaaaaa aaaaaaaaaa agcaagagga agtgaaataa tcaaggccgc catttaatag 14640

tgagcagcca ctccatgtgg tactgtgcaa gcacattata aatattagcc tcacaagaaa 14700

tgtattagca tttgtatttt gtacactggt taagtatctt gcccaagacc tcaaaactgg 14760

ttaagggcag cagaatttag ccccagcacc accttttcaa agcctgggct tctcacactt 14820

ctccatgctg ttcccatttt aacacaggta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc 14880

atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgaccattc tcctgacccc 14940

ttcccatcaa aattttatct ttagtcagtt tgttttcgtt ttgttttgtt tttcagaact 15000

acctctggca catcctccaa atgaaaggac tcacttggta attctgggag ccatcttatt 15060

atgccttggt gtagcactga cattcatctt ccgtttaaga aaaggtagta tttccttaat 15120

tgcagtggtc tccactgggg gtgaggaagg ggtgagaatt ggatcatggc tgcaaggaaa 15180

cccgacttaa cctctgcaag gtggtgcaaa ggcattccac tgttcaacag caattatatt 15240

gaagctgagt gggatcactg ggtgaagatg aagcgtaagg ggtgaggggc aggagaatgg 15300

gtatggatgg aggtagaaga tgcagtgtca tacagttttt ttctatcatg aaaataacca 15360

cagacttaca gaagagaaag agctaaaatg cccgtcattt tcagttgcat tttagtcttg 15420

cattagttgc aaccagctgg tttctgggta ccctaagtaa taaaaatagt tcctctgtag 15480

aactgtagta tgtttaccat agagtatttt gcaaaatttt tggtagagga tgttacataa 15540

tttgcatgtg ttcatttctc catttacctg tgggaacaat taaaatccag gaaaatgagt 15600

atattcaaat aatttcctcc catttaagat gagtcagagt aaataattcc tccaatactt 15660

agagaagtat accaagagat ccagtgatgg tatagagttg tctgatgtta aatagggaag 15720

tagaatatgg aaggggattc caatagtcgt tgaaaaattc cccataaccc cttacatggg 15780

ggaaagtagt gttaactgag agagtagaga taagctgttt ccaaaaatta tattcttaac 15840

aggactgaga tagccagaat ataaggatca agtttcaatg acagtaagat cctgagatgg 15900

agttgatttg cacaaagaaa taattgttgc cagcatgcat tttgaatatt tctctggaaa 15960

aaaagattag ttggcagtag aaatggatag aaatcaatag atattaaaat acctcagaat 16020

ttggttcatc tctgggaaaa gatgaaaaat aaaagtgtat actcctcaag aacatctagg 16080

atcaaaagca tgtgccctac actattgaat taattaacct cataagttgg gacctgtgga 16140

ataaggatgt ccaccagact tcctagggat tacaaatgtt tcacagaact tgaaatttaa 16200

acttgggtca ctgtatggga tgtagagctg tgctatatgg aaataaaaat gatttctttt 16260

tctcaaggga gaatgatgga tgtgaaaaaa tgtggcatcc aagatacaaa ctcaaagaag 16320

caaagtggta agaatatcag aaggaattgg gaagtaaaag tcaaaggaaa caaaaagcta 16380

aagcaataac aaagagaaat ccatcagtca taatctcctc tccttttaaa gaatgctggt 16440

tcccctttgc ctcacagcta acacaagaac tcctccaccg tctgaggagg tttaggagca 16500

gggaagggga aggagtcagc ttcatttgct aatcttctgt tgccctgcac cctagcagct 16560

ccttgcagca ggggacaagg atgacttagg tggatggata attaattgat tctaaaatat 16620

tgtgtgtcag tattgtaata ctatgttaat tgcaccatgc acggtatctc atttaatccc 16680

ccaccccttg ccattaccaa agagagagag agagagagag agagaaatac tagaatttat 16740

cctcatttta cagtagagaa aacagagggt caagaagata atgtaaagtg cccaagaaca 16800

cacagctgat cacaaaaatc aagcttgggg gccattagcc taaccacaga cccttactct 16860

taacccatct gcttcaatcc attttgctac aaatgtttac atttataagc agggcagaaa 16920

aacctcatcc aggttattga actaagaaga aagttatatt aaggtttcta atttttttaa 16980

tgtagttaga aaccaaactt aacaatgagc ccaagtttaa agcagtctaa ttaacctgga 17040

caagctcagg caagtttcat tctgtggccc atagcatcat ctgtgttgta aagctaagta 17100

gcaaatgttg tttgggtcat gctgggggac aagccatccc aatttgctca ggactgaggg 17160

gttttccagg atatcatgta aggataattg ggtacaaata taacctgctg ctttctctca 17220

tttcaaattt atcatttatc atatcagcaa ctatgagtta tgttttttat tagatttctt 17280

gttacttttt ccccagacca cttcccatga aattaatata ctattatcac tctccagata 17340

cacatttgga ggagacgtaa tccagcattg gaacttctga tcttcaagca gggattctca 17400

acctgtggtt taggggttca tcggggctga gcgtgacaag aggaaggaat gggcccgtgg 17460

gatgcaggca atgtgggact taaaaggccc aagcactgaa aatggaacct ggcgaaagca 17520

gaggaggaga atgaagaaag atggagtcaa acagggagcc tggagggaga ccttgatact 17580

ttcaaatgcc tgaggggctc atcgacgcct gtgacaggga gaaaggatac ttctgaacaa 17640

ggagcctcca agcaaatcat ccattgctca tcctaggaag acgggttgag aatccctaat 17700

ttgagggtca gttcctgcag aagtgccctt tgcctccact caatgcctca atttgttttc 17760

tgcatgactg agagtctcag tgttggaacg ggacagtatt tatgtatgag tttttcctat 17820

ttattttgag tctgtgaggt cttcttgtca tgtgagtgtg gttgtgaatg atttcttttg 17880

aagatatatt gtagtagatg ttacaatttt gtcgccaaac taaacttgct gcttaatgat 17940

ttgctcacat ctagtaaaac atggagtatt tgtaaggtgc ttggtctcct ctataactac 18000

aagtatacat tggaagcata aagatcaaac cgttggttgc ataggatgtc acctttattt 18060

aacccattaa tactctggtt gacctaatct tattctcaga cctcaagtgt ctgtgcagta 18120

tctgttccat ttaaatatca gctttacaat tatgtggtag cctacacaca taatctcatt 18180

tcatcgctgt aaccaccctg ttgtgataac cactattatt ttacccatcg tacagctgag 18240

gaagcaaaca gattaagtaa cttgcccaaa ccagtaaata gcagacctca gactgccacc 18300

cactgtcctt ttataataca atttacagct atattttact ttaagcaatt cttttattca 18360

aaaaccattt attaagtgcc cttgcaatat caatcgctgt gccaggcatt gaatctacag 18420

atgtgagcaa gacaaagtac ctgtcctcaa ggagctcata gtataatgag gagattaaca 18480

agaaaatgta ttattacaat ttagtccagt gtcatagcat aaggatgatg cgaggggaaa 18540

acccgagcag tgttgccaag aggaggaaat aggccaatgt ggtctgggac ggttggatat 18600

acttaaacat cttaataatc agagtaattt tcatttacaa agagaggtcg gtacttaaaa 18660

taaccctgaa aaataacact ggaattcctt ttctagcatt atatttattc ctgatttgcc 18720

tttgccatat aatctaatgc ttgtttatat agtgtctggt attgtttaac agttctgtct 18780

tttctattta aatgccacta aattttaaat tcataccttt ccatgattca aaattcaaaa 18840

gatcccatgg gagatggttg gaaaatctcc acttcatcct ccaagccatt caagtttcct 18900

ttccagaagc aactgctact gcctttcatt catatgttct tctaaagata gtctacattt 18960

ggaaatgtat gttaaaagca cgtattttta aaattttttt cctaaatagt aacacattgt 19020

atgtctgctg tgtactttgc tatttttatt tattttagtg tttcttatat agcagatgga 19080

atgaatttga agttcccagg gctgaggatc catgccttct ttgtttctaa gttatctttc 19140

ccatagcttt tcattatctt tcatatgatc cagtatatgt taaatatgtc ctacatatac 19200

atttagacaa ccaccatttg ttaagtattt gctctaggac agagtttgga tttgtttatg 19260

tttgctcaaa aggagaccca tgggctctcc agggtgcact gagtcaatct agtcctaaaa 19320

agcaatctta ttattaactc tgtatgacag aatcatgtct ggaacttttg ttttctgctt 19380

tctgtcaagt ataaacttca ctttgatgct gtacttgcaa aatcacattt tctttctgga 19440

aattccggca gtgtaccttg actgctagct accctgtgcc agaaaagcct cattcgttgt 19500

gcttgaaccc ttgaatgcca ccagctgtca tcactacaca gccctcctaa gaggcttcct 19560

ggaggtttcg agattcagat gccctgggag atcccagagt ttcctttccc tcttggccat 19620

attctggtgt caatgacaag gagtaccttg gctttgccac atgtcaaggc tgaagaaaca 19680

gtgtctccaa cagagctcct tgtgttatct gtttgtacat gtgcatttgt acagtaattg 19740

gtgtgacagt gttctttgtg tgaattacag gcaagaattg tggctgagca aggcacatag 19800

tctactcagt ctattcctaa gtcctaactc ctccttgtgg tgttggattt gtaaggcact 19860

ttatcccttt tgtctcatgt ttcatcgtaa atggcatagg cagagatgat acctaattct 19920

gcatttgatt gtcacttttt gtacctgcat taatttaata aaatattctt atttattttg 19980

ttacttggta caccagcatg tccattttct tgtttatttt gtgtttaata aaatgttcag 20040

tttaacatcc cagtggagaa agtt 20064

<210> 2

<211> 20261

<212> ДНК

<213> macaca fascicularis

<400> 2

gtaaaatcaa ggtgcgttca gatgttggct tgttgtaaat ttctgtttat attaataaca 60

taccaaatgt ggatttgttt taatcttcgg aactctttcc ggtgaaaacc tcatttacaa 120

gaaaactgga ctgacaggtt tcactttctg tttcatttct atacatagct ttattcctag 180

gacaccaaca ccactcgcta cccaaactga aagcttcccc gattccgccg aaggtcagga 240

aagtccaatg ccgggcaaac tggatttgct gccttgcgca gaggtgggcg ggaccccgcc 300

tccgggccgg gcgccaagtt gagcagctgg cacgcctcgc gaagccccag tcctgaagcc 360

ccagtcctgc gctgcttccc gaggctccgc accagccgcg cttctctctg cctgcaggta 420

gggagcgttg ttcctccgca ggtgcccacg gcccagcatc tctggctaac tcgctgggca 480

ccttaggacg gaggatctct acaccctttc tttgggatgg agagaggagg agggaaaggg 540

aaggcgatgg tctagggggc agtagagcca attacctgtt ggggttaata agaacaggca 600

atgcatctgg gcttcctcca ggcgcaattc agttttgctc taaaaataat ttatacctct 660

aaaaataaat aaggtgggta gtataggata ggtagtcatt cttatgcgac cgtgtgttca 720

gaatatagct ctgatgctag gctggaagtc tggacacggg tcctagtcca ccgtcagctg 780

cttgctagta atatgacttg tgtaagtcat cccagctgca gcagataagt aagtctcttc 840

ctgcgctaag cacgtccagg acccctgaac ggaatttatt tgctctgtcc attctgaaaa 900

cccaaaggag tcctaaaaga ggaatggagg agcctaagaa taaaaatagt ataataaaac 960

atttcttaga catgttgacc ttggcctatg tcaaagttca gtctgggttt gtcttataac 1020

ataaggagta aaagtaccat tgttctacct ctttttttaa tacttgaaaa aaaatttact 1080

gtagatgctt ttctattaat taaataacct tctaaaaaat gtttttagtg ctgcattcga 1140

ttaggttgga taactaaatg aaattaattc ctcactgttg ggtataaagg ttatttacag 1200

tggttctgtc ttagctattc actgaacatc attacataga tatctctgga atattgctga 1260

ttgtttccgt caataaactt agaagtgtaa ctacttagtc aaagagactg aatattttaa 1320

aggcattttg aagaaaactg aaaatgcttt ccagaaagga tgtatcagtt gacaatgatg 1380

gttgtcaaca gtatttaagg agaactatga tactctgaag aaaaacttag cctttctcag 1440

tagaagcagg taggcagagg ccacatgaca gcagttagag tgtggtcttc aaggaagtca 1500

cagaaatact gtggggaatt gaaaccccaa gtggaaaatg tacaagagtg tctcagtgtg 1560

actgagaagg aggttgggct tggggtttaa cttaagaatt tttttctttt tcttttgtgg 1620

agatagggct tttgttatgt tacccaggct ggtcttgaac tcctagcctc aggcgatcct 1680

cccgcctcag gctgcagaag tcctgggatt actggccgga gccaccatgc aggcctcttg 1740

ctcctacttt tgagaaagga agcttaacct tttttttttg tttgtttgtt tttgtttttt 1800

gttttttttg agacgagtct cactctgttg cccaagctgg agtgcagtgg tgccatctca 1860

gctcacggca acctctgcct cctgggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccgagta 1920

gctgggacta caggcaccca ccaccacgcc cggctaattt ttgtattttt agtagagatg 1980

gggtttcacc atattggtca ggctgatctc gaactcctga ctcaggtgat ccacctgcct 2040

cagcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg cgcctggcca cttgactttt 2100

tctctatctc ttccttctac ccatcctacc cttggaagat agagaagtaa tatcagttcc 2160

atcgtgttat actgggcttc ccccagggac aaacccactt ccccaacctg aatgagccat 2220

cacttcttcc ccagtttaca tttcattgct ctttgaatgt ctccgttcgg atatgggaat 2280

tcacatgtgg tcataattct tacctgaaga agactgacgt cttcttctct tagaccaact 2340

gccctgatgt gaggtttaga ggttaaagaa catgtgtgta tttacatgat ctttgtattc 2400

tgccttttcg tccctcacta atgacagctg aaccccaagg aaatagagct gtggaggaga 2460

gggtttgatg agaaagtagg taaatattgg atctaatcca tcatcttcca ggaaacctcc 2520

attacttcta aaaatttcaa ccaaattcgt taaaggacaa gaactccacc agagtagggc 2580

cataaacatt ggcaaaatta gttgtaatct atgactagat ttaatgtccc tttgttttat 2640

tcacatatgg ttataatgct ttgcttggaa ttaggggtat tttaagtttt cttctgccta 2700

gtaagtgtat ttgtgcttat aatacaataa ttataaaata tcacattaat attttataac 2760

tgtacagtta actctggccc aaggaaaaga tagtccggta gatgctgcag cctgattttg 2820

tatctaaccc tggcaagagg ataatgactc atgttatttc acttaccctt tttatctttt 2880

aacatgaagg gctcatatag gtcaataaga aaccagtgat ataaacagac caaaaaatga 2940

tcagatcttt cacattagca aaaaaaaata ttttttaaac aatacccaac tgggtgaaaa 3000

tacagtgtaa cagtaccaaa tatcaacatg tgtcaagaac cagaaaaatg tttgttttct 3060

ttgatcagca acactatttg aggaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gcctggcaca 3120

cagtaggcac tgaacaaata tttgctgaac acacacatac ttatgatatt tttaaaattg 3180

gcaacaatcc aatacccaat aatagaggaa ttaaatatta tagaactgtt caataagatg 3240

cttacgaata tcatgcagta agatgggcaa tatttatatc ataagcttaa atgaaacaaa 3300

tgggtattaa aggtatggta aggttataaa ttacttttta agagattaaa gggaaaagac 3360

tgaaagatat atactgaaat gctcacagtg gtgacaaggt tccccagcct tggcactatt 3420

gacattttgg gctatgtctt tgctgtggga ggctggcctg tgctctgcag gaggtttggc 3480

agcactcttg gtttctaccc ctagatagca gtagcaaccc tccctcaacc agcccaattt 3540

tgacaaccaa aaatgtttcc aggcatcacc agattctccc tgggtgagag tgatgaaaca 3600

gtaggtgatt ttccccttct tttctcattt tctgtaattt tgtcacatta cgttaataat 3660

aaggaaaaaa cataaaaaat agatgaattt attattctac ctcagtttgg atgtttggac 3720

tccctttggg ggttctttcc attatatcac ttggtctgct aaacagtcta tggtttggca 3780

aggtgaaatg attcatgaaa ttttgttttt attttttacc tgatactaaa agtaaaacat 3840

tcattcgctt gaaaatttgg acacagaaca ccaaaaaaaa tccataatct catctctctt 3900

tttctgtctt ttccttcctt ttttcccttt aaaaacaaga gtgaaaacct accggttctc 3960

cctccaattt aattcctaaa tataatcact gttaacatct tggacatttc ctgtgtctaa 4020

acacacatac tcactttttc ttttttttag caaaaagtgg atttctgcta catgtagtgt 4080

tccgcaactt cctacatgtt tacaaaatca gtacatttac atatgctgaa ttcagtcctt 4140

aatggtatta tattttgtga atataacaaa atttatttaa ccacttagac aatctaagat 4200

attctcagtt tgctgttatg agcaatgctc ttcctttaca tatacatata tatgtgtgtg 4260

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttttagtagg atagatttct aggagagggc 4320

gaaatgtcat atgacatcca catttacaat tgtaatagga agtatcaaag tgccccctaa 4380

aaaaaaaaat tcctcccatt agtgtgtgag aaagcctatt tgttcatatc ttcacaaaca 4440

ctaaatatta gaaatattta caattgtgtt caagctaaga agtgaaaaat ggtatttcat 4500

atcttataat ttttgttgtg agattgaaca tatttcctat gtttacatgt cacctgtatt 4560

tcttattctc tgaactatac gttatgacct ttcacttatt ttcctcatgg gttatgtgta 4620

gtttgtgtag ttgtcttatt gattgttagg agctatttat atattaggaa cattaatctc 4680

ctgtcttata tgtatgtggc attgattagt tgatcatttg tgagttcatg tctgtataca 4740

aagattagag aggcagtaag agggaaaact tacctctttc ttatcaaagt ttgtaaatat 4800

atgtataaca gaagagagag aaaacattaa taaatgctga aataaagtat aaatttttta 4860

ctccactact tcaacataaa ctacaaaagg agagtgactt ttctttcatg ctgacttcca 4920

tattccccat gcctaaaata gtgcctagca cagaagaggt gctcaatcag tgtttgctaa 4980

atgaaagaat tagtaacatt tcaagcagga tgactaaatg aagaatagaa tctaggcaga 5040

tactctggaa gagtgactgt gagtcattca tggtcttggt atgaattagt caaatccagc 5100

tttctcccct tcccactccc cactgttagt agaataatct gtttattgag agaatagatt 5160

tataatttag aataagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga 5220

ctagcatggc tgagatagtg aagtggaagt cttggaaagc taaagggtaa gatgaaagta 5280

tttagccgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaatg taaaagtcag attctccttg 5340

ctttgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga 5400

aatagttgag aggaatttgg tgaaatatta tcttcctggc ttcttttgag tgagcagatt 5460

tttttcaggg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc 5520

acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaaggtat tgaacttcct attccctgct 5580

gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt caattagaac 5640

caccaagtcc cataatgtca tattgtgtgt ttaattatta agtaaagcag tcttcttttt 5700

gtgttttcca taattagcac attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcac 5760

gatctactgg catttgctga atggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt 5820

aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgataattt aaaatgcatg caattttctt 5880

atagagagaa tattctcttc tttcttctac tttacacaat gacaaagtct ttcttctgct 5940

ttacacaatg ataaagttcc ctgtgtcatt gtgtaaaaat atagagaata tagacaaatt 6000

gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg 6060

aaatggcctg tatgtatata tttatttgtt tgttttcaac aaggccagga tctttcaatc 6120

tttcaatctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga gaatactcta aggaagaatt 6180

gtaggataca tggaaaatgt cagggtaaca cagtactggc accaccctgc ggtcctttct 6240

gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa 6300

gagatgttag aatctaccat tccctctatg taggaagcaa ataggtgtcc agtcaaagga 6360

cattctgggg atgtctacat gaaaccaagt ctcctggttg taagtactcc atctccatat 6420

aatatttcta cagtaatata tgtttataaa ttgtgggggc aacttgttta gctaatttta 6480

ttattctgtt attgggacac tatgtctctg catgagacat agtgtcccaa aacatatttc 6540

aagcccattg gataaaatat gtatttagca agttcttaaa tataatgata acataactga 6600

ccagataagg tgatttttaa atgctgtgcc aactttataa atgttttgag gaattttccc 6660

ttttctgaag gttattcttc tttcttttta gcatttactg tcacggttcc caaggaccta 6720

tatgtggtag agtatggcag caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa 6780

ttagacctga cttcactaat tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt 6840

gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag catagtaact acagacagag ggcccagctg 6900

ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct gcacttcgga tcacagatgt gaaattgcag 6960

gatgcagggg tttaccgctg catgatcagc tatggtggtg ccgactacaa gcggattacc 7020

gtgaaagtca atggtaagaa ttattataga tgagaggcct gatctttata gaaaacatat 7080

tctaagtgtt gaagactttt cattcttata agtccatact tattttcaaa cagaatagca 7140

tagtctcttc attcattcat tcagttcatg aattcattca cgtaagtctc caattagcat 7200

ttcttgagca cctatatgat agtcattgga aatccagaga caacacagag ccatgttcta 7260

cggtatgtac agttttccaa aaataattcc tagtctttac ttttttatta taaatgtaat 7320

acatatactt gcaaagaatt cagatactat ggaagagatc aaatgaattg caaaagtgtc 7380

cctcctccct tcaccactat ctcccatgag ataaccaaga gacactccaa gagagtaacc 7440

attatttgtg tgtccctcca gaaccttttt tattcaacta ccattttttt attttattag 7500

gtctgtcagt tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gctaataaat atattcagat 7560

caaaccccac tgtaaggttc atattaaaaa agacttgaag tctccctatg aagacaaaaa 7620

ataatcatat taagtgtaaa agaacttatt cttccagtac agtataaact atactcactg 7680

ggcatatatt catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga agaggaacta 7740

ggagtgtcaa ttcctgggaa ctgacccaca gttatgtcat caggtcactt gagttcgaag 7800

ttttgtgttg gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcat 7860

agaattgaga gctgaaagga tcccaggcag gagcgactaa tccaaactcc cacaaagaac 7920

aaaaatcccc cagaggatct tctgttcata tatttcctgc agtggcatcc ctgtcatatc 7980

ccacaatggc atccctgcca tttggactcc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta 8040

atagtaagct gaaatctgcc cctctagttg tagttttgga attatttcat ttccatgatg 8100

accttttaat atttgactag aattaaatca tctccccttg gtatttccat tcctggacta 8160

actaccatca atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtctacactt gtcattgatc 8220

actgatcaat gattaatcaa tgatcactga taattataaa ctcaaaaaca aaatcatgta 8280

gggattaaga gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgatt ctggctcaaa 8340

taatgctact attgtcaaga agatatcact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt 8400

taccatgtgc ttctccattc acggcatttc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt 8460

ttctccagtc catcagcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca 8520

tcatgactta gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaagaa gagtataatc 8580

ctggcagtca ggaagaaggc tgcataaagt ataagtttct gcttccaaag aagatctctc 8640

atcagcctgt agggagtgta tagggagggg acagctgtcc ttgtagtagc aaagggtttt 8700

attcaggtca tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga 8760

tcaacacaat aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcaggga 8820

gcaaagcaaa tgaccaacca ggtttgagga cctgatttga caattccatt ttgtatttta 8880

aattagttaa tttgcattct agtcccaatc catcttgtca tttgcagaca gtggttttgg 8940

ggttgagttg agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag gaaggcaacc 9000

accaagcttc acttgcactg aggcagtgtc tccaatggaa acgaggtagc tggcttgcag 9060

aagctttcca actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa ataatttcac 9120

agtactgctg ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agctttgcca 9180

caggagttta ctcaccatgg gattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag 9240

aatttagttt tggattcact caattatcat gatcactttg ggtgttattg cacctttcat 9300

gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct 9360

ttaatcactg aacctaatag tagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt caggaccttc 9420

aatgagatga ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tatcccagta aagctatttg 9480

gatcgtatgg accagatcaa ctgctgtcat tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt 9540

cccagccctg tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat 9600

atcatatcat acttttctat tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac 9660

aagcacagag atttgggtct gttttttaat attgttgtat ccccagggct tgacgtaaag 9720

cagagtggta gtatgacaaa agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga 9780

tttcctcaaa taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagacttgg atatatgaaa 9840

atttatttcc aaaactgttc atcaggaact gttagcacct tctaaagggt acactgaagc 9900

agcagtagta aaaggaggag gaggagaagc agctctgcta ctactattat cgagtactac 9960

tacaactatc gagtactact acaactatcg agtactacta caattagcac ttgcttattc 10020

tgtgtgttag gtcctgtact gaacattctg cctaaattag ttcatttcct cctggaaatg 10080

actctgtggg gtaggtgctt catcatgtaa gatgagtatt tttcacactt cactgtctct 10140

gaaatctgag tgtgtctttc aatgatggaa tctttgattt catgataagt ggtattattc 10200

ccattttaag gatgaggaaa ctggggtcca aagaaattaa gtaatttgcc caaattcacc 10260

tagcctcgta aatgataaag ctagttctaa atccaagcag attggctctg aagtctgggc 10320

ccttaataac cacttattgc ctgtatttgc acctctggtg tatgtatcaa gttatatatt 10380

ggcttcaaaa ctatcatgac cttttcttga ttttgattgt tcaatattag tatagtgttc 10440

tagatctagt agaccagggg tctgcaaaaa attttgatta ctcacctcat ctgtaaaaca 10500

ttttaaactt gtgtgtctgt gcaggcacat ttgtgtgtaa ttataaaaaa tttactatct 10560

attaatatat aggttgtacc gtaagaaaaa ttgccatttt tgaagagcaa aaaaggttga 10620

atattaccag tttcatctgg ttcaacctaa tagacatttg tacaaaaaca gacattttaa 10680

gaggatgaaa taaaaattta ataaacaata ttttcaattt ttactaattg tgacgcttca 10740

ctattgttag ctaatatgtc aaggcatgat ataccttagg gtggaattta tcattaacaa 10800

aggtggatag tgtcaataat cttgaggttt gtgttttttt atataacact gtgaggtcta 10860

attaagtact taattgttta caacctcata cagtcgccaa taataagtgt cacttctgct 10920

gtttcctctg ggttgtgctt gaattattag tattatcttc aatcctcagt ttctttgtgg 10980

aaaacttttt aattagttgt ttaattttgt aagatggtta gtttagtcaa aattagataa 11040

gagaatctga aaatccataa ttaccccaaa gcaacccact cataagaact attatttttg 11100

tgttttgaaa tcataatttt attgatttcc agtgtttcca ctggtagtgg tttcattgat 11160

gtaggagtat caaaacatca ctaattattt atttcagttt tgtttgatcc tagctgtttt 11220

gtgttaactt tgaagaaatt acatcacaga tctattgttg tccttggtaa aggaatggag 11280

agttaaggct ctagatcatt agtggttatg ctgtagtatt aggagtaaaa aaaaagatta 11340

tatcaacaaa ataagaacat gttaatgtac ttgtaataga taaacatgaa taaagctctt 11400

atgctatata gatgcactga acaatctact agaattgtca gcaaacggta tcttaatcct 11460

aaaagggtcc caaaccaatg atctaaaatt gaatcaaact ttcttccttg agcataatta 11520

tttaagtgat ttattaaaat agccagcatt taaaagctta aaatataagt atcataatgt 11580

ggtatcctag atagatccca gaacagagaa aggatattag ggaaaaactg gaggaatgga 11640

ataaattatg cagtttagtt attaataatg tactaatgtc cttagttatg accattgtac 11700

catggtaaag taagatacta acaatagagg aaattgggta aggggtatat gtaactctat 11760

actatctttg caattttttt gtaaatttaa aacttctaaa ataaagaaca aatttgaaca 11820

ttaaaaagtg tcgccaggaa catgtatcac tgtttacaga tgaaacagta tgtattttta 11880

tatctaattt ctgatcattg gcttcaaatc agaaaagtga atgacacatc aagatcaggt 11940

tttctgttta ctaaataaag tctaagaaaa caaagcatac cagctggaga gattcatgtt 12000

tataaagaca gatttataac aacaaaaata aaatatccaa gaataaattt aagaagaaat 12060

agggcactat gtaaaaagta tagcacttta ctgagaaaca tatgaaaacc tgaatacatg 12120

gagagaggta ttttatattt gaatagaaag attgctggtt taaagataat tctctttaaa 12180

ttttttttgt agaaatttaa gaggtacaag agcagttttg tcacacggat atattacata 12240

gtggtgaagt ctggggtttt agtgtaaatt aatctttaca ttttgtttga gcccaataaa 12300

tgtaccaaca tgatttttat agcaagatag tcattcctat taacccaaac ttgtcccaac 12360

tttgaactga actgaggcag agctagcagg tgttccccac tgctgaggca tctgaacatt 12420

aagcgtatcc ctctgagaac cagcctgcat tgatcctctt tctaatgtag acagcatcaa 12480

gctatatatc tagttctgtg ctcagcaaaa gccctgactt ctttttgctt atgtcctagc 12540

tccatacaac aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtcgat ccagtcacct ctgaacatga 12600

actaacatgt caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atttggacaa gcagtgacca 12660

tcaagtcctg agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga agcttttaaa 12720

tgtgaccagc acactgagaa tcaacacaac agctaatgag attttctact gcatttttag 12780

gagattagat cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccaggta atattctgaa 12840

tgtgtccatt aaaatatgtc taacactgtc ccctagcacc tagtatgatg tctgcctatc 12900

atagtcattc agtgtttgtt gaataaatga attaatgaat aacattatat ttacaaaatg 12960

tatcctaatt cctcacttcc attcatccaa atcatattgt tacttaataa acattcacca 13020

aatatttatt gaatatgcct tttgttccat gcattgtagt actcatttga cacacataga 13080

ataataagac tcacgttcac actcttcagg aaacagataa aaaacaaatg aacaaacaaa 13140

aaacaggcaa tccaatacca tgtgggaaat gctttcatac catgtgggaa acctggggga 13200

atacctgaga ggaatattca attcaggcca tgtttcagga atccaaatcc tggcacatca 13260

gagccgcctc cttcttacta gggtttctgt ggcaggaaat aaatggaacg tatttttcta 13320

tcttatgcca aacaggaggg accctttctc ccctgtgcct ctcccaaggt agtctacaat 13380

atttcaacgc tagcagtctg tttagtgcac aggacatgag gctgtgtatc cctgggcaaa 13440

ttgctacact tctgtgtgct tcactttctc tgtaggatta taacctactg agcaaggtta 13500

ttgtgggggt caaattagca acagtgtatg aaaatgattt gagaccagtg cctgcacaaa 13560

ttcaactatt tttttttatc tcactactct atagaagtag gtaggatggg agacagagtc 13620

tgatgggagg ctcagaatgt gaaagtaagt gaggtgagtg agcatgatat ttcatataaa 13680

cacaaagata ctctgagaag agcttctcac ttcccccgcc cccaatagat gttgacagga 13740

aaatgccatg tacttcagca aaaacagctg aaaaattaga cataaaagtc aatcaatagg 13800

aaaagataat ccaggatggt cttgtgaaca gaaagaggga aaaaaaaagt ttagaaaatg 13860

atggggatgc tcttactggg gtatgagtcc tcaggtattc aactggcttt cagaaaaagc 13920

tagactagtg ggttcctgcc atttaaaagc tgttttatga caacttactt gttgggtggc 13980

ctacagtaac tcacttaact gtgctgagtc tgtttcctca tctgtaaatt ggggattttt 14040

taaaataact ggcatgccta actcataaag ttgttctgaa actgaaataa aacatatatg 14100

aacaggcatt gtaaactgta agttacggaa aaagctggct gttgttgtgt ctttaaagct 14160

tcacctgggt agttagagat ggatcatggg tctcagtgga gagctgagcc aggcaggagc 14220

tgactaaggg taagaggtgg gagttagcaa tctctgaaca tctgtgtgcc atgggacccc 14280

ttttcctcct gcatggtacc ccagacaagg agcctagtaa gagatactaa tgacttgttg 14340

tccagagatg ttcaaactgc agagaaagat aagacaacaa gcattggcct ccaatcatga 14400

tgacagatag gaggaggtgg gagctcctta gcagtgctgg ttggttttcc atgttctact 14460

gtgggccatc tctgccatgt actgtaggct actaacttct atattaaaaa atgcaagagg 14520

ggccgggagt ggaggctcat gcctgtaatc tcagcacttt gggaggccaa ggtgggcaga 14580

tcacttgagg tcaggagttt gtaaccagcc tggccaacat ggtgaatctc tgcctctact 14640

aaaaatacaa aaattagcca gatgtggtgg cgtgcacccg taatcccagc tactcgggaa 14700

gctgaggcac gagaattgct tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc caagattgtg 14760

ccactgccct ccagcctggg caacagagaa agactttgcc tcaaaaataa ataaataaat 14820

aaataaataa ataaataaat aaatggaagt gaaataatca aggccaccat ttaatactga 14880

gtagccactc catgtggtac tgtgctaagc acattataaa atattagcct cacaagaaat 14940

gtattagcat ttgtattttg tacactggtt aagtatcttg cccaagacct caaaactggt 15000

taaggggcag cagaatttaa ccccagcgcc accttttcaa agtctgggct tcttacactt 15060

ctccatgctg ttcccatttt aacagatgta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc 15120

atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgactattc tcctgatgac 15180

cccttcccat caaaatttta tctttagtca gtttgttttt gttttgtttt gtttttcaga 15240

actacctctg gcgcttcctc caaatgaaag gactcacttg gtaattctgg gagccatctt 15300

tttactcctt ggtgtagcac tgacattcat cttctattta agaaaaggta gtatttcctt 15360

aattgcagtg gtctccactg gggatgagga gggggtgaga attggatcga tcatggctgc 15420

aaggaaacct gacttaacct ctgcagggtg gtgcaaaggc attccactat tcaacagtaa 15480

ttatattgaa gctgcatggg atcactgggt gaagatgagg tgtaaggggt gagggacagg 15540

agaatgggta tggatggagg tagaagatgc agtgtcatac aatttttttc tatcatgaaa 15600

ataaccacag acttactgta aagaaggagc taaaatgcct gtcattttca gttgcatttt 15660

agttttgcat tagttgcacc cagctggttt ctgggtactc taagtaataa aaatagttcc 15720

tctgtagaac tgtagtattt tcaccataga gtattttgta aaattattgg tagaggatgt 15780

tacataattt gcatgtgttc ctttctccat ttacctgtgg gaacaattaa aatccaggaa 15840

aatgagtata ttcaaataat ttcctcccat ttatgatgat tcagagtaaa taattcctct 15900

gatacttaga gaagtatacc aagagatcca gtgattgtat agagttgtct gatgttaaat 15960

agggaagtag aatatggaag ggaattccaa tagtcgttga aaaattcccc acaacccctt 16020

acatggggga aagtggtgtt aactgagata gtagagataa gctgttacca aaaattatgt 16080

tcttaacagg attgagatag ccagaatata aggatcaagt ttcaatgaca gtaagatcct 16140

gagatgcagt tgatttgcac aaagaaataa ttgttgccag cttgcatttt gaatatttct 16200

ctggaaaaag agattagttg gcagtagaaa tgaatagaaa tcaatagata ttaaaatacc 16260

tcagaatttg attcatctct gggaaaagat gaaaaataaa agtgtatagt cctcaagaaa 16320

atctgggatc aaaagcatgg gccttaccct attgaattaa ttaacctcag aagttgggaa 16380

ctgtggaata aggatgtcca ccagacttcc tagggattac aaatgtttca tagaacttga 16440

aatttaaact tgggtcactg tatgggatgt agagctgtgc tatatggaaa taaaaatgat 16500

ttctttttct caagggagaa tgatggatat gaaaaaatgt ggcattcgag ttacaaactc 16560

aaagaagcaa cgtggtaaga atatcagaag gaattgggaa gtagaaggca aaggaaacaa 16620

aaagctaaag caataacaaa gagaaatcca ttagtcataa tctcctctcc ttttaaagaa 16680

tgctggttcc cctttgcctc acaactaata caagaacttc tccaccatct caggaagttt 16740

agggatggcc ttcaagagta gagagtaggg agcagctctg tggagagagg agaggagcag 16800

ggaaggggaa ggagtcagct tctctttgct aatctgttgc cctgcaccct agcagctccc 16860

tgcagcaggg gacaaggttg acttaggtgg atggataatt aattgattct aaaatattgt 16920

gtgtcagtat tgtatattgt aatactatgt taactgcgcc atgcacggta tctcatttaa 16980

tcccccaccc cttgccatta ccaaaaagag agagagaaaa atactagaat tatcctcatt 17040

ttacagtaga gaaaacagag ggtcaagaag ataaagtaaa gtgcccaaga acacacaact 17100

gatcacaaat atcaagcttg gggtccatta gcctaaccac agacccttac tcttaaccca 17160

tctgcttcaa tccattttgc tacaaatgtt tacatttata tgcagggcag aaaagtctca 17220

tccagtttat tgaactaaga agaaagttat attaaggtgt ctaatttttt ttaatgtagt 17280

tagaaaccaa acttaacaat gagcccaagt ttaaagcagt ctaattaact tgacaagctc 17340

aggcaagttt cattctgtgg cctgtagcat catctgtgtt gtaaagctaa gtagcaaatg 17400

ttatttgggt catcctgggg ggaaagtcat cccaatttgc tcaagactga ggggtttttc 17460

aggatatcat gtaaggataa ttgggtacaa atataacctg cttctttctc tcatttcaaa 17520

tttatcattt atcatctcag caactatgag ttatgttttt tattagattt cttgttactt 17580

tttccccaga ccgctcccca tgaaattaat atactattat cactctccag atacacaatt 17640

ggaggagacg taatccagca ttggaacttc tgatcttcaa gcagggattc tcagcctgtg 17700

gtttgggggt tcgtcagggc tgagcatgac cagaggaatg aatgggcccg tgggatgcat 17760

gcagtatggg acttaaaagg cccaagcact gaaaatggaa cctggcgaaa gcagaggagg 17820

agaatgaaga aaaatggagt tgaacaggga gcgtggaggg agaccttgat actttcaaat 17880

gcctgagggg ctcatcggtg catgtgacag ggagaaagga tacttctgaa caaggagcct 17940

ccaagcaaat catccactgc tcatcttagg aaaacgggtt gagaatccct aatttgaggg 18000

tcagttcctg cagaagtgcc ctttgcctcc actcaatgcc tcaatttgtt ttctgcgtga 18060

ctgagggtcc cagtgttgga acagtattta tgtatgagat tttcctattt attttgagtc 18120

tgtgaggtct tcttgtcatg ggagtgtggt tgtgaatgat ttcttttgaa gatatattgt 18180

agtagatgtt acaattttgt cgccaaacta aacttgatgc ttaatgactt gctcacatct 18240

agtaaaacat ggagtatttg taaggtgctt ggtctcctct ataactacaa gtacacattg 18300

gaagcataaa gatcaaaccg ttgatttgta taggatgtca cctttattta acccattaat 18360

actctgattg acttaatctt attctcagac ctcaagtgtc tgtgcagtat ctgttccatt 18420

taaatatcag ctttataatt atgtggtacc atacacacat aatctccttt catcgctgta 18480

accaccctgt tgtgatgacc actattattt tacccattgt acagctgagg aagcaaacag 18540

attaagtaac ttgccaaaac cagtaaatag cagagctcag actgccaccc actgtccttt 18600

tataatacaa tttacagcta tattttactt taagcaattc atttattcaa aacccattta 18660

ttaagtgccc ttgcaatatc aatcactgta ccaggcattg aatctacaga tgtgagcaag 18720

agaaagtacc tgtcctcaag gagcttggag tataataagg agattaataa gaaaatatat 18780

tattacaatc tagtccagtg tcatagcata aggatgatgt gaggagaaaa gctgagcagt 18840

gttgccaaga ggaggaaata ggccaatgtg gtctgggaca gttgaatgta tttaaacatc 18900

ttaataatca aagtaatttt catttacaaa gagaagtcag tacttaaaat aaccctgaaa 18960

aataacactg gaattccttt tctagcatta tatttatccc tgatttgcct ttgccataca 19020

atctaatgct tgtttatata gtgtctgata ttgtttaaca gttctgtctt ttctattcaa 19080

atgctattaa attttaaatt catacctttc catgattcaa aattcaaaag atcccatggg 19140

agatggtttg aaaatctcca cttcatcctc caagccattc aagtttcctt tccagaagca 19200

actgctactg ccttttattc atatgttctt ctaaagatag tctacatttg gaaatgtatg 19260

ttaaaagcat atatttttaa atttttttcc ctaaatagta acacattata tgtctgctgt 19320

gcactttgct atttttattt attgtagtgt ttcttatgta gcagatggaa tgaatttgaa 19380

gctcccaagg gtcaggacac atgccttctt tgtttctaag ttatctttcc catagctttt 19440

cataatcttt catatgattt agtacatgtt aaatatgtgc tacatataca tttagacaac 19500

cagcatttgt taagtatttg ctctaggact gagtttggat ttatgtttgc tcaaaaggag 19560

acccatgggc tctccagggt gcactgagtc aatctagtcc taaaaagcaa tcttattatt 19620

aactctgtat gacagaatca tatctggaac ttttgttttc tgctttctgt caagtataaa 19680

cttcactttg atgctgtact tgcaaaatca cattttcttt ctggaaattc cagtagtgta 19740

ccttgactgc tagttaccct gtgccagaaa agcctcattc gttgtgcttg aaccctttaa 19800

tgccaccagc tgtcatcact acacaggcct cctaagaggc ttcctggagg ttttgagatt 19860

cagatgccct gagagatccc agagtttcct ttccctcttg gccacattct ggtgtcagtg 19920

acaaggaata ccttcgcttt gccacccgtc aaggttgaag aaacagcgtc tccaacagag 19980

ctccttgtgt tatctgtttg tacatgtgca tttgtacagt aatttgtgtg acagtgttct 20040

ttgtgtgaat tacaggcaag aactgtggct gagcaaggca catagtctac tcagtctatt 20100

cctaactcct ccttttggtg ttggatttgt aaggcacttt atcccttttg tctcatgttt 20160

catcgtaaat ggcataggca gagatgatat ctaattctgc atttgattgt cactttttgt 20220

acctgcatta atttaataaa atatccttat ttattttgtt a 20261

<210> 3

<211> 20340

<212> ДНК

<213> macaca fascicularis

<220>

<221> misc_feature

<222> (1658)..(1881)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2742)..(2745)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2747)..(2747)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2749)..(2749)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4764)..(4802)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8775)..(8778)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8980)..(8984)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9161)..(9293)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9344)..(9348)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9840)..(9874)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9958)..(9973)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10437)..(10452)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10603)..(10603)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10830)..(10830)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10989)..(11006)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11105)..(11122)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11457)..(11457)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13710)..(13710)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14015)..(14049)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14518)..(14585)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14689)..(14699)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14707)..(14767)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14837)..(14865)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15703)..(15741)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17403)..(17415)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19122)..(19135)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 3

ctgaaagctt ccccgattcc gccgaaggtc aggaaagtcc aatgccgggc aaactggatt 60

tgctgccttg cgcagaggtg ggcgggaccc cgcctccggg ccgggcgcca agttgagcag 120

ctggcacgcc tcgcgaagcc ccagtcctga agccccagtc ctgcgctgct tcccgaggct 180

ccgcaccagc cgcgcttctc tctgcctgca ggtagggagc gttgttcctc cgcaggtgcc 240

cacggcccag catctctggc taactcgctg ggcaccttag gacggaggat ctctacaccc 300

tttctttggg atggagagag gaggagggaa agggaaggcg atggtctagg gggcagtaga 360

gccaattacc tgttggggtt aataagaaca ggcaatgcat ctgggcttcc tccagcgcaa 420

ttcagttttg ctctaaaaat aatttatacc tctaaaaata aataaggtgg gtagtatagg 480

ataggtagtc attcttatgc gaccgtgtgt tcagaatata gctctgatgc taggctggaa 540

gtctggacac gggtcctagt ccaccgtcag ctgcttgcta gtaatatgac ttgtgtaagt 600

catcccagct gcagcagata agtaagtctc ttcctgcgct aagcacgtcc aggacccctg 660

aacggaattt atttgctctg tccattctga aaacccaaag gagtcctaaa agaggaatgg 720

aggagcctaa gaataaaaat agtataataa aacatttctt agacaggttg accttggcct 780

atgtcaaagt tcagtctggg tttgtcttat aacataagga gtaaaagtac cattgttcta 840

cctctttttt taatacttga aaaaaaattt actgtagatg cttttctatt aattaaataa 900

ccttctaaaa aatgttttta gtgctgcatt cgattaggtt ggataactaa atgaaattaa 960

ttcctcactg ttgggtataa aggttattta cagtggttct gtcttagcta ttcactgaac 1020

atcattacat agatatctct ggaatattgc tgattgtttc cgtcaataaa cttagaagtg 1080

taactactta gtcaaagaga ctgaatattt taaaggcatt ttgaagaaaa ctgaaaatgc 1140

tttccagaaa ggatgtatca gttgacaatg atggttgtca acagtattta aggagaacta 1200

tgatactctg aagaaaaact tagcctttct cagtagaagc aggtaggcag aggccacatg 1260

acagcagtta gagtgtggtc ttcaaggaag tcacagaaat actgtgggga attgaaaccc 1320

caagtggaaa atgtacaaga gtgtctcagt gtgactgaga aggaggttgg gcttggggtt 1380

taacttaaga attttttctt ttcttttgtg gagatagggc ttttgttatg ttacccaggc 1440

tggtcttgaa ctcctagcct caggcgatcc tcccgcctca ggctgcagaa gtcctgggat 1500

tactggccgg agccaccatg caggcctctt gctcctactt ttgagaaagg aagcttaacc 1560

tttttttttt gtttgttttt gttttttgtt ttttttgtag acgagtctca ctctgttgcc 1620

caagctggag tgcagtggtg ccatctcagc tcacagcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1680

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1740

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngactttttc tctatctctt ccttctaccc atcctaccct 1920

tggaagatag agaagtaata tcagttccat cgtgttatac tgggcttccc ccagggacaa 1980

acccacttcc ccaacctgaa tgagccatca cttcttcccc agtttacatt tcattgctct 2040

ttgaatgtct ccgttcggat atgggaattc acatgtggtc ataattctta cctgaagaag 2100

actgacgtct tcttctctta gaccaactgc cctgatgtga ggtttagagg ttaaagaaca 2160

tgtgtgtatt tacatgatct ttgtattctg ccttttcgtc cctcactaat gacagctgaa 2220

ccccaaggaa atagagctgt ggaggagagg gtttgatgag aaagtaggta aatattggat 2280

ctaatccatc atcttccagg aaacctccat tacttctaaa aatttcaacc aaattcgtta 2340

aaggacaaga actccaccag agtagggcca taaacattgg caaaattagt tgtaatctat 2400

gactagattt aatgtccctt tgttttattc acatatggtt ataatgcttt gcttggaatt 2460

aggggtattt taagttttct tctgcctagt aagtgtattt gtgcttataa tacaataatt 2520

ataaaatatc acattaatat tttataactg tacagttaac tctggcccaa ggaaaagata 2580

gtccggtaga tgctgcagcc tgattttgta tctaaccctg gcaagaggat aatgactcat 2640

gttatttcac ttaccctttt tatcttttaa catgaagggc tcatataggt caataagaaa 2700

ccagtgatat aaacagacca aaaaatgatc agatctttca cnnnnanana aaaaaaatat 2760

ttttaaacaa tacccaactg ggtgaaaata caatgtaaca gtaccaaata tcaacatgtg 2820

tcaagaacca gaaaaatgtt tgttttcttt gatcagcaac actatttgag gaaatctatc 2880

ctcagggcct agcctggggc ctggcacaca gtaggcactg aacaaatatt tgctgaacac 2940

acacatactt atgatatttt taaaattggc aacaatccaa tacccaataa tagaggaatt 3000

aaatattata gaactgttca ataagatgct tacgaatatc atgcagtaag atgggcaata 3060

tttatatcat aagcttaaat gaaacaaatg ggtattaaag gtatggtaag gttataaatt 3120

actttttaag agattaaagg gaaaagactg aaagatatat actgaaatgc tcacagtggt 3180

gacaaggttc cccagccttg gcactattga cattttgggc tatgtctttg ctgtgggagg 3240

ctggcctgtg ctctgcagga ggtttggcag cactcttggt ttctacccct agatagcagt 3300

agcaaccctc cctcaaccag cccaattttg acaaccaaaa atgtttccag gcatcaccag 3360

attctccctg ggtgagagtg atgaaacagt aggtgatttt ccccttcttt tctcattttc 3420

tgtaattttg tcacattacg ttaataataa ggaaaaaaca taaaaaatag atgaatttat 3480

tattctacct cagtttggat gtttggactc cctttggggg ttctttccat tatatcactt 3540

ggtctgctaa acagtctatg gtttggcaag gtgaaatgat tcatgaaatt ttgtttttat 3600

tttttacctg atactaaaag taaaacattc attcgcttga aaatttggac acagaacacc 3660

aaaaaaaatc cataatctca tctctctttt tctgtctttt ccttcctttt ttccctttaa 3720

aaacaagagt gaaaacctac cggttctccc tccaatttaa ttcctaaata taatcactgt 3780

taacatcttg gacatttcct gtgtctaaac acacatactc actttttctt ttttttagca 3840

aaaagtggat ttctgctaca tgtagtgttc cgcaacttcc tacatgttta caaaatcagt 3900

acatttacat acgctgaatt cagtccttaa tggtattata ttttgtgaat ataacaaaat 3960

ttatttaacc acttagacaa tctaagatat tctcagtttg ctgttatgag caatgctctt 4020

cctttacata tacatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt 4080

ttagtaggat agatttctag gagagggcga aatgtcatat gacatccaca tttacaattg 4140

taataggaag tatcaaagtg ccccctaaaa aaaaaaattc ctcccattag tgtgtgagaa 4200

agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga aatatttaca attgtgttca 4260

agctaagaag tgaaaaatgg tatttcatat cttataattt ttgttgtgag attgaacata 4320

tttcctatgt ttacatgtca cctgtatttc ttattctctg aactatacgt tatgaccttt 4380

cacttatttt cctcatgggt tatgtgtagt ttgtgtagtt gtcttattga ttgttaggag 4440

ctatttatat attaggaaca ttaatctcct gtcttatatg tatgtggcat tgattagttg 4500

atcatttgtg agttcatgtc tgtatacaaa gattagagag gcagtaagag ggaaaactta 4560

cctctttctt atcaaagttt gtaaatatat gtataacaga agagagagaa aacattaata 4620

aatgctgaaa taaagtataa atttttactc cactacttca acataaacta caaaaggaga 4680

gtgacttttc tttcatgctg acttccatat tccccatgcc taaaatagtg cctagcacag 4740

aagaggtgct caatcagtgt ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4800

nnaaatgaag aatagaatct aggcagatac tctggaagag tgactgtgag tcattcatgg 4860

tcttggtatg aattagtcaa atccagcttt ctccccttcc cactccccac tgttagtaga 4920

ataatctgtt tattgagaga atagatttat aatttagaat aagaggggca gaagaggaga 4980

ttttgaagga tggcacctga aggaggacta gcatggctga gatagtgaag tggaagtctt 5040

ggaaagctaa agggtaagat gaaagtattt agccgtaggg ggaaaaagca ttgacaggtt 5100

ggaaatgtaa aagtcagatt ctccttgctt tgaaattttg tacagggcag gttctactag 5160

gtatgttaca atgcagaaaa aacatgaaat agttgagagg aatttggtga aatattatct 5220

tcctggcttc ttttgagtga gcagattttt ttcagggcct gtaactataa taaatttgaa 5280

acttctcatc ttttagtaac ttttttcact taagtttatg tggctgtggg caatggaatg 5340

aaggtattga acttcctatt ccctgctggg tttccacaat tacaagtcaa tcatgactgg 5400

ttattagaag actatttcaa ttagaaccac caagtcccat aatgtcatat tgtgtgttta 5460

attattaagt aaagcagtct tctttttgtg ttttccataa ttagcacatt ccagaaagat 5520

gaggatattt gctgtcttta tattcacgat ctactggcat ttgctgaatg gtaagacacc 5580

aaatccttcc attaggttct atattttaaa tattttaacc atgagtttaa aactaaaatg 5640

ataatttaaa atgcatgcaa ttttcttata gagagaatat tctcttcttt cttctacttt 5700

acacaatgac aaagtctttc ttctgcttta cacaatgata aagctccctg tgtcattgtg 5760

taaaaatata gagaatatag acaaattgaa agacacaaaa taatctatta cccatttccc 5820

agggttaact actgaaaata tctggggaaa tggcctgtat gtatatattt atttgtttgt 5880

tttcaacaag gccaggatct ttcaatcttt caatcttggt tgctctgtga catgcctttc 5940

ctgatgagaa tactctaagg aagaattgta ggatacatgg aaaatgtcag ggtaacacag 6000

tactggcacc accctgcggt cctttctgaa ctccatacca atgtacttct tgccagaaaa 6060

ctgatcaaaa gtttagggaa gtaaaaagag atgttagaat ctaccattcc ctctatgtag 6120

gaagcaaata ggtgtccagt caaaggacat tctggggatg tctacatgaa accaagtctc 6180

ctggttgtaa gtactccatc tccatataat atttctacag taatatatgt ttataaattg 6240

tgggggcaac ttgtttagct aattttatta ttctgttatt gggacactat gtctctgcat 6300

gagacatagt gtcccaaaac atatttcaag cccattggat aaaatatgta tttagcaagt 6360

tcttaaatat aatgataaca taactgacca gataaggtga tttttaaatg ctgtgccaac 6420

tttataaatg ttttgaggaa ttttcccttt tctgaaggtt attcttcttt ctttttagca 6480

tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggcagcaa tatgacaatt 6540

gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctgactt cactaattgt ctattgggaa 6600

atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 6660

agtaactaca gacagagggc ccagctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 6720

cttcggatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggttt accgctgcat gatcagctat 6780

ggtggtgccg actacaagcg gattaccgtg aaagtcaatg gtaagaatta ttatagatga 6840

gaggcctgat ctttatagaa aacatattct aagtgttgaa gacttttcat tcttataagt 6900

ccatacttat tttcaaacag aatagcatag tctcttcatt cattcattca gttcatgaat 6960

tcattcacgt aagtctccaa ttagcatttc ttgagcacct atatgatagt cattggaaat 7020

ccagagacaa cacagagcca tgttctacgg tatgtacagt tttccaaaaa taattcctag 7080

tctttacttt tttattataa atgtaataca tatacttgca aagaattcag atactatgga 7140

agagatcaaa tgaattgcaa aagtgtccct cctcccttca ccactatctc ccatgagata 7200

accaagagac actccaagag agtaaccatt atttgtgtgt ccctccagaa ccttttttat 7260

tcaactacca tttttttatt ttattaggtc tgtcagtttt ccttttttga gcctctctat 7320

atcaaatgct aataaatata ttcagatcaa accccactgt aaggttcata ttaaaaaaga 7380

cttgaagtct ccctatgaag acaaaaaata atcatattaa gtgtaaaaga acttattctt 7440

ccagtacagt ataaactata ctcactgggc atatattcat cttgaaaatc tatactgatg 7500

ttgtcttggg gaattgaaga ggaactagga gtgtcaattc ctgggaactg acccacagtt 7560

atgtcatcag gtcacttgag ttcgaagttt tgtgttagca ctagctaagt aaaggaaaac 7620

acctctgctt tcattgttga gtttcataga attgagagct gaaaggatcc caggcaggag 7680

cgactaatcc aaactcccac aaagaacaaa aatcccccag aggatcttct gttcatatat 7740

ttcctgcagt ggcatccctg tcatatccca caatggcatc cctgccattt ggactcccct 7800

tccatatcct gttgaaatta ctccctaata gtaagctgaa atctgcccct ctagttgtag 7860

ttttggaatt atttcatttc catgatgacc ttttaatatt tgactagaat taaatcatct 7920

ccccttggta tttccattcc tggactaact accatcaatc tgagggctaa caatacaagt 7980

agaaaaagtc tacacttgtc attgatcact gatcaatgat taatcaatga tcactgataa 8040

ttataaactc aaaaacaaaa tcatgtaggg attaagagaa atgtatcagt tttatgttgt 8100

atttctggtc cctgattctg gctcaaataa tgctactatt gtcaagaaga tatcacttgt 8160

aaagtagatt taattttcat tatattttac catgtgcttc tccattcacg gcatttcttg 8220

agatgttgtg gtttatactt tcagtttttc tccagtccat cagcaaatat caggcatcta 8280

ctgtgttcca agatattaaa gaaatcatca tgacttagcc tcatcaacag cattgctaga 8340

tctgggatgg aaaagaagag tataatcctg gcagtcagga agaaggctgc ataaagtata 8400

agtttctgct tccaaagaag atctctcatc agcctgtagg gagtgtatag ggaggggaca 8460

gctgtccttg tagtagcaaa gggttttatt caggtcatct gggctccata atatcccttg 8520

tgtatctgca gtctcctttg ccatggatca acacaatagg aaatcttccg gcactgatgg 8580

tttttccaag ggggagttct tcagggagca aagcaaatga ccaaccaggt ttgaggacct 8640

gatttgacaa ttccattttg tattttaaat tagttaattt gcattctagt cccaatccat 8700

cttgtcattt gcagacagtg gttttggggt tgagttgagc tataccaaaa gtctgaacct 8760

tctgcactta gaacnnnnaa ggcaaccacc aagcttcact tgcactgagg cagtgtctcc 8820

aatggaaacg aggtagctgg cttgcagaag ctttccaact cagggaagta gaactcctga 8880

gtcacctcca tatgcaaata atttcacagt actgctgttg aacttcactt cccatcacag 8940

caaatgtgtg gtaacatagc tttgccacag gagtttactn nnnnccatgg gattttaaag 9000

gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt tggattcact caattatcat 9060

gatcactttg ggtgttattg cacctttcat gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg 9120

cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9180

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctgtcat 9300

tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt cccagccctg tttnnnnngt ttttctttaa 9360

tcactgaacc taatagtagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcagg accttcaatg 9420

agatgaggca gctgaaagat caaagtagtt gcatagttat cccagtaaag ctatttggat 9480

cgtatggacc agatcaactg ctgtcattcc ccaccaaccc catctttccc caaaattccc 9540

agccctgttt aagtgttctc tgtagcattt atctctatct agtatattgt gtagcatatc 9600

atatcatact tttctatttt gtttattgtc tctctcctcc tagaatataa actccacaag 9660

cacagagatt tgggtctgtt ttttaatatt gttgtatccc cagggcttga cgtaaagcag 9720

agtggtagta tgacaaaagc acacaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat gaatgatttc 9780

ctcaaatagg attagcctaa aatttggaaa catgaacaga cttggatata tgaaaatttn 9840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttctaa agggtacact gaagcagcag 9900

tagtaaaagg aggaggagga gaagcagctc tgctactact attatcgagt actactannn 9960

nnnnnnnnnn nnnctacaac tatcgagtac tactacaatt agcacttgct tattctgtgt 10020

gttaggtcct gtactgaaca ttctgcctaa attagttcat ttcctcctgg aaatgactct 10080

gtggggtagg tgcttcatca tgtaagatga gtatttttca cacttcactg tctctgaaat 10140

ctgagtgtgt ctttcaatga tggaatcttt gatttcatga taagtggtat tattcccatt 10200

ttaaggatga ggaaactggg gtccaaagaa attaagtaat ttgcccaaat tcacctagcc 10260

tcgtaaatga taaagctagt tctaaatcca agcagattgg ctctgaagtc tgggccctta 10320

ataaccactt attgcctgta tttgcacctc tggtgtatgt atcaagttat atattggctt 10380

caaaactatc atgacctttt cttgattttg attgttcaat attagtatag tgttctnnnn 10440

nnnnnnnnnn nngggtctgc aaaaaatttt gattactcac ctcatctgta aaacatttta 10500

aacttgtgtg tctgtgcagg cacatttgtg tgtaattata aaaaatttac tatctattaa 10560

tatataggtt gtaccgtaag aaaaattgcc atttttgaag agncaaaaaa ggttgaatat 10620

taccagtttc atctggttca acctaataga catttgtaca aaaacagaca ttttaagagg 10680

atgaaataaa aatttaataa acaatatttt caatttttac taattgtgac gcttcactat 10740

tgttagctaa tatgtcaagg catgatatac cttagggtgg aatttatcat taacaaaggt 10800

ggatagtgtc aataatcttg aggtttgtgn ttttttatat aacactgtga ggtctaatta 10860

agtacttaat tgtttacaac ctcatacagt cgccaataat aagtgtcact tctgctgttt 10920

cctctgggtt gtgcttgaat tattagtatt atcttcaatc ctcagtttct ttgtggaaaa 10980

ctttttaann nnnnnnnnnn nnnnnnaaga tggttagttt agtcaaaatt agataagaga 11040

atctgaaaat ccataattac cccaaagcaa cccactcata agaactatta tttttgtgtt 11100

ttggnnnnnn nnnnnnnnnn nntttccagt gtttccactg gtagtggttt cattgatgta 11160

ggagtatcaa aacatcacta attatttatt tcagttttgt ttgatcctag ctgttttgtg 11220

ttaactttga agaaattaca tcacagatct attgttgtcc ttggtaaagg aatggagagt 11280

taaggctcta gatcattagt ggttatgctg tagtattagg agtaaaaaaa agattatatc 11340

aacaaaataa gaacatgtta atgtacttgt aatagataaa catgaataaa gctcttatgc 11400

tatatagatg cactgaacaa tctactagaa ttgtcagcaa acggtatctt aatcctnaaa 11460

agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattattt 11520

aagtgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tataagtatc ataatgtggt 11580

atcctagata gatcccagaa cagagaaagg atattaggga aaaactggag gaatggaata 11640

aattatgcag tttagttatt aataatgtac taatgtcctt agttatgacc attgtaccat 11700

ggtaaagtaa gatactaaca atagaggaaa ttgggtaagg ggtatatgta actctatact 11760

atctttgcaa tttttttgta aatttaaaac ttctaaaata aagaacaaat ttgaacatta 11820

aaaagtgtcg ccaggaacat gtatcactgt ttacagatga aacagtatgt atttttatat 11880

ctaatttctg atcattggct tcaaatcaga aaagtgaatg acacatcaag atcaggtttt 11940

ctgtttacta aataaagtct aagaaaacaa agcataccag ctggagagat tcatgtttat 12000

aaagacagat ttataacaac aaaataaaat atccaagaat aaatttaaga agaaataggg 12060

cactatgtaa aaagtatagc actttactga gaaacatatg aaaacctgaa tacatggaga 12120

gaggtatttt atatttgaat agaaagattg ctggtttaaa gataattctc tttaaatttt 12180

ttttgttaga aatttaagag gtacaagagc agttttgtca cacggatata ttacatagtg 12240

gtgaagtctg gggttttagt gtaaattaat ctttacattt tgtttgagcc caataaatgt 12300

accaacatga tttttatagc aagatagtca ttcctattaa cccaaacttg tcccaacttt 12360

gaactgaact gaggcagagc tagcaggtgt tccccactgc tgaggcatct gaacattaag 12420

cgtatccctc tgagaaccag cctgcattga tcctctttct aatgtagaca gcatcaagct 12480

atatatctag ttctgtgctc agcaaaagcc ctgacttctt tttgcttatg tcctagctcc 12540

atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt tgtcgatcca gtcacctctg aacatgaact 12600

aacatgtcag gctgagggct accccaaggc cgaagtcatt tggacaagca gtgaccatca 12660

agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttaaatgt 12720

gaccagcaca ctgagaatca acacaacagc taatgagatt ttctactgca tttttaggag 12780

attagatcct gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccaggtaata ttctgaatgt 12840

gtccattaaa atatgtctaa cactgtcccc tagcacctag tatgatgtct gcctatcata 12900

gtcattcagt gtttgttgaa taaatgaatt aatgaataac attatattta caaaatgtat 12960

cctaattcct cacttccatt catccaaatc atattgttac ttaataaaca ttcaccaaat 13020

atttattgaa tatgcctttt gttccatgca ttgtagtact catttgacac acatagaata 13080

ataagactca cgttcacact cttcaggaaa cagataaaaa acaaatgaac aaacaaaaaa 13140

caggcaatcc aataccatgt gggaaatgct ttcataccat gtgggaaacc tgggggaata 13200

cctgagagga atattcaatt caggccatgt ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag 13260

ccgcctcctt cttactaggg tttctgtggc aggaaataaa tggaacgtat ttttctatct 13320

tatgccaaac aggagggacc ctttctcccc tgtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt 13380

tcaacgctag cagtctgttt agtgcacagg acatgaggct gtgtatccct gggcaaattg 13440

ctacacttct gtgtgcttca ctttctctgt aggattataa cctactgagc aaggttattg 13500

tgggggtcaa attagcaaca gtgtatgaaa atgatttgag accagtgcct gcacaaattc 13560

aactattttt ttttatctca ctactctata gaagtaggta ggatgggaga cagagtctga 13620

tgggaggctc agaatgtgaa agtaagtgag gtgagtgagc atgatatttc atataaacac 13680

aaagatactc tgagaagagc ttctcacttn ccccgccccc aatagatgtt gacaggaaaa 13740

tgccacgtac ttcagcaaaa acagctgaaa aattagacat aaaagtcaat caataggaaa 13800

agataatcca ggatggtctt gtgaacagaa agaggaaaaa aaaagtttag aaaatgatgg 13860

ggatgctctt actggggtat gagtcctcag gtattcaact ggctttcaga aaaagctaga 13920

ctagtgggtt cctgccattt aaaagctgtt ttatgacaac ttacttgttg ggtggcctac 13980

agtaactcac ttaactgtgc tgagtctgtt tcctnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14040

nnnnnnnnna tgcctaactc ataaagttgt tctgaaactg aaataaaaca tatatgaaca 14100

ggcattgtaa actgtaagtt acggaaaaag ctggctgttg ttgtgtcttt aaagcttcac 14160

ctgggtagtt agagatggat catgggtctc agtggagagc tgagccaggc aggagctgac 14220

taagggtaag aggtgggaat tagcaatctc tgaacatctg tgtgccatgg gacccctttt 14280

cctcctgcat ggtaccccag acaaggagcc tagtaagaga tactaatgac ttgttgtcca 14340

gagatgttca aactgcagag aaagataaga caacaagcat tggcctccaa tcatgatgac 14400

agatagagga ggtgggagct ccttagcagt gctggttggt tttccatgtt ctactgtggg 14460

ccatctctgc catgtactgt aggctactaa cttctatatt aaaaaatgca agaggggnnn 14520

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14580

nnnnntcagg agtttgtaac cagcctggcc aacatggtga atctctgcct ctactaaaaa 14640

tacaaaaatt agccagatgt ggtggcgtgc acccgtaatc ccagctacnn nnnnnnnnna 14700

ggcacgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14760

nnnnnnnagc atgggcaaca gagaaagact ttgcctcaaa aataaataaa aaataaataa 14820

ataaataaat aaataannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncattt aatactgagt 14880

agccactcca tgtggtactg tgctaagcac attataaaat attagcctca caagaaatgt 14940

attagcattt gtattttgta cactggttaa gtatcttgcc caagacctca aaactggtta 15000

aggggcagca gaatttaacc ccagcgccac cttttcaaag tctgggcttc ttacacttct 15060

ccatgctgtt cccattttaa cagatgtatc tcgccattcc agccactcaa actttggcat 15120

ttaagaaaat tatcctaaag ctaaactaaa cttcaaggat gactattctc ctcatgaccc 15180

cttcccatca aaattttatc tttagtcagt ttgtttttgt tttgttttgt ttttcagaac 15240

tacctctggc gcttcctcca aatgaaagga ctcacttggt aattctggga gccatctttt 15300

tactccttgg tgtagcactg acattcatct tctatttaag aaaaggtagt atttccttaa 15360

ttgcagtggt ctccactggg gatgaggagg gggtgagaat tggatcgatc atggctgcaa 15420

ggaaacctga cttaacctct gcagggtggt gcaaaggcat tccactattc aacagtaatt 15480

atattgaagc tgcatgggat cactgggtga agatggggtg taaggggtga gggacaggag 15540

aatgggtatg gatggaggta gaagatgcag tgtcatacaa tttttttcta tcatgaaaat 15600

aaccacagac ttactgtaaa gaaggagcta aaatgcctgt cattttcagt tgcattttag 15660

ttttgcatta gttgcaccca gctggtttct gggtactcta acnnnnnnnn nnnnnnnnnn 15720

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccatagagt attttgtaaa attattggca gaggatgtac 15780

ataatttgca tgtgttcctt tctccattta cctgtgggaa caattaaaat ccaggaaaat 15840

gagtatattc aaataatttc ctcccattta tgatgattca gagtaaataa ttcctctgat 15900

acttagagaa gtataccaag agatccagtg attgtataga gttgtctgat gttaaatagg 15960

gaagtagaat atggaaggga ttccaatagt cgttgaaaaa ttccccacaa ccccttacat 16020

gggggaaagt ggtgttaact gagatagtag agataagctg ttaccaaaaa ttatgttctt 16080

aacaggattg agatagccag aatataagga tcaagtttca atgacagtaa gatcctgaga 16140

tgcagttgat ttgcacaaag aaataattgt tgccagcttg cattttgaat atttctctgg 16200

aaaaagagat tagttggcag tagaaatgaa tagaaatcaa tagatattaa aatacctcag 16260

aatttgattc atctctggga aaagatgaaa aataaaagtg tatagtcctc aagaaaatct 16320

gggatcaaaa gcatgggcct taccctattg aattaattaa cctcagaagt tgggaactgt 16380

ggaataagga tgtccaccag acttcctagg gattacaaat gtttcataga acttgaaatt 16440

taaacttggg tcactgtatg ggatgtagag ctgtgctata tggaaataaa aatgatttct 16500

ttttctcaag ggagaatgat ggatatgaaa aaatgtggca ttcgagttac aaactcaaag 16560

aagcaacgtg gtaagaatat cagaaggaat tgggaagtag aaggcaaagg aaacaaaaag 16620

ctaaagcaat aacaaagaga aatccattag tcataatctc ctctcctttt aaagaatgct 16680

ggttcccctt tgcctcacaa ctaatacaag aacttctcca ccatctcagg aagtttaggg 16740

atggccttca agagtagaga gtagggagca gctctgtgga gagaggagag gagcagggaa 16800

ggggaaggag tcagcttctc tttgctaatc tgttgccctg caccctagca gctccctgca 16860

gcaggggaca aggttgactt aggtggatgg ataattaatt gattctaaaa tattgtgtgt 16920

cagtattgta tattgtaata ctatgttaac tgcgccatgc acggtatctc atttaatccc 16980

ccaccccttg ccattaccaa aaagagagag agaaaaatac tagaattatc ctcattttac 17040

agtagagaaa acagagggtc aagaagataa agtaaagtgc ccaagaacac acaactgatc 17100

acaaatatca agcttggggt ccattagcct aaccacagac ccttactctt aacccatctg 17160

cttcaatcca ttttgctaca aatgtttaca ttatatgcag ggcagaaaag tctcatccag 17220

tttattgaac taagaagaaa gttatattaa ggtgtctaat tttttttaat gtagttagaa 17280

accaaactta acaatgagcc caagtttaaa gcagtctaat taacttgaca agctcaggca 17340

agtttcattc tgtggcctgt agcatcatct gtgttgtaaa gctaagtagc aaatgttatt 17400

tgnnnnnnnn nnnnnggtca tcctgggggg aaagtcatcc caatttgctc aagactgagg 17460

ggtttttcag gatatcatgt aaggataatt gggtacaaat ataacctgct tctttctctc 17520

atttcaaatt tatcatttat catctcagca actatgagtt atgtttttta ttagatttct 17580

tgttactttt tccccagacc gctccccatg aaattaatat actattatca ctctccagat 17640

acacaattgg aggagacgta atccagcatt ggaacttctg atcttcaagc agggattctc 17700

agcctgtggt ttgggggttc gtcagggctg agcatgacca gaggaatgaa tgggcccgtg 17760

ggatgcatgc agtatgggac ttaaaaggcc caagcactga aaatggaacc tggcgaaagc 17820

agaggaggag aatgaagaaa aatggagttg aacagggagc gtggagggag accttgatac 17880

tttcaaatgc ctgaggggct catcggtgca tgtgacaggg agaaaggata cttctgaaca 17940

aggagcctcc aagcaaatca tccactgctc atcttaggaa aacgggttga gaatccctaa 18000

tttgagggtc agttcctgca gaagtgccct ttgcctccac tcaatgcctc aatttgtttt 18060

ctgcgtgact gagggtccca gtgttggaac agtatttatg tatgagattt tcctatttat 18120

tttgagtctg tgaggtcttc ttgtcatggg agtgtggttg tgaatgattt cttttgaaga 18180

tatattgtag tagatgttac aattttgtcg ccaaactaaa cttgatgctt aatgacttgc 18240

tcacatctag taaaacatgg agtatttgta aggtgcttgg tctcctctat aactacaagt 18300

acacattgga agcataaaga tcaaaccgtt gatttgtata ggatgtcacc tttatttaac 18360

ccattaatac tctgattgac ttaatcttat tctcagacct caagtgtctg tgcagtatct 18420

gttccattta aatatcagct ttataattat gtggtaccat acacacataa tctcctttca 18480

tcgctgtaac caccctgttg tgatgaccac tattatttta cccattgtac agctgaggaa 18540

gcaaacagat taagtaactt gccaaaacca gtaaatagca gagctcagac tgccacccac 18600

tgtcctttta taatacaatt tacagctata ttttacttta agcaattcat ttattcaaaa 18660

cccatttatt aagtgccctt gcaatatcaa tcactgtacc aggcattgaa tctacagatg 18720

tgagcaagag aaagtacctg tcctcaagga gcttggagta taataaggag attaataaga 18780

aaatatatta ttacaatcta gtccagtgtc atagcataag gatgatgtga ggagaaaagc 18840

tgagcagtgt tgccaagagg aggaaatagg ccaatgtggt ctgggacagt tgaatgtatt 18900

taaacatctt aataatcaaa gtaattttca tttacaaaga gaagtcagta cttaaaataa 18960

ccctgaaaaa taacactgga attccttttc tagcattata tttatccctg atttgccttt 19020

gccatacaat ctaatgcttg tttatatagt gtctgatatt gtttaacagt tctgtctttt 19080

ctattcaatg ctattaattt taaattcata cctttccatg annnnnnnnn nnnnngatcc 19140

catgggagat ggtttgaaaa tctccacttc atcctccaag ccattcaagt ttcctttcca 19200

gaagcaactg ctactgcctt ttattcatat gttcttctaa agatagtcta catttggaaa 19260

tgtatgttaa aagcatatat ttttaaattt ttttccctaa atagtaacac attatatgtc 19320

tgctgtgcac tttgctattt ttatttattg tagtgtttct tatgtagcag atggaatgaa 19380

tttgaagctc ccaaaggtca ggacacatgc cttctttgtt tctaagttat ctttcccata 19440

gcttttcata atctttcata tgatttagta catgttaaat atgtgctaca tatacattta 19500

gacaaccagc atttgttaag tatttgctct aggactgagt ttggatttat gtttgctcaa 19560

aaggagaccc atgggctctc cagggtgcac tgagtcaatc tagtcctaaa aagcaatctt 19620

attattaact ctgtatgaca gaatcatatc tggaactttt gttttctgct ttctgtcaag 19680

tataaacttc actttgatgc tgtacttgca aaatcacatt ttctttctgg aaattccagt 19740

agtgtacctt gactgctagt taccctgtgc cagaaaagcc tcattcgttg tgcttgaacc 19800

ctttaatgcc accagctgtc atcactacac aggcctccta agaggcttcc tggaggtttt 19860

gagattcaga tgccctgaga gatcccagag tttcctttcc ctcttggcca cattctggtg 19920

tcagtgacaa ggaatacctt cgctttgcca cccgtcaagg ttgaagaaac agcgtctcca 19980

acagagctcc ttgtgttatc tgtttgtaca tgtgcatttg tacagtaatt tgtgtgacag 20040

tgttctttgt gtgaattaca ggcaagaact gtggctgagc aaggcacata gtctactcag 20100

tctattccta actcctcctt ttggtgttgg atttgtaagg cactttatcc cttttgtctc 20160

atgtttcatc gtaaatggca taggcagaga tgatatctaa ttctgcattt gattgtcact 20220

ttttgtacct gcattaattt aataaaatat ccttatttat tttgttactt ggtacaccag 20280

catgtccatt ttcttgttta ttttgtgttt cataaaatgc ttagtttaac atcccggtgg 20340

<210> 4

<211> 20641

<212> ДНК

<213> mus musculus

<400> 4

gcctcatgcc aggctgcact tgcacgtcgc gggccagtct cctcgcctgc aggtaaggga 60

gcatcttctc gcggaatccg cttgcagggc actttaaaga gccagaatcc ctagaccttt 120

ttaggacgga gaagggaacc ggtttcctgg gaaagttaag aactcagaat ccgcagtttt 180

gtgtgtttat ggatcttgtg ggtaggtagc tgggtcagaa gagatgaatt aattggtcct 240

agcgcgactt gactgtttgc tagcaatgac tgggtctttc cacttgaagc atctccggag 300

gtcccttcct ctgtcgaggt ctaggatgct ggagcttaag attttcattc tatctgccca 360

gagaacctaa aggatttttg gaagaaaatg tcccaaacag ttcttagata cagtgaccta 420

ggctatgtta aagtttaggt tggggttgtc ataagaggtg aaagtacaat attctatctt 480

tttttaaaaa taaattatta caggtgcttt cctatgaatt acttagccag ttttttttta 540

attgctatat tccattgtgc tgggttatta aagggcatca ctctcccact gaggaatgca 600

caggttagta atagtgcctt actagctcag tcatccactg accatctgtg tatgtgactg 660

tctggaatat ggctaggtat ttcatttaga taaactctta tatgtataag tacttcatta 720

tgtttgagtg tctgaaaggc ctttgtgtag aaaaaaaaaa aacaacaacc tgagaataca 780

ttccagaaag tatccgcagc tgatgatgat agtgaccaag cggtgtttaa ggagaacttt 840

atacagggaa aatattcacc tttcccagct gagcatcata gataggaaga catgatagtg 900

gttatatgct gctctaagga gggatggaga agggatggat ttgagcacag ggttcaggat 960

catttgatag aatttgaaaa ctgggtaaat tttcactctt ttgagaaagg aagtttgcat 1020

ctgcttcccc tccccgcccc aggcactctt ccccccccca tccccccccg tgcccccccc 1080

ccccatggga agataaagaa gtggcgttcc aagatcttca tctggacttc ccctgggaca 1140

aacctatttc cccatcttga atgagcgtca cttctttact ttaaactctg ttctgtgaaa 1200

ggctctcagc tcttgtctgg gaatttgtga aaggttacag tttcttgccg gagggaggga 1260

gaaggtgacc ctggactctt agcccatgta agaggtgcag gtttagaggt caaaggccat 1320

gctgatttac atggtccctg aatttcccct tttgatctac tgctcacacc tgcaccctga 1380

gagccaggga ggggaggata tgatactgaa gaaggtgact atcagaccca acccatcacc 1440

tttcagactt tatactaagc tttaaagcag actcataagc aatagataac tgttccaact 1500

gagtctgcca tcaacgtagg aaaaattagg tacagtcttc agtggatatc atgtacctca 1560

ttgtgactgt ctagtactcg gcttggccat ttctcccagg gcctcattgc aacagtcact 1620

gtgtcctcac aggcctggat gtcatcctgc ctcatctgct tgggcagatg aactggagag 1680

atatgattaa taatgagtca tttgattttg ctctttttgt aaatgtcctt ggtttggttt 1740

ggtttgttta ttttttgttt tgttgttgtt gtttgttttt attttcatgc tcttgttgtt 1800

gtttgagaca gagtctcact atgtagccca ggctagcctc ttcccccagt ctctcagatg 1860

ctgttgcatc tgcccttttc taacatcaat gattcataat aatcagcaag aaggctatga 1920

ccttaacagt caaaataagt aatcaggtaa ttattgagag ctaaatattt atttaaacaa 1980

atcaagttgc atttttcaag aattgaatgg ggggatctaa aaagtaatgt ttgtgctgca 2040

caaagatgta gtggtatcag ttgccatagt ctttctccct agatccgcag atctccttag 2100

ggaaatctat aattcaagcc taaacttgga cctggtacac aactggtact cgcccaaaca 2160

ttggccaagc acacacatat ttgtgactct gaaaaaaggg acaacacata acagcaaagg 2220

cgctccgtgt taggggcctg ttaaatacaa gacttgggga aattatgcca taatcttaca 2280

ttttaaaaat ggctattaca tgtgtgagac aacgggggct ggagagatac ctcagaggta 2340

ctaggcacac atatggcaag cagatgtaca agcaggcaaa acattcttaa aaaacaaaaa 2400

caaaacccca aaacagattt ctttctatat tatttatatg gggttctgcc tgcgtgtaca 2460

cctgaagggc agaggagagc accaggtctc ataggtggtt ggttgtaagc taccatatgg 2520

ttgctaggaa ttaaactcag gactttggta agagcagcca gtgctcttaa cctctgagcc 2580

atccctccag tcccagacaa aacactctta cacataaaat aaatcaatct ttaaaagtgt 2640

agaggaaaat ggctgaacag aaactattga cagacatgct gagagtggtc accgtttctc 2700

cagcttggca ctggtggtgc tgtaggccat ctcagtgtct gtcaccttgg ggcggggcgg 2760

ggggcgggag ggggggaagg cggcagggca gggtcttggc agcatctcgg gcctctattt 2820

catcacatca gtaacagctc tccttcgtcc caagcaagct ttggcaacca aataaatatg 2880

ttagccaata ttaccaaacg gtccctagag gagaatgtgt gtaatgtgcc tacattcgtt 2940

tttataacaa caccaacaat atccaaccat aaaaataaac tgaaatggtc actctacctc 3000

agtgacaacg tctgagctcc gtttcagggt ccctcacaag aaattcgata ggtgtaatga 3060

tttatttttc ctaataagta aaatgattat tcactcattt gaaaattgga cacacacaca 3120

aaaaaatgaa gaaaaaattt gctatttcat ctctcctttt ctatctcttt ccctttaaaa 3180

aaagtataaa tgtgggctaa agagatggct cagcagttaa gagcactggc tgctcttccg 3240

gaggtactga gttcaaactg caccaaccac atggtggctc acaaccatct gtaatgggat 3300

ctgatgccct cttctggtgt gtctagagac agtgacagtg tactcacata cataaaataa 3360

gtaaaaaaaa aaaaaacaaa actttttttt aagtataaat gtgtaagaac ttacctgtct 3420

tccctataaa agccacaatt acctttgcag ataatcactg tcaggcagtg tcttcaagag 3480

aagtggggtt gttctacgac acaagaatat ttttgtttat atactaccct ctaagctcct 3540

tcctacttct ctgcaaactc atcccctgtg catatactga aatctatccg tcacggtatt 3600

ttgagtatac acagttatcc gtcacggtat tttgagtata cacagtttta ttagctaata 3660

catggggtat ttcaagtctg ggactgttgt tggctgtgtc atctctgtta catatgactt 3720

atattttcta agatgaattt ccaagacagg aatagagaga tcatacgaca tgcacagtta 3780

aagttttaag agattacaaa attgaccttt aagaagctat acaatttcac atcctttcca 3840

ggaaaggtca agaaatccct gtatcttcac taatgctacc tatgaggagt ctgtaatttt 3900

ggtagagcag aaggtccaaa tggtatcaca gatcctccat ggactttctt atcgagagcg 3960

ttctttccgc ttttattgat tatccttcga gctatgtgag actctcatcc gtcttcctct 4020

tgaccgatgt atagttttct cactgagttc agaggctagg atgcagaagc cgtcctcgtc 4080

agctttatac acctttcaga ttgactgtga atgagcacac aggtcagaga gacggtaagg 4140

gaagacctac tctcccatga acgttgtaaa catgcgaata acacagaagc agaaaatgta 4200

aactattaga ctggctggaa tgtagcgctc acctttgagc ccactccttt agacaccggt 4260

ttcatggaag aatggctcct gtttcccacc tgctgcttca gcagtgcccc aaatagtgcc 4320

agattcagag gagatactca gtgtttgccg agtgaattag gaaagtgttc agcggagggg 4380

acactagcat tcagacatcc agaccttaga gtaaccgggc cagatggaag tctccttcct 4440

tcccatagct gttaccactg tactgtcttt actggggaaa agatttatca tgtggaatag 4500

gtgcgaggca gaggtgagat tttaatgggg aggaagcatt gaaaagtgaa agtgaaaatt 4560

ggatgctctt tgctttgaag ctttgcctaa agcaggtttt agctttcaaa tacgtttcaa 4620

tgttgaaaga acgcatgata catatggagg ggggcctggg gggggtcctt ggctgagttt 4680

gaatgtacat taacaatctg gggggctaat aactcaatgt aaagctgctg atcccatcat 4740

actgacttct ttccacttgg ttctacatgg ctttgagtta caaaatgaaa gcattgaatt 4800

ttgaactgtt cagctgtgtt tccacacttg caaatcggtt gttggccagc cctcagaatt 4860

gcttcagtta cagctggctc gtctgctctt tccagactgg cttttagggc ttatgtatat 4920

atgagaagga cacatttact agtgtctcct tgctctgcta ttgaaattaa gcagacctct 4980

ctgtgtttcc cgttactaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc 5040

acagcctgct gtcacttgct acggggtaag tcaccaaatc ttttcagtgg gttctatatt 5100

ttcaatattt tagctatgaa ttaaaaatgg aagtaatttg tggggtgtgt atgtgtgtgt 5160

atatgtgtgt gtagaggggg gtctgtgtgt atgtgcagtt gctaggcaca cataaagcgt 5220

tcataggaca acctagagct tagtcctcac cttctacctt gtttgagaca aggtctctta 5280

tttgttgtac attgctgagt cctgtagttc ggctagctca gaacctcctg ggggctctcc 5340

tgtctccacc tcccagtcca ctgagattgt aggcacatgc tactgcacct ggcttctacc 5400

tggtctctgg ggatttgaac ttgggtccat gggctacaca gcaagtcgtt tacttactgg 5460

gcaatcactc catcccctaa gataattata aggaatatac cttgcttatc caaacacatt 5520

ctcattctcc tttgccataa ataagttact tggcaaatat attgtatgta tttttaataa 5580

ataaataaaa tcttaaaaat aaataaaatt atttgtgaag acaaaaaaaa taagttactt 5640

ggaaaggatg aaggaaaata ctggagcttt gggtgtggtt tagtagtaga acacttggct 5700

gatgtaaaaa aaaagcccta ggtgcaatcc caacaccaga aacaaatgaa ggaatgaaca 5760

acaaccgccc ccacccccca ggggatgaat ataaaaatat caggtaatac agaactaaca 5820

ggtgatccgt ttcctatgaa taactactga acattcccag ggaggtggcc cactgataat 5880

atatttttat ttattggttc cttttaaaca agactgggaa tatattatct agcttgcatc 5940

accaccacca ccccccaccc ccgccccatg aagttatttc aaagaagaat tttagtgttc 6000

atgtgattcc ctaaataaaa tgatagtaac cttttaccca ggttttcaga tgtgtttgga 6060

ggagttttct gtcttctgag ggctggtcct ctttcctttt cagcgtttac tatcacggct 6120

ccaaaggact tgtacgtggt ggagtatggc agcaacgtca cgatggagtg cagattccct 6180

gtagaacggg agctggacct gcttgcgtta gtggtgtact gggaaaagga agatgagcaa 6240

gtgattcagt ttgtggcagg agaggaggac cttaagcctc agcacagcaa cttcaggggg 6300

agagcctcgc tgccaaagga ccagcttttg aagggaaatg ctgcccttca gatcacagac 6360

gtcaagctgc aggacgcagg cgtttactgc tgcataatca gctacggtgg tgcggactac 6420

aagcgaatca cgctgaaagt caatggtaag aattaccctg gatggggaag gcttcatccg 6480

tatttaaaac agctccctaa tgttgagagc tcttcattct tgagagttcg cacgcacttc 6540

tcacagaaca acagcagcct gttcttctcg ctcgtttgtt cattcgttcg ttcacacact 6600

tcaccagtga aaaagcctag cactgtgtgt ttgatagtaa cttgagattc agtaccagat 6660

aatactcagc catgctttgc agtcagtacc atgatcttgc aaaggtgaaa tgccaggtgt 6720

ttgtttctta tcataaatgc aatatataat atattacata gatgtataga tataactgtg 6780

taacatgcaa taagatataa tatgcatata tttcatataa cataatgtat aatatataat 6840

gtataataat atatactaca atatatagtt atatgcatag ttatatattg catttatgat 6900

aaaaagcaaa cacctggcat ttcacttttg caagcttttt gaattacttg taaatatata 6960

tacatgcaaa catacataca cacacatgtt tttttacaag taatttgaat gtcatggaaa 7020

gaaatagaat cataaaaatg tccctcctcc ctaactacca tcttctaagc ataaatatac 7080

agtaactact atttgtacat ccctccatga ctttttgatt ggattactgt ttatatttaa 7140

tctatcaggc ttagcacatt ttctttcctt tgaatacctc catacaaaat tcaatgtgtg 7200

tttatatata tatgtatata tatagttata tcatatcata tatcatacaa agttttatat 7260

atgtatacat atataaacac acatatctac acatacatac acatttttta tatatataca 7320

caatatataa tgtatatgtg tgtgtgtgtg catatacctc tatatctatc tatctatcta 7380

tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatagcttct actgtaaggg tcacttttta 7440

aaaaattaag gttaatctat gaaggatgag aagtgaagat cttaagtgta gaagaagccg 7500

ttcttccaca gagatggtac aggctacact cagcaggcat gcattcattt tcagggcctg 7560

catctctggg agtgctgagg aggaactatg agtgtaagtt cctgggtaac gagccacaga 7620

aatgtcatca ggtcccttga gttcacggtt ctgggttgga actaactaag ggaaggaaaa 7680

caccttgcta accacccctg ctttcactgt tgggttgcat agacctgaga gcttcactca 7740

tcgcaggcgt gcacacagcc agcccagttg cccaccagga ctggaaatcc ccaaggctct 7800

cctcttcaca tacctcccac agtggtgtcc ctcgaatcag gtccctttcg tggtctgcgg 7860

aaacttcacc ttgatggaca ctgagccgaa ccccgtcttc tccaggcaga cgttgcagat 7920

ggtctgcctg ctccttttcg gttttcataa taactttaaa actatttggc tagaatcaga 7980

tagtctcctt cgatcttttt actcctaaac tagtgtgaag ctcaatatta tacataggaa 8040

aaattcacat tcctcataag ggatcacggc agttattaac gcaatcttat gtagagatta 8100

ggaaaaatgt gtccattcga cagtttatta atgggtctgt gatggtgggt cgcttagagc 8160

ttatgaagat gccacttgcc ttatttcggt gcttggctct aacttccatt accttttact 8220

tacaattctt catttgtgac actcatgaaa ggagactcgg gatatggttg ttaatatctt 8280

gagcagctgt tagtacatca gcaaatatga ggctcctgtt tggttccaag atttttaaag 8340

acattgtgaa gctggaaggc catgagcagt caaagttgct ggacctgggg cactggaagg 8400

agctcaaggc gggcagtcag gaagaaggga gcagggtgta agcctctgtg acaagaggtc 8460

tctcatggct tgttaggagt aggtgactct ggtaaggagg aatttactct agattatgtg 8520

ctcagtgata tctctgatac caaagacaat cttttggagc gcacggcttc tccacggagg 8580

gacctgtgat gcggcaaagc tggtatccaa gcagtcttga aggcctgctt gactattttg 8640

ttttcttaca gaaatcacta cgtcgatatt ttactcccag ttcaccttgc catttgcatg 8700

cacgttagct ggtctaggcc aagagtctga accttggttg tggctcaaat ctgtaatctc 8760

agctatgtgg gaagctgagg caggagaatc gcgcaattag gacttgtctg agctacgaac 8820

atatagcagg ttcaagagca gcctgggcaa tttggcaaga tccgttctca aagacataca 8880

tacatacata tatttggcaa gatccgttct caaagacata catacataca tacatttggc 8940

aagatccgtt ctcaaagaca tacatacatg catgcatgca taaatacatg tataaatgaa 9000

tataaaatta aaataggaac aggactgagg acatgcccag tgatgtacag gaccctggtt 9060

tcagtttcta gcaccatggt cgctggcatg caaaagcttt ccatgtcaag gaagtagaac 9120

tcctgaattc tgtgctatgc aaatgacttc acagcaaggt tccttcccat cactgcaagt 9180

gtgtggtggt gaagcagccc tacagggagt tcactcgcca tggggtttta aaggtgaatt 9240

atttcaaaac tgaaatctga aagagtgtag ttttggatta actcagtttt tattatctct 9300

ttggataatg ttctaccttc aaaggtttac agaagaccct caggcatcag gcttttaatt 9360

gaaaaatatt cagctttaat cactgacctc aatatcagaa aagaatgaag tgtccattta 9420

gtagtcctcg gaccgtagat ggcattaagc agctgtaaga aacacgctca tcacatggtt 9480

caacaattaa ggattgccat ggtgcacccg atcccccagc tctgtttaaa ccttttctct 9540

gtcatctatg cctatctaag atgtctcagc atatcatgct tattgtctct ttccttctct 9600

tgaacacaag ctctaggggt aggggctttg gtcagtttta ttgttggacc tgttggcctt 9660

gacgtattat gaaggggcag tgtaataaga aaagaaaacc gtgtttgttg atggaatggt 9720

ttaaaaaaaa attagcttaa aatgtatgct atacgaacgg gcatgaatct gggagatttt 9780

agactgttcc ttgtgagccg taggaacttt cttgtttctg tgttcacagt cctccgcagc 9840

tgtgctcatg gtcctccaca tctgcctaac aacagcaggg gtagatgtta taattaacac 9900

tcacagaaca cctgatatgt gagaggttgt gccctgggct tcttgctcat atgaattcat 9960

ttcatcttta acataactct tcgggggagg cacttgccca tgaccatggc ttgttttctt 10020

tcctatcgac tatctttcaa atcggaatgt gtctttccct aggtgacatc tcagattcaa 10080

tgttacacag cactgctgtg cccattttca ggcattaaaa atgcgatccg cctaaattcc 10140

accccgataa aattatgcag ccaggttcgg aacccaacta gcccatctct aaaaatctat 10200

gcccttccta gcctcgcttt gttgcctgtc tttgtacctc tggagtgggt atcaaggaac 10260

agaatggctt taaacatgat ttgaactttt cctggttttt gatcacagca gtaacagagt 10320

gttctagaga taagccagag gtttgaaaac aaacagaact tgtctttgag gtgttataaa 10380

catgtgtgtg attataaagg atatatctgg tgccaatagg tatagcttat attataagaa 10440

atggccattg tgaagatcag aaggagataa ctcactgatt tcaggtggtt gattcaatct 10500

aacacatgat atattctgaa actgtacaaa aaagatattc aaaagaagaa acacatggaa 10560

caaagagtat atggaaattc tgacaactca gaatcagtgt atgttaagat gaagttcatg 10620

attaacaaat ggagatggtc gcagtcatcc tgaagcttat tttagccaat gctttatcac 10680

atccaactca atcttcgttt tttttttttc agatggatct tcccattttt aattaacctt 10740

atcatgatag cccctagtaa ggcatgtcct gacatttctt ttcttttttt ttatagctta 10800

tgtttctttt tttaaaaatt tttttactac atattttcct caattacatt tccaatgcta 10860

tcccaaaagt cccccatacc ctcctccccc actcccctac ccacccactc ccactttttg 10920

gccctggggt tcccctgtac tgggggatat aaagtctgcg tgtccaatgg gcctctcttt 10980

ccagtgatgg cctactaggc catcttttga tacatatgca gcttgagtca agagctccgg 11040

ggtactggtt agttcatagt gttgttccac ctatagggtt gcagatccct ttagttcctt 11100

gggtgctttc tctagcttct ccattgggag ccctgtgatc catccaatag ctgactgtga 11160

gcatccactt ctgtgtttgc taggtcccgg ccaagtctca caagagacag ctatttcagg 11220

gtcctttcag catatgcttg ctagtgtatg caatggtgtc atcgtttgga ggctaattat 11280

gggatggctc cctggatatg gcagtctcta aatggtccat ccttttgtct cagctccaaa 11340

ctttgtctct gtaactcctt tcaatcttcg tttttaatgt ccgaaaatga ctggtaacgt 11400

cactgcttac atttcccttt gctttgtgtt gaattgtgag ctttatcttt gatctggagt 11460

ttctttaaga agactttgta atgtgcttat ttttaaagat ggtgaattca attaaagata 11520

gacaagaggg acgggtctgt atttcatctg gtagagtgct tacctgccat tcatgaagtt 11580

ctggttcgat ccccggcaca gcatagaacc acatgcggtg gcaactcagt tgcctgtgac 11640

cccagcactc aggagctaga ggcaggttac ctttgactac acagcaagtt caaggctagc 11700

ctggtctaca tgcaactctt cctcaaaggg aaaacaaaac aaaaatagac aggagaattg 11760

gaaacatcca tagaaaccca aatatgaatc aatagactcc cctcttcctg tgtcagacat 11820

tcagactcag tgacagccgt caccgtttat gaggcatgac tgattttaca gatcctagag 11880

caagcgtgca caattctggt gtttcctgcc tgcgtcctca cacacacgct caccttaggg 11940

acggaggcag cggaggtcta gtcagtttca gacgaatcca ctcatcagct gctcaccatg 12000

gtcttctagg tgaagcagaa ctctccttcc atcagcaccc gtgaaaaaca aaagtggaaa 12060

gcagatattt cactccgaat gctttatcat tggcagtgat ttcaaattta aaccactaat 12120

ttcccagaag aattaggtca cgggccatgt ggcattagac cctattgtgg tgacattatt 12180

tcctgatgtg cctatttaat aatgtatagt ggtctcatct ttatttagtt ggtcttgaat 12240

gtgataaata caagactggg caagtgttca tcaaagctgt tacttgaaat tgtaattata 12300

cctattttgt tggtggtgtt ttttcttggt tcatggacaa ccaaacacat tacggctttg 12360

ctttgtctta gctactctgt gtcaagttcc tgtgaaaata ccgtattaca gtgctcttat 12420

tacatctttg gtaatgaagt agtcacctaa gcccctatcc tgggctctct atggctcact 12480

aaagaatcgt aagttggata atgattgctg aagaaataga tatgttttat ttacattgag 12540

gtagaaagac ctgtggtttc taggtaacag tttacttaac ttagttgcta catctagttt 12600

gcactcagta aacaccctgg tgtggttttt acaacaacaa ggttgttcct gaagcccaaa 12660

catggcccag atttgaatag aagacctgag gcagactaac actcactccc tgctgccaaa 12720

gtagcagagc cggggacata tttctccaat agccagcccg agttgatgct ctttgtaagc 12780

agacaccaca aagccacacg gctagcccta agatgggaga gccctgacct ctctttgctt 12840

ctgacctagc cccataccgc aaaatcaacc agagaatttc cgtggatcca gccacttctg 12900

agcatgaact aatatgtcag gccgagggtt atccagaagc tgaggtaatc tggacaaaca 12960

gtgaccacca acccgtgagt gggaagagaa gtgtcaccac ttcccggaca gaggggatgc 13020

ttctcaatgt gaccagcagt ctgagggtca acgccacagc gaatgatgtt ttctactgta 13080

cgttttggag atcacagcca gggcaaaacc acacagcgga gctgatcatc ccaggtgagt 13140

tgcctaactc gtccccggat tcctagcacg atggccatcc gccatagtca tttagcagta 13200

gttggccgag tgtatgaata catgaaactt acattggcta gacgtattct agttcctctt 13260

tctcttgcgt gcaagccata atgctacttg gtcaacactc agcaagaatt aagtgtttgc 13320

tcctgacaga cagtatgtta gtcattgagt attcgtggct ggataggaca taagttactc 13380

tgctccagga aacaggtgac agtcgcatgt aggagatgct cttgtaactt gggcaccacg 13440

ggcaacgtga gagcaagctt atgcttcagg aatgtaaacc tttgtcacat caaagctgcc 13500

ctcttccctc ccgggctgct gtagtagaaa gcaaatgcat tgcctttttt tgtatcttat 13560

attcaacagg aagaatcctt tcttcccata ctcctcttca gggcattccc tgatacttca 13620

actccaggaa gtctgcctgt gcatagaaca cgaggctgat gcctatgggc aaccgactag 13680

ctgggttgta actcaccagg ccagggcatt gtagggatag aatgagctgc acgaaaatga 13740

ttgtaggaaa atcgtttgag aattcagctg tctttaaaat tcatttacct tacagaaata 13800

gggccacagg agacagtttg gtgagaggct cagagcatta tatgaatatg aacccagagg 13860

tactcactct gaggagggtt gcttctgcct ccatcgacac ccctttccca atgtatgtca 13920

acagtacatt gatgtctaga gatagctctg tgaagtttag agaagatata taaaactaca 13980

ttaaaaagtc aaccaatatg aaaaatgaag cccaggatgg gcgtggagcc aaaaggagca 14040

cacaagtttg gaaaaatgta aaataaaaag gaagacactc taactagaat tggacttttc 14100

cataaaagct atattgttgg tttcctacca ttaaatgttt tatggggctg gagacgttgt 14160

agctcagttg ggagagtact tgcctagcat ccacaatgct ctgaccccag cgccatataa 14220

acgtatatag ggctcaccta tagtctaaac actttggtgg tggaagccgg agggtcagtt 14280

caaggtcatc ctcagcttca tagcaagttc aaggccagta tggactgact acaagagacc 14340

ctgcctcaaa gacaaaacaa gcaaacatca tcataataaa acagcaaaaa gctgttctct 14400

ggccatttct ttgtaggaca tcctggagta acttaaccac tctgagtgtc tcttctcatc 14460

tgtaacttgg gttcatagtg ggaccaaata ggagctgagt tacaacagga gatggaagtt 14520

agcaatctca gagcatccca gagccctggg acccattttt ctctttctca aaactccagg 14580

cagagaaaca gggagatgtt aatgactgga gtgcccaaga gtctcagaca tggaagaaac 14640

acaacccgca ctggtccaca tttgtgggag acagaagcgg cttagcagtg ccccgctttc 14700

ccatgttcgg gagttggcct tccacaccaa gtcagccatt actgtctata ttaatgagtg 14760

cacaaggaag ttactgcact aaggttacca tttaatattg cagtcacttt ctgtggcaac 14820

atgtcacagg cctggagttc ttctctgtgc tgctcccagt ttcttaggag atctgtcttc 14880

ttcttccaac ccttacctgg acattaactt tcagtgatta agattaccct aagaccaaac 14940

tatatttcag gagtcatcat tcccctgact atggcgcagc aaagccttac cttccatcag 15000

cttctcttta tccttttcca gaactgcctg caacacatcc tccacagaac aggactcact 15060

gggtgcttct gggatccatc ctgttgttcc tcattgtagt gtccacggtc ctcctcttct 15120

tgagaaaaca aggtatttcc tccattgctg tactgcctgc agggaagtgc atgagggtcc 15180

cttcaccatt gccttgagca ggcagtgcca gagatggtac caccctgaca agaacagacc 15240

cacatcacag ggcgtcctac actgcacgct agctgaacct caccaggaaa cactgacttg 15300

aaaggtgctg ccctccattc cctgggcttg ctttcagtta cacagagtaa gttttaacag 15360

tgactctggt gtactgagtc ttccttaagt cctgttcaca ttgttgctct gcgacatctc 15420

ctaccttgga gctcggtgtt ggaccctgtt gtaatatgaa gaggtatcag ttggacaagg 15480

gcgtagggaa gctaaaagac ttagctttca aggcgtgggg gagggggagg gcattgtgag 15540

gttccctgtt cagcggttca gagtaaagct gggcagcaca caagtttaga caacaaggaa 15600

gatgctctaa ctggggttgg aggtcaatgg tgcagggata ggtagcaatg gaggctaaag 15660

aagaaagcca taaggtttct ttctacagac tctgaagaca gagcactgtg gtgcctattg 15720

gtctcaggtg aactcaagtc ttgtgttcct tacaccacct attgagctgg gttctggata 15780

ccctaagtgg aaaaacactt ctgtctaaaa agagctgtgg catctttacc acaaagcact 15840

tttttttttt gcaagatttc tgaagacgaa atgacacagt ttttaaaata atttccatat 15900

atttatttca gtacttaccc ataagaatga ctgaaatcta ggaaaatgaa tatattcaaa 15960

taatgccttc ctattgtaaa gtgacttaga gtaaaccttt tcaccaaata ctttgaaatg 16020

cataccaagt gagccaatga tgcatggact tgtgtgaagc caaatgggga aatagaatat 16080

gggagggaac atcaatcatc agagaggaat tccccatcac ccttttggag ggcgcgtgta 16140

tgggaaaagt gttgtaactg gggcggtagc gaccagctgc ttccaaagaa taagccctga 16200

gcagaaccaa gagggttgcc agggtgtgaa gattaagctt cagagacaca tctggcttag 16260

ggctagccta ggacttgcac aggaccgcag ttgttgccta atggcatctg ggatgattgg 16320

ctgaggatga ggaaagcaga gagtcagtta ggtggtaagc tagctcagga tgtgggacgt 16380

ttctgaggga agggtggaag acaaagtaga cagtcctaaa aaccatctga gaatgaaagt 16440

atgtacccta aattgttgaa taattaactt tgcggcgtgg gatctggaat aaggaagttc 16500

acgggctaaa agcctggtga ttaggggatt gatcggtgtc tcctaaaaac cttaagttga 16560

aaatcgagtc cctgtgggtt gtagtagcat cttgctataa ggaattaaga ttgatttctt 16620

cttctttagt gagaatgcta gatgtggaga aatgtggcgt tgaagataca agctcaaaaa 16680

accgaaatgg taagtgtgag taacgaggga ggggcaagcc gagggaatga gtgggacaga 16740

gcagccaagc agggtcctgc aagggctgca gttccagcgc tctgtaggct gaggcagggg 16800

gatagggagt tccaggccag caaccacaca gccaaaacaa aacaaacaaa acaaaaaaca 16860

aagcaaaagg aagagcagaa aaagctactg ttaccaacaa gagacatact ttagccgtga 16920

tctcctctcc ttccaaagga agctgtttgt gggggctgct ggttcctctg cctaaggatc 16980

gccacatctg agaaaactct gggtttgctg ctgcggtgtc tgtgtggtag ccctgcaacc 17040

agggacgctg ttgacttatt tgaatgggca tttgattaag caaatgattc tgctgtgtgg 17100

ttagctgtta actgtttcat gtgtatgata tggcatttca tttcatcatc ctgcccccaa 17160

tcagataaat atgagaatca tctccattgt atagtaggga aaacagggct gagaagataa 17220

tgcgaggtgc ctaagaacac acagacttgc taccacagac gtccgttctt tgctaggtgc 17280

ttcaatctat gctgctacta atgtctgtat ttataagagt agaaaactct gcccgggcgt 17340

tggtggccca cgcctttaat cccagcactc gggaggcaga ggtagtcgga tttctgagtt 17400

tgaggccagc ctggtctaca gagtgagttc caggacagcc aggctacaca gagaaaccct 17460

gtctcgaaaa aaatcaaaaa agaaaaaaga acaagaaaac tctaactgaa ctatcttgta 17520

gtaaattaca gtgtgttcta attcatttta gtgttgttag aaaccaaaca gtaaggccag 17580

gcagaactaa agtggtttcg ctaacttggg cagacccaag caggttccct cctgtacatt 17640

accatttatt ctgctgagtc accctgagga accggcctgg cttgctcaag actgaggatt 17700

tctcagccat gaacactttc cattttaaaa ctagggcagt cccggacaag caaggatggt 17760

tagtcatcct tcatcatgta agggtagtca gacataggta gtatctgtct ctgtcttacg 17820

gcaacgttac tatctgctct agcaaacatc ccatttgttt atcttacata tcatacgttt 17880

cccccccaca tattccctgc ccctgtgaaa ttattatact atgatcactc tccagataca 17940

caattcgagg agacgtaagc agtgttgaac cctctgatcg tcgattggca gcttgtggtc 18000

tgtgaaagaa agggcccatg ggacatgagt ccaaagactc aagatggaac ctgagggaga 18060

gaaccaagaa agtgttggga gaggagcctg gaacaacgga cattttttcc agggagacac 18120

tgctaagcaa gttgcccatc agtcgtcttg ggaaatggat tgagggttcc tggcttagca 18180

gctggtcctt gcacagtgac cttttcctct gctcagtgcc gggatgagag atggagtcat 18240

gagtgttgaa gaataagtgc cttctattta ttttgagtct gtgtgttctc actttgggca 18300

tgtaattatg actggtgaat tctgacgaca tgatagatct taagatgtag tcaccaaact 18360

caactgctgc ttagcatcct ccgtaactac tgatacaagc agggaacaca gaggtcacct 18420

gcttggtttg acaggctctt gctgtctgac tcaaataatc tttatttttc agtcctcaag 18480

gctcttcgat agcagttgtt ctgtatcagc cttataggtg tcaggtatag cactcaacat 18540

ctcatctcat tacaatagca accctcatca ccatagcaac agctaacctc tgttatcctc 18600

acttcatagc caggaagctg agcgactaag tcacttgccc acagagtatc agctctcaga 18660

tttctgttct tcagccactg tcctttcagg atagaatttg tcgttaagaa attaatttaa 18720

aaactgatta ttgagtagca ttgtatatca atcacaacat gccttgtgca ctgtgctggc 18780

ctctgagcat aaagatgtac gccggagtac cggtcggaca tgtttatgtg tgttaaatac 18840

tcagagaaat gttcattaac aaggagcttg cattttagag acactggaaa gtaactccag 18900

ttcattgtct agcattacat ttacctcatt tgctatcctt gccatacagt ctcttgttct 18960

ccatgaagtg tcatgaatct tgttgaatag ttcttttatt ttttaaatgt ttctatttaa 19020

atgatattga catctgaggc gatagctcag ttggtaaaac cctttcctca caagtgtgaa 19080

accctgagtc ttatccctag aacccacata aaaaacagtt gcgtatgttt gtgcatgctt 19140

ttgatcccag cactagggag gcagaggcag gcagatcctg agctctcatt gaccacccag 19200

cctagcctac atggttagct ccaggcctac aggagctggc agagcctgaa aaacgatgcc 19260

tagacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccat gtactcatag 19320

acctaagtgc accctcctac acatgcacac acatacaatt caaacacaaa tcaacaggga 19380

attgtctcag aatggtcccc aagacaaaga agaagaaaaa caccaaacca gctctattcc 19440

ctcagcctat cctctctact ccttcctaga agcaactact attgtttttg tatataaatt 19500

tacccaacga cagttaatat gtagaatata tattaaagtg tctgtcaata tatattatct 19560

ctttctttct ttcttccttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 19620

ctttcttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ctttctttct ttctttcttt 19680

ttttctgtct atctgtacct aaatggttgc tcactatgca ttttctgtgc tcttcgccct 19740

ttttatttaa tgtatggata tttatgctgc ttccagaatg gatctaaagc tctttgtttc 19800

taggttttct cccccatcct tctaggcatc tctcacactg tctaggccag acaccatgtc 19860

tgctgcctga atctgtagac accatttata aagcacgtac tcaccgagtt tgtatttggc 19920

ttgttctgtg tctgattaaa gggagaccat gagtccccag ggtacactga gttaccccag 19980

taccaagggg gagccttgtt tgtgtctcca tggcagaagc aggcctggag ccattttggt 20040

ttcttccttg acttctctca aacacagacg cctcacttgc tcattacagg ttctcctttg 20100

ggaatgtcag cattgctcct tgactgctgg ctgccctgga aggagcccat tagctctgtg 20160

tgagcccttg acagctactg cctctcctta ccacaggggc ctctaagata ctgttaccta 20220

gaggtcttga ggatctgtgt tctctggggg gaggaaagga ggaggaaccc agaactttct 20280

tacagttttc cttgttctgt cacatgtcaa gactgaagga acaggctggg ctacgtagtg 20340

agatcctgtc tcaaaggaaa gacgagcata gccgaacccc cggtggaacc ccctctgtta 20400

cctgttcaca caagcttatt gatgagtctc atgttaatgt cttgtttgta tgaagtttaa 20460

gaaaatatcg ggttgggcaa cacattctat ttattcattt tatttgaaat cttaatgcca 20520

tctcatggtg ttggattggt gtggcacttt attcttttgt gttgtgtata accataaatt 20580

ttattttgca tcagattgtc aatgtattgc attaatttaa taaatatttt tatttattaa 20640

a 20641

<210> 5

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 5

taattggctc tactgc 16

<210> 6

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 6

tcgcataaga atgact 16

<210> 7

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 7

tgaacacaca gtcgca 16

<210> 8

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 8

ctgaacacac agtcgc 16

<210> 9

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 9

tctgaacaca cagtcg 16

<210> 10

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 10

ttctgaacac acagtc 16

<210> 11

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 11

acaagtcatg ttacta 16

<210> 12

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 12

acacaagtca tgttac 16

<210> 13

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 13

cttacttaga tgctgc 16

<210> 14

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 14

acttacttag atgctg 16

<210> 15

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 15

gacttactta gatgct 16

<210> 16

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 16

agacttactt agatgc 16

<210> 17

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 17

gcaggaagag acttac 16

<210> 18

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 18

aataaattcc gttcagg 17

<210> 19

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 19

gcaaataaat tccgtt 16

<210> 20

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 20

agcaaataaa ttccgt 16

<210> 21

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 21

cagagcaaat aaattcc 17

<210> 22

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 22

tggacagagc aaataaat 18

<210> 23

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 23

atggacagag caaata 16

<210> 24

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 24

cagaatggac agagca 16

<210> 25

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 25

ttctcagaat ggacag 16

<210> 26

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 26

ctgaactttg acatag 16

<210> 27

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 27

aagacaaacc cagactga 18

<210> 28

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 28

tataagacaa acccagac 18

<210> 29

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 29

ttataagaca aacccaga 18

<210> 30

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 30

tgttataaga caaaccc 17

<210> 31

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 31

tagaacaatg gtacttt 17

<210> 32

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 32

gtagaacaat ggtact 16

<210> 33

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 33

aggtagaaca atggta 16

<210> 34

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 34

aagaggtaga acaatgg 17

<210> 35

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 35

gcatccacag taaatt 16

<210> 36

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 36

gaaggttatt taattc 16

<210> 37

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 37

ctaatcgaat gcagca 16

<210> 38

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 38

tacccaatct aatcga 16

<210> 39

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 39

tagttaccca atctaa 16

<210> 40

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 40

catttagtta cccaat 16

<210> 41

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 41

tcatttagtt acccaa 16

<210> 42

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 42

ttcatttagt taccca 16

<210> 43

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 43

gaattaattt catttagt 18

<210> 44

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 44

cagtgaggaa ttaattt 17

<210> 45

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 45

ccaacagtga ggaatt 16

<210> 46

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 46

cccaacagtg aggaat 16

<210> 47

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 47

tatacccaac agtgagg 17

<210> 48

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 48

ttatacccaa cagtgag 17

<210> 49

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 49

tttataccca acagtga 17

<210> 50

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 50

cctttatacc caacag 16

<210> 51

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 51

taacctttat acccaa 16

<210> 52

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 52

aataaccttt ataccca 17

<210> 53

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 53

gtaaataacc tttata 16

<210> 54

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 54

actgtaaata acctttat 18

<210> 55

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 55

atatatatgc aatgag 16

<210> 56

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 56

agatatatat gcaatg 16

<210> 57

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 57

gagatatata tgcaat 16

<210> 58

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 58

ccagagatat atatgc 16

<210> 59

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 59

caatattcca gagatat 17

<210> 60

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 60

gcaatattcc agagata 17

<210> 61

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 61

agcaatattc cagagat 17

<210> 62

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 62

cagcaatatt ccagag 16

<210> 63

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 63

aatcagcaat attccag 17

<210> 64

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 64

acaatcagca atattcc 17

<210> 65

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 65

actaagtagt tacacttct 19

<210> 66

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 66

ctaagtagtt acacttc 17

<210> 67

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 67

gactaagtag ttacactt 18

<210> 68

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 68

tgactaagta gttaca 16

<210> 69

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 69

ctttgactaa gtagtta 17

<210> 70

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 70

ctctttgact aagtag 16

<210> 71

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 71

gctctttgac taagta 16

<210> 72

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 72

ccttaaatac tgttgac 17

<210> 73

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 73

cttaaatact gttgac 16

<210> 74

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 74

tccttaaata ctgttg 16

<210> 75

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 75

tctccttaaa tactgtt 17

<210> 76

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 76

tatcatagtt ctcctt 16

<210> 77

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 77

agtatcatag ttctcc 16

<210> 78

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 78

gagtatcata gttctc 16

<210> 79

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 79

agagtatcat agttct 16

<210> 80

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 80

cagagtatca tagttc 16

<210> 81

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 81

ttcagagtat catagt 16

<210> 82

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 82

cttcagagta tcatag 16

<210> 83

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 83

ttcttcagag tatcata 17

<210> 84

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 84

tttcttcaga gtatcat 17

<210> 85

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 85

gagaaaggct aagttt 16

<210> 86

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 86

gacactcttg tacatt 16

<210> 87

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 87

tgagacactc ttgtaca 17

<210> 88

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 88

tgagacactc ttgtac 16

<210> 89

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 89

ctttattaaa ctccat 16

<210> 90

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 90

accaaacttt attaaa 16

<210> 91

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 91

aaacctctac taagtg 16

<210> 92

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 92

agattaagac agttga 16

<210> 93

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 93

aagtaggagc aagaggc 17

<210> 94

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 94

aaagtaggag caagagg 17

<210> 95

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 95

gttaagcagc caggag 16

<210> 96

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 96

agggtaggat gggtag 16

<210> 97

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 97

aagggtagga tgggta 16

<210> 98

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 98

caagggtagg atgggt 16

<210> 99

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 99

ccaagggtag gatggg 16

<210> 100

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 100

tccaagggta ggatgg 16

<210> 101

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 101

cttccaaggg taggat 16

<210> 102

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 102

atcttccaag ggtagga 17

<210> 103

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 103

agaagtgatg gctcatt 17

<210> 104

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 104

aagaagtgat ggctcat 17

<210> 105

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 105

gaagaagtga tggctca 17

<210> 106

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 106

atgaaatgta aactggg 17

<210> 107

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 107

caatgaaatg taaactgg 18

<210> 108

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 108

gcaatgaaat gtaaactg 18

<210> 109

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 109

agcaatgaaa tgtaaact 18

<210> 110

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 110

gagcaatgaa atgtaaac 18

<210> 111

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 111

tgaattccca tatccga 17

<210> 112

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 112

agaattatga ccatat 16

<210> 113

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 113

aggtaagaat tatgacc 17

<210> 114

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 114

tcaggtaaga attatgac 18

<210> 115

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 115

cttcaggtaa gaattatg 18

<210> 116

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 116

tcttcaggta agaatta 17

<210> 117

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 117

cttcttcagg taagaat 17

<210> 118

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 118

tcttcttcag gtaagaa 17

<210> 119

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 119

tcttcttcag gtaaga 16

<210> 120

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 120

tggtctaaga gaagaag 17

<210> 121

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 121

gttggtctaa gagaag 16

<210> 122

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 122

agttggtcta agagaa 16

<210> 123

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 123

cagttggtct aagagaa 17

<210> 124

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 124

gcagttggtc taagagaa 18

<210> 125

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 125

cagttggtct aagaga 16

<210> 126

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 126

gcagttggtc taagaga 17

<210> 127

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 127

gcagttggtc taagag 16

<210> 128

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 128

ctcatatcag ggcagt 16

<210> 129

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 129

cacacatgtt ctttaac 17

<210> 130

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 130

taaatacaca catgttct 18

<210> 131

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 131

gtaaatacac acatgttc 18

<210> 132

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 132

tgtaaataca cacatgtt 18

<210> 133

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 133

gatcatgtaa atacacac 18

<210> 134

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 134

agatcatgta aatacaca 18

<210> 135

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 135

caaagatcat gtaaatacac 20

<210> 136

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 136

acaaagatca tgtaaataca 20

<210> 137

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 137

gaatacaaag atcatgta 18

<210> 138

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 138

agaatacaaa gatcatgt 18

<210> 139

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 139

cagaatacaa agatcatg 18

<210> 140

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 140

gcagaataca aagatca 17

<210> 141

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 141

aggcagaata caaagat 17

<210> 142

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 142

aaggcagaat acaaaga 17

<210> 143

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 143

attagtgagg gacgaa 16

<210> 144

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 144

cattagtgag ggacga 16

<210> 145

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 145

gagggtgatg gattag 16

<210> 146

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 146

ttaggagtaa taaagg 16

<210> 147

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 147

ttaatgaatt tggttg 16

<210> 148

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 148

ctttaatgaa tttggt 16

<210> 149

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 149

catggattac aactaa 16

<210> 150

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 150

tcatggatta caacta 16

<210> 151

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 151

gtcatggatt acaact 16

<210> 152

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 152

cattaaatct agtcat 16

<210> 153

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 153

gacattaaat ctagtca 17

<210> 154

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 154

agggacatta aatcta 16

<210> 155

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 155

caaagcatta taacca 16

<210> 156

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 156

acttactagg cagaag 16

<210> 157

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 157

cagagttaac tgtaca 16

<210> 158

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 158

ccagagttaa ctgtac 16

<210> 159

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 159

gccagagtta actgta 16

<210> 160

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 160

tgggccagag ttaact 16

<210> 161

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 161

cagcatctat cagact 16

<210> 162

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 162

tgaaataaca tgagtcat 18

<210> 163

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 163

gtgaaataac atgagtc 17

<210> 164

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 164

tctgtttatg tcactg 16

<210> 165

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 165

gtctgtttat gtcact 16

<210> 166

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 166

tggtctgttt atgtca 16

<210> 167

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 167

ttggtctgtt tatgtc 16

<210> 168

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 168

tcacccattg tttaaa 16

<210> 169

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 169

ttcagcaaat attcgt 16

<210> 170

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 170

gtgtgttcag caaatat 17

<210> 171

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 171

tctattgtta ggtatc 16

<210> 172

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 172

attgcccatc ttactg 16

<210> 173

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 173

tattgcccat cttact 16

<210> 174

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 174

aaatattgcc catctt 16

<210> 175

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 175

ataaccttat cataca 16

<210> 176

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 176

tataacctta tcatac 16

<210> 177

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 177

ttataacctt atcata 16

<210> 178

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 178

tttataacct tatcat 16

<210> 179

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 179

actgctattg ctatct 16

<210> 180

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 180

aggactgcta ttgcta 16

<210> 181

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 181

gaggactgct attgct 16

<210> 182

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 182

acgtagaata ataaca 16

<210> 183

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 183

ccaagtgata taatgg 16

<210> 184

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 184

ttagcagacc aagtga 16

<210> 185

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 185

gtttagcaga ccaagt 16

<210> 186

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 186

tgacagtgat tatatt 16

<210> 187

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 187

tgtccaagat attgac 16

<210> 188

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 188

gaatatccta gattgt 16

<210> 189

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 189

caaactgaga atatcc 16

<210> 190

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 190

gcaaactgag aatatc 16

<210> 191

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 191

tcctattaca atcgta 16

<210> 192

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 192

ttcctattac aatcgt 16

<210> 193

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 193

actaatggga ggattt 16

<210> 194

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 194

tagttcagag aataag 16

<210> 195

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 195

taacatatag ttcaga 16

<210> 196

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 196

ataacatata gttcag 16

<210> 197

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 197

cataacatat agttca 16

<210> 198

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 198

tcataacata tagttc 16

<210> 199

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 199

tagctcctaa caatca 16

<210> 200

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 200

ctccaatctt tgtata 16

<210> 201

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 201

tctccaatct ttgtat 16

<210> 202

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 202

tctatttcag ccaatc 16

<210> 203

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 203

cggaagtcag agtgaa 16

<210> 204

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 204

ttaagcatga ggaata 16

<210> 205

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 205

tgattgagca cctctt 16

<210> 206

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 206

gactaattat ttcgtt 16

<210> 207

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 207

tgactaatta tttcgt 16

<210> 208

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 208

gtgactaatt atttcg 16

<210> 209

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 209

ctgcttgaaa tgtgac 16

<210> 210

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 210

cctgcttgaa atgtga 16

<210> 211

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 211

atcctgcttg aaatgt 16

<210> 212

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 212

attataaatc tattct 16

<210> 213

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 213

gctaaatact ttcatc 16

<210> 214

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 214

cattgtaaca taccta 16

<210> 215

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 215

gcattgtaac atacct 16

<210> 216

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 216

taatattgca ccaaat 16

<210> 217

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 217

gataatattg caccaa 16

<210> 218

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 218

agataatatt gcacca 16

<210> 219

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 219

gccaagaaga taatat 16

<210> 220

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 220

cacagccaca taaact 16

<210> 221

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 221

ttgtaattgt ggaaac 16

<210> 222

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 222

tgacttgtaa ttgtgg 16

<210> 223

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 223

tctaactgaa atagtc 16

<210> 224

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 224

gtggttctaa ctgaaa 16

<210> 225

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 225

caatatggga cttggt 16

<210> 226

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 226

atgacaatat gggact 16

<210> 227

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 227

tatgacaata tgggac 16

<210> 228

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 228

atatgacaat atggga 16

<210> 229

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 229

cttcacttaa taatta 16

<210> 230

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 230

ctgcttcact taataa 16

<210> 231

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 231

aagactgctt cactta 16

<210> 232

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 232

gaatgcccta attatg 16

<210> 233

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 233

tggaatgccc taatta 16

<210> 234

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 234

gcaaatgcca gtaggt 16

<210> 235

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 235

ctaatggaag gatttg 16

<210> 236

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 236

aatatagaac ctaatg 16

<210> 237

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 237

gaaagaatag aatgtt 16

<210> 238

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 238

atgggtaata gattat 16

<210> 239

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 239

gaaagagcac agggtg 16

<210> 240

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 240

ctacatagag ggaatg 16

<210> 241

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 241

gcttcctaca tagagg 16

<210> 242

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 242

tgcttcctac atagag 16

<210> 243

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 243

tgggcttgaa atatgt 16

<210> 244

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 244

cattatattt aagaac 16

<210> 245

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 245

tcggttatgt tatcat 16

<210> 246

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 246

cactttatct ggtcgg 16

<210> 247

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 247

aaattggcac agcgtt 16

<210> 248

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 248

accgtgacag taaatg 16

<210> 249

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 249

tgggaaccgt gacagta 17

<210> 250

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 250

ccacatatag gtcctt 16

<210> 251

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 251

catattgcta ccatac 16

<210> 252

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 252

tcatattgct accata 16

<210> 253

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 253

caattgtcat attgct 16

<210> 254

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 254

cattcaattg tcatattg 18

<210> 255

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 255

tttctactgg gaatttg 17

<210> 256

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 256

caattagtgc agccag 16

<210> 257

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 257

gaataatgtt cttatcc 17

<210> 258

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 258

cacaaattga ataatgttct 20

<210> 259

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 259

catgcacaaa ttgaataat 19

<210> 260

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 260

atcctgcaat ttcacat 17

<210> 261

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 261

ccaccatagc tgatca 16

<210> 262

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 262

accaccatag ctgatca 17

<210> 263

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 263

caccaccata gctgatc 17

<210> 264

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 264

tagtcggcac caccat 16

<210> 265

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 265

cttgtagtcg gcaccac 17

<210> 266

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 266

cttgtagtcg gcacca 16

<210> 267

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 267

cgcttgtagt cggcac 16

<210> 268

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 268

tcaataaaga tcaggc 16

<210> 269

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 269

tggacttaca agaatg 16

<210> 270

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 270

atggacttac aagaat 16

<210> 271

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 271

gctcaagaaa ttggat 16

<210> 272

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 272

tactgtagaa catggc 16

<210> 273

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 273

gcaattcatt tgatct 16

<210> 274

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 274

tgaagggagg agggacac 18

<210> 275

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 275

agtggtgaag ggaggag 17

<210> 276

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 276

tagtggtgaa gggaggag 18

<210> 277

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 277

atagtggtga agggaggag 19

<210> 278

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 278

tagtggtgaa gggagga 17

<210> 279

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 279

atagtggtga agggagga 18

<210> 280

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 280

tagtggtgaa gggagg 16

<210> 281

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 281

atagtggtga agggagg 17

<210> 282

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 282

gatagtggtg aagggagg 18

<210> 283

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 283

atagtggtga agggag 16

<210> 284

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 284

gatagtggtg aagggag 17

<210> 285

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 285

gagatagtgg tgaagg 16

<210> 286

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 286

catgggagat agtggt 16

<210> 287

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 287

acaaataatg gttactct 18

<210> 288

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 288

acacacaaat aatggtta 18

<210> 289

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 289

gagggacaca caaataat 18

<210> 290

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 290

atatagagag gctcaa 16

<210> 291

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 291

ttgatataga gaggct 16

<210> 292

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 292

gcatttgata tagaga 16

<210> 293

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 293

tttgcatttg atatag 16

<210> 294

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 294

ctggaagaat aggttc 16

<210> 295

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 295

actggaagaa taggtt 16

<210> 296

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 296

tactggaaga ataggt 16

<210> 297

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 297

tggcttatcc tgtact 16

<210> 298

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 298

atggcttatc ctgtac 16

<210> 299

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 299

tatggcttat cctgta 16

<210> 300

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 300

gtatggctta tcctgt 16

<210> 301

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 301

atgaatatat gcccagt 17

<210> 302

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 302

gatgaatata tgccca 16

<210> 303

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 303

caagatgaat atatgcc 17

<210> 304

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 304

gacaacatca gtataga 17

<210> 305

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 305

caagacaaca tcagta 16

<210> 306

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 306

cactcctagt tccttt 16

<210> 307

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 307

aacactccta gttcct 16

<210> 308

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 308

taacactcct agttcc 16

<210> 309

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 309

ctaacactcc tagttc 16

<210> 310

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 310

tgataacata actgtg 16

<210> 311

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 311

ctgataacat aactgt 16

<210> 312

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 312

tttgaactca agtgac 16

<210> 313

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 313

tcctttactt agctag 16

<210> 314

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 314

gagtttggat tagctg 16

<210> 315

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 315

tgggatatga caggga 16

<210> 316

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 316

tgtgggatat gacagg 16

<210> 317

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 317

atatggaagg gatatc 16

<210> 318

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 318

acaggatatg gaaggg 16

<210> 319

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 319

atttcaacag gatatgg 17

<210> 320

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 320

gagtaatttc aacagg 16

<210> 321

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 321

agggagtaat ttcaaca 17

<210> 322

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 322

attagggagt aatttca 17

<210> 323

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 323

cttactatta gggagt 16

<210> 324

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 324

cagcttacta ttaggg 16

<210> 325

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 325

tcagcttact attagg 16

<210> 326

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 326

atttcagctt actattag 18

<210> 327

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 327

ttcagcttac tattag 16

<210> 328

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 328

cagatttcag cttact 16

<210> 329

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 329

gactacaact agaggg 16

<210> 330

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 330

agactacaac tagagg 16

<210> 331

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 331

aagactacaa ctagag 16

<210> 332

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 332

atgatttaat tctagtcaaa 20

<210> 333

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 333

tttaattcta gtcaaa 16

<210> 334

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 334

gatttaattc tagtca 16

<210> 335

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 335

atgatttaat tctagtca 18

<210> 336

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 336

gatgatttaa ttctagtca 19

<210> 337

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 337

gatttaattc tagtca 16

<210> 338

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 338

gatgatttaa ttctagtc 18

<210> 339

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 339

tgatttaatt ctagtc 16

<210> 340

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 340

gagatgattt aattcta 17

<210> 341

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 341

gagatgattt aattct 16

<210> 342

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 342

cagattgatg gtagtt 16

<210> 343

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 343

ctcagattga tggtag 16

<210> 344

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 344

gttagccctc agattg 16

<210> 345

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 345

tgtattgtta gccctc 16

<210> 346

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 346

acttgtattg ttagcc 16

<210> 347

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 347

agccagtatc agggac 16

<210> 348

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 348

ttgacaatag tggcat 16

<210> 349

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 349

acaagtggta tcttct 16

<210> 350

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 350

aatctacttt acaagt 16

<210> 351

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 351

cacagtagat gcctgata 18

<210> 352

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 352

gaacacagta gatgcc 16

<210> 353

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 353

cttggaacac agtagat 17

<210> 354

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 354

atatcttgga acacag 16

<210> 355

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 355

tctttaatat cttggaac 18

<210> 356

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 356

tgatttcttt aatatcttg 19

<210> 357

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 357

tgatgatttc tttaatatc 19

<210> 358

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 358

aggctaagtc atgatg 16

<210> 359

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 359

ttgatgaggc taagtc 16

<210> 360

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 360

ccaggattat actctt 16

<210> 361

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 361

gccaggatta tactct 16

<210> 362

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 362

ctgccaggat tatact 16

<210> 363

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 363

cagaaactta tactttatg 19

<210> 364

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 364

aagcagaaac ttatact 17

<210> 365

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 365

gaagcagaaa cttatact 18

<210> 366

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 366

tggaagcaga aacttatact 20

<210> 367

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 367

tggaagcaga aacttatac 19

<210> 368

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 368

aagcagaaac ttatac 16

<210> 369

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 369

tggaagcaga aacttata 18

<210> 370

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 370

aagggatatt atggag 16

<210> 371

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 371

tgccggaaga tttcct 16

<210> 372

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 372

atggattggg agtaga 16

<210> 373

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 373

agatggattg ggagta 16

<210> 374

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 374

aagatggatt gggagt 16

<210> 375

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 375

acaagatgga ttggga 16

<210> 376

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 376

agaaggttca gacttt 16

<210> 377

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 377

gcagaaggtt cagact 16

<210> 378

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 378

tgcagaaggt tcagac 16

<210> 379

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 379

agtgcagaag gttcag 16

<210> 380

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 380

aagtgcagaa ggttca 16

<210> 381

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 381

taagtgcaga aggttc 16

<210> 382

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 382

tctaagtgca gaaggt 16

<210> 383

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 383

ctcaggagtt ctacttc 17

<210> 384

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 384

ctcaggagtt ctactt 16

<210> 385

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 385

atggaggtga ctcaggag 18

<210> 386

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 386

atggaggtga ctcagga 17

<210> 387

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 387

atggaggtga ctcagg 16

<210> 388

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 388

tatggaggtg actcagg 17

<210> 389

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 389

atatggaggt gactcagg 18

<210> 390

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 390

tatggaggtg actcag 16

<210> 391

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 391

atatggaggt gactcag 17

<210> 392

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 392

catatggagg tgactcag 18

<210> 393

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 393

atatggaggt gactca 16

<210> 394

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 394

catatggagg tgactca 17

<210> 395

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 395

catatggagg tgactc 16

<210> 396

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 396

gcatatggag gtgactc 17

<210> 397

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 397

tgcatatgga ggtgactc 18

<210> 398

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 398

ttgcatatgg aggtgactc 19

<210> 399

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 399

tttgcatatg gaggtgactc 20

<210> 400

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 400

gcatatggag gtgact 16

<210> 401

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 401

tgcatatgga ggtgact 17

<210> 402

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 402

ttgcatatgg aggtgact 18

<210> 403

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 403

tttgcatatg gaggtgact 19

<210> 404

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 404

tgcatatgga ggtgac 16

<210> 405

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 405

ttgcatatgg aggtgac 17

<210> 406

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 406

tttgcatatg gaggtgac 18

<210> 407

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 407

tttgcatatg gaggtga 17

<210> 408

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 408

tttgcatatg gaggtg 16

<210> 409

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 409

aagtgaagtt caacagc 17

<210> 410

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 410

tgggaagtga agttca 16

<210> 411

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 411

atgggaagtg aagttc 16

<210> 412

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 412

gatgggaagt gaagtt 16

<210> 413

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 413

ctgtgatggg aagtgaa 17

<210> 414

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 414

attgagtgaa tccaaa 16

<210> 415

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 415

aattgagtga atccaa 16

<210> 416

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 416

gataattgag tgaatcc 17

<210> 417

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 417

gtgataattg agtgaa 16

<210> 418

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 418

aagaaaggtg caataa 16

<210> 419

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 419

caagaaaggt gcaata 16

<210> 420

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 420

acaagaaagg tgcaat 16

<210> 421

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 421

atttaaactc acaaac 16

<210> 422

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 422

ctgttaggtt cagcga 16

<210> 423

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 423

tctgaatgaa catttcg 17

<210> 424

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 424

ctcattgaag gttctg 16

<210> 425

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 425

ctaatctcat tgaagg 16

<210> 426

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 426

cctaatctca ttgaag 16

<210> 427

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 427

actttgatct ttcagc 16

<210> 428

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 428

actatgcaac actttg 16

<210> 429

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 429

caaatagctt tatcgg 16

<210> 430

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 430

ccaaatagct ttatcg 16

<210> 431

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 431

tccaaatagc tttatc 16

<210> 432

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 432

gatccaaata gcttta 16

<210> 433

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 433

atgatccaaa tagctt 16

<210> 434

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 434

tatgatccaa atagct 16

<210> 435

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 435

taaacagggc tgggaat 17

<210> 436

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 436

acttaaacag ggctgg 16

<210> 437

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 437

acacttaaac agggct 16

<210> 438

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 438

gaacacttaa acaggg 16

<210> 439

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 439

agagaacact taaacag 17

<210> 440

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 440

ctacagagaa cactta 16

<210> 441

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 441

atgctacaga gaacact 17

<210> 442

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 442

ataaatgcta cagagaaca 19

<210> 443

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 443

agataaatgc tacagaga 18

<210> 444

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 444

tagagataaa tgctaca 17

<210> 445

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 445

tagatagaga taaatgct 18

<210> 446

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 446

caatatacta gatagaga 18

<210> 447

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 447

tacacaatat actagatag 19

<210> 448

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 448

ctacacaata tactag 16

<210> 449

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 449

gctacacaat atacta 16

<210> 450

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 450

atatgctaca caatatac 18

<210> 451

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 451

tgatatgcta cacaat 16

<210> 452

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 452

atgatatgat atgctac 17

<210> 453

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 453

gaggagagag acaataaa 18

<210> 454

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 454

ctaggaggag agagaca 17

<210> 455

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 455

tattctagga ggagaga 17

<210> 456

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 456

ttatattcta ggaggag 17

<210> 457

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 457

gtttatattc taggag 16

<210> 458

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 458

tggagtttat attctagg 18

<210> 459

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 459

cgtaccacca ctctgc 16

<210> 460

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 460

tgaggaaatc attcattc 18

<210> 461

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 461

tttgaggaaa tcattcat 18

<210> 462

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 462

aggctaatcc tatttg 16

<210> 463

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 463

tttaggctaa tcctat 16

<210> 464

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 464

tgctccagtg taccct 16

<210> 465

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 465

tagtagtact cgatag 16

<210> 466

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 466

ctaattgtag tagtactc 18

<210> 467

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 467

tgctaattgt agtagt 16

<210> 468

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 468

agtgctaatt gtagta 16

<210> 469

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 469

gcaagtgcta attgta 16

<210> 470

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 470

gaggaaatga actaattta 19

<210> 471

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 471

caggaggaaa tgaacta 17

<210> 472

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 472

ccctagagtc atttcc 16

<210> 473

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 473

atcttacatg atgaagc 17

<210> 474

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 474

gacacactca gatttcag 18

<210> 475

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 475

agacacactc agatttcag 19

<210> 476

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 476

aagacacact cagatttcag 20

<210> 477

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 477

agacacactc agatttca 18

<210> 478

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 478

aagacacact cagatttca 19

<210> 479

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 479

aaagacacac tcagatttca 20

<210> 480

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 480

gaaagacaca ctcagatttc 20

<210> 481

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 481

aagacacact cagatttc 18

<210> 482

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 482

aaagacacac tcagatttc 19

<210> 483

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 483

tgaaagacac actcagattt 20

<210> 484

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 484

tgaaagacac actcagatt 19

<210> 485

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 485

tgaaagacac actcagat 18

<210> 486

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 486

attgaaagac acactca 17

<210> 487

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 487

tcattgaaag acacact 17

<210> 488

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 488

ttccatcatt gaaaga 16

<210> 489

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 489

ataataccac ttatcat 17

<210> 490

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 490

ttacttaatt tctttgga 18

<210> 491

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 491

ttagaactag ctttatca 18

<210> 492

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 492

gaggtacaaa tatagg 16

<210> 493

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 493

cttatgatac aactta 16

<210> 494

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 494

tcttatgata caactt 16

<210> 495

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 495

ttcttatgat acaact 16

<210> 496

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 496

cagtttctta tgatac 16

<210> 497

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 497

gcagtttctt atgata 16

<210> 498

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 498

tacaaatgtc tattaggtt 19

<210> 499

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 499

tgtacaaatg tctattag 18

<210> 500

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 500

agcatcacaa ttagta 16

<210> 501

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 501

ctaatgatag tgaagc 16

<210> 502

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 502

agctaatgat agtgaa 16

<210> 503

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 503

atgccttgac atatta 16

<210> 504

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 504

ctcaagatta ttgacac 17

<210> 505

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 505

acctcaagat tattga 16

<210> 506

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 506

aacctcaaga ttattg 16

<210> 507

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 507

cacaaacctc aagattatt 19

<210> 508

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 508

gtacttaatt agacct 16

<210> 509

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 509

agtacttaat tagacc 16

<210> 510

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 510

gtatgaggtg gtaaac 16

<210> 511

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 511

aggaaacagc agaagtg 17

<210> 512

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 512

gcacaaccca gaggaa 16

<210> 513

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 513

caagcacaac ccagag 16

<210> 514

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 514

ttcaagcaca acccag 16

<210> 515

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 515

aattcaagca caaccc 16

<210> 516

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 516

taataattca agcacaacc 19

<210> 517

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 517

actaataatt caagcac 17

<210> 518

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 518

ataatactaa taattcaagc 20

<210> 519

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 519

tagatttgtg aggtaa 16

<210> 520

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 520

agccttaatt ctccat 16

<210> 521

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 521

aatgatctag agcctta 17

<210> 522

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 522

ctaatgatct agagcc 16

<210> 523

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 523

actaatgatc tagagc 16

<210> 524

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 524

cattaacatg ttcttatt 18

<210> 525

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 525

acaagtacat taacatgttc 20

<210> 526

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 526

ttacaagtac attaacatg 19

<210> 527

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 527

gctttattca tgtttat 17

<210> 528

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 528

gctttattca tgttta 16

<210> 529

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 529

agagctttat tcatgttt 18

<210> 530

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 530

ataagagctt tattcatg 18

<210> 531

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 531

cataagagct ttattca 17

<210> 532

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 532

agcataagag ctttat 16

<210> 533

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 533

tagattgttt agtgca 16

<210> 534

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 534

gtagattgtt tagtgc 16

<210> 535

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 535

gacaattcta gtagatt 17

<210> 536

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 536

ctgacaattc tagtag 16

<210> 537

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 537

gctgacaatt ctagta 16

<210> 538

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 538

aggattaaga tacgta 16

<210> 539

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 539

caggattaag atacgt 16

<210> 540

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 540

tcaggattaa gatacg 16

<210> 541

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 541

ttcaggatta agatac 16

<210> 542

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 542

aggaagaaag tttgattc 18

<210> 543

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 543

tcaaggaaga aagtttga 18

<210> 544

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 544

ctcaaggaag aaagtttg 18

<210> 545

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 545

tgctcaagga agaaagt 17

<210> 546

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 546

aattatgctc aaggaaga 18

<210> 547

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 547

taggatacca cattatga 18

<210> 548

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 548

cataatttat tccattcctc 20

<210> 549

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 549

tgcataattt attccat 17

<210> 550

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 550

actgcataat ttattcc 17

<210> 551

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 551

ctaaactgca taatttatt 19

<210> 552

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 552

ataactaaac tgcata 16

<210> 553

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 553

ttattaataa ctaaactgc 19

<210> 554

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 554

tagtacatta ttaataact 19

<210> 555

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 555

cataactaag gacgtt 16

<210> 556

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 556

tcataactaa ggacgt 16

<210> 557

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 557

cgtcataact aaggac 16

<210> 558

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 558

tcgtcataac taagga 16

<210> 559

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 559

atcgtcataa ctaagg 16

<210> 560

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 560

gttagtatct tacatt 16

<210> 561

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 561

ctctattgtt agtatc 16

<210> 562

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 562

agtatagagt tactgt 16

<210> 563

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 563

ttcctggtga tacttt 16

<210> 564

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 564

gttcctggtg atactt 16

<210> 565

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 565

tgttcctggt gatact 16

<210> 566

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 566

ataaacatga atctctcc 18

<210> 567

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 567

ctttataaac atgaatctc 19

<210> 568

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 568

ctgtctttat aaacatg 17

<210> 569

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 569

ttgttataaa tctgtctt 18

<210> 570

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 570

ttaaatttat tcttggata 19

<210> 571

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 571

cttaaattta ttcttgga 18

<210> 572

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 572

cttcttaaat ttattcttg 19

<210> 573

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 573

tatgtttctc agtaaag 17

<210> 574

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 574

gaattatctt taaacca 17

<210> 575

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 575

cccttaaatt tctaca 16

<210> 576

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 576

acactgctct tgtacc 16

<210> 577

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 577

tgacaacact gctctt 16

<210> 578

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 578

tacatttatt gggctc 16

<210> 579

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 579

gtacatttat tgggct 16

<210> 580

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 580

ttggtacatt tattgg 16

<210> 581

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 581

catgttggta catttat 17

<210> 582

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 582

aatcatgttg gtacat 16

<210> 583

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 583

aaatcatgtt ggtaca 16

<210> 584

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 584

gacaagtttg gattaa 16

<210> 585

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 585

aatgttcaga tgcctc 16

<210> 586

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 586

gcttaatgtt cagatg 16

<210> 587

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 587

cgtacatagc ttgatg 16

<210> 588

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 588

gtgaggaatt aggata 16

<210> 589

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 589

gtaacaatat ggtttg 16

<210> 590

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 590

gaaatattgt agacta 16

<210> 591

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 591

ttgaaatatt gtagac 16

<210> 592

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 592

aagtctagta atttgc 16

<210> 593

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 593

gctcagtaga ttataa 16

<210> 594

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 594

catacactgt tgctaa 16

<210> 595

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 595

atggtctcaa atcatt 16

<210> 596

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 596

caatggtctc aaatca 16

<210> 597

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 597

ttcctattga ttgact 16

<210> 598

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 598

tttctgttca caacac 16

<210> 599

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 599

aggaacccac taatct 16

<210> 600

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 600

taaatggcag gaaccc 16

<210> 601

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 601

gtaaatggca ggaacc 16

<210> 602

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 602

ttgtaaatgg caggaa 16

<210> 603

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 603

ttatgagtta ggcatg 16

<210> 604

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 604

ccaggtgaaa ctttaa 16

<210> 605

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 605

cccttagtca gctcct 16

<210> 606

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 606

acccttagtc agctcc 16

<210> 607

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 607

cacccttagt cagctc 16

<210> 608

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 608

tctcttacta ggctcc 16

<210> 609

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 609

cctatctgtc atcatg 16

<210> 610

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 610

tcctatctgt catcat 16

<210> 611

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 611

gagaagtgtg agaagc 16

<210> 612

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 612

catccttgaa gtttag 16

<210> 613

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 613

taataagatg gctccc 16

<210> 614

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 614

caaggcataa taagat 16

<210> 615

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 615

ccaaggcata ataaga 16

<210> 616

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 616

tgatccaatt ctcacc 16

<210> 617

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 617

atgatccaat tctcac 16

<210> 618

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 618

cgcttcatct tcaccc 16

<210> 619

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 619

tatgacactg catctt 16

<210> 620

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 620

gtatgacact gcatct 16

<210> 621

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 621

tgtatgacac tgcatc 16

<210> 622

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 622

ttctcttctg taagtc 16

<210> 623

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 623

ttctacagag gaacta 16

<210> 624

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 624

actacagttc tacaga 16

<210> 625

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 625

ttcccacagg taaatg 16

<210> 626

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 626

attatttgaa tatactcatt 20

<210> 627

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 627

tgggaggaaa ttatttg 17

<210> 628

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 628

tgactcatct taaatg 16

<210> 629

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 629

ctgactcatc ttaaat 16

<210> 630

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 630

tttactctga ctcatc 16

<210> 631

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 631

tattggagga attatt 16

<210> 632

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 632

gtattggagg aattat 16

<210> 633

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 633

tggtatactt ctctaagtat 20

<210> 634

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 634

gatctcttgg tatact 16

<210> 635

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 635

cagacaactc tatacc 16

<210> 636

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 636

aacatcagac aactcta 17

<210> 637

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 637

tttaacatca gacaactc 18

<210> 638

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 638

taacatcaga caactc 16

<210> 639

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 639

atttaacatc agacaa 16

<210> 640

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 640

cctatttaac atcagac 17

<210> 641

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 641

tccctattta acatca 16

<210> 642

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 642

tcaacgacta ttggaat 17

<210> 643

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 643

cttatattct ggctat 16

<210> 644

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 644

atccttatat tctggc 16

<210> 645

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 645

gatccttata ttctgg 16

<210> 646

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 646

tgatccttat attctg 16

<210> 647

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 647

attgaaactt gatcct 16

<210> 648

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 648

actgtcattg aaactt 16

<210> 649

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 649

tcttactgtc attgaa 16

<210> 650

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 650

aggatcttac tgtcatt 17

<210> 651

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 651

gcaaatcaac tccatc 16

<210> 652

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 652

gtgcaaatca actcca 16

<210> 653

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 653

caattatttc tttgtgc 17

<210> 654

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 654

tggcaacaat tatttctt 18

<210> 655

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 655

gctggcaaca attatt 16

<210> 656

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 656

atccatttct actgcc 16

<210> 657

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 657

taatatctat tgatttcta 19

<210> 658

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 658

tcaatagtgt agggca 16

<210> 659

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 659

ttcaatagtg tagggc 16

<210> 660

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 660

aggttaatta attcaatag 19

<210> 661

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 661

catttgtaat ccctag 16

<210> 662

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 662

acatttgtaa tcccta 16

<210> 663

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 663

aacatttgta atccct 16

<210> 664

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 664

taaatttcaa gttctg 16

<210> 665

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 665

gtttaaattt caagttct 18

<210> 666

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 666

ccaagtttaa atttcaag 18

<210> 667

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 667

acccaagttt aaatttc 17

<210> 668

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 668

catacagtga cccaagttt 19

<210> 669

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 669

acatcccata cagtga 16

<210> 670

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 670

agcacagctc tacatc 16

<210> 671

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 671

atatagcaca gctcta 16

<210> 672

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 672

tccatatagc acagct 16

<210> 673

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 673

atttccatat agcaca 16

<210> 674

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 674

tttatttcca tatagca 17

<210> 675

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 675

tttatttcca tatagc 16

<210> 676

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 676

aaggagagga gattatg 17

<210> 677

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 677

agttcttgtg ttagct 16

<210> 678

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 678

gagttcttgt gttagc 16

<210> 679

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 679

attaattatc catccac 17

<210> 680

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 680

atcaattaat tatccatc 18

<210> 681

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 681

agaatcaatt aattatcc 18

<210> 682

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 682

tgagataccg tgcatg 16

<210> 683

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 683

aatgagatac cgtgca 16

<210> 684

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 684

ctgtggttag gctaat 16

<210> 685

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 685

aagagtaagg gtctgtggtt 20

<210> 686

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 686

gatgggttaa gagtaa 16

<210> 687

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 687

agcagatggg ttaaga 16

<210> 688

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 688

tgtaaacatt tgtagc 16

<210> 689

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 689

cctgcttata aatgta 16

<210> 690

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 690

tgccctgctt ataaat 16

<210> 691

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 691

tcttcttagt tcaata 16

<210> 692

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 692

tggtttctaa ctacat 16

<210> 693

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 693

agtttggttt ctaacta 17

<210> 694

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 694

gaatgaaact tgcctg 16

<210> 695

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 695

attatcctta catgat 16

<210> 696

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 696

gtacccaatt atcctt 16

<210> 697

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 697

tgtacccaat tatcct 16

<210> 698

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 698

ttgtacccaa ttatcc 16

<210> 699

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 699

tttgtaccca attatc 16

<210> 700

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 700

agcagcaggt tatatt 16

<210> 701

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 701

tgggaagtgg tctggg 16

<210> 702

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 702

ctggagagtg ataata 16

<210> 703

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 703

aatgctggat tacgtc 16

<210> 704

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 704

caatgctgga ttacgt 16

<210> 705

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 705

ttgttcagaa gtatcc 16

<210> 706

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 706

gatgatttgc ttggag 16

<210> 707

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 707

gaaatcattc acaacc 16

<210> 708

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 708

ttgtaacatc tactac 16

<210> 709

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 709

cattaagcag caagtt 16

<210> 710

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 710

ttactagatg tgagca 16

<210> 711

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 711

tttactagat gtgagc 16

<210> 712

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 712

gaccaagcac cttaca 16

<210> 713

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 713

agaccaagca ccttac 16

<210> 714

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 714

atgggttaaa taaagg 16

<210> 715

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 715

tcaaccagag tattaa 16

<210> 716

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 716

gtcaaccaga gtatta 16

<210> 717

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 717

attgtaaagc tgatat 16

<210> 718

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 718

cacataattg taaagc 16

<210> 719

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 719

gaggtctgct atttac 16

<210> 720

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 720

tgtagattca atgcct 16

<210> 721

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 721

cctcattata ctatga 16

<210> 722

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 722

ccttatgcta tgacac 16

<210> 723

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 723

tccttatgct atgaca 16

<210> 724

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 724

aagatgttta agtata 16

<210> 725

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 725

ctgattatta agatgt 16

<210> 726

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 726

tggaaaggta tgaatt 16

<210> 727

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 727

acttgaatgg cttgga 16

<210> 728

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 728

aacttgaatg gcttgg 16

<210> 729

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 729

caatgtgtta ctattt 16

<210> 730

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 730

acaatgtgtt actatt 16

<210> 731

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 731

catctgctat ataaga 16

<210> 732

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 732

cctagagcaa atactt 16

<210> 733

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 733

cagagttaat aataag 16

<210> 734

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 734

gttcaagcac aacgaa 16

<210> 735

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 735

agggttcaag cacaac 16

<210> 736

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 736

tgttggagac actgtt 16

<210> 737

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 737

aaggaggagt taggac 16

<210> 738

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 738

ctatgccatt tacgat 16

<210> 739

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 739

tcaaatgcag aattag 16

<210> 740

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 740

agtgacaatc aaatgc 16

<210> 741

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 741

aagtgacaat caaatg 16

<210> 742

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 742

gtgtaccaag taacaa 16

<210> 743

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 743

tgggatgtta aactga 16

<210> 744

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 744

agtttacatt ttctgc 16

<210> 745

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 745

tatgtgaaga ggagag 16

<210> 746

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 746

cacctttaaa acccca 16

<210> 747

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 747

tcctttataa tcacac 16

<210> 748

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 748

acggtatttt cacagg 16

<210> 749

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 749

gacactacaa tgagga 16

<210> 750

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 750

tggtttttag gactgt 16

<210> 751

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 751

cgacaaattc tatcct 16

<210> 752

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 752

tgatatacaa tgctac 16

<210> 753

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 753

tcgttgggta aattta 16

<210> 754

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 754

tgctttataa atggtg 16

<210> 755

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 755

caagtttaca ttttctgc 18

<210> 756

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 756

catatgtgaa gaggagag 18

<210> 757

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 757

cacctttaaa acccca 16

<210> 758

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 758

catcctttat aatcacac 18

<210> 759

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 759

caacggtatt ttcacagg 18

<210> 760

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 760

cagacactac aatgagga 18

<210> 761

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 761

catggttttt aggactgt 18

<210> 762

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 762

cacgacaaat tctatcct 18

<210> 763

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 763

catgatatac aatgctac 18

<210> 764

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 764

catcgttggg taaattta 18

<210> 765

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 765

catgctttat aaatggtg 18

<210> 766

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 766

caacaaataa tggttactct 20

<210> 767

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 767

cacagattga tggtagtt 18

<210> 768

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 768

cacctattta acatcagac 19

<210> 769

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 769

cactaattgt agtagtactc 20

<210> 770

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 770

caataaacat gaatctctcc 20

<210> 771

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 771

tgatttaatt ctagtca 17

<210> 772

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень

<400> 772

gcagtagagc caatta 16

<210> 773

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 773

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

<210> 774

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 774

Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp

1 5 10 15

<210> 775

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 775

Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu

1 5 10 15

<210> 776

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 776

Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser

1 5 10 15

<210> 777

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 777

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile

1 5

<210> 778

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 778

Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln

1 5 10 15

<210> 779

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 779

Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu

1 5

<210> 780

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 780

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val

1 5

<210> 781

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 781

Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr

1 5 10 15

Val Trp Leu Ser Val

20

<210> 782

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 782

Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val

1 5 10

<210> 783

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 783

Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu

1 5 10

<210> 784

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 784

ctgtgccttg ggtggcttt 19

<210> 785

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 785

aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24

<210> 786

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 786

ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25

<---