УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[1] Система доставки является одной из ключевых технологий в разработке лекарственных средств на основе малых РНК. Один тип системы доставки малых РНК представляет собой технологию направленной (нацеленной, таргетной) доставки конъюгата в клетки печени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[2] Согласно одному аспекту настоящего изобретения в этом документе предложено соединение, имеющее структуру, представленную формулой (321):
Формула (321)
где
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2, и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, C1-C10 алкила, C1-C10 галогеналкила и C1-C10 алкокси;
R4 представляет собой группу, способную связываться с активным лекарственным средством или активным агентом ковалентной связью;
каждый L1 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый S1 независимо представляет собой M1, в котором любой активный гидроксил, если он есть, защищен защитной группой для гидроксила;
каждый M1 независимо выбран из лиганда, спосыобного связываться с рецептором на поверхности клетки.
[3] В некоторых вариантах реализации каждый L1 независимо выбран из группы, состоящей из групп A1 - A26 и любых их комбинаций:
где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый R' независимо представляет собой C1-C10 алкил;
каждый Ra независимо выбран из группы, состоящей из A27 - A45 и любых их комбинаций:
каждый Rb независимо представляет собой C1-C10 алкил; и
представляет собой место присоединения группы к остальной части молекулы.
[4] В одном аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат, имеющий структуру, представленную формулой (1):
Формула (1),
где
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2, и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, C1-C10 алкила, C1-C10 галогеналкила и C1-C10 алкокси;
R3 представляет собой активное лекарственное средство;
R2 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 20 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и где R2 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый L1 независимо представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый M1 выбран из одного из лигандов, способных связываться с рецептором на поверхности клетки.
[5] В некоторых вариантах реализации каждый L1 независимо выбран из группы, состоящей из групп A1 - A26 и любых их комбинаций:
где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый R' независимо представляет собой C1-C10 алкил;
каждый Ra независимо выбран из группы, состоящей из A27 - A45 и любых их комбинаций:
каждый Rb независимо представляет собой C1-C10 алкил; и
представляет собой место присоединения группы к остальной части молекулы.
[6] В одном аспекте настоящего изобретения предложено применение конъюгата, описанного в данной заявке, для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения патологического состояния или заболевания, вызванного экспрессией определенного гена в гепатоцитах.
[7] В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения у нуждающегося в этом субъекта патологического состояния или заболевания, вызванного экспрессией определенного гена в гепатоцитах, включающий введение указанному субъекту эффективного количества конъюгата, описанного в данной заявке.
[8] В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ ингибирования экспрессии определенного гена в гепатоцитах, включающий приведение в контакт с конъюгатом, описанным в данной заявке.
[9] В одном аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий конъюгат, описанный в данной заявке.
[10] Дополнительные особенности и преимущества настоящего изобретения будут подробно проиллюстрированы далее в данной заявке.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[11] Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании, включены в данную заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[12] Новые особенности настоящего изобретения подробно описаны в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание особенностей и преимуществ настоящего изобретения будет достигнуто после рассмотрения следующего подробного описания, в котором описаны иллюстративные варианты реализации, в которых применяются принципы настоящего изобретения, и сопроводительных чертежей, из которых:
[13] На фиг. 1A и 1B показан полуколичественный результат анализа стабильности конъюгатов миРНК в тритосоме in vitro.
[14] На фиг. 2A и 2B показан полуколичественный результат анализа стабильности исследованных конъюгатов миРНК в плазме человека in vitro.
[15] На фиг. 3A и 3B показан полуколичественный результат анализа стабильности исследованных конъюгатов миРНК в плазме обезьяны in vitro.
[16] На фиг. 4 - 11 представлены метаболические профили в динамике, показывающие ФК/ТК концентрации в плазме или ткани для: конъюгата 24 в плазме крысы при дозировке 10 мг/кг (фиг. 4); конъюгата 24 в печени и почке крысы при дозировке 10 мг/кг (фиг. 5); конъюгата 24 в плазме крысы при дозировке 50 мг/кг (фиг. 6); конъюгата 24 в печени и почке крысы при дозировке 50 мг/кг (фиг. 7); конъюгата 25 в плазме крысы при дозировке 10 мг/кг (фиг. 8); конъюгата 25 в печени и почке крысы при дозировке 10 мг/кг (фиг. 9); конъюгата 25 в плазме крысы при дозировке 50 мг/кг (фиг. 10); конъюгата 25 в печени и почке крысы при дозировке 50 мг/кг (фиг. 11).
[17] На фиг. 12A, 12B, 12C и 12D показано определение значения IC50 для конъюгата 24 в отношении ингибирования экспрессии GSCM по сравнению с GSSM, PSCM и PSSM, соответственно.
[18] На фиг. 13 - 15 показано ингибирование мРНК HBV in vivo конъюгатами, описанными в данной заявке.
[19] На фиг. 16 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатами, описанными в данной заявке.
[20] На фиг. 17 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии ДНК HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатами, описанными в данной заявке.
[21] На фиг. 18 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатом 25, описанным в данной заявке.
[22] На фиг. 19 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в моделях M-Tg конъюгатами, описанными в данной заявке.
[23] На фиг. 20 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в моделях M-Tg конъюгатами, описанными в данной заявке.
[24] На фиг. 21 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в 1,28-копийных моделях M-Tg конъюгатами, описанными в данной заявке.
[25] На фиг. 22 - 24 показано ингибирование целевой мРНК (мишени) по сравнению с нецелевой мРНК конъюгатами, описанными в данной заявке.
[26] На фиг. 25 - 27 показано ингибирование мРНК HBV in vivo конъюгатами, описанными в данной заявке.
[27] На фиг. 28 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатами, описанными в данной заявке.
[28] На фиг. 29 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатами, описанными в данной заявке.
[29] На фиг. 30 показано ингибирование мРНК HBV in vivo в Д85 конъюгатами, описанными в данной заявке.
[30] На фиг. 31 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатом 43.
[31] На фиг. 32 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии ДНК HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей конъюгатом 43.
[32] На фиг. 33 и 34 показана стабильность конъюгата 167 в лизате лизосом из человека и крысы.
[33] На фиг. 35 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBsAg в 1,28-копийных моделях M-Tg конъюгатом 168.
[34] На фиг. 36 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии HBeAg в 1,28-копийных моделях M-Tg конъюгатом 168.
[35] На фиг. 37 показано зависимое от времени ингибирование экспрессии ДНК HBV в 1,28-копийных моделях M-Tg конъюгатом 168.
[36] На фиг. 38A и 38B показано соотношение ингибирования экспрессии мРНК ANGPTL в Д14 и Д28.
[37] На фиг. 39A и 39B показано соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатами, описанными в данной заявке.
[38] На фиг. 40A и 40B показано зависимое от времени соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатом 115.
[39] На фиг. 41A и 41B показано зависимое от времени соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатами 115 и 111.
[40] На фиг. 42A, 42B, 42C и 42D показано зависимое от времени соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатом 111 при различных дозировках.
[41] На фиг. 43A и 43B показано зависимое от времени соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатами 25 и 169; и на фиг. 43C показано соотношение ингибирования экспрессии мРНК ANGPTL.
[42] На фиг. 44A показано соотношение ингибирования экспрессии APOC3 в печени в Д14, и на фиг. 44B и 44C показано соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатом 144 при различных дозировках.
[43] На фиг. 45A и 45B показано соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатом 170 при различных дозировках.
[44] На фиг. 46A, 46B, 46C и 46D показано соотношение ингибирования липидов крови, представленных общим холестерином (ОХ) и триглицеридами (ТГ) в сыворотке, конъюгатами, описанными в данной заявке.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[45] Конкретные варианты реализации настоящего изобретения подробно описаны ниже. Следует понимать, что подробные варианты реализации, описанные в данной заявке, используются лишь для иллюстрирования и объяснения настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего описания в каком-либо отношении.
Определения
[46] В контексте настоящего описания, если не указано иное, заглавные буквы C, G, U и A обозначают основания, из которых состоят нуклеотиды; строчная буква m указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве m, представляет собой модифицированный 2'-метокси-группой нуклеотид; строчная буква f указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве f, представляет собой модифицированный 2'-фтором нуклеотид; строчная буква s указывает на фосфоротиоатную связь между двумя нуклеотидами, примыкающими с двух сторон к букве s; P1 указывает на то, что нуклеотид, примыкающий справа к P1, представляет собой нуклеотид с 5'-фосфатом или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, особенно нуклеотид, модифицированный винилфосфатом (обозначен VP в примерах ниже), нуклеотид с 5'-фосфатом (обозначен P в примерах ниже) или нуклеотид, модифицированный 5'-тиофосфатом (обозначен Ps в примерах ниже).
[47] В контексте настоящего описания формулировки «комплементарный» и «обратно комплементарный» используют взаимозаменяемо в данной заявке, и они имеют значение, хорошо известное в данной области, а именно, каждое из оснований в одной цепи комплементарно спарено с основанием в другой цепи в двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты. В ДНК пуриновое основание аденин (A) всегда спаривается с пиримидиновым основанием тимином (T) (или урацилом (U) в молекулах РНК); и пуриновое основание гуанин (G) всегда спаривается с пиримидиновым основанием цитозином (C). Каждая пара оснований содержит пурин и пиримидин. Если аденины в цепи всегда спариваются с тиминами (или урацилами) в другой цепи и гуанины спариваются с цитозинами, то указанные цепи считают комплементарными; и последовательность оснований цепи можно установить по последовательности комплементарной цепи. Соответственно, «ошибочное спаривание» относится к основаниям в соответствующих сайтах (положениях), которые не представлены в комплементарной паре в двухцепочечной нуклеиновой кислоте.
[48] В контексте настоящего описания, если не указано иное, «в основном обратно комплементарный» относится не более чем к 3 ошибочным спариваниям в двух последовательностях нуклеотидов. «По существу обратно комплементарный» относится не более чем к 1 ошибочному спариванию в двух последовательностях нуклеотидов. «Полностью обратно комплементарный» относится к отсутствию ошибочного спаривания в двух последовательностях нуклеотидов.
[49] В контексте настоящего описания «различие в нуклеотидах» между последовательностью нуклеотидов и другой последовательностью нуклеотидов относится к изменению в них оснований указанных нуклеотидов в одном и том же положении. Например, в случае, когда основание нуклеотида во второй последовательности представляет собой A, тогда как основание в том же сайте в первой последовательности представляет собой U, C, G или T, считают, что существует различие в нуклеотидах в данном сайте между 2 последовательностями. В некоторых вариантах реализации, если нуклеотид в некотором положении заменен на нуклеотид с удаленным основанием или аналог нуклеотида, то также считают, что существует различие в нуклеотидах в данном сайте.
[50] В контексте настоящего описания, в частности, в описании способа получения конъюгирующей молекулы или конъюгата миРНК, описанного в настоящем описании, если не указано иное, «мономер нуклеозида» или «мономеры нуклеозида» относятся, в зависимости от последовательности РНК, которую необходимо получить, к «немодифицированному или модифицированному РНК-фосфорамидиту», или «немодифицированным или модифицированным РНК-фосфорамидитам», соответственно, применяемым в так называемом «фосфорамидитном твердофазном синтезе», который хорошо известен в данной области как способ синтеза РНК. РНК-фосфорамидиты также называют нуклеозид-фосфорамидитами в других местах в данной заявке. Все мономеры нуклеозидов, применяемые в настоящем описании, доступны для приобретения.
[51] В данной заявке тире («-»), которое не находится между двумя буквами или символами, используют для обозначения точки присоединения заместителя. Например, C1-C10 алкилNH2 присоединен через C1-C10 алкил.
[52] В данной заявке «необязательный» или «необязательно» означает, что описанное далее событие или обстоятельство может произойти или может не произойти, и что настоящее описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда оно не происходит. Например, в объем термина «необязательно содержащий заместители алкил» входят как «алкил», так и «содержащий заместители алкил», как указано ниже. Специалистам в данной области будет понятно, в отношении любой группы, содержащей один или более заместителей, что не предполагается, что такие группы содержат любое замену (замещение) или паттерны замен (замещений), которые нереализуемы со стерической точки зрения, которые невозможно синтезировать и/или которые по своей природе нестабильны.
[53] В данной заявке «алкил» относится к линейной цепи и разветвленной цепи, содержащей указанное количество атомов углерода, обычно от 1 до 20 атомов углерода, например, от 1 до 10 атомов углерода, например, от 1 до 8 или от 1 до 6 атомов углерода. Например, C1-C6 алкил включает алкил как с линейной, так и с разветвленной цепью из от 1 до 6 атомов углерода. Если упоминается остаток алкила, содержащий указанное количество атомов углерода, предполагается, что включены все варианты с разветвленной и линейной цепью, содержащие данное количество атомов углерода; таким образом, например, подразумевают, что «бутил» включает н-бутил, втор-бутил, изобутил и трет-бутил; «пропил» включает н-пропил и изопропил. Алкилен является подгруппой алкила, относящейся к тем же остаткам, что и алкил, но имеющей две точки присоединения.
[54] В данной заявке «алкенил» относится к алкильной группе с ненасыщенной разветвленной или линейной цепью, содержащей по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь, полученную путем удаления одной молекулы водорода из смежных атомов углерода исходного алкила. Указанная группа может быть либо в цис-, либо в транс-конфигурации относительно двойной(-ых) связи(-ей). Обычные алкенильные группы включают, но не ограничены перечисленными: этенил; пропенилы, такие как проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил (аллил), проп-2-ен-2-ил; бутенилы, такие как бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил; и тому подобные группы. В некоторых вариантах реализации алкенильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода и, в других вариантах реализации, от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкенилен представляет собой разновидность алкенила, относящуюся к тем же остаткам, что и алкенил, но имеющую две точки присоединения.
[55] В данной заявке «алкинил» относится к алкильной группе с ненасыщенной разветвленной или линейной цепью, содержащей по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь, полученную путем удаления двух молекул водорода из смежных атомов углерода исходного алкила. Обычные алкинильные группы включают, но не ограничены перечисленными: этинил; пропинилы, такие как проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил; бутинилы, такие как бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и тому подобные группы. В некоторых вариантах реализации алкинильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода и в других вариантах реализации от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкинилен представляет собой разновидность алкинила, относящуюся к тем же остаткам, что и алкинил, но имеющую две точки присоединения.
[56] В данной заявке «алкокси» относится к алкильной группе из указанного количества атомов углерода, соединенных кислородным мостиком, такой как, например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентилокси, 2-пентилокси, изопентилокси, неопентилокси, гексилокси, 2-гексилокси, 3-гексилокси, 3-метилпентилокси и тому подобные группы. Алкокси-группы обычно будут содержать от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода, соединенных кислородным мостиком.
[57] В данной заявке «арил» относится к радикалу, являющемуся производным ароматической моноциклической или полициклической углеводородной кольцевой системы путем удаления атома водорода из кольцевого атома углерода. Ароматическая моноциклическая или полициклическая углеводородная кольцевая система содержит только водород и углерод, от шести до восемнадцати атомов углерода, при этом по меньшей мере одно из колец в кольцевой системе полностью ненасыщенное, т.е., содержит циклическую систему делокализованных (4n+2) π-электронов в соответствии с теорией Хюккеля. Арильные группы включают, но не ограничены такими группами как фенил, флуоренил и нафтил. Арилен представляет собой разновидность арила, относящуюся к тем же остаткам, что и арил, но имеющую две точки присоединения.
[58] В данной заявке «циклоалкил» относится к неароматическому карбоциклическому кольцу, обычно содержащему от 3 до 7 кольцевых атомов углерода. Кольцо может быть насыщенным или может содержать одну или более углерод-углеродных двойных связей. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил и циклогексенил, а также мостиковые и каркасные кольцевые группы, такие как норборнан.
[59] В данной заявке «галогено-» или «галоген» относится к фторо-, хлоро-, бромо- и йодо-, и термин «галоген» включает фтор, хлор, бром и йод.
[60] В данной заявке «галогеналкил» относится к алкилу согласно определению выше, в котором указанное количество атомов углерода замещен на 1 или более атомами галогена, вплоть до максимально допустимого количества атомов галогена. Примеры галогеналкила включают, но не ограничены перечисленными: трифторметил, дифторметил, 2-фторэтил и пентафторэтил.
[61] «Гетероциклил» относится к стабильному 3-18-членному неароматическому кольцевому радикалу, который содержит от двух до двенадцати атомов углерода и от одного до шести гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Если в настоящем описании конкретно не указано иное, то гетероциклический радикал представляет собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Гетероатомы в гетероциклическом радикале необязательно могут быть окислены. Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно могут быть кватернизированы. Гетероциклический радикал является частично или полностью насыщенным. Гетероциклил можно присоединить к остальной части молекулы через любой атом кольца(-ец). Примеры таких гетероциклических радикалов включают, но не ограничены перечисленными: диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил, имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксопирролидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, тритианил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-оксотиоморфолинил и 1,1-диоксотиоморфолинил.
[62] «Гетероарил» относится к радикалу, являющемуся производным 3-18-членного ароматического кольцевого радикала, который содержит от двух до семнадцати атомов углерода и от одного до шести гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. В данной заявке гетероарильный радикал может представлять собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, причем по меньшей мере одно из колец в кольцевой системе является полностью ненасыщенным, т.е., содержит циклическую систему делокализованных (4n+2) π-электронов в соответствии с теорией Хюккеля. Гетероарил включает конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Гетероатом(ы) в гетероарильном радикале необязательно окислены. Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно кватернизированы. Гетероарил присоединен к остальной части молекулы через любой атом кольца(-ец). Примеры гетероарилов включают, но не ограничены перечисленными: азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензиндолил, 1,3-бензодиоксолил, бензофуранил, бензооксазолил, бензо[d]тиазолил, бензотиадиазолил, бензо[b][1,4]диоксепинил, бензо[b][1,4]оксазинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензоксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил (бензотиофенил), бензотиено[3,2-d]пиримидинил, бензотриазолил, бензо[4,6]имидазо[1,2-a]пиридинил, карбазолил, циннолинил, циклопента[d]пиримидинил, 6,7-дигидро-5H-циклопента[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 5,6-дигидробензо[h]хиназолинил, 5,6-дигидробензо[h]циннолинил, 6,7-дигидро-5H-бензо[6,7]циклогепта[1,2-c]пиридазинил, дибензофуранил, дибензотиофенил, фуранил, фуранонил, фуро[3,2-c]пиридинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиримидинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиридазинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта [d]пиридинил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, индазолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, 5,8-метано-5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, нафтиридинил, 1,6-нафтиридинонил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-октагидробензо[h]хиназолинил, 1-фенил-1H-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиразолo[3,4-d]пиримидинил, пиридинил, пиридо[3,2-d]пиримидинил, пиридо[3,4-d]пиримидинил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, пирролил, хиназолинил, хиноксалинил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидрохинолинил, 5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 6,7,8,9-тетрагидро-5H-циклогепта[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 5,6,7,8-тетрагидропиридо[4,5-c]пиридазинил, тиазолил, тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил, тиено[2,3-d]пиримидинил, тиено[3,2-d]пиримидинил, тиено[2,3-c]пиридинил и тиофенил (т.е., тиенил).
[63] В настоящем описании могут применяться различные защитные группы для гидроксила. Обычно защитные группы делают химические функциональные группы неактивными по отношению к определенным условиям реакции, и их можно добавлять и удалять из таких функциональных групп в молекуле по существу без повреждения остальной части молекулы. Примеры защитных групп для гидроксила описаны в Beaucage и др., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, а также в Greene и Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, глава 2, 2ое изд., John Wiley & Sons, Нью-Йорк, 1991, каждый из которых настоящим полностью включен в данную заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации защитная группа стабильна в основных условиях, но может быть удалена в кислых условиях. В некоторых вариантах реализации неисключительные примеры защитных групп для гидроксилов, которые можно применять в данной заявке, включают диметокситритил (DMT), монометокситритил, 9-фенилксантен-9-ил (пиксил (Pixyl)) и 9-(пара-метоксифенил)ксантен-9-ил (мокс (Mox)). В некоторых вариантах реализации неисключительные примеры защитных групп для гидроксила, который можно применять в данной заявке, включают Tr (тритил), MMTr (4-метокситритил), DMTr (4,4'-диметокситритил) и TMTr (4,4',4''-триметокситритил).
[64] Термин «субъект» в данной заявке относится к любому животному, например, млекопитающему или сумчатому. Субъекты согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными: людей, отличных от человека приматов (например, макак резус или других типов макак), мышей, свиней, лошадей, ослов, коров, овец, крыс и птиц любой вида.
[65] В данной заявке «лечение», или «лечить», или «смягчение» или «облегчение» используют взаимозаменяемо. Данные термины относятся к подходу получения полезных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь терапевтической пользой. Под «терапевтической пользой» подразумевают устранение или снижение выраженности основного расстройства, которое лечат. Также терапевтическая польза достигается устранением или снижением выраженности одного или более физиологических симптомов, связанных с основным расстройством, так что у пациента наблюдается улучшение, несмотря на то, что пациент может все еще страдать основным расстройством.
[66] В данной заявке «предотвращение» и «предотвращать» используются взаимозаменяемо. Данные термины относятся к подходу получения полезных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь профилактической пользой. Для «профилактической пользы» конъюгаты или композиции можно вводить пациенту, у которого есть риск развития конкретного заболевания, или пациенту, сообщающему об одном или более физиологических симптомах заболевания, даже если не был поставлен диагноз данного заболевания.
Конъюгирующие молекулы
[67] В одном аспекте в данной заявке описана конъюгирующая молекула для доставки активного агента или активного лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации описанные в данной заявке конъюгирующие молекулы полезны для тканеспецифического нацеливания. В некоторых вариантах реализации описанные в данной заявке конъюгирующие молекулы связываются с рецептором на поверхности клетки. Для данной цели считают подходящим любой рецептор на поверхности клетки или биомаркер, или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации конъюгирующие молекулы, описанные в данной заявке, специфично связываются с рецептором, уникальным для определенной ткани, и за счет этого достигается тканеспецифическое нацеливание. В некоторых вариантах реализации конъюгирующие молекулы, описанные в данной заявке, специфично нацеливаются на рецепторы на поверхности гепатоцитов и, следовательно, специфично нацеливаются на ткани печени. В некоторых вариантах реализации конъюгирующие молекулы, описанные в данной заявке, специфично нацеливаются на рецепторы на поверхности клетки, которые уникальны для клеток печени. В некоторых вариантах реализации конъюгирующие молекулы, описанные в данной заявке, специфично нацеливаются на асиалогликопротеиновые рецепторы на поверхности клеток печени (ASGPR).
[68] В данной заявке термин «активный агент» используют взаимозаменяемо с термином «активное лекарственное средство», оба термина относятся к молекуле, которую способна доставлять конъюгирующая молекула, описанная в данной заявке. В некоторых вариантах реализации активные агенты представляют собой агенты, которые требуется доставить в гепатоцит. Такие агенты известны специалистам в данной области и включают, но не ограничены перечисленными: функциональные нуклеотиды, такие как функциональные олигонуклеотиды, особенно описанные в данной заявке.
[69] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена конъюгирующая молекула, имеющая структуру, представленную формулой (321):
Формула (321)
где:
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2, и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10; каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, C1-C10 алкила, C1-C10 галогеналкила и C1-C10 алкокси;
R4 представляет собой группу, способную связываться с активным лекарственным средством или активным агентом ковалентной связью;
каждый L1 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый S1 независимо представляет собой M1, в котором любой активный гидроксил, если он есть, защищен защитной группой для гидроксила;
каждый M1 независимо выбран из лиганда, способного связываться с рецептором на поверхности клетки.
[70] В некоторых вариантах реализации n1 может представлять собой целое число от 1 до 3, и n3 может представлять собой целое число от 0 до 4, чтобы гарантировать наличие по меньшей мере 2 групп S1 в конъюгирующей молекуле. В некоторых вариантах реализации n1+n3 ≥ 2, так что количество лиганда M1 в конъюгате, образованном конъюгирующей молекулой, может составлять по меньшей мере 3, тем самым позволяя лиганду M1 более удобно связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности гепатоцитов, что может способствовать эндоцитозу конъюгата в клетки. Эксперименты показали, что если количество лигандов M1 больше чем 3, то возможность связывания лиганда M1 с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности гепатоцитов повышается незначительно. Следовательно, принимая во внимание различные аспекты, такие как удобство синтеза, стоимость получения структуры/процесса и эффективность доставки, в некоторых вариантах реализации n1 представляет собой целое число от 1 до 2, n3 представляет собой целое числоот 0 до 1, и n1+n3 = 2 - 3.
[71] В некоторых вариантах реализации, когда каждый из m1, m2 и m3 независимо выбран из целого числа, равного 2 - 10, полагают, что стерическое положение среди множества лигандов M1 в конъюгате, образованном конъюгирующей молекулой, может подходить для связывания лигандов M1 с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности гепатоцитов. Для того чтобы сделать конъюгирующую молекулу, предложенную в настоящем описании, проще, удобнее для синтеза и/или снизить стоимость, в некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 5, в некоторых вариантах реализации m1 = m2 = m3.
[72] Специалистам в данной области может быть понятно, что если каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, C1-C10 алкила, C1-C10 галогеналкила и C1-C10 алкокси, то цель настоящего описания можно достичь без изменения свойств конъюгирующей молекулы, описанной в данной заявке. В некоторых вариантах реализации каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, метила и этила. В некоторых вариантах реализации все R10, R11, R12, R13, R14 и R15 представляют собой H.
[73] R4 представляет собой группу, способную связываться с активным агентом, который нужно доставить с помощью конъюгирующих молекул, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации R4 представляет собой группу, способную связываться с олигонуклеотидом, который нужно доставить с помощью конъюгирующих молекул, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации R4 представляет собой группу, способную связываться с олигонуклеотидом ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации R4 представляет собой группу, способную связываться с олигонуклеотидом фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации R4 выбирают, чтобы добиться связи с атомом N на азотистом остове и чтобы создать подходящие реакционные центры для синтеза олигонуклеотидного конъюгата. В контексте настоящего описания «азотистый остов» относится к цепочечной структуре, в которой атомы углерода, к которым присоединены R10, R11, R12, R13, R14 и R15, и атомы N связаны друг с другом. В некоторых вариантах реализации R4 представляет собой молекулу, которую можно присоединить к атому N на азотистом остове подходящим способом. В некоторых вариантах реализации R4 содержит сайт, связывающийся с атомом N на азотистом остове и любой функциональной группой, которую можно конъюгировать с олигонуклеотидом фосфодиэфирной связью в ходе реакции.
[74] В некоторых вариантах реализации R4 содержит первую функциональную группу, которая может реагировать с группой на олигонуклеотиде или нуклеотиде с образованием фосфоэфирной связи, и вторую функциональную группу, которая может образовывать ковалентную связь с гидрокси-группой или аминогруппой, или твердофазной подложкой, связанной ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации первая функциональная группа представляет собой фосфорамидит, гидрокси или защищенную гидрокси. В некоторых вариантах реализации вторая функциональная группа представляет собой фосфорамидит, карбоксил или карбоксилатную соль. В некоторых вариантах реализации вторая функциональная группа представляет собой твердофазную подложку, присоединенную к остальной части молекулы ковалентной связью, образованной гидрокси-группой или аминогруппой. В некоторых вариантах реализации твердофазная подложка связана фосфоэфирной связью, карбоксиэфирной связи или амидной связи. В некоторых вариантах реализации твердофазная подложка представляет собой смолу.
[75] В некоторых вариантах реализации первая функциональная группа включает гидрокси, -ORk или группу, представленную формулой (C3); и/или вторая функциональная группа включает группу, представленную формулой (C1), (C2), (C3), (C1') или (C3'):
где q1 представляет собой целое число от 1 до 4, X представляет собой O или NH, M+ представляет собой катион, Rk представляет собой защитную группу для гидрокси, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой сайт ковалентного присоединения указанной группы.
[76] В некоторых вариантах реализации первая функциональная группа включает фосфорамидитную группу, такую как группа, представленная формулой (C3). Фосфорамидитная группа может соединяться с гидрокси в любом положении на нуклеотиде, таким как 2'- или 3'- гидрокси, и образовывать фосфодиэфирную связь путем окисления, чтобы конъюгировать конъюгирующую молекулу с олигонуклеотидом. Таким образом, даже если вторая функциональная группа не существует, то конъюгирующую молекулу, описанную в данной заявке, можно будет конъюгировать с нуклеотидом. В данном случае конъюгирующая молекула пригодна для приведения в контакт с гидрокси на последнем нуклеотиде последовательности нуклеотидов и образования фосфодиэфирной связи путем последующего окисления, посредством этого конъюгируя конъюгирующую молекулу согласно настоящему описанию с олигонуклеотидом.
[77] В некоторых вариантах реализации первая функциональная группа включает защищенную гидрокси-группу. В некоторых вариантах реализации вторая функциональная группа включает группу, способную вступать в реакцию с твердофазной подложкой, с образованием конъюгирующей молекулы, содержащей твердофазную подложку. В некоторых вариантах реализации вторая функциональная группа включает карбоксил, карбоксилат или фосфорамидит, такая как функциональная группа, представленная формулой (C1), (C2) или (C3). Карбоксил или карбоксилат может вступать в реакцию этерификацией или амидирования с гидрокси или аминогруппой на твердофазной подложке, такой как смола, с образованием конъюгирующей молекулы, содержащей твердофазную подложку, связанную карбоксилатной эфирной связью или амидной связью. Фосфорамидит может соединяться с гидрокси-группой на универсальной твердофазной подложке, такой как смола, и образовывать конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку, связанную фосфодиэфирной связью путем последующего окисления. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата, описанного в данной заявке, с такой конъюгирующей молекулой. В некоторых вариантах реализации указанный способ включает сначала соединение конъюгирующей молекулы с твердофазной подложкой путем реакции конденсации или сочетания, а затем добавление мономеров нуклеозида в соответствии со способом фосфорамидитного твердофазного синтеза, тем самым получая конъюгат, описанный в данной заявке, содержащий конъюгирующую молекулу согласно настоящему описанию, конъюгированную с олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации в процессе фосфорамидитного твердофазного синтеза с первой функциональной группы снимают защиту, с последующим соединением с фосфорамидитной группой на нуклеозиде в условиях сочетания.
[78] В некоторых вариантах реализации R4 содержит первую функциональную группу и вторую функциональную группу, причем первая функциональная группа включает гидрокси или защищенную гидрокси-группу, и вторая функциональная группа включает карбоксилатную эфирную связь, амидную связь или фосфодиэфирную связь или твердофазную подложку, связанную карбоксилатной эфирной связью, амидной связью или фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации вторая функциональная группа представляет собой молекулу, представленную формулой (C1') или (C3'). В некоторых вариантах реализации, если вторая функциональная группа включает твердофазную подложку, конъюгирующая молекула, содержащая такую твердофазную подложку, полезна для получения конъюгата, описанного в данной заявке. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата, описанного в данной заявке, с конъюгирующей молекулой. В некоторых вариантах реализации указанный способ включает приведение в контакт конъюгирующей молекулы, содержащей твердофазную подложку, с мономерами нуклеозида в соответствии со способом фосфорамидитного твердофазного синтеза, тем самым получая конъюгирующую молекулу согласно настоящему описанию, конъюгированную с олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку, можно получить самостоятельно из конъюгирующей молекулы с карбоксилом, карбоксилатом или фосфорамидитом путем приведения во взаимодействие конъюгирующей молекулы с твердофазной подложкой. В некоторых вариантах реализации конъюгирующую молекулу может предоставить поставщик.
[79] В некоторых вариантах реализации карбоксилат может быть представлен как -COO-M+, где M+ представляет собой катион, такой как катион металла, катион аммония NH4+ или органический катион аммония. В некоторых вариантах реализации катион металла может представлять собой катион щелочного металла, такой как K+ или Na+. Для того чтобы повысить растворимость и ускорить реакцию, в некоторых вариантах реализации органический катион аммония представляет собой катион аммония, образованный третичным амином, или катион четвертичного аммония, такой как катион аммония, образованный триэтиламином или N,N-диизопропилэтиламином. В некоторых вариантах реализации карбоксилат представляет собой карбоксилат триэтиламина или карбоксилат N,N-диизопропилэтиламина.
[80] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию R4 представляет собой группу, представленную формулой (B9), (B10), (B9'), (B10'), (B11), (B12), (B11') или (B12'):
где q1 представляет собой целое число от 1 до 4, q2 представляет собой целое число от 1 до 10, X представляет собой O или NH, M+ представляет собой катион, Rk представляет собой защитную группу для гидрокси, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой место ковалентного присоединения указанной группы. В некоторых вариантах реализации q1 представляет собой 1 или 2. В некоторых вариантах реализации q2 представляет собой целое число от 1 до 5. В некоторых вариантах реализации R4 включает группу, представленную формулой (B9) или (B10). В некоторых вариантах реализации R4 включает группу, представленную формулой (B11) или (B12).
[81] В некоторых вариантах реализации Rk представляет собой один или более из Tr (тритила), MMTr (4-метокситритила), DMTr (4,4'-диметокситритила) и TMTr (4,4',4''-триметокситритила). В некоторых вариантах реализации Rk представляет собой DMTr.
[82] L1 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила). Для специалиста должно быть очевидно, что хотя L1 называют линейным алкиленом для удобства, он может не быть линейной группой или может называться по-другому, например, амином или алкенилом, в результате указанной выше замены и/или замещения. Для целей настоящего описания, приведенного в данной заявке, длина L1 представляет собой атомное число в цепи, соединяющей две точки присоединения. Для данной цели кольцо, полученное в результате замены атома углерода линейного алкилена, такое как гетероциклилен или гетероарилен, считают как один атом.
[83] В некоторых вариантах реализации L1 используют для соединения лиганда M1 (или соответствующей группы S1) с атомом N на азотистом остове, за счет чего получают функцию нацеливания на печень конъюгата согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации L1 включает любую из формул A1 - A26 и любые их комбинации. В некоторых вариантах реализации L1 представляет собой любую из A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11, A13 и их комбинации. В некоторых вариантах реализации L1 представляет собой комбинацию по меньшей мере двух из A1, A4, A8, A10 и A11; в некоторых вариантах реализации L1 представляет собой комбинацию по меньшей мере двух групп из A1, A8 и A10.
[84] В некоторых вариантах реализации длина L1 может составлять от 3 до 25, от 3 до 20, от 4 до 15 или от 5 до 12 атомов. В некоторых вариантах реализации длина L1 составляет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 атомов.
[85] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию, следовательно, j1 представляет собой целое число от 2 до 10, и в некоторых вариантах реализации представляет собой целое число от 3 до 5; j2 представляет собой целое число от 2 до 10, и в некоторых вариантах реализации представляет собой целое число от 3 до 5; R' представляет собой C1-C4 алкил, и в некоторых вариантах реализации представляет собой один из метила, этила и изопропила. Ra представляет собой один из A27, A28, A29, A30 и A31 и в некоторых вариантах реализации представляет собой A27 или A28; Rb представляет собой C1-C5 алкил и в некоторых вариантах реализации представляет собой один из метила, этила, изопропила и бутила. В некоторых вариантах реализации j1, j2, R', Ra и Rb выбирают соответствующим образом из A1 - A26, чтобы добиться связи между лигандами M1 и атомом N на азотистом остове в олигонуклеотидном конъюгате, образованном конъюгирующей молекулой, и чтобы сделать стерическое положение среди лигандов M1 более подходящим для связывания лигандов M1 с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности гепатоцитов.
[86] Каждый M1 независимо выбран из лиганда, способного связываться с рецептором на поверхности клетки. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один M1 представляет собой лиганд, способный связываться с рецептором на поверхности гепатоцитов. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один M1 представляет собой лиганд, способный связываться с рецептором на поверхности клетки млекопитающего. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один M1 представляет собой лиганд, способный связываться с рецептором на поверхности гепатоцитов человека. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один M1 представляет собой лиганд, способный связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности клеток печени (ASGPR).
[87] В некоторых вариантах реализации M1 может представлять собой любой из лигандов, который обладает аффинностью к асиалогликопротеиновым рецепторам (ASGP-R) на поверхности гепатоцитов млекопитающих. Типы данных лигандов хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из M1 представляет собой сахарид. В некоторых вариантах реализации каждый M1 представляет собой сахарид. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из M1 представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид или полисахарид. В некоторых вариантах реализации каждый M1 представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид или полисахарид. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из M1 представляет собой модифицированный сахарид. В некоторых вариантах реализации каждый M1 представляет собой модифицированный сахарид. В некоторых вариантах реализации каждый M1 независимо выбран из полисахаридов, модифицированных полисахаридов, моносахаридов или производных моносахаридов. В некоторых вариантах реализации каждый или по меньшей мере один M1 можно независимо выбрать из группы, состоящей из глюкозы и ее производных, маннозы и ее производных, галактозы и ее производных, ксилозы и ее производных, рибозы и ее производных, фукозы и ее производных, лактозы и ее производных, мальтозы и ее производных, арабинозы и ее производных, фруктозы и ее производных и сиаловой кислоты.
[88] В некоторых вариантах реализации каждый или по меньшей мере один M1 можно независимо выбрать из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-н-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один M1 представляет собой N-ацетилгалактозамин (GalNAc). В некоторых вариантах реализации каждый M1 представляет собой N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Выбор лиганда можно найти, например, в описании CN105378082A, которое полностью включено в данную заявку посредством ссылки.
[89] В CN105378082A описано соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, причем указанная конъюгирующая группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу, а также один или более лигандов, каждый лиганд выбран из группы, состоящей из полисахаридов, модифицированных полисахаридов, маннозы, галактозы, производных маннозы, производных галактозы, D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, α-D-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы и L-4-тиорибозы. Утверждается, что соединение может снизить количество или активность транскрипции нуклеиновой кислоты в клетках.
[90] В WO2016077321A1 описано множество миРНК, специфично нацеленных на ген HBV, и способы их доставки, и стабильность данных миРНК в сыворотке повышают путем модификации их нуклеотидов. В данном документе также описаны конъюгаты миРНК и дополнительно конкретно описано несколько конъюгатов миРНК.
[91] В WO2016168286A1 описано множество миРНК, специфично нацеленных на ген ANGPTL3, и способы их доставки, и стабильность данных миРНК в сыворотке повышают путем модификации их нуклеотидов. В данном документе также описаны конъюгаты миРНК.
[92] N-ацетилгалактозамин (GalNAc) представляет собой лиганд, который связывается с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности клеток печени (ASGPR). ASGPR представляет собой эндоцитозный рецептор, который специфично экспрессируется гепатоцитами. Недавно N-ацетилгалактозамин (GalNAc) применяли в качестве нацеливающей молекулы для доставки лекарственных средств на основе малых РНК в печень. Например, Alnylam Pharmaceuticals, Inc., первоначально сообщила, что миРНК, основанные на технологии конъюгирования с GalNAc, проявляла интерферирующую активность у мышей (Nair и др., J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 16958-16961). В данной статье сообщили, что миРНК, конъюгированная с тремя кластерами GalNAc, проявляет хорошую активность доставки как in vitro, так и in vivo. С помощью экспериментов in vivo с мышами, которым вводили дозу подкожно, определили, что ED50 разовой дозы составляла 1 мг/кг, если разовая инъекционная доза составляла менее 1 мл. В экспериментах по длительному введению, как утверждают, можно добиться стабильной активности интерференции вплоть до 9 месяцев при подкожной инъекции раз в неделю.
[93] В некоторых вариантах реализации S1 независимо представляет собой M1. В некоторых вариантах реализации S1 независимо представляет собой M1, содержащий по меньшей мере одну активную гидрокси-группу, защищенную защитной группой для гидроксила. В некоторых вариантах реализации S1 независимо представляет собой M1, в котором все активные гидроксилы, если они есть, были защищены защитной группой для гидроксила. В некоторых вариантах реализации можно применять любую защитную группу для гидроксила, известную специалисту, для защиты активного гидроксила на M1. В некоторых вариантах реализации защищенная гидрокси-группа представлена формулой YCOO-, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из C1-C10 алкила и C6-C10 арила, которые необязательно содержат в качестве заместителей один или более из заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена и C1-C6 алкила. В некоторых вариантах реализации каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и C1-C6 алкилфенила.
[94] В некоторых вариантах реализации каждый S1 независимо выбран из группы, состоящей из формул A46 - A54:
[95] В некоторых вариантах реализации S1 представляет собой A49 или A50. В некоторых вариантах реализации Y независимо для каждого появления представляет собой один из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметиловой, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и алкилфенила. Для того чтобы упростить конъюгирующую молекулу согласно настоящему изобретению, в некоторых вариантах реализации Y представляет собой метил.
[96] В некоторых вариантах реализации конъюгирующая молекула согласно настоящему изобретению имеет структуру, представленную формулой (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) или (422):
,
(405)
,
(406)
,
(407)
,
(408)
,
(409)
,
(410)
,
(411)
,
(412)
,
(413)
,
(414)
,
(415)
,
(416)
,
(417)
,
(418)
,
(419)
,
(420)
,
(421)
.
(422)
[97] В приведенных выше формулах с (403) по (422) X представляет собой O или NH, Rk представляет собой защитную группу для гидрокси и M+ представляет собой катион металла, катион аммония, катион, образованный из третичного амина, или катион четвертичного аммония. В некоторых вариантах реализации M+ представляет собой 
.
[98] В некоторых вариантах реализации конъюгирующая молекула согласно настоящему изобретению имеет структуру, представленную формулой (423), (424), (425), (426), (427), (428), (429), (430), (431), (432), (433), (434), (435), (436), (437), (438), (439), (440), (441) или (442):
,
(423)
,
(424)
,
(425)
,
(426)
,
(427)
,
(428)
,
(429)
,
(430)
,
(431)
,
(432)
,
(433)
,
(434)
,
(435)
,
(436)
,
(437)
,
(438)
,
(439)
,
(440)
,
(441)
.
(442)
[99] В приведенных выше формулах с (423) по (442) X представляет собой O или NH, Rk представляет собой защитную группу для гидроксила и SPS представляет собой твердофазную подложку.
[100] В некоторых вариантах реализации конъюгирующая молекула согласно настоящему изобретению имеет структуру, представленную формулой (503), (504), (505), (506), (507), (508), (509), (510), (511), (512), (513), (514), (515), (516), (517), (518), (519), (520), (521) или (522):
(503)
(504)
(505)
(506)
(507)
(508)
(509)
(510)
(511)
(512)
(513)
(514)
(515)
(516)
(517)
(518)
(519)
(520)
(521)
.
(522)
[101] В приведенных выше формулах (503) - (522) DMTr представляет собой 4,4'-диметокситритил. Структура
представляет собой соли, образованные соответствующими карбоновыми кислотами и триэтиламином.
[102] В некоторых вариантах реализации конъюгирующая молекула согласно настоящему изобретению имеет структуру, представленную формулой (523), (524), (525), (526), (527), (528), (529), (530), (531), (532), (533), (534), (535), (536), (537), (538), (539), (540), (541) или (542):
(523)
(524)
(525)
(526)
(527)
(528)
(529)
(530)
(531)
(532)
(533)
(534)
(535)
(536)
(537)
(538)
(539)
(540)
(541)
.
(542)
[103] В приведенных выше формулах с (523) по (542) SPS представляет собой твердофазную подложку и DMTr относится к 4,4'-диметокситритилу.
Получение конъюгирующей молекулы согласно настоящему описанию.
[104] Конъюгирующую молекулу согласно настоящему описанию специалисты в данной области могут получить с помощью любого подходящего пути синтеза.
[105] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию способ получения конъюгирующей молекулы, представленной формулой (321), включает приведение в контакт соединения, представленного формулой (313), с циклическим ангидридом в условиях реакции этерификации в присутствии основания и катализатора этерификации в органическом растворителе; обмен ионами и выделение соединения, представленного формулой (321):
,
Формула (313)
где:
R6 представляет собой группу для получения R4 формулы (321). В некоторых вариантах реализации, например, R6 имеет структуру, представленную формулой (A61):
определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1 являются, соответственно, такими, как описано выше; Ri представляет собой группу, способную соединяться с атомом N на азотистом остове, с RkO и со свободной гидрокси-группой; Rk представляет собой защитную группу для гидрокси. В данном случае получают соединение, представленное формулой (321), где R4 содержит защитную группу для гидрокси в качестве первой функциональной группы и группу, представленную формулой (C1) или (C2), в качестве второй функциональной группы. В некоторых вариантах реализации R6 представляет собой B7 или B8:
где q2 и Rk, соответственно, такие как описано выше.
[106] Условия реакции этерификации включают температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 8 до 48 часов. В некоторых вариантах реализации условия реакции этерификации включают температуру реакции от 10 до 40°C и время реакции от 20 до 30 часов.
[107] В некоторых вариантах реализации органический растворитель включает один или более из эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3 - 50 л/моль, и в некоторых вариантах реализации 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (313).
[108] В некоторых вариантах реализации циклический ангидрид представляет собой один из янтарного ангидрида, глутарового ангидрида, адипинового ангидрида или пимелинового ангидрида. В некоторых вариантах реализации циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид. Молярное соотношение циклического ангидрида к соединению, представленному формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 2:1 до 5:1.
[109] Катализатор этерификации может представлять собой любой катализатор способный катализировать этерификацию, такой как 4-диметиламинопиридин. Молярное соотношение катализатора к соединению, представленному формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 2:1 до 5:1.
[110] В некоторых вариантах реализации основание может представлять собой любое неорганическое основание, органическое основание или их комбинацию. Принимая во внимание растворимость, а также стабильность продукта, основание представляет собой третичный амин. В некоторых вариантах реализации третичный амин представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин. Молярное соотношение третичного амина к соединению, представленному формулой (313), составляет от 1:1 до 20:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 3:1 до 10:1.
[111] Обмен ионами служит для превращения соединения, представленного формулой (321), в желательную форму карбоновой кислоты или ее соль. Для способа обмена ионами конъюгирующую молекулу с M+ катионом можно получить, применяя подходящий раствор для обмена ионами и условия для обмена ионами, которые хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах реализации раствор фосфата триэтиламина используют для обмена ионами. В некоторых вариантах реализации концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,2 - 0,8 М. В некоторых вариантах реализации концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,4 - 0,6 М. В некоторых вариантах реализации количество раствора фосфата триэтиламина составляет 3 - 6 л/моль и в дополнительном варианте реализации 4 - 5 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (313).
[112] Соединение, представленное формулой (321), можно выделить из реакционной смеси, применяя любые подходящие способы. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (321), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, применяя следующие условия хроматографии для выделения: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью содержащего 1‰ триэтиламина (по массе) дихлорметана: метанола = 100:18 - 100:20; или (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовый наполнитель в колонках C18 и C8, с градиентным элюированием смесью метанола:ацетонитрила = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (321), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[113] В некоторых вариантах реализации способ получения соединения, представленного формулой (321), дополнительно включает: приведение в контакт продукта описанного выше обмена ионами с твердофазной подложкой с аминогруппами или гидроксигруппами в условиях реакции конденсации в присутствии конденсирующего агента, катализатора конденсации и третичного амина в органическом растворителе. В данном случае получают соединение, представленное формулой (321), в котором R4 содержит защитную группу для гидрокси в качестве первой функциональной группы и группу, представленную формулой (C1'), в качестве второй функциональной группы.
[114] Твердофазная подложка представляет собой одну из подложек, применяемых в твердофазном синтезе миРНК, некоторые из которых хорошо известны специалистам в данной области. Например, твердофазную подложку можно выбрать из подложек, содержащих активную функциональную гидрокси-группу или функциональную аминогруппу. В некоторых вариантах реализации твердофазная подложка представляет собой амино- или гидроксисмолу. В некоторых вариантах реализации размер частиц амино- или гидроксисмолы составляет 100 - 400 меш, и нагрузка амина или гидрокси на поверхности составляет 0,2 - 0,5 ммоль/г. Отношение соединения, представленного формулой (321), к твердофазной подложке составляет от 10 мкмоль соединения на грамм твердофазной подложки (мкмоль/г) до 400 мкмоль/г. В некоторых вариантах реализации отношение соединения формулы (321) к твердофазной подложке составляет от 50 мкмоль/г до 200 мкмоль/г.
[115] Органический растворитель может представлять собой любой подходящий растворитель или смесь растворителей, известные специалистам, подходящие для цели, описанной в данной заявке. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран, эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир, галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 20 - 200 л/моль, в некоторых вариантах реализации составляет 50 - 100 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (313).
[116] В некоторых вариантах реализации конденсирующий агент может представлять собой бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфония гексафторфосфат, 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотриазол-4(3H)-он и/или O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат. В некоторых вариантах реализации конденсирующий агент представляет собой O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат. Молярное соотношение конденсирующего агента к соединению, представленному формулой (313), составляет от 1:1 до 20:1 и в дополнительных вариантах реализации от 1:1 до 5:1.
[117] В некоторых вариантах реализации третичный амин представляет собой триэтиламин и/или N,N-диизопропилэтиламин и в некоторых вариантах реализации представляет собой N,N-диизопропилэтиламин. Молярное соотношение третичного амина к соединению, представленному формулой (313), составляет от 1:1 до 20:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:1 до 5:1.
[118] В некоторых вариантах реализации указанный способ получения соединения, представленного формулой (321), дополнительно включает: приведение в контакт полученного продукта реакции конденсации с кэпирующим реагентом и катализатором ацилирования в условиях реакции кэпирования в органическом растворителе, и выделение соединения, представленного формулой (321). Реакцию кэпирования используют для удаления любых активных функциональных групп, которые не должны вступать в реакцию, чтобы избежать ненужных побочных продуктов в следующих реакциях. Условия реакции кэпирования включают температуру реакции от 0 до 50°C и в некоторых вариантах реализации от 15 до 35°C и время реакции от 1 до 10 часов и в некоторых вариантах реализации от 3 до 6 часов. Кэпирующий реагент может представлять собой реагент, применяемый в твердофазном синтезе миРНК, который хорошо известен специалистам в данной области. В некоторых вариантах реализации кэпирующий реагент состоит из кэпирующего реагента A (capA) и кэпирующего реагента B (capB). CapA представляет собой N-метилимидазол и в некоторых вариантах реализации предложен в виде раствора N-метилимидазола в смешанном растворителе пиридин/ацетонитрил, в котором объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет от 1:10 до 1:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:3 до 1:1. В некоторых вариантах реализации отношение общего объема пиридина и ацетонитрила к объему N-метилимидазола составляет от 1:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 3:1 до 7:1. В некоторых вариантах реализации кэпирующий реагент B представляет собой уксусный ангидрид. В некоторых вариантах реализации кэпирующий реагент B предложен в виде раствора уксусного ангидрида в растворителе ацетонитриле, в котором объемное отношение уксусного ангидрида к ацетонитрилу составляет от 1:1 до 1:10 и в дополнительных вариантах реализации составляет от 1:2 до 1:6.
[119] В некоторых вариантах реализации отношение объема раствора N-метилимидазола в смешанном растворителе пиридин/ацетонитрил к массе соединения формулы (313) составляет 5 мл/г - 50 мл/г и в некоторых вариантах реализации составляет 15 мл/г - 30 мл/г. Отношение объема раствора уксусного ангидрида в ацетонитриле к массе соединения формулы (313) составляет 0,5 мл/г - 10 мл/г и в некоторых вариантах реализации составляет 1 мл/г - 5 мл/г.
[120] В некоторых вариантах реализации кэпирующий реагент представляет собой эквимолярные уксусный ангидрид и N-метилимидазол. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой ацетонитрил. В некоторых вариантах реализации количество органического растворителя составляет 10 - 50 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 5 - 30 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (313).
[121] В некоторых вариантах реализации катализатор ацилирования можно выбрать из любого катализатора, который можно применять для этерификации или амидирования, такого как щелочные гетероциклические соединения. В некоторых вариантах реализации катализатор ацилирования представляет собой 4-диметиламинопиридин. Отношение массы катализатора к массе соединения, представленного формулой (313), может составлять от 0,001:1 до 1:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 0,01:1 до 0,1:1.
[122] В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (321), можно выделить из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов. В некоторых вариантах реализации соединение формулы (321) можно получить путем достаточной промывки органическим растворителем и фильтрации для удаления не вступивших в реакцию реагентов, избытка кэпирующего реагента и других примесей, причем органический растворитель выбирают из ацетонитрила, дихлорметана или метанола. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой ацетонитрил.
[123] В некоторых вариантах реализации получение Конъюгирующей молекулы, представленной формулой (321), включает приведение в контакт соединения, представленного формулой (313), с фосфородиамидитом в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания в органическом растворителе и выделение соединения, представленного формулой (321). В данном случае получают соединение, представленное формулой (321), где R4 содержит защитную группу для гидрокси в качестве первой функциональной группы и группу, представленную формулой (C3), в качестве второй функциональной группы.
[124] В некоторых вариантах реализации условия реакции сочетания включают температуру реакции от 0 до 50°C, такую как 15 - 35°C. Молярное соотношение соединения формулы (322) к фосфородиамидиту может составлять от 1:1 до 1:50, например, от 1:5 до 1:15. Молярное соотношение соединения формулы (313) к агенту реакции сочетания может составлять от 1:1 до 1:100, например, от 1:50 до 1:80. Время реакции может составлять 200 - 3000 секунд, предпочтительно 500 - 1500 секунд. Фосфородиамидит может представлять собой, например, 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфородиамидит и может быть доступен для приобретения или его можно получить в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Агент реакции сочетания выбирают из одного или более из 1H-тетразола, 5-этилтио-1H-тетразола и 5-бензилтио-1H-тетразола, такого как 5-этилтио-1H-тетразол. Реакцию сочетания можно вести в органическом растворителе. В некоторых вариантах реализации органический растворитель выбран из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного DMF и безводного дихлорметана, предпочтительно выбирают безводный ацетонитрил. Количество органического растворителя может составлять 3 - 50 л/моль, например, 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (313). Посредством реакции сочетания гидрокси-группа в соединении (313) реагирует с фосфородиамидитом с образованием фосфорамидитной группы. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (321), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[125] В некоторых вариантах реализации способ получения соединения, представленного формулой (321), дополнительно включает: приведение в контакт выделенного продукта с твердофазной подложкой с гидрокси-группами в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания в органическом растворителе, а затем кэпирование, окисление и выделение с получением соединения, представленного формулой (321), где R4 содержит защитную группу для гидрокси в качестве первой функциональной группы и группу, представленную формулой (C3'), в качестве второй функциональной группы.
[126] В некоторых вариантах реализации твердофазная подложка представляет собой подложку, применяемую в твердофазном синтезе нуклеиновых кислот, такую как универсальная твердофазная подложка со снятыми защитными группами, которая доступна для приобретения (такая как подложка для олигонуклеотидного синтеза NittoPhase®HL UnyLinker™ 300, Kinovate Life Sciences, представленная формулой B80):
(B80).
[127] Реакция снятия защитных групп хорошо известна в данной области. В некоторых вариантах реализации условия реакции снятия защитных групп включают температуру от 0 до 50°C, такую как 15 - 35°C, и время реакции от 30 до 300 секунд, такое как 50 - 150 секунд. Агент для снятия защитных групп можно выбрать из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты. В некоторых вариантах реализации агент для снятия защитных групп представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное соотношение агента для снятия защитных групп к защитной группе -DMTr (4,4′-диметокситритил) на твердофазной подложке может составлять от 2:1 до 100:1, например, от 3:1 до 50:1. Путем такого снятия защитных групп получают способные вступать в реакцию свободные гидрокси-группы на поверхности твердофазной подложки, которые, следовательно, доступны для последующей реакции сочетания.
[128] Условия реакции сочетания и агент реакции сочетания можно выбрать, как описано выше. Посредством такого сочетания свободные гидрокси-группы, образовавшиеся в результате снятия защитных групп, реагируют с фосфорамидитными группами с образованием фосфитной эфирной связи.
[129] В некоторых вариантах реализации условия реакции кэпирования включают температуру от 0 до 50°C, такую как 15 - 35°C, и время реакции от 5 до 500 секунд, такое как 10 - 100 секунд. Кэпирующий агент и его количество можно выбрать, как описано выше.
[130] Условия реакции окисления могут включать температуру от 0 до 50°C, такую как 15 - 35°C, и время реакции от 1 до 100 секунд, такое как 5 - 50 секунд. Окислитель может представлять собой, например, йод (в некоторых вариантах реализации предоставлен в виде йодной воды). В некоторых вариантах реализации молярное соотношение окислителя к последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, на этапе сочетания составляет от 1:1 до 100:1, предпочтительно от 5:1 до 50:1. В некоторых вариантах реализации реакцию окисления ведут в смешанном растворителе тетрагидрофуран:вода:пиридин = 3:1:1 - 1:1:3.
[131] В некоторых вариантах реализации R6 представляет собой B7 или B8. В данном случае соединение, представленное формулой (313), можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (314), с соединением, представленным формулой (A-1) или (A-2), в условиях реакции амидирования в присутствии конденсирующего агента для реакции амидирования и третичного амина в органическом растворителе с последующим выделением:
,
Формула (314)
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2 и Rk являются, соответственно, такими, как описано выше.
[132] Условия реакции амидирования могут включать температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 1 до 48 часов. В некоторых вариантах реализации условия реакции амидирования включают температуру реакции от 10 до 40°C и время реакции от 2 до 16 часов.
[133] В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из спиртового растворителя, эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации спиртовой растворитель представляет собой один или более из метанола, этанола и пропанола и в дополнительных вариантах реализации представляет собой этанол. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3 - 50 л/моль и в дополнительных вариантах реализации 3 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (314).
[134] В некоторых вариантах реализации конденсирующий агент для реакции амидирования представляет собой бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат, 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он, 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид, 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ) или O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат и в дополнительных вариантах реализации представляет собой 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он. Молярное соотношение конденсирующего агента для реакции амидирования к соединению, представленному формулой (314), может составлять от 1:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 2,5:1 до 5:1.
[135] В некоторых вариантах реализации третичный амин представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и в дополнительных вариантах реализации представляет собой N,N-диизопропилэтиламин. Молярное соотношение третичного амина к соединению, представленному формулой (314), может составлять от 3:1 до 20:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 5:1 до 10:1.
[136] В некоторых вариантах реализации соединения формул (A-1) и (A-2) можно получить с помощью любых подходящих средств. Например, соединение формулы (A-1) можно получить путем приведения в реакцию глицерата кальция с DMTrCl, где Rk представляет собой группу DMTr. Аналогично, соединение формулы (A-2) можно получить путем сначала приведения в контакт 3-амино-1,2-пропандиола с циклическим ангидридом, который может содержать 4 - 13 атомов углерода и в некоторых вариантах реализации 4 - 8 атомов углерода, а затем приведения в контакт с DMTrCl. Специалисты в данной области легко поймут, что выбор различных циклических ангидридов соответствует различным значениям q2 в соединении формулы (A-2). Например, если циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид, то q2 = 1; если циклический ангидрид представляет собой глутаровый ангидрид, то q2 = 2, и так далее.
[137] В некоторых вариантах реализации соединение формулы (313) также можно получить путем последовательного приведения в реакцию соединения, представленного формулой (314), с циклическим ангидридом, 3-амино-1,2-пропандиолом и DMTrCl. Специалисты в данной области легко поймут, что данные варианты не будут влиять на структуру и функции соединения формулы (313), и данные варианты легко могут получить специалисты в данной области на основе описанных выше способов.
[138] Аналогично, соединение, представленное формулой (313), можно выделить из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (313), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии. Например, для выделения можно использовать следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5 - 1:1:1:0,6; и (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (313), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[139] В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (314), можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (315), с галогенуксусной кислотой в условиях реакции снятия защитных групп в органическом растворителе с последующим выделением:
где R7 выбран из группы, представленной формулой (330), (331), (332) или (333), и в некоторых вариантах реализации R7 имеет структуру, представленную формулой (330):
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 и S1 являются, соответственно, такими, как описано выше.
[140] Галогенуксусную кислоту можно выбрать из одной или более из дихлоруксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, монохлоруксусной кислоты и трифторуксусной кислоты, и в некоторых вариантах реализации она представляет собой дихлоруксусную кислоту.
[141] Условия реакции снятия защитных групп могут включать температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 0,1 до 24 часов, и в некоторых вариантах реализации включают температуру реакции от 10 до 40°C и время реакции от 0,5 до 16 часов.
[142] В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3 - 50 л/моль, и в дополнительных вариантах реализации 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (315).
[143] Молярное соотношение галогенуксусной кислоты к соединению, представленному формулой (315), может составлять от 5:1 до 100:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 10:1 до 50:1.
[144] Аналогично, соединение, представленное формулой (314), можно выделить из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (314), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, используя для выделения следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью дихлорметан:метанол = 100:30 - 100:40; и (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (314), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[145] Соединение, представленное формулой (315), можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (317), с соединением, представленным формулой (316), в условиях реакции конденсации в присутствии конденсирующего агента для реакции амидирования и третичного амина в органическом растворителе с последующим выделением:
Формула (316)
,
Формула (317)
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 и S1 являются, соответственно, такими, как описано выше.
[146] В отношении соединения формулы (316), можно использовать такие соединения, как описанные в J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961. В качестве альтернативы, соединения формулы (316) может получить специалист в данной области с помощью различных способов. Например, некоторые соединения формулы (316) можно получить в соответствии с описанием в примере 1 патента США 8106022 B2, все содержание которого полностью включено в данную заявку посредством ссылки.
[147] В некоторых вариантах реализации условия реакции конденсации включают температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 0,1 до 24 часов. В некоторых вариантах реализации температура реакции составляет 10 - 40°C и время реакции составляет 0,5 - 16 часов.
[148] Молярное соотношение соединения, представленного формулой (316), к соединению, представленному формулой (317), может составлять от 2:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 2,5:1 до 5:1.
[149] В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя может составлять 3 - 50 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (317).
[150] В некоторых вариантах реализации конденсирующий агент для реакции амидирования представляет собой бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат, 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT), O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат или 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид и в дополнительных вариантах реализации может представлять собой 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид. Молярное соотношение конденсирующего агента для реакции амидирования к соединению, представленному формулой (317), может составлять от 2:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 2,5:1 до 5:1.
[151] Третичный амин может представлять собой N-метилморфолин, триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и в некоторых вариантах реализации представляет собой N-метилморфолин. Молярное соотношение третичного амина к соединению, представленному формулой (317), может составлять от 3:1 до 20:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 5:1 до 10:1.
[152] Аналогично, соединение, представленное формулой (315), можно выделить из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (315), выделяют путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, используя для выделения следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью дихлорметан:метанол = 100:5 - 100:7; (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель сразу удаляют с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (315), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[153] В некоторых вариантах реализации соединение формулы (317) вступает в реакцию с достаточным количеством одного соединения формулы (316) в одной партии с получением желательного соединения формулы (315), содержащего идентичные группы S1-L1. В некоторых вариантах реализации соединение формулы (317) вступает в реакцию в партиях с различными соединениями формулы (316), т.е., с соединениями формулы (316), содержащими различные L1 и/или S1, которые необходимы, чтобы получить соединение формулы (315), содержащее два или более типов S1 и/или L1. Например, 1 эквивалент соединения формулы (317) можно сначала привести в контакт с 2 эквивалентами первого соединения формулы (316), чтобы присоединить первые группы S1-L1 к двум концевым группам первичного амина в соединении формулы (317), а затем привести в контакт с (n3+n1-1) эквивалентами второго соединения формулы (316), чтобы присоединить вторые группы S1-L1 к (n3+n1-1) группам вторичного амина (где определение и пределы n3 и n1 такие, как определено выше) в соединении формулы (317).
[154] В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (317), можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (318), с водным раствором метиламина в условиях реакции снятия защитных групп в присутствии органического растворителя с последующим выделением:
,
Формула (318)
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14 и R15, соответственно, такие как описано выше.
[155] Условия реакции снятия защитных групп могут включать температуру реакции от 0 до 150°C и время реакции от 5 до 72 часов и в некоторых вариантах реализации включают температуру реакции от 20 до 80°C и время реакции от 10 до 30 часов.
[156] Органический растворитель можно выбрать из спиртов, в некоторых вариантах реализации он представляет собой один из метанола, этанола и изопропанола и в дополнительных вариантах реализации представляет собой метанол. Количество органического растворителя может составлять 1 - 20 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 1,5 - 10 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (318).
[157] Концентрация водного раствора метиламина может составлять 30% - 40% по массе, и молярное соотношение метиламина к соединению, представленному формулой (318), может составлять от 10:1 до 500:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 50:1 до 200:1.
[158] Аналогично, соединение, представленное формулой (317), можно выделить из реакционной смеси, применяя любые подходящие способы выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (317), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, используя для выделения следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью дихлорметан:метанол:водный аммиак (25 % по массе) = 1:1:0,05 - 1:1:0,25; и (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (317), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[159] Соединение, представленное формулой (318) можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (319), с трифенилхлорметаном (TrCl), дифенилэтилфенилхлорметаном, фенилдиэтилфенилхлорметаном или триэтилфенилхлорметаном и в некоторых вариантах реализации с трифенилхлорметаном (TrCl) в условиях реакции замещения в присутствии органического растворителя, с последующим выделением:
,
Формула (319)
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 и R15, соответственно, такие как описано выше.
[160] Условия реакции замещения могут включать температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 5 до 72 часов и в некоторых вариантах реализации включают температуру реакции от 10 до 40°C и время реакции от 10 до 30 часов.
[161] Трифенилхлорметан (TrCl), дифенилэтилфенилхлорметан, фенилдиэтилфенилхлорметан или триэтилфенилхлорметан доступны для приобретения. Молярное соотношение трифенилхлорметана (TrCl), дифенилэтилфенилхлорметана, фенилдиэтилфенилхлорметана или триэтилфенилхлорметана к соединению, представленному формулой (319), может составлять от 1:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:1 до 3:1.
[162] Органический растворитель может представлять собой один или более из эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя может составлять 3 - 50 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (319).
[163] Аналогично, соединение, представленное формулой (318), можно выделить из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (318), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, используя для выделения следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью метанол:дихлорметан = 0,01:1 - 0,5:1 или градиентным элюированием смесью метанол:дихлорметан:этилацетат:петролейный эфир = 0,1:1:1:1 - 1:1:1:1; и (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (318), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
[164] В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (319), можно получить путем приведения в контакт соединения, представленного формулой (320), с этилтрифторацетатом в условиях реакции замещения в органическом растворителе с последующим выделением:
,
Формула (320)
где определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 и R15, соответственно, такие как описано выше.
[165] В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. В некоторых вариантах реализации эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. В некоторых вариантах реализации эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир и/или метил-трет-бутиловый эфир. В некоторых вариантах реализации галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. В некоторых вариантах реализации органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя может составлять 1 - 50 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 1 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (320).
[166] Условия реакции замещения могут включать температуру реакции от 0 до 100°C и время реакции от 5 до 72 часов и в некоторых вариантах реализации включают температуру реакции от 10 до 40°C и время реакции от 10 до 30 часов.
[167] Соединение, представленное формулой (320), можно приобрести в коммерческом источнике или получить с помощью способов, известных специалисту в данной области. Например, в случае, когда m1 = m2 = m3 = 3, n1 = 1, n3 = 2, тогда как каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 представляет собой H, соединение, представленное формулой (320), доступно от Alfa Aesar Inc.
[168] Молярное соотношение этилтрифторацетата к соединению, представленному формулой (320), может составлять от 2:1 до 10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 3:1 до 5:1.
[169] Аналогично, соединение, представленное формулой (319), можно выделить из реакционной смеси, применяя любые подходящие способы выделения. В некоторых вариантах реализации соединение, представленное формулой (319), можно выделить путем удаления растворителя посредством выпаривания и последующей хроматографии, например, используя для выделения следующие два набора условий хроматографии: (1) нормально-фазовая очистка: силикагелевый наполнитель с размером частиц 200 - 300 меш с градиентным элюированием смесью метанол:дихлорметан = 0,01:1 - 0,5:1 или градиентное элюирование смесью метанол:дихлорметан:этилацетат:петролейный эфир = 0,1:1:1:1 - 1:1:1:1; и (2) обращенно-фазовая очистка: обращенно-фазовые наполнители в колонках C18 и C8 с градиентным элюированием смесью метанол:ацетонитрил = 0,1:1 - 1:0,1. В некоторых вариантах реализации растворитель можно сразу удалить с получением неочищенного продукта соединения, представленного формулой (319), который можно непосредственно использовать в следующих реакциях.
Конъюгат
[170] В другом аспекте, в настоящей заявке предложен конъюгат, имеющий структуру, представленную формулой (1):
Формула (1),
где:
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2, и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, C1-C10 алкила, C1-C10 галогеналкила и C1-C10 алкокси и в некоторых вариантах реализации независимо представляет собой H, метил или этил;
R3 представляет собой активное лекарственное средство, в некоторых вариантах реализации включает функциональный олигонуклеотид;
R2 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 20 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и где R2 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый L1 независимо представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила), и в некоторых вариантах реализации L1 может быть выбран из группы, состоящей из A1 - A26 или любой комбинации перечисленных, причем структуры и определения A1 - A26 представлены выше;
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15 и M1 такие, как определено выше.
[171] В некоторых вариантах реализации R2 представляет собой связывающую группу, образованную путем связывания группы R4 в соединении формулы (321) с активным лекарственным средством в результате реакции. В некоторых вариантах реализации R2 представляет собой связывающую группу, образованную путем связывания группы R4 в соединении формулы (321) с функциональным олигонуклеотидом в результате реакции. В некоторых вариантах реализации группа R2 содержит как сайт, связывающийся с атомом N на азотистом остове, так и сайт, связывающийся с атомом P в R3. В некоторых вариантах реализации в R2, сайт, связывающийся с атомом N на азотистом остове, образует амидную связь с атомом N, и сайт, связывающийся с атомом P в R3, образует фосфоэфирную связь с атомом P. В некоторых вариантах реализации R2 представляет собой B5, B6, B5' или B6':
где представляет собой сайт, в котором группы ковалентно связаны; выбор вариантов и диапазоны q2 описаны выше.
[172] В некоторых вариантах реализации R3 представляет собой группу, имеющую структуру, представленную формулой A59:
где E1 представляет собой OH, SH или BH2 и в некоторых вариантах реализации представляет собой OH или SH; и Nu представляет собой функциональный олигонуклеотид.
[173] В контексте настоящего описания, если не указано иное, «конъюгирующая» группа или молекула относится к группе или молекуле, которая способна образовывать ковалентную связь с подходящим ей партнером, и как конъюгирующая группа или молекула, так и ее партнер обладают определенными функциями. Соответственно, «конъюгат» относится к соединению, образованному ковалентной связью такой химической молекулы с ее партнером. Кроме того, «олигонуклеотидный конъюгат» представляет собой соединение, образованное ковалентно присоединенным олигонуклеотидом и одной или более конъюгирующими молекулами, каждая из которых обладает определенными функциями. В некоторых вариантах реализации конъюгат, описанный в данной заявке, представляет собой олигонуклеотидный конъюгат. В данном контексте «конъюгирующая молекула» может представлять собой определенное соединение, способное конъюгироваться с олигонуклеотидом в результате реакций, таким образом, наконец, образуя олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид представляет собой миРНК, следовательно, олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению представляет собой конъюгат миРНК.
[174] В некоторых вариантах реализации конъюгат имеет структуру, представленную формулой (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21) или (22):
Формула (3)
Формула (4)
Формула (5)
Формула (6)
Формула (7)
Формула (8)
Формула (9)
Формула (10)
Формула (11)
Формула (12)
Формула (13)
Формула (14)
Формула (15)
Формула (16)
Формула (17)
Формула (18)
Формула (19)
Формула (20)
Формула (21)
.
Формула (22)
[175] В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид в олигонуклеотидном конъюгате согласно настоящему описанию представляет собой функциональный олигонуклеотид. Функциональный олигонуклеотид относится к олигонуклеотиду, который способен повышать или снижать экспрессию целевого гена или приводить к альтернативному сплайсингу мРНК, образуя стабильный и специфичный гибрид с целевой последовательностью, используя такие принципы, как РНК-активация (РНКа), РНК-интерференция (РНКи), технология антисмысловых нуклеиновых кислот и технология пропуска экзона. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид также может представлять собой структуру нуклеиновой кислоты, которая осуществляет стабильное и специфическое связывание с целевым белком. Кроме того, специалисты в данной области легко поймут, что полинуклеотид, такой как мРНК как таковая или ее фрагменты, также подходит для образования конъюгата путем конъюгирования с конъюгирующей молекулой, предложенной в настоящем описании, чтобы добиться направленной доставки, такой как направленная доставка в печень, тем самым регулируя экспрессию белка, транслированного с мРНК. Таким образом, в данном контексте, в объем термина «функциональный олигонуклеотид» также может входить мРНК или ее фрагменты.
[176] В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид способен взаимодействовать с целевой последовательностью, тем самым влияя на нормальную функцию молекулы целевой последовательности, например, вызывая разрывы или репрессию трансляции мРНК, или альтернативный сплайсинг мРНК, возникший в результате пропуска экзона, и т.д.. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид комплементарен основаниям в целевой последовательности. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид комплементарен более чем 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% оснований в целевой последовательности, или может быть полностью комплементарен целевой последовательности. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид может содержать 1, 2 или 3 основания, которые не комплементарны целевой последовательности. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид содержит дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и модифицированные нуклеотиды. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечную ДНК, РНК или химеру ДНК-РНК, или двухцепочечную ДНК, РНК или гибрид ДНК-РНК.
[177] По этой причине, в некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид подходящий для олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению, может представлять собой один из: малой интерферирующей РНК (миРНК), микроРНК, анти-микроРНК (антимиР), антагониста микроРНК (антагомир), миметиков микроРНК, олигонуклеотидной ловушки, иммуностимулятора, G-квадруплекса, изменяющей сплайсинг, одноцепочечной РНК (оцРНК), антисмысловой нуклеиновой кислоты, аптамера нуклеиновой кислоты, малой активирующей РНК (маРНК), РНК петля-на-стебле или ДНК. В WO2015/006740A2 описан конъюгат с различными лигандами, конъюгированными с олигонуклеотидом, причем указанные лиганды связаны с олигонуклеотидом линкерами. Олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК (миРНК), микроРНК, анти-микроРНК (антимиР), антагомира, миметиков микроРНК, олигонуклеотидных ловушек (ловушек), иммуностимулятора, G-квадруплекса, изменяющей сплайсинг, одноцепочечной РНК (оцРНК), антисмысловой нуклеиновой кислоты (антисмысловая), аптамера, РНК петля-на-стебле или ДНК. Данные конъюгаты проявляют хорошую стабильность при доставке олигонуклеотидов in vivo. В дополнительных вариантах реализации функциональный олигонуклеотид, подходящий для олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению, представляет собой олигонуклеотиды, описанные в WO2009082607A2, WO2009073809A2 или WO2015006740A2, все из которых полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
[178] Олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению может регулировать аберрантную экспрессию определенных генов в некоторых клетках, таких как гепатоциты, повышая нацеленную на печень доставку активного агента, такого как функциональный олигонуклеотид, и, таким образом, улучшая взаимодействие функционального олигонуклеотида с целевой последовательностью в данных клетках. В некоторых вариантах реализации указанный определенный ген может представлять собой эндогенный ген, экспрессируемый в печени, или патогенный ген, размноженный в печени. Ген, который аберрантно экспрессируется в гепатоцитах, может представлять собой такой ген, как ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV и HCV и т.д. В некоторых вариантах реализации ген, который аберрантно экспрессируется в гепатоцитах, представляет собой ген HBV, ген ANGPTL3 или ген APOC3. В контексте настоящего описания ген HBV относится к гену, имеющему последовательность, представленную под номером доступа в Genbank NC_003977.1; ген ANGPTL3 относится к гену, имеющему последовательность мРНК, представленную под номером доступа в Genbank NM_014495.3; и ген APOC3 относится к гену, имеющему последовательность мРНК, представленную под номером доступа в Genbank NM_000040.1.
[179] В некоторых вариантах реализации «целевая последовательность» представляет собой целевую мРНК. В контексте настоящего описания «целевая мРНК» относится к мРНК, соответствующей гену, который аберрантно экспрессируется в таких клетках как гепатоциты, которая может быть либо мРНК, соответствующей сверхэкспрессируемому гену, либо мРНК, соответствующей недоэкспрессированному гену. В некоторых вариантах реализации целевая мРНК предпочтительно представляет собой мРНК, соответствующую сверхэкспрессируемому гену, поскольку большинство заболеваний возникают в результате сверхэкспрессии мРНК. В некоторых вариантах реализации настоящего описания целевая мРНК, соответствующая приведенному выше аберрантно экспрессируемому гену, может представлять собой мРНК, соответствующую такому гену, как ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV и HCV, и т.д.. В некоторых вариантах реализации целевая мРНК может представлять собой мРНК, транскрибированную с соответствующего гена HBV, гена ANGPTL3 или гена APOC3.
[180] Атом P в формуле A59 может быть связан с любым возможным положением в олигонуклеотидной последовательности, например, с любым нуклеотидом олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид в олигонуклеотидном конъюгате согласно настоящему описанию представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид (например, одноцепочечную РНК или аптамер). В данном случае атом P в формуле A59 может быть связан с концевым участком одноцепочечного олигонуклеотида, который относится к 4 нуклеотидам, наиболее близким к одному концу одноцепочечного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 связан с любым кольцом одноцепочечного олигонуклеотида.
[181] В некоторых вариантах реализации функциональный олигонуклеотид в олигонуклеотидном конъюгате согласно настоящему описанию представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид (например, миРНК, микроРНК или ДНК), содержащий смысловую цепь и антисмысловую цепь. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 может быть связан с концевым участком смысловой цепи или антисмысловой цепи в двухцепочечном олигонуклеотиде, который относится к 4 нуклеотидам, наиболее близким к одному концу смысловой или антисмысловой цепи. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 связан с любым кольцом смысловой или антисмысловой цепи. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 связан с 3'-концом смысловой цепи. В случае, когда атом P в формуле A59 связан с указанным выше положением в смысловой цепи двухцепочечного олигонуклеотида, олигонуклеотидный конъюгат, предложенный в настоящем описании, может высвободить отдельную антисмысловую цепь двухцепочечного олигонуклеотида во время раскручивания после проникновения в клетки, посредством этого блокируя трансляцию целевой мРНК в белок и ингибируя экспрессию определенного гена.
[182] Атом P в формуле A59 может быть связан с любым возможным положением нуклеотида в олигонуклеотидной последовательности, например, с положением 5', 2' или 3' или с основанием нуклеотида. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 может быть связан с положением 2', 3' или 5' нуклеотида в олигонуклеотидной последовательности путем образования фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 связан с атомом кислорода, образовавшимся после депротонирования 3′-гидрокси-группы нуклеотида на 3′-конце смысловой цепи в двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности, или связан с нуклеотидом путем замещения атома водорода в 2'-гидрокси-группе нуклеотида смысловой цепи или путем замещения атома водорода в 5'-гидрокси-группе нуклеотида на 5′-конце смысловой цепи в двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности.
[183] Без ограничения, настоящее изобретение описано в дополнительных деталях в следующих вариантах реализации и примерах в отношении типичных вариантов реализации, в которых функциональный олигонуклеотид в олигонуклеотидном конъюгате согласно настоящему описанию представляет собой малую интерферирующую РНК (миРНК). В данном случае олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению представляет собой конъюгат миРНК. В контексте настоящего описания конъюгаты миРНК в данных вариантах реализации также называют конъюгатами миРНК согласно настоящему изобретению лишь для удобства описания. Не подразумевают, что олигонуклеотид в олигонуклеотидном конъюгате согласно настоящему изобретению может представлять собой только миРНК, напротив, олигонуклеотид и даже активное лекарственное средство могут представлять собой дополнительные альтернативные варианты, описанные в данной заявке или известные специалисту. Предполагается, что, на основании подробного описания конъюгата миРНК, другие активные лекарственные средства или функциональные олигонуклеотиды будут действовать аналогично, когда они конъюгированы с конъюгирующими молекулами, предложенными в данной заявке.
[184] Специалистам в данной области известно, что миРНК содержит нуклеотидные группы в качестве структурных звеньев. Нуклеотидная группа, в свою очередь, содержит фосфатную группу, рибозную группу и основание. Как правило, длина активной миРНК, т.е., функциональной миРНК, может составлять приблизительно 12 - 40 нуклеотидов, и в некоторых вариантах реализации ее длина составляет приблизительно 15 - 30 нуклеотидов. Каждый нуклеотид в миРНК может независимо представлять собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид. Для повышенной стабильности по меньшей мере один нуклеотид в миРНК представляет собой модифицированный нуклеотид.
[185] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что миРНК, описанные в следующих вариантах реализации, проявляют более высокую активность и/или стабильность и, следовательно, их можно использовать в качестве миРНК для целей, описанных в данной заявке.
[186] В некоторых вариантах реализации каждый нуклеотид в миРНК конъюгата миРНК согласно настоящему описанию (далее в данной заявке также называют миРНК согласно настоящему описанию) независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид. Указанная миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем смысловая цепь содержит последовательность нуклеотидов 1, и антисмысловая цепь содержит последовательность нуклеотидов 2. Как последовательность нуклеотидов 1, так и последовательность нуклеотидов 2 имеют длину 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов, и они по меньшей мере частично обратно комплементарны, чтобы образовать двухцепочечный комплементарный участок. Последовательность нуклеотидов 2 комплементарна первому фрагменту последовательности нуклеотидов, который относится к фрагменту последовательности нуклеотидов в целевой мРНК.
[187] В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию относится к миРНК, способной ингибировать по меньшей мере 50% экспрессии гена HBV, по меньшей мере 50% экспрессии гена ANGPTL3 или по меньшей мере 50% экспрессии гена APOC3 при концентрации 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию относится к миРНК, способной ингибировать по меньшей мере 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% экспрессии гена HBV, гена ANGPTL3 или гена APOC3 при концентрации 3 мг/кг.
[188] В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов 1 имеет такую же длину и отличается не более чем 3 нуклеотидами от первого фрагмента последовательности нуклеотидов; последовательность нуклеотидов 2 имеет такую же длину и отличается не более чем 3 нуклеотидами от последовательности нуклеотидов B, которая относится к последовательности нуклеотидов, полностью обратно комплементарной первому фрагменту последовательности нуклеотидов. Без привязки к какой-либо теории, данные особые различия в нуклеотидах не будут значительно снижать репрессирующую способность конъюгата миРНК и, следовательно, входят в объем настоящего описания.
[189] В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов 1 в основном обратно комплементарна, по существу обратно комплементарна или полностью обратно комплементарна последовательности нуклеотидов 2.
[190] В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов 1 содержит не более 1 нуклеотида, отличного от первого фрагмента последовательности нуклеотидов; и/или последовательность нуклеотидов 2 содержит не более 1 нуклеотида, отличного от последовательности нуклеотидов B. В некоторых вариантах реализации различия в нуклеотидах между последовательностью нуклеотидов 2 и последовательностью нуклеотидов B включают различие в положении первого нуклеотида Z' в последовательности нуклеотидов 2 от 5'-конца к 3'-концу. В некоторых вариантах реализации последний нуклеотид Z в последовательности нуклеотидов 1 от 5'-конца к 3'-концу представляет собой нуклеотид, комплементарный Z'.
[191] В некоторых вариантах реализации смысловая цепь также содержит последовательность нуклеотидов 3, и антисмысловая цепь также содержит последовательность нуклеотидов 4. Последовательности нуклеотидов 3 и 4 имеют одинаковую длину 1 - 4 нуклеотида. Последовательность нуклеотидов 3 связана с 5'-концом последовательности нуклеотидов 1, и последовательность нуклеотидов 4 связана с 3'-концом последовательности нуклеотидов 2. Последовательность нуклеотидов 4 комплементарна второму фрагменту последовательности нуклеотидов, который относится к последовательности нуклеотидов, расположенной рядом с первым фрагментом последовательности нуклеотидов и имеющей такую же длину, что и последовательность нуклеотидов 4 в целевой мРНК. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов 3 по существу обратно комплементарна или полностью обратно комплементарна последовательности нуклеотидов 4. Следовательно, в некоторых вариантах реализации смысловая цепь и антисмысловая цепь могут иметь длину 19 - 23 нуклеотидов.
[192] В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию также содержит последовательность нуклеотидов 5, которая имеет длину 1 - 3 нуклеотида и связана с 3'-концом антисмысловой цепи, образуя, таким образом, 3'-липкий конец антисмысловой цепи. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов 5 имеет длину 1 или 2 нуклеотида. Поэтому в некоторых вариантах реализации отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему описанию может составлять 19/20, 19/21, 20/21, 20/22, 21/22, 21/23, 22/23, 22/24, 23/24 или 23/25.
[193] В некоторых вариантах реализации длина последовательности нуклеотидов 5 составляет 2 нуклеотида. Более того, последовательность нуклеотидов 5 представляет собой 2 последовательных дезоксинуклеотида тимидина или 2 последовательных дезоксинуклеотида уридина в направлении от 5'-конца к 3'-концу, или комплементарна третьему фрагменту последовательности нуклеотидов, который относится к последовательности нуклеотидов, расположенной рядом с первым или вторым фрагментом последовательности нуклеотидов в целевой мРНК и имеющей такую же длину, что и последовательность нуклеотидов 5. В некоторых вариантах реализации отношение длины смысловой цепи к антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему описанию составляет 19/21 или 21/23. В данном случае, миРНК согласно настоящему описанию проявляет значительную замалчивающую активность, направленную на мРНК в гепатоцитах.
[194] В некоторых вариантах реализации каждый из нуклеотидов в миРНК согласно настоящему описанию независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию не содержит модифицированных нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию содержит модифицированную нуклеотидную группу.
[195] На сегодняшний день в данной области существует множество средств, которые можно применять для модификации миРНК, включая модификацию остова (или модификацию межнуклеотидной связи, такую как модификация фосфатной группы), модификацию рибозной группы, модификацию оснований и т.д. (см., например, Watts, J.K., G. F. Deleavey и M. J.Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008,13(19-20): стр. 842-55, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки).
[196] В контексте настоящего описания термин «модифицированный нуклеотид», используемый в данной заявке, включает нуклеотид, в котором рибозная группа модифицирована, такой как нуклеотиды, образованные замещением 2'-гидрокси-группы рибозной группы другими группами, аналогом нуклеотида или нуклеотидом с модифицированным основанием.
[197] В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию по меньшей мере один нуклеотид в смысловой или антисмысловой цепи представляет собой модифицированный нуклеотид, и/или по меньшей мере один фосфат представляет собой фосфатную группу с модифицированными группами. Другими словами, по меньшей мере часть фосфатной и/или рибозной группы в рибозофосфатном остове по меньшей мере одной отдельной цепи из смысловой цепи и антисмысловой цепи представляет собой фосфатную и/или рибозную группу с модифицированными группами (или модифицированным фосфатом и/или модифицированной рибозой). В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию все нуклеотиды в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи представляют собой модифицированные нуклеотиды.
[198] В некоторых вариантах реализации каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид или не фтор-модифицированный нуклеотид.
[199] «Модифицированный фтором (фтор-модифицированный) нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному замещением 2'-гидрокси-группы рибозной группы фтором, что представлено в формуле (207).
[200] «Не фтор-модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному в результате замещения 2'-гидрокси-группы рибозной группы не содержащей фтор группой, или аналог нуклеотида. В некоторых вариантах реализации каждый не фтор-модифицированный нуклеотид независимо представляет собой нуклеотид, образованный в результате замещения 2'-гидрокси-группы его рибозной группы не фтор-содержащей группой или аналогом нуклеотида.
[201] Нуклеотид, образованный в результате замещения 2'-гидрокси-группы рибозной группы не-фторсодержащей группой, хорошо известен в данной области, например, модифицированные 2'-алкокси-группой нуклеотиды, модифицированные содержащей заместители 2'-алкокси-группой нуклеотиды, модифицированные 2'-алкилом нуклеотиды, модифицированные содержащим заместители 2'-алкилом нуклеотиды, модифицированные 2'-амином нуклеотиды, модифицированные содержащим заместители 2'-амином нуклеотиды или 2'-дезоксинуклеотиды.
[202] В некоторых вариантах реализации модифицированный 2'-алкокси-группой нуклеотид представляет собой модифицированный метокси-группой нуклеотид, представленный формулой (208). В некоторых вариантах реализации модифицированный замещенной 2'-алкокси-группой нуклеотид представляет собой модифицированный 2'-O-метоксиэтокси-группой нуклеотид, представленный формулой (209). В некоторых вариантах реализации модифицированный 2'-амином нуклеотид представлен формулой (210). В некоторых вариантах реализации 2'-дезоксинуклеотид (ДНК) представлен формулой (211).
[203] «Аналог нуклеотида» относится к группе, которая может заменять нуклеотид в нуклеиновой кислоте, и при этом отличается от рибонуклеотида аденина, рибонуклеотида гуанина, рибонуклеотида цитозина, рибонуклеотида урацила или дезоксирибонуклеотида тимина. В некоторых вариантах реализации аналог нуклеотида может быть таким как изонуклеотид, нуклеотид мостиковой нуклеиновой кислоты (МНК) или ациклический нуклеотид.
[204] Нуклеотид МНК представляет собой нуклеотид, который конформационно ограничен или недоступен. МНК могут содержать мостиковую структуру с 5-, 6-членным или даже 7-членным кольцом с «фиксированным» C3'-эндо отклонением от плоскости сахарного кольца. Мостик обычно находится между положениями 2' и 4' рибозного кольца с образованием 2', 4'-МНК нуклеотида, такого как запертая нуклеиновая кислота (ЗНК), этилен-мостиковая нуклеиновая кислота (ЭНК) и МНК с ограниченным этилом (оЭТ), которые представлены формулами (212), (213) и (214), соответственно.
[205] Ациклический нуклеотид представляет собой нуклеотид, в котором рибозное кольцо разомкнуто, такой как нуклеотид незапертой нуклеиновой кислоты (ННК) и нуклеотид глицериннуклеиновой кислоты (ГНК), которые соответственно представлены формулами (215) и (216).
где R представляет собой H, OH или алкокси (O-алкил).
[206] Изонуклеотид представляет собой нуклеотид, в котором положение основания на рибозном кольце изменяется, например, соединение, в котором основание перемещено с 1' в 2' или 3' на рибозном кольце, представленное соответственно формулами (217) или (218).
где основание представляет собой основание нуклеиновой кислоты A, U, G, C или T; R представляет собой H, OH, F или не фтор-содержащую группу, описанную выше.
[207] В некоторых вариантах реализации аналог нуклеотида представляет собой изонуклеотид, ЗНК, ЭНК, оЭТ, ННК или ГНК. В некоторых вариантах реализации каждый не фтор-модифицированный нуклеотид представляет собой модифицированный метокси-группой нуклеотид, который относится к нуклеотиду, образованному в результате замещения 2'-гидрокси-группы рибозной группы метокси-группой.
[208] В контексте настоящего описания «фтор-модифицированный (модифицированный фтором) нуклеотид», «модифицированный 2'-фтором нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидрокси-группа рибозной группы замещена фтором» и «нуклеотид с 2'-фторрибозилом» имеют те же значения, что и нуклеотид, в котором 2'-гидрокси-группа нуклеотида замещена фтором с образованием структуры, представленной формулой (207). «Модифицированный метокси-группой нуклеотид», «модифицированный 2'-метокси-группой нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидрокси-группа рибозной группы замещен метокси-группой» и «нуклеотид с 2'-метоксирибозилом» имеют те же значения, что и нуклеотид, в котором 2'-гидрокси-группа рибозной группы в нуклеотиде замещен метокси-группой с образованием структуры, представленной формулой (208).
[209] В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию представляет собой миРНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 последовательности нуклеотидов 1 в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором (не фтор-модифицированные) нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой модифицированные метокси-группой нуклеотиды; и/или нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 последовательности нуклеотидов 2 в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные метокси-группой нуклеотиды. В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию представляет собой миРНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 последовательности нуклеотидов 1 в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой модифицированные метокси-группой нуклеотиды; и/или нуклеотиды в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 последовательности нуклеотидов 2 в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные 2'-метокси-группой нуклеотиды. В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию представляет собой миРНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 последовательности нуклеотидов 1 в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой модифицированные метокси-группой нуклеотиды; и/или в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 последовательности нуклеотидов 2 в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные метокси-группой нуклеотиды.
[210] В некоторых вариантах реализации миРНК согласно настоящему описанию, нуклеотид содержит модификации на фосфатных группах. В контексте настоящего описания модификация на фосфатной группе в некоторых вариантах реализации представляет собой фосфоротиоатную модификацию, представленную формулой (201) ниже, то есть замещение немостикового атома кислорода в фосфодиэфирной связи на атом серы таким образом, что фосфодиэфирная связь меняется на фосфоротиоат-диэфирную связь. В некоторых вариантах реализации данная модификация стабилизирует структуру миРНК и сохраняет высокую специфичность и высокую аффинность спаривания оснований.
(201)
[211] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего описания, в миРНК фосфоротиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из следующих положений: между первым и вторым нуклеотидами с любого конца смысловой или антисмысловой цепи, между вторым и третьим нуклеотидами с любого конца смысловой цепи или антисмысловой цепи, или в любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации фосфоротиоатная связь присутствует во всех указанных выше положениях, за исключением 5'-конца смысловой цепи. В некоторых вариантах реализации фосфоротиоатная связь присутствует во всех указанных выше положениях, за исключением 3'-конца смысловой цепи. В некоторых вариантах реализации фосфоротиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из следующих положений:
- между первым и вторым нуклеотидами с 5'-конца смысловой цепи;
- между вторым и третьим нуклеотидами с 5'-конца смысловой цепи;
- между первым и вторым нуклеотидами с 3'-конца смысловой цепи;
- между вторым и третьим нуклеотидами с 3'-конца смысловой цепи;
- между первым и вторым нуклеотидами с 5'-конца антисмысловой цепи;
- между вторым и третьим нуклеотидами с 5'-конца антисмысловой цепи;
- между первым и вторым нуклеотидами с 3'-конца антисмысловой цепи; и
- между вторым и третьим нуклеотидами с 3'-конца антисмысловой цепи.
[212] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего описания, 5'-концевой нуклеотид в последовательности антисмысловой цепи молекулы миРНК представляет собой нуклеотид с 5'-фосфатом или модифицированный аналогом 5'-фосфата нуклеотид.
[213] В некоторых вариантах реализации нуклеотид с 5'-фосфатом имеет следующую структуру, представленную формулой (202):
Обычные типы модифицированных аналогом 5'-фосфата нуклеотидов хорошо известны специалистам в данной области, например, следующие 4 нуклеотида, представленные формулами (203) - (206), описанные в Anastasia Khvorova и Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48:
где R представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из H, OH, F и метокси;
[214] «основание» представляет собой основание, выбранное из A, U, C, G или T.
[215] В некоторых вариантах реализации нуклеотид с 5'-фосфатом или модифицированный аналогом 5'-фосфата нуклеотид представляет собой нуклеотид с модификацией винилфосфатом (VP), представленный формулой (203), нуклеотид с 5'-фосфатом, представленный формулой (202), или модифицированный 5'-фосфоротиоатом нуклеотид, представленный формулой (205).
[216] Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгат миРНК согласно настоящему описанию проявляет значительно улучшенную стабильность в сыворотке, тогда как активность замалчивания целевой мРНК значительно не нарушается, что приводит к превосходному ингибиторному действию in vivo на экспрессию гена. Было показано, что доставка in vivo данных конъюгатов миРНК согласно настоящему описанию более эффективна. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего описания, олигонуклеотидные конъюгаты согласно настоящему описанию, следовательно, представляют собой конъюгаты миРНК, содержащие такие миРНК, которые представлены в таблице 1A - таблице 1F.
Таблица 1. Последовательности миРНК.
Таблица 1A.
Таблица 1B
Таблица 1C
Таблица 1D
Таблица 1E
Таблица 1F
*С: смысловая цепь; АС: антисмысловая цепь
[217] В представленных выше таблицах заглавные буквы C, G, U и A указывают на состав оснований в нуклеотидах; строчная буква m указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве m, представляет собой модифицированный 2'-метокси-группой нуклеотид; строчная буква f указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве f, представляет собой модифицированный 2'-фтором нуклеотид; строчная буква s указывает на фосфоротиоатную связь между двумя нуклеотидами, примыкающими с двух сторон к букве s; P1 указывает на то, что нуклеотид, примыкающий справа к P1, представляет собой нуклеотид с 5'-фосфатом или модифицированный аналогом 5'-фосфата нуклеотид, и в некоторых вариантах реализации представляет собой модифицированный винилфосфатом нуклеотид (обозначен VP в примерах ниже), модифицированный фосфатом нуклеотид (обозначен P в примерах ниже) или модифицированный фосфоротиоатом нуклеотид (обозначен Ps в примерах ниже).
[218] Специалистам в данной области хорошо известно, что модифицированную нуклеотидную группу можно включить в миРНК согласно настоящему описанию посредством мономера нуклеозида с соответствующей модификацией. Способы получения мономера нуклеозида, содержащего соответствующую модификацию, и введения модифицированной нуклеотидной группы в миРНК также хорошо известны специалистам в данной области. Модифицированные мономеры нуклеозида либо доступны для приобретения, либо их можно получить с помощью известных способов.
Получение олигонуклеотидных конъюгатов.
[219] Олигонуклеотидные конъюгаты согласно настоящему описанию можно получить с помощью любых подходящих путей синтеза. Например, олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению можно получить с помощью способа, включающего последовательное соединение мономеров нуклеозида в направлении от 3' к 5' в соответствии с типом нуклеотида и последовательностью олигонуклеотида, соответственно, в условиях твердофазного синтеза фосфорамидита, в котором присоединение каждого мономера нуклеозида включает четырехэтапную реакцию: снятие защитных групп, соединение, кэпирование и окисление или сульфирование. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает приведение в контакт соединения, представленного формулой (321), с мономером нуклеозида или последовательностью нуклеотидов, связанных с твердофазной подложкой, в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания, тем самым связывая соединение, представленное формулой (321), с последовательностью нуклеотидов посредством реакции сочетания.
[220] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает этап снятия защитных групп и отщепление от твердофазной подложки, выделение и очистку.
[221] В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид, и способ получения включает следующие этапы: приведение в контакт соединения, представленного формулой (321), с мономером нуклеозида на 3'-конце смысловой или антисмысловой цепи в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания, тем самым связывая соединение, представленное формулой (321), с первым нуклеотидом в последовательности, последовательное соединение мономеров нуклеозида от 3' к 5', чтобы синтезировать смысловую или антисмысловую цепь двухцепочечного олигонуклеотида, где соединение формулы (321) представляет собой соединение, в котором R4 содержит защищеннуб гидрокси-группу в качестве первой функциональной группы и группу, представленную формулой (C1') или (C3'), в качестве второй функциональной группы, с соединения формулы (321) снимают защиту перед соединением с первым мономером нуклеозида, и указанное присоединение каждого мономера нуклеозида включает четырехэтапную реакцию: снятие защитных групп, соединение, кэпирование и окисление или сульфирование, таким образом получая смысловую или антисмысловую цепь, связанную с конъюгирующей молекулой; последовательное соединение мономеров нуклеозида от 3' к 5', чтобы синтезировать другую цепь двухцепочечного олигонуклеотида, причем присоединение каждого мономера нуклеозида включает четырехэтапную реакцию: снятие защитных групп, соединение, кэпирование и окисление или сульфирование; удаление защитных групп и отщепление от твердофазной подложки; получение смысловой цепи и антисмысловой цепи путем выделения и очистки; и отжиг.
[222] В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид, и способ получения включает следующие этапы: последовательное соединение мономеров нуклеозида от 3' к 5', чтобы синтезировать смысловую цепь и антисмысловую цепь двухцепочечного олигонуклеотида, присоединение каждого мономера нуклеозида включает четырехэтапную реакцию: снятие защитных групп, соединение, кэпирование и окисление или сульфирование, таким образом получая смысловую цепь, связанную с твердофазной подложкой, и антисмысловую цепь, связанную с твердофазной подложкой; приведение в контакт соединения, представленного формулой (321), со смысловой цепью, связанной с твердофазной подложкой, или антисмысловой цепью, связанной с твердофазной подложкой, в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания, тем самым связывая соединение, представленное формулой (321), со смысловой или антисмысловой цепью, где соединение формулы (321) представляет собой соединение, в котором R4 включает фосфорамидитную группу в качестве первой функциональной группы; удаление защитных групп и отщепление от твердофазной подложки, получение смысловой цепи и антисмысловой цепи олигонуклеотида путем выделения и очистки, и отжиг, при этом смысловая или антисмысловая цепь олигонуклеотида связана с конъюгирующей молекулой.
[223] В некоторых вариантах реализации атом P в формуле A59 связан с 3'-концом смысловой цепи в миРНК, и способ получения конъюгата миРНК согласно настоящему описанию включает:
(1) удаление защитной группы Rk в соединении формулы (321), связанном с твердофазной подложкой, как описано выше (далее также называют L-конъюгирующей молекулой, связанной с твердофазной подложкой); приведение в контакт L-конъюгирующей молекулы, связанной с твердофазной подложкой, с мономером нуклеозида с получением мономера нуклеозида, связанного с твердофазной подложкой L-конъюгирующей молекулой, в условиях реакции сочетания в присутствии агента реакции сочетания;
(2) синтез смысловой цепи миРНК от 3' к 5' фосфорамидитным способом твердофазного синтеза, начиная с мономера нуклеозида, связанного с твердофазной подложкой L-конъюгирующей молекулой;
(3) синтез антисмысловой цепи миРНК фосфорамидитным способом твердофазного синтеза; и
(4) выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК и ее отжиг с получением конъюгата миРНК согласно настоящему описанию.
[224] Причем на этапе (1) способ удаления защитной группы Rk с L-конъюгирующей молекулы, связывающей с твердофазной подложкой, включает приведение в контакт соединения формулы (321) с агентом для снятия защитных групп в условиях реакции снятия защитных групп. Условия реакции снятия защитных групп включают температуру от 0 до 50°C, и в некоторых вариантах реализации от 15 до 35°C, и время реакции от 30 до 300 секунд, и в некоторых вариантах реализации от 50 до 150 секунд. Агент для снятия защитных групп можно выбрать из одного или более из следующих: трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты, и в некоторых вариантах реализации он представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное соотношение агента для снятия защитных групп к соединению, представленному формулой (322), может составлять от 10:1 до 1000:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 50:1 до 500:1.
[225] Условия реакции сочетания и агент реакции сочетания могут представлять собой любые условия и агенты, подходящие для описанной выше реакции сочетания. В некоторых вариантах реализации используют те же условие и агент, что и в реакции сочетания в применяемом способе твердофазного синтеза.
[226] В некоторых вариантах реализации условия реакции сочетания включают температуру реакции от 0 до 50°C и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C. Молярное соотношение соединения формулы (321) к мономеру нуклеозида может составлять от 1:1 до 1:50 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:2 до 1:5. Молярное соотношение соединения формулы (322) к агенту реакции сочетания может составлять от 1:1 до 1:50 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:3 до 1:10. Время реакции может составлять 200 - 3000 секунд и в некоторых вариантах реализации составляет 500 - 1500 секунд. Агент реакции сочетания можно выбрать из одного или более из 1H-тетразола, 5-этилтио-1H-тетразола и 5-бензилтио-1H-тетразола, и в некоторых вариантах реализации он представляет собой 5-этилтио-1H-тетразол. Реакцию сочетания можно вести в органическом растворителе. Органический растворитель можно выбрать из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного DMF и безводного дихлорметана, и в некоторых вариантах реализации он представляет собой безводный ацетонитрил. Количество органического растворителя может составлять 3 - 50 л/моль и в некоторых вариантах реализации составляет 5 - 20 л/моль в зависимости от соединения, представленного формулой (321).
[227] На этапе (2) смысловую цепь С конъюгата миРНК синтезируют в направлении от 3' к 5' фосфорамидитным способом твердофазного синтеза, начиная с мономера нуклеозида, связанного с твердофазной подложкой L-конъюгирующей молекулой, полученной на описанных выше этапах. В данном случае L-конъюгирующая молекула связана с 3'-концом полученной в результате этого смысловой цепи.
[228] Другие условия твердофазного синтеза, описанного в этапах (2) и (3), включают условия реакции снятия защитных групп для мономера нуклеозида, тип и количество агента для снятия защитных групп, условия реакции сочетания, тип и количество агента реакции сочетания, условие реакции кэпирования, тип и количество кэпирующего агента, условия реакции окисления, тип и количество окислителя, условия реакции сульфирования и тип и количество сульфирующего агента, различные агенты, количества и условия, обычно применяемые в данной области, используют в настоящем изобретении.
[229] В некоторых вариантах реализации, например, при твердофазном синтезе, описанном в этапах (2) и (3), можно использовать следующие условия.
[230] Условия реакции снятия защитных групп для мономера нуклеозида включают температуру от 0 до 50°C и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C и время реакции от 30 до 300 секунд и в некоторых вариантах реализации 50 - 150 секунд. Агент для снятия защитных групп можно выбрать из одного или более из следующих: трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты, и в некоторых вариантах реализации он представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное соотношение агента для снятия защитных групп к защитной группе 4,4′-диметокситритилу на твердофазной подложке может составлять от 2:1 до 100:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 3:1 до 50:1.
[231] Условия реакции сочетания включают температуру от 0 до 50°C и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C. Молярное соотношение последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, к мономеру нуклеозида может составлять от 1:1 до 1:50 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:5 до 1:15. Молярное соотношение последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, к агенту реакции сочетания может составлять от 1:1 до 1:100 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:50 до 1:80. Время реакции и агент реакции сочетания выбирают, как описано выше.
[232] Условия реакции кэпирования включают температуру от 0 до 50°C, и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C, и время реакции от 5 до 500 секунд, и в некоторых вариантах реализации 10 - 100 секунд. Кэпирующий агент выбирают, как описано выше. Молярное соотношение общего количества кэпирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, может составлять от 1:100 до 100:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 1:10 до 10:1. В случае, когда эквимолярный уксусный ангидрид и N-метилимидазол применяют в качестве кэпирующего агента, молярное соотношение уксусного ангидрида, N-метилимидазола и последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, может составлять 1:1:10 - 10:10:1 и в некоторых вариантах реализации составляет 1:1:2 - 2:2:1.
[233] Условия реакции окисления включают температуру от 0 до 50°C, и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C, и время реакции от 1 до 100 секунд, и в некоторых вариантах реализации 5 - 50 секунд. В некоторых вариантах реализации окислитель представляет собой йод (и в дополнительных вариантах реализации предложен в виде йодной воды). Молярное соотношение окислителя к последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, на этапе сочетания может составлять от 1:1 до 100:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 5:1 до 50:1. В некоторых вариантах реализации реакцию окисления ведут в смешанном растворителе тетрагидрофуран:вода:пиридин = 3:1:1 - 1:1:3. Условия реакции сульфирования включают температуру от 0 до 50°C, и в некоторых вариантах реализации 15 - 35°C, и время реакции от 50 до 2000 секунд, и в некоторых вариантах реализации 100 - 1000 секунд. В некоторых вариантах реализации сульфирующий агент представляет собой гидрид ксантана. Молярное соотношение сульфирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазной подложкой, на этапе сочетания может составлять от 10:1 до 1000:1 и в некоторых вариантах реализации составляет от 10:1 до 500:1. В некоторых вариантах реализации реакцию сульфирования ведут в смешанном растворителе ацетонитрил: пиридин = 1:3 - 3:1.
[234] Согласно способу, предложенному в данной заявке, указанный способ дополнительно включает выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК после соединения всех мономеров нуклеозида и перед отжигом. Способы выделения хорошо известны специалистам в данной области и, как правило, включают удаление синтезированной последовательности нуклеотидов с твердофазной подложки, снятие защитных групп с оснований, фосфатных групп и лигандов и очистку и обессоливание.
[235] Синтезированную последовательность нуклеотидов можно отщепить от твердофазной подложки, и защитные группы на основаниях, фосфатных группах и лигандах удалить, в соответствии с обычными способами расщепления и снятия защитных групп при синтезе миРНК. Например, полученную последовательность нуклеотидов, связанную с твердофазной подложкой, приводят в контакт с концентрированным водным аммиаком; во время снятия защитных групп, защитную группу YCOO- в группах A46 - A54 превращают в гидрокси-группу, таким образом, группы S1 превращают в соответствующие группы M1, получая конъюгат, представленный формулой (1). В данном случае концентрированный водный аммиак может представлять собой водный аммиак при концентрации 25 - 30% по массе. Количество концентрированного водного аммиака может составлять 0,2 мл/мкмоль - 0,8 мл/мкмоль в отношении целевой последовательности миРНК.
[236] Если на синтезированной последовательности нуклеотидов есть по меньшей мере одна защита 2'-TBDMS, то указанный способ дополнительно включает приведение в контакт последовательности нуклеотидов, удаленной с твердофазной подложки, с тригидрофторидом триэтиламина, чтобы удалить защиту 2'-TBDMS. В данном случае, полученная в результате этого последовательность целевой миРНК будет содержать свободную 2'-гидрокси-группу в соответствующем нуклеозиде. Количество чистого тригидрофторида триэтиламина относительно целевой последовательности миРНК может составлять 0,4 мл/мкмоль - 1,0 мл/мкмоль. Таким образом можно получить конъюгат миРНК согласно настоящему описанию.
[237] Способы очистки и обессоливания хорошо известны специалистам в данной области. Например, очистку нуклеиновых кислот можно осуществить, применяя колонку для препаративной очистки с помощью ионообменной хроматографии с элюированием градиентом NaBr или NaCl; после сбора и объединения продукта, можно применять колонку для очистки методом обращенно-фазовой хроматографии для обессоливания.
[238] В процессе синтеза можно определить чистоту и молекулярную массу последовательности нуклеиновой кислоты в любое время, чтобы удобнее было контролировать качество синтеза. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Например, чистоту нуклеиновой кислоты можно определить с помощью ионообменной хроматографии и молекулярную массу можно определить с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС).
[239] Способы отжига также хорошо известны специалистам в данной области. Например, синтезированную смысловую цепь (С цепь) и антисмысловую цепь (АС цепь) можно просто смешать в воде для инъекций в эквимолярных соотношениях, нагреть до 70 - 95°C, а затем охладить при комнатной температуре с образованием двухцепочечной структуры водородными связями. Соответственно, таким образом можно получить конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению.
[240] После получения конъюгата согласно настоящему изобретению, в некоторых вариантах реализации, конъюгат миРНК, синтезированный таким образом, также можно охарактеризовать, применяя такие устройства как устройства для ЖХ/МС с помощью таких средств как средства детектирования молекулярной массы, чтобы подтвердить, что синтезированный конъюгат миРНК представляет собой разработанный целевой конъюгат миРНК и синтезированная последовательность миРНК представляет собой желательную последовательность миРНК, например, представляет собой одну из последовательностей, перечисленных в таблице 1 выше.
Применение конъюгата согласно настоящему изобретению.
[241] В данной заявке описано, что конъюгат можно применять для доставки в клетку некоторого активного агента для лечения или предотвращения заболевания или состояния, при котором может потребоваться такая доставка. Без привязки к какой-либо теории полагают, что пространственная конфигурация конъюгирующей молекулы особенно эффективна для нацеливания на рецептор на поверхности клетки и, следовательно, приведения в контакт нагруженного активного агента с клеткой. В некоторых вариантах реализации такой конъюгат представляет собой олигонуклеотидный конъюгат, нацеленный на гепатоцит.
[242] В некоторых вариантах реализации олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению обладает превосходной специфичностью нацеливания на печень и, следовательно, может эффективно доставлять конъюгированный функциональный олигонуклеотид в печень, за счет этого эффективно регулируя экспрессию определенных генов в гепатоцитах. Следовательно, олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению имеет широкие перспективы применения.
[243] В некоторых вариантах реализации настоящего описания предложено применение олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения патологических состояний или заболеваний, вызванных экспрессией определенных генов в гепатоцитах. Определенный ген может представлять собой эндогенный ген, экспрессированный в печени, или патогенный ген, размножившийся в печени. В некоторых вариантах реализации указанные определенные гены представляют собой такие гены как ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV или HCV. В некоторых вариантах реализации определенный ген представляет собой ген HBV, ген ANGPTL3 или ген APOC3. Соответственно, заболевания выбраны из хронического заболевания печени, гепатита, фиброза печени, пролиферативных заболеваний печени и дислипидемии. В некоторых вариантах реализации дислипидемия представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию или атеросклероз.
[244] В некоторых вариантах реализации настоящего описания предложен способ лечения патологических состояний или заболеваний, вызванных экспрессией определенных генов в гепатоцитах, включающий введение олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах реализации указанные определенные гены представляют собой такие гены как ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV или HCV. В некоторых вариантах реализации определенный ген выбран из гена HBV, гена ANGPTL3 и гена APOC3. Соответственно, заболевания выбраны из хронического заболевания печени, гепатита, фиброза печени, пролиферативных заболеваний печени и дислипидемии. В некоторых вариантах реализации дислипидемия представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию или атеросклероз. В некоторых вариантах реализации конъюгат, предложенный в настоящем описании, также можно применять для лечения других заболеваний печени, включая заболевания, для которых характерна нежелательная пролиферация клеток, болезни крови, метаболические заболевания и заболевания, для которых характерно воспаление. Пролиферативные заболевания печени могут представлять собой доброкачественные или злокачественные заболевания, такие как рак, гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), метастазы в печень или гепатобластома. Гематология печени или воспалительные заболевания могут представлять собой заболевания с вовлечением факторов свертывания крови, комплемент-опосредованного воспаления или фиброза. Метаболические заболевания печени включают дислипидемию и нарушенную регуляцию глюкозы. В некоторых вариантах реализации указанный способ включает введение одного или более олигонуклеотидов, имеющих высокую степень гомологии с последовательностями генов, вовлеченных в заболевания печени.
[245] В некоторых вариантах реализации настоящего описания предложен способ ингибирования экспрессии определенных генов в гепатоцитах, включающий приведение в контакт конъюгата миРНК согласно настоящему описанию с гепатоцитами.
[246] Цели предотвращения и/или лечения патологических состояний или заболеваний, вызванных экспрессией определенных генов в гепатоцитах, можно достичь за счет механизма регуляции экспрессии гена путем введения олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следовательно, олигонуклеотидный конъюгат согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или лечения патологических состояний или заболеваний, описанных в данной заявке, или для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения патологических состояний или заболеваний, описанных в данной заявке.
[247] В данной заявке термин «введение» и его грамматические эквиваленты относятся к доставке конъюгата, такого как олигонуклеотидный конъюгат, в организм субъекта с помощью способа или пути, который по меньшей мере частично локализует конъюгат в желательном месте для получения необходимого эффекта. Подходящие пути введения для способов согласно настоящему описанию включают, но не ограничены топическим введением и системным введением. Обычно топическое введение приводит к доставке большего количества олигонуклеотидных конъюгатов в определенное место по сравнению с системным кровотоком субъекта; тогда как системное введение приводит к доставке олигонуклеотидного конъюгата в системный кровоток пациента. В некоторых вариантах реализации используют способ введения, способный доставлять лекарственные средства в печень, принимая во внимание, что целью настоящего изобретения является предоставление средств для предотвращения и/или лечения патологических состояний или заболеваний, вызванных экспрессией определенных генов в гепатоцитах.
[248] Введение пациенту можно осуществить с помощью любых подходящих путей, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь пероральным и парентеральным путем, таким как внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, трансдермальное введение, внутритрахеальное введение (аэрозоль), введение в легкие, назальное введение, ректальное введение и топическое введение (включая буккальное введение и сублингвальное введение). Частота введения может составлять один или более раз в день, неделю, две недели, месяц или год.
[249] Доза олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению может представлять собой обычную в данной области дозу, которую можно определить в соответствии с различными параметрами, особенно возрастом, массой тела и полом пациента. Токсичность и эффективность можно измерить в культурах клеток или экспериментальных животных с помощью стандартных фармацевтических процедур, например, путем определения LD50 (летальной дозы, которая вызывает смерть 50% популяции) и ED50 (дозы, которая может вызывать 50% интенсивности максимального ответа при количественной оценке ответа, и которая вызывает положительный ответ у 50% у экспериментальных субъектов в рамках качественного ответа). Диапазон дозы для человека можно установить на основании результатов, полученных при анализе культур клеток и исследованиях на животных.
[250] При введении конъюгата согласно настоящему изобретению, например, мышам C57BL/6J или C3H/HeNCrlVr, самцам или самкам в возрасте 6 - 12 недель с массой тела 18 - 25 г, для доставки олигонуклеотидного конъюгата, образованного функциональным олигонуклеотидом и конъюгирующими молекулами, описанными в данной заявке, количество олигонуклеотида для доставки с помощью конъюгата может составлять 0,001 - 100 мг/кг массы тела и в некоторых вариантах реализации составляет 0,01 - 50 мг/кг массы тела, и в дополнительных вариантах реализации составляет 0,05 - 20 мг/кг массы тела, и в еще дополнительных вариантах реализации составляет 0,1 - 15 мг/кг массы тела, и в еще дополнительных вариантах реализации составляет 0,1 - 10 мг/кг массы тела, что рассчитывают по количеству олигонуклеотида в олигонуклеотидном конъюгате. При введении олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению указанные выше количества предпочтительны.
[251] Кроме того, цель ингибирования экспрессии определенных генов в гепатоцитах также может быть достигнута за счет механизма регуляции экспрессии гена путем введения олигонуклеотидного конъюгата согласно настоящему изобретению в гепатоциты с аберрантной экспрессией определенных генов. В некоторых вариантах реализации гепатоциты представляют собой клетки гепатита, и в некоторых вариантах реализации представляют собой клетки HepG2.2.15. В некоторых вариантах реализации гепатоциты можно выбрать из линий клеток гепатомы, таких как Hep3B, HepG2 или Huh7, и выделенных первичных клеток печени, и в некоторых вариантах реализации они представляют собой клетки гепатомы Huh7.
[252] В случае, когда экспрессию определенных генов в гепатоцитах ингибируют применяя способ, предложенный в настоящем описании, количество функционального олигонуклеотида в предложенном олигонуклеотидном конъюгате могут легко определить специалисты в данной области в зависимости от необходимого эффекта. Например, в некоторых вариантах реализации, в которых олигонуклеотидный конъюгат представляет собой конъюгат миРНК, количество миРНК в предложенном конъюгате миРНК представляет собой количество, достаточное для снижения экспрессии целевого гена и приводящее к внеклеточной концентрации, составляющей от 1 пМ до 1 мкМ, или от 0,01 нМ до 100 нМ, или от 0,05 нМ до 50 нМ или от 0,05 нМ до приблизительно 5 нМ. Количество, необходимое для достижения такой локальной концентрации, будет изменяться в зависимости от различных факторов, включая способ доставки, место доставки, количество слоев клеток между местом доставки и целевыми клетками или тканью, путь доставки (топический или системный) и т.д. Концентрация в месте доставки может быть значительно выше, чем таковая на поверхности целевых клеток или ткани.
Полезные действия.
[253] В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, более эффективно доставляют олигонуклеотид in vivo, проявляют более низкую токсичность, лучшую стабильность и/или более высокую активность. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии целевого гена, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена HBV, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена HBV в печени, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена HBV в печени в моделях на животных, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена HBV у людей, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии поверхностного антигена HBV, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 в печени, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 в печени в моделях на животных, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена ANGPTL3 у людей, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена APOC3, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена APOC3 в печени, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена APOC3 в печени в моделях на животных, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, проявляют степень ингибирования экспрессии гена APOC3 у людей, составляющую по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в данной заявке, не оказывают значительного нецелевого действия. Побочное действие может представлять собой, например, ингибирование экспрессии гена, который не является целевым геном. Его считают незначимым, если уровень связывания/ингибирования экспрессии нецелевого гена ниже, чем 50%, 40%, 30%, 20% или 10% от такового для целевого действия.
[254] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего описания, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, эффективно доставляют миРНК в печень, и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена HBV, например, степень ингибирования 87,4% - 92,2% экспрессии гена HBV в печени моделей HBV у мышей при дозе, равной 1 мг/кг, наряду с низким уровнем нецелевого действия. В некоторых вариантах реализации конъюгаты согласно настоящему описанию эффективно снижают экспрессию поверхностного антигена HBV в модели HBV у мышей и достигают степени ингибирования, составляющей 96,9% экспрессии поверхностного антигена HBV, и степени ингибирования, составляющей 95,4% ДНК HBV, при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, оказывают превосходное ингибиторное действие на экспрессию HBV при низких дозах в течение периода, составляющего до 140 дней.
[255] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, эффективно доставляют миРНК в печень и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена HBV, например, степень ингибирования, составляющую по меньшей мере 69,3% или 78,1% - 89,1% экспрессии гена HBV в печени моделей HBV у мышей при дозе, равной 1 мг/кг, наряду с низким уровнем нецелевого действия. В некоторых вариантах реализации конъюгаты согласно настоящему описанию эффективно снижают экспрессию поверхностного антигена HBV в модели HBV у мышей и достигают степени ингибирования, составляющей 98,4% экспрессии поверхностного антигена HBV, и степени ингибирования, составляющей 95,8% ДНК HBV, при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации специфичные конъюгаты, предложенные в настоящем описании, оказывают превосходное ингибиторное действие на экспрессию HBV при низких дозах в течение периода, составляющего до 84 дней, по сравнению с эталонными конъюгатами.
[256] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, эффективно доставляют миРНК в печень и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена HBV, например, степень ингибирования, составляющую по меньшей мере 48,5% или 76,8% - 80,0% экспрессии гена HBV в печени моделей HBV у мышей при дозе, равной 1 мг/кг, наряду с низким уровнем нецелевого действия. В некоторых вариантах реализации конъюгаты согласно настоящему описанию также эффективно снижают экспрессию поверхностного антигена HBV в модели HBV у мышей и достигают степени ингибирования, составляющей 84,6% экспрессии поверхностного антигена HBV, и степени ингибирования, составляющей 85,6% ДНК HBV, даже при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, оказывают большее ингибиторное действие на экспрессию HBV при низких дозах в течение периода 21 день, по сравнению с эталонными конъюгатами.
[257] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, эффективно доставляют миРНК в печень и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена HBV, например, степень ингибирования, составляющую по меньшей мере 60,1% или в некоторых вариантах реализации 80,7% - 84,5% экспрессии участка гена X HBV в печени моделей HBV у мышей при дозе, равной 1 мг/кг, наряду с низким уровнем нецелевого действия. В некоторых вариантах реализации конъюгаты согласно настоящему описанию также эффективно снижают экспрессию поверхностного антигена HBV в модели HBV у мышей и достигают степени ингибирования, составляющей 94,8% экспрессии поверхностного антигена HBV, и степени ингибирования, составляющей 95,8% ДНК HBV, даже при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, оказывают превосходное ингибиторное действие на экспрессию HBV при низких дозах в течение периода, составляющего до 56 дней, по сравнению с эталонными конъюгатами.
[258] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, могут эффективно доставлять миРНК в печень и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена ANGPTL3, например, степень ингибирования, составляющую по меньшей мере 57,3% экспрессии гена ANGPTL3 в печени модельных мышей, получавших корм с высоким содержанием жиров, при дозе, равной 1 мг/кг, и до 90,4% при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, проявляют превосходное ингибирование экспрессии ANGPTL3 и оказывают гиполипидемическое действие при низких дозах и низкой частоте введения в течение периода, составляющего до 49 дней, по сравнению с эталонными конъюгатами.
[259] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, конъюгаты, предложенные в настоящем описании, эффективно доставляют миРНК в печень, и проявляют превосходное свойство ингибирования экспрессии гена APOC3, например, степень ингибирования, составляющую по меньшей мере 75% экспрессии гена APOC3 в печени модельных мышей, получавших корм с высоким содержанием жиров, при дозе, равной 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, оказывают превосходное ингибиторное действие на липиды крови при низких дозах и низкой частоте введения в течение периода, составляющего до 65 дней, по сравнению с эталонными конъюгатами.
[260] В некоторых вариантах реализации конъюгаты, предложенные в настоящем описании, проявляют низкую токсичность в моделях на животных, что свидетельствует о достаточной безопасности. Например, в некоторых вариантах реализации не наблюдают явного токсичного ответа, даже когда конъюгат согласно настоящему изобретению вводят мышам C57BL/6J при концентрации, до 100 раз превышающей эффективную концентрацию (3 мг/кг при эффективной концентрации).
[261] В описанных выше примерах проиллюстрировано, что конъюгаты, предложенные в данной заявке, эффективны для нацеливания на рецепторы на поверхности клетки и доставки нагруженных активных агентов в клетки, экспрессирующие указанные рецепторы. Предусмотрено, что конъюгирующие молекулы могут быть приспособлены для дополнительных рецепторов на поверхности клетки и дополнительных активных агентов для нацеливания активных агентов на клетки, экспрессирующие данные рецепторы.
Набор.
[262] В другом аспекте, в настоящей заявке предложен набор, содержащий описанные выше конъюгаты.
[263] В некоторых вариантах реализации наборы, предложенные в данной заявке, содержат конъюгаты в одном контейнере. В некоторых вариантах реализации наборы, предложенные в данной заявке, содержат контейнер, содержащий фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. В некоторых вариантах реализации наборы, предложенные в данной заявке, дополнительно содержат фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы или консерванты. В некоторых вариантах реализации наборы, предложенные в данной заявке, содержат по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент. В некоторых вариантах реализации наборы содержат по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент в контейнере, отличном от контейнера, содержащего конъюгаты, предложенные в данной заявке. В некоторых вариантах реализации наборы содержат инструкцию по смешиванию указанных конъюгатов с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или другими ингредиентами (если они присутствуют).
[264] В наборе согласно настоящему описанию конъюгаты и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут быть предоставлены в любой форме, например, в жидкой форме, в сухой форме или в лиофилизированной форме. В некоторых вариантах реализации конъюгаты и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества являются по существу чистыми и/или стерильными. В некоторых вариантах реализации в наборах согласно настоящему описанию может быть предоставлена стерильная вода.
Примеры
[265] Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью примеров. Если не указано иное, то все реагенты и культуральные среды, используемые в следующих примерах, доступны для приобретения, и все применяемые манипуляции, такие как электрофорез нуклеиновых кислот и ПЦР в реальном времени проводят в соответствии со способами, описанными в Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
[266] Клетки HEK293A были предоставлены Лабораторией технологии нуклеиновых кислот Института молекулярной медицины (Molecular Medicine Institute) Пекинского университета, и их культивировали в полной среде DMEM (компания Hyclone), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС, компания Hyclone), 0,2% об. цианомицина, с двойной устойчивостью (пенициллин-стрептомицин, Gibco, компания Invitrogen), при 37°C в термостате, содержащем 5% CO2/95% воздуха.
[267] Клетки Huh7 приобретали в Банке стволовых клеток Китайской академии наук и культивировали в полной среде DMEM (компания Hyclone), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ЭБС, компания Hyclone), 1% заменимых аминокислот (NEAA, компания Corning), при 37°C в термостате, содержащем 5% CO2/95% воздуха.
[268] Если не указано иное, липофектаминTM2000 (компания Invitrogen) применяли в качестве реагента трансфекции, когда клетки трансфицировали конъюгатами миРНК, синтезированными в Примерах получения 12 - 15, описанных ниже. Конкретные манипуляции проводили в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем.
[269] Если не указано иное, все соотношения реагентов, представленные ниже, рассчитаны в объемном отношении (об./об.)
[270] Если не указано иное, используемые модели на животных описаны далее.
[271] Мыши C57BL/6J: приобретали в Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
[272] Крысы SD: предоставлены Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
[273] Трансгенных по HBV мышей C57B/6N-Tg (1,28 HBV)/Vst (генотип A) приобретали в Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. Выбирали мышей с COI>104 (ниже для краткости называют 1,28-копийными мышами) перед проведением экспериментов.
[274] Трансгенные по HBV мыши C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J: приобретали в Отделе исследования лабораторных животных, Научный центр здоровья Пекинского университета. Выбирали мышей с S/COV>10 перед проведением экспериментов.
[275] Трансгенные по HBV мыши: назвали M-TgHBV, приобретали в Отделе животных, Центр общественного здравоохранения Шанхая. Способы получения трансгенных мышей описаны у Ren J. и др., в J. Medical Virology. 2006, 78:551-560.
[276] Трансгенные по AAV-HBV мыши: получали в соответствии с описанным в литературе способом (Xiaoyan Dong и др., Chin J Biotech 2010, 25 мая; 26(5): 679−686), применяя вирус rAAV8-1.3HBV, тип D (ayw) (приобретали в Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co. Ltd., 1×1012 вирусный геном (в.г.)/мл, номер партии 2016123011). rAAV8-1.3HBV разбавляли до 5×1011 в.г./мл стерильным ФБР. 200 мкл разбавленного rAAV8-1.3HBV вводили путем инъекции каждой мыши, т.е., 1×1011 в.г. на мышь. Кровь (приблизительно 100 мкл) брали из глазниц всех мышей в День 28 после инъекции вируса, чтобы собрать сыворотку для детектирования ДНК HBsAg и HBV.
[277] Трансгенные мыши с низкой концентрацией AAV-HBV: применяли почти такой же способ получения модели, как описанный выше, различие было в том, что вирус разбавляли до 1×1011 в.г./мл стерильным ФБР перед проведением эксперимента. 100 мкл вируса вводили путем инъекции каждой мыши, т.е., 1×1010 в.г. на мышь.
[278] Мыши BALB/c: возраст 6 - 8 недель, приобретали в Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
[279] Мыши ob/ob: возраст 6 - 8 недель, приобретали в Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.
[280] Трансгенные по APOC3 человека мыши: B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, приобретали в Jackson Lab.
[281] Обезьяна с метаболическим синдромом: все самцы, предоставлены Центром исследований отличных от человека приматов, Институт молекулярной медицины, Пекинский университет.
Пример получения 1. Получение Конъюгирующей молекулы L-9 (Конъюгирующей молекулы 1).
[282] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 1 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой L-9) синтезировали в соответствии со следующим способом.
(1-1) Синтез GAL-5 (молекулы в концевом фрагменте Конъюгирующей молекулы L-9).
(1-1a) Синтез GAL-2.
[283] 100,0 г GAL-1 (N-ацетил-D-галактозамина гидрохлорид, номер в реестре CAS: 1772-03-8, приобретали в Ning Bo hongxiang bio-chem Co., Ltd., 463,8 ммоль) растворяли в 1000 мл безводного пиридина, в который добавляли 540 мл уксусного ангидрида (приобретали в Enox Inc., 5565,6 ммоль) на ледяной бане для проведения реакции в течение 1,5 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор вливали в 10 л ледяной воды и фильтровали с отсасыванием при пониженном давлении. Остаток промывали 2 л ледяной воды, а затем добавляли смешанный растворитель ацетонитрил/толуол (в объемном отношении ацетонитрил: толуол = 1:1) до полного растворения. Растворитель выпаривали с получением 130,0 г продукта GAL-2 в виде белого твердого вещества.
(1-1b) Синтез GAL-3.
[284] GAL-2 (35,1 г, 90,0 ммоль), полученный на этапе (1-1a), растворяли в 213 мл безводного 1,2-дихлорэтана, в который добавляли 24,0 г TMSOTf (CAS №: 27607-77-8, приобретали в Macklin Inc., 108,0 ммоль) на ледяной бане и атмосфере азота для проведения реакции в течение ночи при комнатной температуре.
[285] 400 мл дихлорметана добавляли в реакционный раствор для разбавления, фильтровали с помощью диатомита, а затем добавляли 1 л насыщенного водного раствора бикарбоната натрия в полученный в результате этого реакционный раствор и равномерно перемешивали. Выделяли органическую фазу. Оставшуюся водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 300 мл дихлорэтана, и все органические фазы объединяли и промывали 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу, полученную в результате промывки, выделяли и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 26,9 г продукта GAL-3 в виде светло-желтого вязкого сиропа.
(1-1c) Синтез GAL-4.
[286] GAL-3 (26,9 г, 81,7 ммоль), полученный на этапе (1-1b), растворяли в 136 мл безводного 1,2-дихлорэтана, добавляли к нему 30 г молекулярных сит с размером пор 4Å в виде сухого порошка, а затем 9,0 г 5-гексен-1-ола (CAS №: 821-41-0, приобретали в Adamas-beta Inc., 89,9 ммоль), и перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Добавляли 9,08 мл TMSOTf (40,9 ммоль) на ледяной бане и с защитой азота для проведения реакции в течение ночи при перемешивании при комнатной температуре. Порошок молекулярных сит 4Å удаляли фильтрацией. 300 мл дихлорэтана добавляли в фильтрат для разбавления, фильтровали с помощью диатомита, а затем добавляли 500 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия в полученный в результате этого реакционный раствор и перемешивали в течение 10 минут для промывки. Выделяли органическую фазу. Оставшуюся водную фазу однократно экстрагировали 300 мл дихлорэтана. Все органические фазы объединяли и промывали 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу, полученную в результате промывки, выделяли и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 41,3 г продукта GAL-4 в виде желтого сиропа, который непосредственно использовали в следующей реакции окисления без очистки.
(1-1d) Синтез GAL-5.
[287] GAL-4 (14,9 г, 34,7 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-1c), растворяли в смешанном растворителе 77 мл дихлорметана и 77 мл ацетонитрила, добавляли к нему 103 мл деионизированной воды и 29,7 г периодата натрия (CAS №: 7790-28-5, приобретали в Aladdin Inc., 138,8 ммоль), соответственно, и перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут. Трихлорид рутения (CAS №: 14898-67-0, доступный в Energy Chemical, 238 мг, 1,145 ммоль) добавляли для проведения реакции в течение ночи при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли путем добавления 300 мл воды, перемешивали и подводили pH до приблизительно 7,5 путем добавления насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную органическую фазу отбрасывали. Оставшуюся водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 200 мл дихлорметана, и органическую фазу, полученную в результате экстрагирования, отбрасывали. pH водной фазы, полученной в результате экстрагирования, подводили до приблизительно 3 с помощью твердых частиц лимонной кислоты и экстрагировали три раза, каждый раз 200 мл дихлорметана, и органические фазы объединяли и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 6,85 г продукта GAL-5 в виде белого пенистого твердого вещества.
[288] Конъюгирующую молекулу L-9 синтезировали, применяя соединение GAL-5, полученное в соответствии с описанным выше способом с помощью следующих технологических путей:
(1-2) Синтез M-11-T3:
[289] J-0 (1,883 г, 10 ммоль, приобретали в Alfa Aesar) растворяли в 25 мл ацетонитрила, добавляли к нему триэтиламин (4,048 г, 40 ммоль), и охлаждали до 0°C на ледяной бане. Этилтрифторацетат (5,683 г, 40 ммоль) добавляли для проведения реакции в течение 22 часов при комнатной температуре. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение 18 часов с получением 5,342 г неочищенного твердого продукта M-11-T3, который непосредственно использовали в следующей реакции без дополнительной очистки. Масс-спектрометрия (МС) m/z: C15H22F9N4O3, [M+H]+, рассчитанное: 477,35, измеренное: 477,65.
(1-3) Синтез M-11-T3-Tr:
[290] Неочищенный продукт M-11-T3 (5,342 г, 10 ммоль) растворяли в 50 мл дихлорметана. В полученный в результате этого реакционный раствор добавляли TrCl (3,345 г, 12 ммоль) и триэтиламин (1,518 г, 15 ммоль) для проведения реакции в течение 20 часов при перемешивании при комнатной температуре. Реакционный раствор промывали дважды 20 мл насыщенного бикарбоната натрия и один раз 20 мл насыщенного рассола. Органическую фазу сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи с получением 7,763 г неочищенного твердого продукта M-11-T3-Tr. МС m/z: C34H36F9N4O3, [M+Na]+, рассчитанное: 741,25, измеренное: 741,53. Неочищенный твердый продукт M-11-T3-Tr затем использовали на следующем этапе для синтеза M-18-Tr без очистки.
(1-4) Синтез M-18-Tr.
[291] Неочищенный продукт M-11-T3-Tr (7,763 г, 10 ммоль), полученный на этапе (1-3), растворяли в 100 мл метанола, и добавляли к нему 100 мл водного раствора метиламина (40% по массе) для проведения реакции в течение 23 часов при перемешивании при 50°C. Нерастворимые частицы удаляли фильтрацией. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и в остаток добавляли 200 мл смешанного растворителя дихлорметан (ДХМ):метанол в объемном отношении 1:1, промывали 50 мл насыщенного бикарбоната натрия. Полученную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 50 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи и очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол:водный аммиак (25 % по массе) = 1:1:0,05 - 1:1:0,25. Элюат собирали, растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением 2,887 г чистого продукта M-18-Tr. Ядерный магнитный резонанс на ядрах 1H (1H ЯМР) (400 МГц, ДМСО) δ 7,47 - 7,39 (m, 6H), 7,32 -7,24 (m, 6H), 7,19 - 7,12 (m, 3H), 2,60 - 2,47 (m, 4H), 2,46 - 2,19 (m, 13H), 1,70 - 1,55 (m, 4H), 1,40 (p, J = 6,8 Гц, 2H). МС m/z: C28H39N4, [M+H]+, рассчитанное: 431,65, измеренное: 432,61.
(1-5) Синтез L-5-Tr:
[292] M-18-Tr (2,02 г, 4,69 ммоль), полученный на этапе (1-4), и GAL-5 (6,93 г, 15,48 ммоль), полученный на этапе (1-1), смешивали и растворяли в 47 мл ацетонитрила и добавляли к ним N-метилморфолин (3,13 г, 30,96 ммоль) и 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид (DMTMM, 4,28 г, 15,48 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли 200 мл дихлорметана, промывали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 100 мл насыщенного рассола, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Затем растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:5 - 100:7. Элюат собирали и растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 7,49 г чистого продукта L-5-Tr. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,83 - 7,10 (m, 4H), 7,67 - 7,60 (m, 1H), 7,44 - 7,34 (m, 6H), 7,33 - 7,24 (m, 6H), 7,20 - 7,15 (m, 3H), 5,22 (s, 3H), 4,97 (d, J = 11,3 Гц, 3H), 4,49 (d, J = 8,4 Гц, 3H), 4,06 - 3,07 (m, 9H),3,95 - 3,83 (m, 3H), 3,77 - 3,64 (m, 3H), 3,45 - 3,35 (m, 3H), 3,12 - 2,87 (m, 8H), 2,30 - 2,15 (m, 3H), 2,11 - 1,98 (m, 22H), 1,95 - 1,84 (m, 11H), 1,81 - 1,61 (m, 14H), 1,54 - 1,36 (m, 14H). МС m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, рассчитанное: 1718,81, измеренное: 1718,03.
(1-6) Синтез L-8:
[293] L-5-Tr (5,94 г, 3,456 ммоль), полученный на этапе (1-5), растворяли в 69 мл дихлорметана и добавляли к нему дихлоруксусную кислоту (13,367 г, 103,67 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли путем добавления 100 мл дихлорметана, промывали и подводили pH до 7 - 8 с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали шесть раз, каждый раз 30 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Затем растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, добавляя 10% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали 1‰ (по массе) триэтиламина и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:30 - 100:40. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 4,26 г чистого продукта L-8. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,84 (d, J = 9,0 Гц, 3H), 7,27 - 7,23 (m, 1H), 7,13 - 7,18 (m, 1H), 5,22 (d, J = 3,1 Гц, 3H), 4,97 (dd, J = 11,3, 3,1 Гц, 3H), 4,48 (d, J = 8,4 Гц, 3H), 4,09 - 3,98 (m, 9H), 3,88 (dd, J = 19,3, 9,3 Гц, 3H), 3,75 - 3,66 (m, 3H), 3,44 - 3,38 (m, 3H), 3,17 - 3,30 (m, 4H), 3,10 - 2,97 (m, 4H), 2,35 - 2,20 (m, 6H), 2,15 - 2,08 (m, 9H), 2,07 - 1,98 (m, 13H), 1,94 - 1,87 (m, 9H), 1,81 - 1,74 (m, 9H), 1,65 - 1,42 (m, 18H). МС m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, рассчитанное: 1477,59, измеренное: 1477,23.
(1-7a) Синтез A-1.
[294] DMTrCl (4,4'-диметокситритилхлорид, 38,12 г, 112,5 ммоль) растворяли в 450 мл безводного пиридина (Py) и добавляли к нему кальция DL-глицерат гидрат (12,88 г, 45,0 ммоль) для проведения реакции в течение 22 часов при 45°C. Полученный в результате этого реакционный раствор фильтровали. Остаток промывали 200 мл ДХМ, и фильтрат концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 500 мл дихлорметана и промывали дважды, каждый раз 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина (pH = 7 - 8). Выделенную водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 200 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:метанол = 1:1:1:0,35 - 1:1:1:0,55. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 500 мл дихлорметана и однократно промывали 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 200 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток при пониженном давлении с помощью вакуумного масляного насоса досуха в течение ночи с получением 20,7 г продукта A-1 в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,46 (ddd, J = 6,5, 2,3, 1,1 Гц, 1H), 7,40 - 7,28 (m, 7H), 6,89 - 6,81 (m, 4H), 4,84 (d, J = 5,0 Гц, 1H), 4,36 - 4,24 (m, 1H), 4,29 (s, 6H), 3,92 (dd, J = 12,4, 7,0 Гц, 1H), 3,67 (dd, J = 12,3, 7,0 Гц, 1H), 2,52 (q, J = 6,3 Гц, 6H), 1,03 (t, J = 6,3 Гц, 9H). МС m/z: C24H23O6, [M-H]-, рассчитанное: 407,15, измеренное: 406,92.
(1-7b) Синтез L-7.
[295] L-8 (2,262 г, 1,532 ммоль), полученный на этапе (1-6), и A-1 (2,342 г, 4,596 ммоль), полученный на этапе (1-7a), смешивали и растворяли в 16 мл дихлорметана, добавляли к нему 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 1,375 г, 4,596 ммоль) и дополнительно добавляли диизопропилэтиламин (1,188 г, 9,191 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при 25°C, промывали 10 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и промывали 10 мл насыщенного рассола, и выделенную водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 10 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток сушили во вспененном состоянии в течение ночи с помощью вакуумного масляного насоса с получением 4,900 г неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 120 г, с 20 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром, содержащим 1% по массе триэтиламина, и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5 - 1:1:1:0,6. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 2,336 г чистого продукта L-7. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,90 - 7,78 (m, 4H), 7,75 - 7,64 (m, 1H), 7,38 - 7,18 (m, 9H), 6,91 - 6,83 (m, 4H), 5,25 - 5,10 (m, 4H), 4,97 (dd, J = 11,2, 3,2 Гц, 3H), 4,48 - 4,30 (m, 4H), 4,02 (s, 9H), 3,93 - 3,84 (m, 3H), 3,76 - 3,66 (m, 9H), 3,45 - 3,35 (m, 3H), 3,24 - 2,98 (m, 10H), 2,30 - 2,20 (m, 2H), 2,11 - 1,88 (m, 31H), 1,80 - 1,40 (m, 28H). МС m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, рассчитанное: 1564,65, измеренное: 1564,88.
(1-8) Синтез L-9:
[296] L-7 (2,300 г, 1,26 ммоль), полученный на этапе (1-7b), янтарный ангидрид (0,378 г, 3,78 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 0,462 г, 3,78 ммоль) смешивали и растворяли в 13 мл дихлорметана, дополнительно добавляли к нему DIPEA (0,814 г, 6,30 ммоль), и перемешивали в течение 24 часов при 25°C. Полученный в результате этого реакционный раствор промывали 5 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 5 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением 2,774 г неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 60 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламин:метанол = 100:18 - 100:20. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,874 г чистого продукта конъюгирующей молекулы L-9 (Конъюгирующей молекулы 1). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 8,58 (d, J = 4,2 Гц, 1H), 7,94 - 7,82 (m, 3H), 7,41 - 7,29 (m, 5H), 7,22 (d, J = 8,1 Гц, 5H), 6,89 (d, J = 8,3 Гц, 4H), 5,49 - 5,37 (m, 1H), 5,21 (d, J = 3,0 Гц, 3H), 4,97 (d, J = 11,1 Гц, 3H), 4,49 (d, J = 8,2 Гц, 3H), 4,02 (s, 9H), 3,88 (dd, J = 19,4, 9,4 Гц, 3H), 3,77 - 3,65 (m, 9H), 3,50 - 3,39 (m, 6H), 3,11 - 2,90 (m, 5H), 2,61 - 2,54 (m, 4H), 2,47 - 2,41 (m, 2H), 2,26 - 2,17 (m, 2H), 2,15 - 1,95 (m, 22H), 1,92 - 1,84 (m, 9H), 1,80 - 1,70 (m, 10H), 1,65 - 1,35 (m, 17H), 1,31 - 1,19 (m, 4H), 0,96 (t, J = 7,1 Гц, 9H). МС m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, рассчитанное: 1664,72, измеренное: 1655,03. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы L-9 представлена формулой (503).
Пример получения 2. Получение Конъюгирующей молекулы P-9 (Конъюгирующей молекулы 2).
[297] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 2 (далее в данной заявке также называемую Конъюгирующей молекулой P-9) синтезировали в соответствии со следующим способом:
(2-1) Синтез GAL5-C4-1.
[298] GAL-5 (13,43 г, 30,0 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным выше в (1-1), трет-бутил-4-аминобутирата гидрохлорид (5,87 г, 30,0 ммоль), O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат (13,65 г, 36,0 ммоль) и диизопропилэтиламин (11,63 г, 90,0 ммоль) добавляли в 40 мл N,N-диметилформамида, растворяли до однородности, а затем перемешивали при комнатной температуре для проведения реакции в течение 5 часов. 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия добавляли в полученный в результате этого реакционный раствор. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 200 мл этилацетата. Все органические фазы объединяли и однократно промывали 200 мл насыщенного рассола. Органические фазы, полученные в результате промывки, выделяли и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении досуха с получением 30,3 г неочищенного продукта GAL5-C4-1 в виде масла, которое непосредственно использовали в следующей реакции.
(2-2) Синтез GAL5-C4-2.
[299] Неочищенный продукт GAL5-C4-1 (30,3 г, 30 ммоль), полученный на этапе (2-1), растворяли в 180 мл муравьиной кислоты и перемешивали при комнатной температуре для проведения реакции в течение 16 часов. Растворитель выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол = 100:18 - 100:20). Элюат собирали и концентрировали, чтобы удалить растворители, с получением всего 14,84 г целевого продукта GAL5-C4-2.
(2-3) Синтез P-6.
[300] M-18-Tr (2,02 г, 4,69 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-4), и GAL5-C4-2 (8,24 г, 15,48 ммоль), полученный на этапе (2-2), смешивали и растворяли в 47 мл ацетонитрила, добавляли к нему N-метилморфолин (3,13 г, 30,96 ммоль), а затем 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид (DMTMM, 4,28 г, 15,48 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли 200 мл дихлорметана. Полученную в результате органическую фазу промывали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 100 мл насыщенного рассола, соответственно. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:5 - 100:7. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением всего 8,27 г чистого продукта P-6.
(2-4) Синтез P-7.
[301] P-6 (6,82 г, 3,456 ммоль), полученный в (2-3) выше, растворяли в 69 мл дихлорметана, и добавляли к нему дихлоруксусную кислоту (13,367 г, 103,67 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли путем добавления 100 мл дихлорметана, промывали и подводили pH до 7 - 8 с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали шесть раз, каждый раз 30 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Затем растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, с 10% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали 1‰ (по массе) триэтиламина и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:30 - 100:40. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением всего 4,82 г P-7. МС m/z: C78H127N10O33, [M+H]+, рассчитанное: 1732,91, измеренное: 1735,73.
(2-5) Синтез P-8.
(A-1)
[302] P-7 (2,653 г, 1,532 ммоль) и A-1 (2,342 г, 4,596 ммоль) смешивали и растворяли в 16 мл дихлорметана, и добавляли к нему 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотриазол 4(3H)-он (DEPBT) (1,375 г, 4,596 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (1,188 г, 9,191 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при 25°C, промывали 10 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и промывали 10 мл насыщенного рассола. Выделенную водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 10 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток сушили во вспененном состоянии в течение ночи с помощью вакуумного масляного насоса с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 120 г, с 20 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром, содержащим 1% по массе триэтиламина, и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5 - 1:1:1:0,6. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением всего 2,793 г чистого продукта P-8.
(2-6) Синтез P-9.
[303] P-8 (490 мг, 0,231 ммоль), янтарный ангидрид (69 мг, 0,693 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 68 мг, 0,554 ммоль) смешивали и растворяли в 2,3 мл дихлорметана, и добавляли к ним диизопропилэтиламин (DIPEA, 149 мг, 1,155 ммоль) для проведения реакции в течение 21 часа при перемешивании при 25°C. 50 мл дихлорметана добавляли в полученный в результате этого реакционный раствор для разбавления, а затем промывали 100 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 80 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламина:метанол = 100:18 - 100:20. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением всего 200 мг чистого продукта - Конъюгирующей молекулы P-9 (Конъюгирующей молекулы 2). МС m/z: C106H153N10O41, [M-DMTr]+, рассчитанное: 1921,05, измеренное: 1920,97. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы P-9 представлена формулой (504).
Пример получения 3. Получение Конъюгирующей молекулы R-4 (Конъюгирующей молекулы 3).
[304] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 3 (далее в данной заявке также называемую Конъюгирующей молекулой R-4) синтезировали в соответствии со следующим способом:
(3-1) Синтез GAL-C7-1.
[305] GAL-3 (26,4 г, 80,2 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-1b), растворяли в 134 мл безводного 1,2-дихлорэтана и добавляли 60 г молекулярных сит 4Å в виде порошка, а затем 7-октен-1-ол (11,3 г, 88,2 ммоль) для проведения реакции в течение 10 минут при перемешивании при комнатной температуре. Добавляли триметилсилил трифторметансульфонат (TMSOTf, 8,9 г, 40,1 ммоль) на ледяной бане и с защитой азота для проведения реакции в течение 24 часов при перемешивании при комнатной температуре. Порошок молекулярных сит 4Å удаляли фильтрацией. 500 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия добавляли в фильтрат для промывки. Выделяли органическую фазу. Оставшуюся водную фазу однократно экстрагировали 100 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и однократно промывали 250 мл насыщенного рассола. Органическую фазу, полученную в результате промывки, сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении досуха с получением 33,3 г продукта GAL-C7-1 в виде желтого сиропа, который непосредственно использовали в следующей реакции окисления без очистки.
(3-2) Синтез GAL-C7-2.
[306] GAL-C7-1 (33,3 г, 72,8 ммоль), полученный на этапе (3-1), растворяли в смешанном растворителе 160 мл дихлорметана и 160 мл ацетонитрила, добавляли 216 мл воды и твердый периодат натрия (62,3 г, 291,2 ммоль), соответственно, перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут, и добавляли катализатор трихлорид рутения (498 мг, 2,4 ммоль). Реакционная смесь естественным образом нагревалась до комнатной температуры, и ее перемешивали в течение 23 часов. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли путем добавления 200 мл воды, перемешивали и подводили pH до 7,5 путем добавления насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную органическую фазу отбрасывали. Оставшуюся водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз дихлорметаном. Органические фазы, полученные в результате экстрагирования, отбрасывали. pH водной фазы, полученной в результате экстрагирования, подводили до приблизительно 3 с помощью твердой лимонной кислоты, экстрагировали три раза, каждый раз 200 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол = 100:18 - 100:20) с получением 22,4 г продукта GAL-C7-2 в виде белого пенистого твердого вещества. МС m/z: C21H32NO11, [M+H]+, рассчитанное: 476,50, измеренное: 475,94.
(3-3) Синтез R-1.
[307] M-18-Tr (2,02 г, 4,69 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-4), и GAL-C7-2 (7,36 г, 15,48 ммоль) смешивали и растворяли в 47 мл ацетонитрила, добавляли N-метилморфолин (3,13 г, 30,96 ммоль), а затем 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид (DMTMM, 4,28 г, 15,48 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли 200 мл дихлорметана. Полученную в результате органическую фазу промывали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 100 мл насыщенного рассола, соответственно. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:5 - 100:7. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 7,82 г чистого продукта R-1.
(3-4) Синтез R-2.
[308] R-1 (6,23 г, 3,456 ммоль) растворяли в 69 мл дихлорметана, и добавляли к нему дихлоруксусную кислоту (13,367 г, 103,67 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный в результате этого реакционный раствор разбавляли путем добавления 100 мл дихлорметана, промывали и подводили pH до 7 - 8 с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали шесть раз, каждый раз 30 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Затем растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, с 10% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали 1‰ (по массе) триэтиламина и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:30 - 100:40. Растворитель элюата выпаривали при пониженном давлении с получением 4,49 г чистого продукта R-2.
(3-5) Синтез R-3.
[309] R-2 (2,391 г, 1,532 ммоль) и A-1 (2,342 г, 4,596 ммоль) смешивали и растворяли в 16 мл дихлорметана, и добавляли 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 1,375 г, 4,596 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (1,188 г, 9,191 ммоль) для проведения реакции в течение 2 часов при перемешивании при 25°C, промывали 10 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и промывали 10 мл насыщенного рассола. Выделенную водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз 10 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток сушили во вспененном состоянии в течение ночи с помощью вакуумного масляного насоса с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 120 г, с 20 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром, содержащим 1% по массе триэтиламина, и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5 - 1:1:1:0,6. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 2,642 г чистого продукта R-3.
(3-6) Синтез R-4.
[310] R-3 (795 мг, 0,4074 ммоль), янтарный ангидрид (82 мг, 0,8148 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 100 мг, 0,8148 ммоль) смешивали и растворяли в 4 мл дихлорметана, и добавляли диизопропилэтиламин (DIPEA, 100 мг, 0,8148 ммоль) для проведения реакции в течение 18 часов при перемешивании при 25°C. Полученный в результате этого реакционный раствор промывали 5 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 5 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 30 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламина:метанол = 100:18 - 100:20. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 505 мг чистого продукта - Конъюгирующей молекулы R-4 (Конъюгирующей молекулы 3). Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы R-4 представлена формулой (507).
Пример получения 4. Получение Конъюгирующей молекулы LA-4 (Конъюгирующей молекулы 4)
[311] Ожидается, что Конъюгирующую молекулу 4 (далее в данной заявке также называемую Конъюгирующей молекулой LA-4) можно синтезировать в соответствии со следующим технологическим путем. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы LA-4 представлена формулой (512).
[312] Конъюгирующая молекула.
Пример получения 5. Получение Конъюгирующей молекулы LB-4 (Конъюгирующей молекулы 5).
[313] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 5 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой LB-4) синтезировали в соответствии со следующим способом:
(5-1) Синтез LB-1.
[314] L-8 (5,0 г, 3,386 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-6), адипиновый ангидрид (870 мг, 6,772 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 827 мг, 6,772 ммоль) смешивали и растворяли в 130 мл дихлорметана, и добавляли к нему диизопропилэтиламин (DIPEA, 2,2 г, 16,931 ммоль) для проведения реакции в течение 4 часов при перемешивании при 25°C. 70 мл дихлорметана добавляли в полученный в результате этого реакционный раствор для разбавления, а затем промывали 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали четыре раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 120 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:метанол = 1:1:1:0,2 - 1:1:1:1. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 4,267 г чистого продукта LB-1.
(5-2) Синтез LB-2.
[315] LB-1 (4,697 г, 2,753 ммоль, объединение 2 партий), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (5-1), 3-амино-1,2-пропандиол (313 мг, 3,442 ммоль) 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина гидрохлорид (DMTMM, 953 мг, 3,442 ммоль) и N-метилморфолин (700 мг, 6,884ммоль) последовательно добавляли в смесь 30 мл ацетонитрила и 3 мл метанола для проведения реакции в течение ночи при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную смесь переносили в масляную баню при 60°C и перемешивали в течение 18 часов. Растворитель выпаривали досуха и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол = 1:0,07 - 1:0,5). Элюат собирали и концентрировали, чтобы удалить растворители, с получением 3,27 г целевого продукта LB-2.
(5-3) Синтез LB-3.
[316] LB-2 (2,27 г, 1,353 ммоль) растворяли в 14 мл безводного пиридина и добавляли к нему 4,4'-диметокситритилхлорид (688 мг, 2,03 ммоль) для проведения реакции в течение ночи при перемешивании при комнатной температуре. Реакцию гасили добавлением 150 мл метанола. Растворитель выпаривали досуха и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол = 1:0,05 - 1:0,2). Элюат собирали и концентрировали, чтобы удалить растворители, с получением 1,647 г целевого продукта LB-3.
(5-4) Синтез LB-4.
[317] LB-3 (822 мг, 0,415 ммоль), янтарный ангидрид (83 г, 0,83 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 102 мг, 0,83 ммоль) смешивали и растворяли в 4 мл дихлорметана, добавляли к нему DIPEA (270 мг, 2,075 ммоль) и перемешивали при 25°C для проведения реакции в течение ночи. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь трижды промывали 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 2 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с 5 % по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламин:метанол = 100:5 - 100:20. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 787 мг чистого продукта - Конъюгирующей молекулы LB-4 (Конъюгирующей молекулы 5). Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы LB-4 представлена формулой (513).
Пример получения 6. Синтез Конъюгирующей молекулы V-7 (Конъюгирующей молекулы 6).
[318] Ожидается, что Конъюгирующую молекулу 6 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой V-7) можно синтезировать в соответствии со следующим технологическим путем. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы V-7 представлена формулой (514). Конъюгирующая молекула.
[319] Конъюгирующая молекула.
Пример получения 7. Получение Конъюгирующей молекулы W-7 (Конъюгирующей молекулы 7).
[320] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 7 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой W-7) синтезировали в соответствии со следующим способом.
(7-1) Синтез W-1.
[321] W-0 (2,024 г, 10 ммоль) растворяли в 25 мл ацетонитрила, добавляли к нему триэтиламин (4,048 г, 40 ммоль) и охлаждали до приблизительно 0°C на ледяной бане. Этилтрифторацетат (5,683 г, 40 ммоль) добавляли для проведения реакции в течение 22 часов при комнатной температуре. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение 18 часов с получением 5,835 г неочищенного твердого продукта W-1.
(7-2) Синтез W-2.
[322] Неочищенный продукт W-1 (5,835 г, 10 ммоль) растворяли в 50 мл дихлорметана. TrCl (3,345 г, 12 ммоль) и триэтиламин (1,518 г, 15 ммоль) добавляли для проведения реакции в течение 20 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь промывали дважды 20 мл насыщенного бикарбоната натрия и один раз 20 мл насыщенного рассола. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Органический растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи с получением 8,012 г неочищенного твердого продукта W-2. Неочищенный твердый продукт W-2 использовали в следующей реакции снятия защитных групп без обработки.
(7-3) Синтез W-3.
[323] Неочищенный продукт W-2 (8,012 г, 10 ммоль) растворяли в 100 мл метанола и добавляли к нему 100 мл водного раствора метиламина (40% по массе) для проведения реакции в течение 23 часов при перемешивании при 50°C. Нерастворимые частицы удаляли из реакционной смеси фильтрацией. Растворитель выпаривали при пониженном давлении. К остатку добавляли 200 мл смешанного растворителя ДХМ: метанол в объемном отношении 1:1, и полученную в результате органическую фазу промывали 50 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 50 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи и очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол:водный аммиак (25 % по массе) = 1:1:0,05 - 1:1:0,25. Элюат собирали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением 3,062 г чистого продукта W-3.
(7-4) Синтез W-4.
[324] W-3 (675 мг, 1,517 ммоль) и GAL-C7-2 (2,60 г, 5,46 ммоль) смешивали и растворяли в 47 мл ацетонитрила, добавляли диизопропилэтиламин (1,57 г, 12,14 ммоль), а затем 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 1,816 г, 6,04 ммоль) для проведения реакции в течение 2,5 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь разбавляли 100 мл дихлорметана. Полученную органическую фазу промывали 80 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 80 мл насыщенного рассола, соответственно. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:5 - 100:7. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,610 г чистого продукта W-4.
(7-5) Синтез W-5.
[325] W-4 (1,61 г, 0,886 ммоль) растворяли в 125 мл дихлорметана и добавляли дихлоруксусную кислоту (3,5 мл, 42,43 ммоль) для проведения реакции в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь нейтрализовали путем добавления 150 мл пиридина. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, с 10% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали 1‰ (по массе) триэтиламина и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 100:30 - 100:40. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,26 г чистого продукта W-5.
(7-6) Синтез W-6.
[326] W-5 (1,25 г, 0,793 ммоль) и A-1 (1,21 г, 2,38 ммоль), полученные в соответствии со способом, описанным на этапе (1-7a), смешивали и растворяли в 12 мл дихлорметана, и добавляли к ним 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 0,712 г, 2,38 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (0,615 г, 4,76 ммоль) для проведения реакции в течение 3 часов при перемешивании при 25°C, и промывали 80 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и промывали 10 мл насыщенного рассола. Полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток сушили во вспененном состоянии в течение ночи с помощью вакуумного масляного насоса с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 185 г, с 20 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром, содержащим 1% по массе триэтиламина и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,1 - 1:1:1:0,7. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,57 г чистого продукта W-6.
(7-7) Синтез W-7.
[327] W-6 (1,238 г, 0,63 ммоль), янтарный ангидрид (0,189 г, 1,89 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 0,231 г, 1,89 ммоль) смешивали и растворяли в 7 мл дихлорметана, и добавляли к нему DIEA (0,407 г, 3,15 ммоль) для проведения реакции в течение 24 часов при перемешивании при 25°C. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь промывали 5 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 5 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 30 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламин:метанол = 100:18 - 100:20. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,033 г чистого продукта - Конъюгирующей молекулы W-7 (Конъюгирующей молекулы 7). МС m/z: C101H146N7O38, [M-DMTr]+, рассчитанное: 1763,92, измеренное: 1763,21. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы W-7 представлена формулой (515).
Пример получения 8. Получение Конъюгирующей молекулы X-7 (Конъюгирующей молекулы 8).
[328] Ожидается, что Конъюгирующую молекулу 8 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой X-7) можно синтезировать в соответствии со следующим технологическим путем. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы X-7 представлена формулой (521). Конъюгирующая молекула.
Конъюгирующая молекула.
Пример получения 9. Получение Конъюгирующей молекулы K-3 (Сопоставимой конъюгирующей молекулы 1).
[329] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу K-3 (далее в данной заявке также называют Сопоставимой конъюгирующей молекулой 1) синтезировали в соответствии со следующим способом:
(9-1) Синтез K-1.
[330] A-1 (3,0 г, 6,0 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-7a), PyBOP (6,2 г, 12,0 ммоль), HOBt (1,6 г, 2,0 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIPEA, 3,9 г, 30,0 ммоль) добавляли к 60 мл дихлорметана для проведения реакции в течение 10 минут при перемешивании при комнатной температуре. Затем описанный выше раствор добавляли в K-0 (5,6 г, 30,0 ммоль) для проведения реакции при комнатной температуре в течение 1 часа и 50 минут. Жидкую реакционную смесь вливали в 30 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 30 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили безводным сульфатом натрия, затем фильтровали, концентрировали и очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол:водный аммиак (25 % по массе) = 10:2:0,1 - 4:4:1. Элюат собирали, концентрировали, чтобы удалить растворители, и сушили во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением 2,2 г продукта K-1 в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 8,02 (s, 1H), 7,43 (d, J = 7,8 Гц, 2H), 7,34 - 7,17 (m, 7H), 6,87 (d, J = 8,6 Гц, 4H), 4,05 (d, J = 5,2 Гц, 1H), 3,74(s, 6H), 3,20 - 3,01 (m, 5H), 2,60 - 2,38 (m, 12H), 1,60 - 1,39 (m, 8H), 1,24 (s, 1H). МС m/z: C33H47N4O5, [M+H]+, рассчитанное: 579,35, измеренное: 579,26.
(9-2) Синтез K-2.
[331] GAL-5 (483 мг, 1,08 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-1), 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (359 мг, 1,2 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIPEA, 310 мг, 2,4 ммоль) добавляли в 3 мл дихлорметана и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли K-1 (174 мг, 0,3 ммоль) для проведения реакции при комнатной температуре в течение 16 часов. Жидкую реакционную смесь вливали в 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, промывали 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия, сушили безводным сульфатом натрия, затем фильтровали, концентрировали и очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан:метанол = 20:1. Элюат собирали, концентрировали, чтобы удалить растворители, и сушили во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением 205 мг продукта K-2 в виде желтого твердого вещества.
(9-3) Синтез K-3.
[332] K-2 (205 мг, 0,11 ммоль), янтарный ангидрид (22 мг, 0,22 ммоль), 4-диметиламинопиридин (DMAP, 27 мг, 0,22 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIPEA, 71 мг, 0,55 ммоль) добавляли в 1,1 мл дихлорметана для проведения реакции в течение ночи при перемешивании при комнатной температуре. Жидкую реакционную смесь промывали три раза, каждый раз 0,5 мл 0,5 M раствора фосфата триэтиламина, и водную фазу, полученную в результате каждой промывки, однократно подвергали обратной экстракции с помощью 0,5 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия, концентрировали, чтобы удалить растворитель, и сушили во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением 218 мг продукта в виде светло-желтого твердого вещества - Конъюгирующей молекулы K-3 (Сопоставимой конъюгирующей молекулы 1).
Пример получения 10. Данный пример получения используют, чтобы проиллюстрировать синтез Конъюгирующей молекулы (GalNAc)3 (Сопоставимой конъюгирующей молекулы 2).
[333] В данном примере получения, соединение 47 синтезировали в соответствии со способом получения, описанным в примерах 1 - 4 WO2014025805A1. Структура соединения 47 показана в следующей формуле, и в данной заявке его называют Конъюгирующей молекулой (GalNAc)3 (Сопоставимой конъюгирующей молекулой 2):
Пример получения 11. Данный пример получения используют, чтобы проиллюстрировать получение Конъюгирующей молекулы FIN-2 (Сопоставимой конъюгирующей молекулы 3).
[334] В данном примере получения конъюгирующую молекулу FIN-2 (Сопоставимую конъюгирующую молекулу 3) синтезировали на основании способа получения, описанного в Rajeev и др., ChemBioChem 2015, 16, 903-908, в соответствии со следующим технологическим путем:
(11-1) Синтез соединения PRO-10.
(11-1-1) Синтез PRO-7.
[335] 2,93 г PRO-6 (L-гидроксипролин, номер в реестре CAS: 51-35-4, приобретали в Energy Chemical, 22,4 ммоль) растворяли в 22,5 мл 1,4-диоксана и добавляли 34 мл 10% (по массе) водного раствора Na2CO3. 6,954 г Fmoc-Cl (9-флуоренилметилхлороформат, номер в реестре CAS: 28920-43-6, приобретали в Energy Chemical, 26,8 ммоль) растворяли в 56,5 мл 1,4-диоксана, добавляли в описанную выше реакционную смесь на ледяной бане и естественным образом нагревали до комнатной температуры для ведения реакции в течение ночи. Жидкую реакционную смесь вливали в 150 мл ледяной воды и экстрагировали три раза, каждый раз 100 мл метил-трет-бутилового эфира, полученные в результате этого органические фазы отбрасывали. pH оставшейся водной фазы подводили до ≤ 5 с помощью концентрированной соляной кислоты, экстрагировали дважды 100 мл этилацетата, и полученные органические фазы объединяли и сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 7,83 г продукта PRO-7 в виде белого пенистого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,91 (t, J = 7,2 Гц, 2H), 7,67 (d, J = 7,5 Гц, 2H), 7,48 - 7,39 (m, 2H), 7,38 - 7,27 (m, 2H), 5,17 (s, 1H), 4,27 (s, 2H), 4,23 - 4,11 (m, 2H), 3,55 - 3,41 (m, 3H), 2,31 - 2,10 (m, 1H), 2,08 - 1,88 (m, 1H). Масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (МСВР (ИЭР)) m/z рассчитанная для C20H19NO5 [M-H]-352,1190, измеренная: 352,1033.
(11-1-2) Синтез PRO-8.
[336] 7,83 г PRO-7 (22,2 ммоль) растворяли в 80 мл ТГФ, нагревали до 65°C на масляной бане, добавляли 36,6 мл 2 моль/л раствора BH3-Me2S в ТГФ (CAS № 13292-87-0, приобретали в J&K Scientific Ltd., 73,2 ммоль) при кипении с обратным холодильником, и непрерывно грели с обратным холодильником для проведения реакции в течение 3 часов. Жидкую реакционную смесь выливали, и оставшееся твердое вещество растворяли в метаноле. В полученную в результате этого жидкую реакционную смесь добавляли метанол при перемешивании до тех пор, пока не перестал выделяться газ, и непрерывно перемешивали в течение 30 минут. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем остаток очищали три раза, каждый раз петролейным эфиром, с получением 7,1 г продукта PRO-8 в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,91 (t, J = 6,7 Гц, 2H), 7,67 (d, J = 7,2 Гц, 2H), 7,49 - 7,39 (m, 2H), 7,38 - 7,26 (m, 2H), 5,18 (dd, J = 6,1, 3,8 Гц, 1H), 4,28 (s, 2H), 4,23 - 4,13 (m, 2H), 3,55 - 3,38 (m, 2H), 2,32 - 2,11 (m, 1H), 2,08 - 1,89 (m, 1H). МСВР (ИЭР) m/z рассчитанная для C20H21NO4 [M+Na]+ 362,1368, измеренная: 362,1012.
(11-1-3) Синтез PRO-9.
[337] 7,1 г PRO-8 (21 ммоль) растворяли в 100 мл пиридина и добавляли к нему 14,2 г DMTr-Cl (4,4'-диметокситритилхлорид, 42 ммоль) для проведения реакции в течение 5 часов при перемешивании при комнатной температуре. Растворитель удаляли путем выпаривания при пониженном давлении. Полученный в результате этого неочищенный продукт растворяли в этилацетате и фильтровали, чтобы удалить солевые примеси. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем остаток очищали, применяя колонку с силикагелем. Для очистки, неочищенный продукт, растворенный в ДХМ, загружали на колонку с силикагелем, предварительно обработанную пиридином для подщелачивания колонки. DMTr-Cl элюировали ДХМ, содержащим 1% (в объемном отношении) пиридина, а затем продукт элюировали этилацетатом. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 8,2 г продукта PRO-9 в виде белого твердого вещества. МСВР (ИЭР) m/z рассчитанная для C41H39NO6 [M+Na]+ 664,2675, измеренная: 664,2348; C18 ОФ ВЭЖХ (номер партии: JJS160324-1); чистота: 94,20%.
(11-1-4) Синтез PRO-10.
[338] 8,2 г PRO-9 (12,8 ммоль) растворяли в 64 мл DMF и добавляли 40 мл пиперидина (384 ммоль) для проведения реакции в течение 30 минут при перемешивании при комнатной температуре. Жидкую реакционную смесь вливали в 300 мл ледяной воды и экстрагировали три раза, каждый раз 150 мл этилацетата. Полученные в результате этого органические фазы объединяли, промывали 200 мл насыщенного рассола, и органические фазы, полученные в результате промывки, сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем остаток очищали, применяя колонку с силикагелем. Для очистки, неочищенный продукт, растворенный в ДХМ, загружали на колонку с силикагелем, предварительно обработанную пиридином для подщелачивания колонки. Fmoc элюировали ДХМ, содержащим 1% (в объемном отношении) пиридина, а затем продукт элюировали этилацетатом. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 4,65 г продукта PRO-10 в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,40 (d, J = 7,2 Гц, 2H), 7,35 - 7,18 (m, 7H), 6,93 - 6,84 (m, 4H), 4,56 (d, J = 3,9 Гц, 1H), 4,12 (s, 1H), 3,74 (s, 6H), 3,46 - 3,37 (m, 1H), 2,88 (ddd, J = 18,5, 10,0, 5,5 Гц, 2H), 2,75 (dd, J = 8,7, 5,8 Гц, 1H), 2,62 (dd, J = 11,0, 2,7 Гц, 1H), 1,74 - 1,65 (m, 1H), 1,40 (ddd, J = 12,9, 8,5, 5,9 Гц, 1H); МСВР (ИЭР) m/z рассчитанная для C26H29NO4 [M+Na]+ 442,1994, измеренная: 442,1999; C18 ОФ ВЭЖХ (номер партии: JJS160329-1), чистота: 97,07%.
(11-2) Синтез FIN-1.
[339] GAL-5 (4,5 г, 10 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным в (1-1), растворяли в 40 мл DMF, последовательно добавляли к нему 3,9 г DIPEA (N,N-диизопропилэтиламин, номер в реестре CAS: 7087-68-5, приобретали в Aladdin Inc., 30 ммоль) и 3,8 г HBTU (бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат, номер в реестре CAS: 94790-37-2, приобретали в Aladdin Inc., 11 ммоль), и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут с получением жидкой реакционной смеси. PRO-10 (4,2 г, 10 ммоль), полученный на этапе (12-4), растворяли в 40 мл DMF, затем добавляли в полученную выше жидкую реакционную смесь. Полученную в результате этого жидкую реакционную смесь сушили путем добавления безводного сульфата натрия и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Жидкую реакционную смесь вливали в 120 мл ледяной воды и экстрагировали три раза, каждый раз 60 мл этилацетата. Полученные в результате этого органические фазы объединяли, промывали 20 мл воды и 20 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу, полученную в результате промывки, выделяли, сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем остаток очищали, применяя колонку с силикагелем. Для очистки, образец загружали на колонку с силикагелем, предварительно обработанную пиридином для подщелачивания колонки, и элюировали раствором дихлорметана (ДХМ), содержащим 1% (в объемном отношении) триэтиламина и 1% (в объемном отношении) метанола. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 6,5 г продукта FIN-1 в виде светло-желтого пенистого твердого вещества. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,83 (d, J = 9,2 Гц, 1H), 7,32 (t, J = 6,6 Гц, 4H), 7,20 (td, J = 8,9, 3,5 Гц, 5H), 6,93 - 6,84 (m, 4H), 5,21 (d, J = 3,2 Гц, 1H), 5,04 - 4,90 (m, 2H), 4,49 (s, 1H), 4,40 (d, J = 4,4 Гц, 0,8H), 4,31 (d, J = 5,0 Гц, 0,2H), 4,15 (s, 1H), 4,03 (s, 3H), 3,93 (s, 1H), 3,74 (s, 7H), 3,59 (dt, J = 12,0, 6,0 Гц, 1H), 3,50 - 3,40 (m, 1H), 3,39 - 3,25 (m, 3H), 3,13 (dd, J = 8,9, 5,2 Гц, 1H), 3,00 (dq, J = 9,3, 5,3, 4,3 Гц, 1H), 2,22 (s, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,90 (s, 4H), 1,74 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,36 (s, 1H). C18 ОФ ВЭЖХ (номер партии: LJ160422), чистота: 95,45%.
(11-3) Синтез FIN-2.
[340] FIN-1 (3,0 г, 3,53 ммоль), полученный на этапе (11-2), растворяли в 10 мл DMF, добавляли к нему 2,13 г PA (2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфородиамидит, Adamas Inc., № продукта 11356B, 7,06 ммоль) и 346 мг тетразола (CAS №: 288-94-8, приобретали в Aladdin Inc., 4,94 ммоль) в атмосфере азота, и перемешивали, чтобы они прореагировали, при комнатной температуре. Добавляли 10 мл DMF и непрерывно перемешивали для проведения реакции в течение 1 часа. Растворитель удаляли путем выпаривания при пониженном давлении, а затем остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Для очистки, неочищенный продукт, растворенный в ДХМ, загружали на колонку с силикагелем, предварительно обработанную пиридином для подщелачивания колонки, и элюировали этилацетатом. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 4,5 г неочищенного продукта в виде бесцветного сиропа. Неочищенный продукт полностью растворяли в 50% (в объемном отношении) водного раствора ацетонитрила и очищали, применяя колонку со средним давлением (C-18, 330 г, 300 Å), предварительно обработанную 1% (в объемном отношении) пиридина в ацетонитриле для подщелачивания колонки. Продукт собирали путем градиентного элюирования и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 2,2 г продукта в виде белого порошка - Конъюгирующей молекулы FIN-2 (Сопоставимой конъюгирующей молекулы 3). 31P ЯМР (162 МГц, CDCl3) δ 148,04, 147,94, 147,62, 147,19, чистота 31P ЯМР: 92%; чистота C18 ОФ ВЭЖХ: 90,54%.
Пример получения 12. Данный пример получения используют, чтобы проиллюстрировать получение Конъюгирующей молекулы Z-4 (Конъюгирующей молекулы 153).
[341] В данном примере получения Конъюгирующую молекулу 153 (далее в данной заявке также называют Конъюгирующей молекулой Z-4) синтезировали в соответствии со следующим способом.
(12-1) Синтез Z-1.
[342] W-3 (1,50 г, 3,37 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (7-3), и GAL5-C4-2 (7,18 г, 13,48 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (2-2), смешивали и растворяли в 34 мл дихлорметана, добавляли к ним диизопропилэтиламин (3,48 г, 26,96 ммоль), а затем 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 4,04 г, 13,48 ммоль) для проведения реакции в течение 4,5 часов при перемешивании при комнатной температуре. Полученный в результате этого жидкий раствор разбавляли 100 мл дихлорметана, промывали 80 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 80 мл насыщенного рассола, соответственно. Все органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром, добавляли к нему 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 30:1-15:1. Элюат собирали и выпаривали при пониженном давлении с получением 3,97 г чистого продукта Z-1. МС m/z: C98H143N10O33, [M+H]+, рассчитанное: 1987,98, измеренное: 1987,90.
(12-2) Синтез Z-2.
[343] Z-1 (3,97 г, 2,00 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным в (12-1), растворяли в 250 мл дихлорметана и добавляли к нему дихлоруксусную кислоту (10,941 г, 84,85 ммоль) для проведения реакции в течение 1 часа при комнатной температуре. Пиридин добавляли, чтобы нейтрализовать полученный в результате этого реакционный раствор до нейтрального состояния. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. В колонку загружали 200 г нормально-фазового силикагеля, 200 - 300 меш, и 10% по массе пиридина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали 1‰ (по массе) пиридина и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 10:1 - 2:1. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 3,49 г чистого продукта Z-2. МС m/z: C79H129N10O33, [M+H]+, рассчитанное: 1746,94, измеренное: 1746,90.
(12-3) Синтез Z-3.
[344] Z-2 (3,49 г, 2,0 ммоль) и A-1 (3,06 г, 6,0 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на этапе (1-7a), смешивали и растворяли в 30 мл дихлорметана и добавляли к ним 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT, 1,80 г, 6,0 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (1,55 г, 12,0 ммоль) для проведения реакции в течение 3 часов при перемешивании при 25°C. 100 мл дихлорметана добавляли в полученный в результате этого реакционный раствор для разбавления. Органическую фазу промывали дважды 30 мл насыщенного бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали 10 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и промывали 50 мл насыщенного рассола. Полученные органические фазы объединяли, сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток сушили во вспененном состоянии в течение ночи с помощью вакуумного масляного насоса с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 200 г, с 20 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали петролейным эфиром, содержащим 1% по массе триэтиламина, и элюировали градиентом дихлорметан:метанол = 25:1 - 15:1. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 2,2 г чистого продукта Z-3. МС m/z: C103H151N10O38, [M+H]+, рассчитанное: 2136,02, измеренное: 2136,20.
(12-4) Синтез Z-4.
[345] Z-3 (2,10 г, 0,983 ммоль) растворяли в 14,8 мл дихлорметана, содержащего DIEA (635 мг, 4,915 ммоль), в полученный в результате этого раствор добавляли 4-диметиламинопиридин (DMAP, 240 мг, 1,966 ммоль) и перемешивали до достижения прозрачности. Добавляли янтарный ангидрид (197 мг, 1,966 ммоль) для проведения реакции в течение 18 часов при перемешивании при 25°C. В полученный в результате этого реакционный раствор добавляли 50 мл дихлорметана для разбавления и промывали 80 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу экстрагировали дважды 50 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке, применяя нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, 188 г, с 1% по массе триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля. Колонку уравновешивали дихлорметаном и элюировали градиентом: дихлорметан, содержащий 1‰ (по массе) триэтиламина:метанол = 10:1 - 3:1. Элюат собирали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 1,95 г чистого продукта - конъюгирующей молекулы Z-4 (Конъюгирующей молекулы 12). МС m/z: C107H155N10O41, [M+H]+, рассчитанное: 1935,07, измеренное: 1935,29. Структура полученной в результате этого Конъюгирующей молекулы Z-4 представлена формулой (422).
Пример получения 13. Получение конъюгата L10-siHBa1 (Конъюгата 9).
[346] В данном примере получения, Конъюгат L10-siHBa1 (далее в данной заявке также называют Конъюгатом 9) получали из конъюгирующей молекулы L-9 (Конъюгирующей молекулы 1) в соответствии со следующим способом.
(13-1) Синтез соединения L-10.
[347] На данном этапе соединение L-10 получали путем соединения Конъюгирующей молекулы L-9 с твердофазной подложкой.
[348] Конъюгирующую молекулу L-9 (0,233 г, 0,1126 ммоль), полученную на этапе (1-8), O-бензотриазолтетраметилурония гексафторфосфат (HBTU, 0,064 г, 0,1689 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIPEA, 0,029 г, 0,2252 ммоль) смешивали и растворяли в 19 мл ацетонитрила, и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Аминометильную смолу (0,901 г, 100 - 200 меш, загрузка амином: 400 мкмоль/г, приобретали в Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.) добавляли в жидкую реакционную смесь. Реакцию проводили на встряхивателе при 25°C и 220 об./мин. в течение 15 часов, а затем фильтровали. Остаток промывали два раза 30 мл ДХМ, три раза 30 мл ацетонитрила и один раз 30 мл этилового эфира и сушили в течение 2 часов с помощью вакуумного масляного насоса. Затем вели реакцию кэпирования в соответствии с отношением зарядов, как показано в таблице 2.
Таблица 2. Отношение зарядов реакции кэпирования.
[349] В таблице выше Кэп 1 и Кэп 2 представляют собой растворы кэпирующих реагентов. Кэп 1 представляет собой раствор 20% в объемном отношении N-метилимидазола в смеси пиридина/ацетонитрила, причем объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет 3:5. Кэп 2 представляет собой раствор 20% в объемном отношении уксусного ангидрида в ацетонитриле.
[350] Кэп 1, Кэп 2, 4-диметиламинопиридин (DMAP) и ацетонитрил добавляли в описанную выше реакционную смесь. Реакцию проводили на встряхивателе при 25°C и 200 об./мин. в течение 5 часов. Жидкую реакционную смесь фильтровали. Остаток промывали три раза, каждый раз 30 мл ацетонитрила, растворитель выпаривали досуха, и смесь сушили в течение ночи при пониженном давлении с помощью вакуумного масляного насоса с получением 1,100 г соединения L-10 (т.е., конъюгирующей молекулы L-9, связанной с твердофазной подложкой), с нагрузкой 90,8 мкмоль/г. Структура соединения L-10 может быть представлена формулой (523).
(13-2) Синтез смысловой цепи конъюгата L10-siHB1.
[351] На данном этапе миРНК конъюгата миРНК представляет собой последовательность под номером siHBa1:
siHBa1
смысловая цепь: 5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (SEQ ID NO: 1),
антисмысловая цепь: 5'- UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3' (SEQ ID NO: 2).
[352] Мономеры нуклеозидов присоединяли один за другим в направлении от 3' к 5' в соответствии с указанной выше последовательностью фосфорамидитным способом твердофазного синтеза, начиная с соединения L-10, полученного на описанном выше этапе. Присоединение каждого мономера нуклеозида включало четырехэтапную реакцию снятия защитных групп, сочетания, кэпирования и окисления. Условия синтеза были такими, как описано далее.
[353] Мономеры нуклеозида были предложены в 0,1 M растворе ацетонитрила. Условия были одинаковыми для каждой реакции снятия защитных групп, т.е., температура 25°C, время реакции 70 секунд, раствор дихлоруксусной кислоты в дихлорметане (3% в объемном отношении) в качестве реагента для снятия защитных групп и молярное соотношение дихлоруксусной кислоты к защитной группе на твердофазной подложке 4,4'-диметокситритилу составляло 5:1.
[354] Условия были одинаковыми для каждой реакции сочетания, включая температуру 25°C, молярное соотношение последовательности нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке, к мономерам нуклеозида 1:10, молярное соотношение последовательности нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке, к агенту реакции сочетания 1:65, время реакции 600 секунд и 0,5 M раствор в ацетонитриле 5-этилтио-1H-тетразола в качестве агента реакции сочетания.
[355] Условия были одинаковыми для каждой реакции кэпирования, включая температуру 25°C и время реакции 15 секунд. Кэпирующий реагент представлял собой смешанный раствор Кэпа 1 и Кэпа 2 в молярном соотношении 1:1; и молярное соотношение кэпирующего реагента к последовательности нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке, было следующим: уксусный ангидрид: N-метилимидазол: последовательность нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке = 1:1:1.
[356] Условия были одинаковыми для каждой реакции окисления, включая температуру 25°C, время реакции 15 секунд и 0,05 М йодную воду в качестве окисляющего реагента; и молярное соотношение йода к последовательности нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке, на этапе сочетания составляло 30:1. Реакцию проводили в смешанном растворителе тетрагидрофуран:вода:пиридин = 3:1:1.
[357] Условия для расщепления и снятия защитных групп были такими, как описано далее. Синтезированную последовательность нуклеотидов, связанную с подложкой, добавляли в 25 % по массе водного аммиака для проведения реакции в течение 16 часов при 55°C, и водный аммиак находился в количестве 0,5 мл/мкмоль относительно последовательности нуклеотидов. Жидкость удаляли и остаток концентрировали в вакууме досуха. После обработки водным аммиаком продукт растворяли в N-метилпирролидоне в количестве 0,4 мл/мкмоль, а затем добавляли 0,3 мл/мкмоль триэтиламина и 0,6 мл/мкмоль тригидрофторида триэтиламина, относительно количества одноцепочечной нуклеиновой кислоты, тем самым удаляя защиту 2'-TBDMS с рибозы. Очистка и обессоливание: очистку нуклеиновой кислоты проводили, применяя колонку для препаративной ионообменной хроматографии (Source 15Q) с элюированием градиентом NaCl. В частности, элюент A: 20 мМ фосфат натрия (pH 8,1), растворитель: вода/ацетонитрил = 9:1 (в объемном отношении); элюент B: 1,5 М хлорид натрия, 20 мМ фосфат натрия (pH 8,1), растворитель: вода/ацетонитрил = 9:1 (в объемном отношении); градиент элюирования: отношение элюент A: элюент B = 100:0 - 50:50. Элюат собирали, объединяли и обессоливали, применяя колонку для обращенно-фазовой хроматографии. Особенность условий состояла в том, что для обессоливания применяли колонку с сефадексом, причем сефадекс G25 использовали в качестве наполнителя, а деионизированную воду использовали для элюирования.
[358] Детектирование: чистота, выявленная с помощью ионообменной хроматографии (ИО-ВЭЖХ), составляла 92,4%; и молекулярную массу анализировали с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС), причем рассчитанное значение составляло 7253,96 и измеренное значение составляло 7253,12.
[359] Таким образом, на данном этапе Конъюгирующую молекулу L-9 присоединили к 3'-концу полученной в результате этого смысловой цепи, получив смысловую цепь (С) миРНК, в которой Конъюгирующая молекула L-9 была конъюгирована с 3' концом миРНК.
(13-3) Синтез антисмысловой цепи.
[360] На данном этапе антисмысловую цепь (АС) конъюгата L10-siHB1 синтезировали, применяя универсальную твердофазную подложку (нагруженные UnyLinker™ твердые подложки NittoPhase®HL, Kinovate Life Sciences Inc.). Антисмысловую цепь (АС) миРНК получали с помощью таких же условий, которые использовали для синтеза смысловой цепи, включая условия реакций снятия защитных групп, сочетания, кэпирования и окисления в способе твердофазного синтеза, условия снятия защитных групп и расщепления и условия выделения.
[361] Детектирование: чистота, обнаруженная с помощью ИО-ВЭЖХ, составляла 93,2%; и молекулярная масса была проанализирована с помощью ЖХ/МС, причем рассчитанное значение составляло 6675,04 и измеренное значение составляло 6674,50.
(13-4) Синтез конъюгата L10-siHBa1.
[362] С цепь и АС цепь растворяли в воде для инъекций, чтобы получить раствор 40 мг/мл, соответственно. Их смешивали в эквимолярных соотношениях, грели в течение 15 мин при 50°C, а затем охлаждали до комнатной температуры с образованием двухцепочечной структуры водородными связями.
[363] После завершения описанного выше синтеза конъюгат разбавляли до концентрации 0,2 мг/мл, применяя ультрачистую воду (собственного производства с помощью устройства для получения ультрачистой воды Milli-Q, с удельным сопротивлением 18,2 МОм*см (25°C)). Молекулярную массу измеряли с помощью устройства для ЖХ/МС (приобретали в Waters Corp., модель: LCT Premier). В результате, рассчитанные значения молекулярной массы для С и АС составляли 7253,96 и 6675,04, соответственно, и измеренные значения для них составляли 7253,24 и 6674,61, соответственно. Подтвердили, что синтезированный конъюгат представляет собой целевую разработанную двухцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты с Конъюгирующей молекулой L9, поскольку измеренные значения соответствуют рассчитанным значениям. Структура конъюгата L10-siHBa1 (Конъюгата 9) представлена формулой (3).
Пример получения 14. Получение конъюгатов 16 - 18, 24 - 26, 42 - 43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144 и 154 - 171.
[364] Данные конъюгаты получали, применяя такой же способ, как описанный в Примере получения 13, за исключением того, что: 1) конъюгированные миРНК имеют последовательности, показанные в Таблицах 3A - 3G, соответствующие конъюгатам 16 - 18, 24 - 26, 42 - 43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144, 157 - 163 и 167 - 171; 2) если присутствует фосфоротиоатная связь между двумя нуклеотидами в целевой последовательности, то следующий этап реакции сульфирования использовали в качестве замены этапа реакции окисления во время соединения последнего из двух нуклеотидов; условия были одинаковыми для каждой реакции сульфирования, включая температуру 25°C, время реакции 300 секунд и гидрид ксантана в качестве сульфирующего реагента; молярное соотношение сульфирующего реагента к последовательности нуклеиновой кислоты, присоединенной к твердофазной подложке, на этапе сочетания составляло 120:1; Реакцию проводили в смешанном растворителе ацетонитрил: пиридин = 1:1; и 3) если 2'-положения всех нуклеотидов в целевой последовательности представляют собой модифицированные гидрокси-группы, то этап удаления защиты 2'-TBDMS с рибозы не включают в условия отщепления и снятия защитных групп. Таким образом, получают конъюгаты 16 - 18, 24 - 26, 42 - 43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144, 157 - 163 согласно настоящему описанию.
[365] Кроме того, конъюгаты 154 - 156 и 164 - 166 получали, применяя такой же способ, как описанный в Примере получения 13, за исключением того, что следующие Конъюгирующие молекулы использовали для замены Конъюгирующей молекулы L-9, соответственно: Конъюгат 164 получали из Конъюгирующей молекулы P-9 (Конъюгирующей молекулы 2), которую получали в Примере получения 2; Конъюгаты 155, 156 и 165 получали из Конъюгирующей молекулы W-7 (Конъюгирующей молекулы 7), которую получали в Примере получения 7; Конъюгаты 154 и 166 получали из Z-4 (Конъюгирующей молекулы 12), которую получали в Примере получения 12, и конъюгированные миРНК имеют последовательности, показанные в таблицах 3A - 3G, соответствующие конъюгатам 154 - 156 и 164 - 166, соответственно, и конъюгаты были пронумерованы отдельно согласно таблицам 3A - 3G. Их структуры представлены формулой (3), формулой (4), формулой (15) и формулой (22), соответственно. Молекулярные массы конъюгатов измеряли с помощью ЖХ/МС, как описано далее:
Конъюгат 142: Рассчитанные значения: С: 7649,55, АС: 6991,46,
- Измеренные значения: С: 7649,1, АС: 6991;
Конъюгат 170: Рассчитанные значения: С: 7649,55, АС: 6995,47,
- Измеренные значения: С: 7648,8, АС: 6994,8;
Конъюгат 171: Рассчитанные значения: С: 7649,55, АС: 7011,53,
- Измеренные значения: С: 7648,8, АС: 7010,9;
Конъюгат 115: Рассчитанные значения: С: 7584,5, АС: 7007,46,
- Измеренные значения: С: 7584, АС: 7006,2;
Конъюгат 109: Рассчитанные значения: С: 7584,5, АС: 6931,47,
- Измеренные значения: С: 7584, АС: 6930,9;
Конъюгат 106: Рассчитанные значения: С: 7572,47, АС: 6907,41,
- Измеренные значения: С: 7571,8, АС: 6906,9;
Конъюгат 113: Рассчитанные значения: С: 7584,5, АС: 7011,47,
- Измеренные значения: С: 7584, АС: 7011,3;
Конъюгат 17: Рассчитанные значения: С: 7504,34, АС: 6961,52,
- Измеренные значения: С: 7503,4, АС: 6960,9;
Конъюгат 25: Рассчитанные значения: С: 7504,34, АС: 7037,51,
- Измеренные значения: С: 7503,6, АС: 7036,9;
Конъюгат 18: Рассчитанные значения: С: 8218,83, АС: 7703,05,
- Измеренные значения: С: 8218, АС: 7702,5;
Конъюгат 16: Рассчитанные значения: С: 7516,37, АС: 6985,58,
- Измеренные значения: С: 7516,5, АС: 6984,9;
Конъюгат 159: Рассчитанные значения: С: 7504,34, АС: 7057,58,
- Измеренные значения: С: 7503,6, АС: 7057;
Конъюгат 160: Рассчитанные значения: С: 7504,34, АС: 7041,52,
- Измеренные значения: С: 7503,6, АС: 7040,8;
Конъюгат 161: Рассчитанные значения: С: 7516,37, АС: 7065,58,
- Измеренные значения: С: 7516,6, АС: 7064,5;
Конъюгат 162: Рассчитанные значения: С: 7504,34, АС: 7139,68,
- Измеренные значения: С: 7515,6, АС: 7138,9;
Конъюгат 163: Рассчитанные значения: С: 7516,37, АС: 7081,64,
- Измеренные значения: С: 7515,6, АС: 7080,9;
Конъюгат 62: Рассчитанные значения: С: 7485,3, АС: 7161,7,
- Измеренные значения: С: 7484,4, АС: 7160,9;
Конъюгат 78: Рассчитанные значения: С: 7423,22, АС: 7207,78,
- Измеренные значения: С: 7422,6, АС: 7207,2;
Конъюгат 42: Рассчитанные значения: С: 7407,22, АС: 7208,77,
- Измеренные значения: С: 7406,4, АС: 7208,1;
Конъюгат 43: Рассчитанные значения: С: 7407,22, АС: 7170,72,
- Измеренные значения: С: 7406,5, АС: 7170,1,
и измеренные значения соответствуют рассчитанным значениям.
Таблица 3A. Конъюгаты миРНК.
Таблица 3A.
Таблица 3B.
siHBb2M1SP
Таблица 3C.
Таблица 3D.
Таблица 3E.
Таблица 3F.
Таблица 3G.
*С: смысловая цепь; АС: антисмысловая цепь
Примечание: заглавные буквы C, G, U и A указывают на состав оснований нуклеотидов; dT указывает на нуклеотид дезокситимин; строчная буква m указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве m, представляет собой модифицированный 2'-метокси-группой нуклеотид; строчная буква f указывает на то, что нуклеотид, примыкающий слева к букве f, представляет собой модифицированный 2'-фтором нуклеотид; строчная буква s указывает на фосфоротиоатную связь между двумя нуклеотидами, примыкающими с двух сторон к букве s; VP указывает на то, что нуклеотид, примыкающий справа к буквам VP, представляет собой модифицированный винилфосфатом нуклеотид; P указывает на то, что нуклеотид, примыкающий справа к букве P, представляет собой модифицированный фосфатом нуклеотид; Ps указывает на то, что нуклеотид, примыкающий справа к буквам Ps, представляет собой модифицированный фосфоротиоатом нуклеотид; Tmoe указывает на нуклеотид тимин модифицирован 2'-метокси-группой.
[366] Модифицированный винилфосфатом и 2'-метокси-группой мономер уридина (VP-Um) синтезировали в соответствии со следующим способом:
(14-1) Синтез VP-U-2.
[367] Молекулу VP-U-2 синтезировали в соответствии со следующим способом:
[368] Модифицированный 2'-метокси-группой нуклеозид урацил (2'-OMe-U, 51,30 г, 91,6 ммоль), трет-бутил дифенилхлорсилан (TBDPSCl, 50,35 г, 183,2 ммоль) и имидазол (12,47 г, 183,2 ммоль) смешивали и растворяли в 450 мл N,N-диметилформамида (DMF) для проведения реакции в течение 20 часов при перемешивании при комнатной температуре. DMF удаляли путем выпаривания, и остаток растворяли с помощью 600 мл дихлорметана и промывали 300 мл насыщенного бикарбоната натрия. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 300 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли, промывали 5% щавелевой кислотой до достижения pH водной фазы <5. Растворитель выпаривали досуха с получением неочищенного продукта VP-U-1, который непосредственно использовали в последующем синтезе VP-U-2.
[369] Неочищенный продукт VP-U-1 растворяли в 100 мл дихлорметана, а затем перемешивали в течение 10 минут на ледяной бане. Добавляли 450 мл 2% раствора п-толуолсульфоновой кислоты (со смешанным растворителем из метанола и дихлорметана в объемном отношении 3:7), предварительно охлажденного в холодильной камере при 4°C, для проведения реакции в течение 10 минут. Реакцию гасили добавлением 200 мл насыщенного бикарбоната натрия. Полученную органическую фазу промывали добавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия до pH = 8. Водные фазы объединяли и экстрагировали дважды 200 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и однократно промывали 200 мл насыщенного рассола. Растворитель выпаривали, и остаток очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:метанол = 1:1:1:0,05 - 1:1:1:0,25. Элюат собирали, растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением всего 40,00 г чистого продукта VP-U-2. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,96 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,64 (dtd, J = 5,1, 4,0, 2,2 Гц, 4H), 7,41-7,30 (m, 6H), 6,79 (d, J = 4,7 Гц, 1H), 5,73 (d, J = 7,6 Гц, 1H), 4,94 (t, J = 7,0 Гц, 1H), 4,12 (td, J = 4,6, 3,9 Гц, 1H), 4,05 (dd, J = 4,8, 4,0 Гц, 1H), 3,96 (t, J = 4,7 Гц, 1H), 3,68 (ddd, J = 11,8, 7,0, 4,6 Гц, 1H), 3,57 - 3,46 (m, 1H), 3,39 (s, 3H), 1,05 (s, 8H). МС m/z: C26H33N2O6Si, [M+H]+, рассчитанное: 497,21, измеренное: 497,45.
(14-2) Синтез VP-U-4.
[370] VP-U-2 (19,84 г, 40,0 ммоль), дициклогексилкарбодиимид (DCC, 16,48 г, 80,0 ммоль), пиридин (4,20 г, 53,2 ммоль) и трифторуксусную кислоту (6,61 г, 53,2 ммоль) смешивали и растворяли в 200 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для проведения реакции в течение 20 часов при перемешивании при комнатной температуре с получением жидкой реакционной смеси. Отдельно, тетраэтилметилендифосфат (21,44 г, 74,4 ммоль) растворяли в 120 мл ТГФ, охлаждали на ледяной бане, добавляли t-BuOK (11,36 г, 101,2 ммоль) при температуре ледяной бани для проведения реакции в течение 10 мин, нагревали до комнатной температуры для проведения реакции в течение 0,5 ч и добавляли в полученную выше жидкую реакционную смесь на приблизительно 1 ч. Реакцию проводили в течение 1 ч при температуре ледяной бани, а затем нагревали до комнатной температуры для проведения реакции в течение 18 ч. Реакцию гасили добавлением воды. Выделенную водную фазу экстрагировали три раза, каждый раз 200 мл дихлорметана. Все органические фазы объединяли и однократно промывали 200 мл насыщенного рассола. Растворитель выпаривали досуха, и остаток очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром и элюировали градиентом петролейный эфир: этилацетат = 1:1 - 1:4. Элюат собирали, растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением всего 14,00 г чистого продукта VP-U-4. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,96 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 7,64 (dtd, J = 5,1, 4,0, 2,2 Гц, 4H), 7,41 - 7,30 (m, 6H), 6,82 - 6,71 (m, 2H), 5,90 (ddd, J = 25,9, 15,0, 1,0 Гц, 1H), 5,73 (d, J = 7,6 Гц, 1H), 4,36 - 4,21 (m, 3H), 4,18 (t, J = 4,9 Гц, 1H), 4,05 (ddq, J = 9,7, 8,5, 6,9 Гц, 2H), 3,87 (t, J = 4,8 Гц, 1H), 3,39 (s, 3H), 1,32 (td, J = 6,9, 0,7 Гц, 6H), 1,05 (s, 8H). МС m/z: C31H42N2O8PSi, [M+H]+, рассчитанное: 629,24, измеренное: 629,51.
(14-3) Синтез VP-U-5.
VP-U-4 (14,00 г, 22,29 ммоль) растворяли в 100 мл тетрагидрофурана, добавляли тригидрофторид триэтиламина (17,96 г, 111,45 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов, чтобы они полностью прореагировали. Неочищенный продукт получали путем непосредственного выпаривания растворителя досуха с последующим растворением в дихлорметане и выпариванием досуха дважды, с использованием 50 мл дихлорметана. Неочищенный продукт очищали, применяя нормально-фазовую колонку с силикагелем, 200 - 300 меш. Колонку заполняли петролейным эфиром и элюировали градиентом петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:метанол = 1:1:1:0,05 - 1:1:1:0,25. Элюат собирали, растворитель выпаривали при пониженном давлении и сушили остаток во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса с получением всего 6,70 г чистого продукта VP-U-5. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,96 (d, J = 7,8 Гц, 1H), 6,77 (dd, J = 15,0, 6,2 Гц, 1H), 5,99 - 5,82 (m, 2H), 5,73 (d, J = 7,6 Гц, 1H), 5,27 (d, J = 5,1 Гц, 1H), 5,10 (dd, J = 5,3, 4,7 Гц, 1H), 4,29 (ddq, J = 9,8, 8,6, 7,0 Гц, 2H), 4,17 (ddd, J = 6,2, 5,2, 1,0 Гц, 1H), 4,12 - 3,98 (m, 3H), 3,39 (s, 2H), 1,32 (td, J = 6,9, 0,6 Гц, 6H). МС m/z: C15H24N2O8P, [M+H]+, рассчитанное: 391,13, измеренное: 391,38.
(14-4) Синтез VP-U-6.
[371] VP-U-5 (391 мг, 1,0 ммоль), пиридин трифторацетат (0,232 г, 1,2 ммоль), N-метилимидазол (0,099 г, 1,2 ммоль) и 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфородиамидит (0,452 г, 1,5 ммоль) добавляли в 10 мл безводного дихлорметана в атмосфере аргона для проведения реакции в течение 5 часов при перемешивании при комнатной температуре. Растворитель выпаривали досуха, а затем остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (нормально-фазовый силикагель, 200 - 300 меш, с элюированием градиентом дихлорметан: ацетонитрил (содержащий 0,5 % по массе триэтиламина) = 3:1 - 1:3). Элюат собирали и концентрировали, чтобы удалить растворитель, с получением всего 508 мг целевого продукта VP-U-6. 31P ЯМР (161 МГц, ДМСО-d6) δ 150,34, 150,29, 17,07, 15,50. МС m/z: C24H41N4O9P2, [M+H]+, рассчитанное: 591,23, измеренное: 591,55. Это свидетельствует о том, что VP-U-6 представляет собой целевой продукт VP-Um, который участвует в синтезе цепей РНК в качестве мономера нуклеозида.
[372] Модификацию 5'-фосфатным эфиром присоединяли к 5'-концу с применением следующего способа.
[373] В качестве исходного материала использовали фосфорилированный структурный мономер со следующей структурой формулы CPR-I (приобретали в Suzhou GenePharma Inc. под номером в каталоге13-2601-XX):
(CPR-I)
[374] После того как присоединили все нуклеозиды антисмысловой цепи, мономер формулы (CPR-I) присоединяли к 5'-концу антисмысловой цепи с помощью четырехэтапной реакции снятия защитных групп, сочетания, кэпирования и окисления в соответствии со способом фосфорамидитного твердофазного синтеза нуклеиновой кислоты, с последующим отщеплением и снятием защитных групп в соответствии с описанными ниже условиями, таким образом получая антисмысловую цепь.
[375] Синтезированную последовательность нуклеотидов, связанную с подложкой, добавляли в 25 % по массе водного аммиака для проведения реакции в течение 16 часов при 55°C, и количество водного аммиака составляло 0,5 мл/мкмоль относительно последовательности нуклеотидов. Жидкость удаляли и остаток концентрировали в вакууме досуха. После обработки водным аммиаком продукт растворяли в N-метилпирролидоне в количестве 0,4 мл/мкмоль, а затем добавляли 0,3 мл/мкмоль триэтиламина и 0,6 мл/мкмоль тригидрофторида триэтиламина, относительно количества одноцепочечной нуклеиновой кислоты, тем самым удаляя защиту 2'-TBDMS на рибозе. Очистка и обессоливание: очистку нуклеиновой кислоты проводили, применяя колонку для препаративной ионообменной хроматографии (Source 15Q) с элюированием градиентом NaCl. В частности, элюент A: 20 мМ фосфат натрия (pH 8,1), растворитель: вода/ацетонитрил = 9:1 (в объемном отношении); элюент B: 1,5 М хлорид натрия, 20 мМ фосфат натрия (pH 8,1), растворитель: вода/ацетонитрил = 9:1 (в объемном отношении); градиент элюирования: отношение элюент A: элюент B = 100:0 - 50:50. Элюат собирали, объединяли и обессоливали, применяя колонку для обращенно-фазовой хроматографии. Особенность условий состояла в том, что для обессоливания применяли колонку с сефадексом, причем сефадекс G25 использовали в качестве наполнителя, а деионизированную воду использовали для элюирования.
[376] В случае, когда целевой продукт содержал 5'-фосфоротиоатную модификацию, использовали такую же процедуру, как описанная выше, за исключением того, что описанные выше условия реакции окисления заменили на условия реакции сульфирования при присоединении, тем самым проводя реакцию сульфирования.
[377] Для смысловой цепи и антисмысловой цепи, синтезированных как описано выше, чистоту определяли с помощью ионообменной хроматографии (ИО-ВЭЖХ), молекулярную массу проанализировали с помощью ЖХ/МС и подтвердили, что синтезированная последовательность нуклеиновой кислоты соответствует соответствующим миРНК в примерах и сопоставимых примерах, описанных в таблице 5.
Пример получения 15. Получение остальных конъюгатов, представленных в таблицах 3A - 3G.
[378] В других случаях ожидается, что остальные конъюгаты, представленные в таблицах 3A - 3G, можно получить, применяя такой же способ, как описанный в Примере получения 13, за исключением того, что: 1) в отношении Конъюгатов 31 - 37, 52 - 58, 68 - 74, 84 - 90, 121 - 127 и 146 - 152, Сравнительных конъюгатов 4 - 5, 7 - 8 и 10 - 13, Конъюгирующую молекулу L-9 заменили на Конъюгирующие молекулы 2 - 8 или 12 и Сопоставимые конъюгирующие молекулы 1 - 2, полученные в примерах 2 - 10 или 12 (например, когда Конъюгирующую молекулу L-9 заменили на Конъюгирующую молекулу P-9 (Конъюгирующую молекулу 2)), ожидается, что можно получить конъюгаты 31, 52, 68, 84, 121 и 146, которые пронумерованы как конъюгат P10. Когда Конъюгирующую молекулу L-9 заменяли на Конъюгирующую молекулу R-4 (Конъюгирующую молекулу 3), ожидается, что можно получить конъюгаты 32, 53, 69, 85, 122 и 147, которые пронумерованы как конъюгат R5, и так далее; 2) конъюгированные миРНК имеют последовательности, представленные в таблицах 3A - 3G, соответствующие конъюгатам 10 - 15, 19 - 23, 27 - 41, 44 - 61, 63 - 77, 79 - 104, 106 - 108, 110, 112 - 114, 116 - 141 и 143 - 152 и сравнительным конъюгатам 4 - 5, 7 - 8 и 10 - 17; 3), если присутствует фосфоротиоатная связь между двумя нуклеотидами в целевой последовательности, то этап реакции сульфирования, описанный в Примере получения 13, используют для замены этапа реакции окисления во время соединения последнего из двух нуклеотидов; и 4) если 2'-положения всех нуклеотидов в целевой последовательности представляют собой модифицированные гидрокси-группы, то этап удаления защиты 2'-TBDMS на рибозе не включали в условия отщепления и снятия защитных групп. Следовательно, ожидается, что можно получить конъюгаты 10 - 15, 19 - 23, 27 - 41, 44 - 61, 63 - 77, 79 - 104, 106 - 108, 110, 112 - 114, 116 - 141 и 143 - 152 и сравнительные конъюгаты 4 - 5, 7 - 8 и 10 - 17, и указанные конъюгаты были пронумерованы отдельно в соответствии с таблицами 3A - 3G. Конъюгаты согласно настоящему описанию представлены формулами (3), (4), (7), (12), (13), (14), (15), (21) и (22), соответственно, и сравнительные конъюгаты представлены формулами (901) и (902), соответственно:
Формула (901)
Формула (902)
где Nu представляет собой миРНК в сравнительных конъюгатах 4 - 5, 7 - 8 и 10 - 13.
Пример получения 16. Синтез сравнительных конъюгатов 6 и 9.
[379] Сравнительные конъюгаты 6 и 9 синтезировали, применяя FIN-2, полученный на описанном выше этапе (11-3). Условия твердофазного синтеза РНК и снятия защитных групп такие же, как и для твердофазного синтеза нуклеиновой кислоты, описанного на упомянутом выше этапе (11-2). Единственное различие состоит в том, что FIN_FIN_FIN сначала конъюгировали с 3'-концом смысловой цепи РНК посредством трех циклов реакции с FIN-2 с последующим твердофазным синтезом с применением универсальной твердофазной подложки (твердофазные подложки NittoPhase®HL с нагруженным UnyLinker™).
[380] Присоединение конъюгирующей группы FIN_FIN_FIN осуществляли в соответствии со способом, описанным в Rajeev и др., Chem Bio Chem 2015, 16, 903-908. В частности, сначала удаляли защитную группу для гидрокси с упомянутой выше универсальной твердофазной подложки, и твердофазную подложку впоследствии приводили в контакт и соединяли с конъюгирующей молекулой FIN-2 при условиях реакции сочетания и с помощью агента реакции сочетания, и конъюгирующую молекулу FIN, соединенную с твердофазной подложкой, получали после реакции кэпирования и окисления. Более того, защитную группу для гидрокси DMTr удаляли с конъюгирующей молекулы FIN, соединенной с твердофазной подложкой, и твердофазную подложку дополнительно приводили в контакт и соединяли с другой конъюгирующей молекулой FIN-2, с последующей реакцией кэпирования и окисления. После еще одного дополнительного цикла снятия защитных групп-сочетания-кэпирования-окисления, присоединяли третью конъюгирующую молекулу FIN-2, и таким образом получали конъюгирующую группу (FIN_FIN_FIN), соединенную с твердофазной подложкой. После этого, начиная с конъюгирующей группы, соединенной с твердофазной подложкой, последовательно присоединяли мономеры нуклеотидов и, наконец, получали смысловую цепь РНК с конъюгирующей группой (FIN_FIN_FIN), конъюгированной с 3'-концом.
[381] В описанных выше реакциях условия, растворители и агенты снятия защитных групп, сочетания, кэпирования и окисления соответствуют таковым для твердофазного синтеза РНК, описанного на этапе (11-2).
[382] Затем расщепление и снятие защитных групп, очистку и обессоливание, детектирование, и отжиг проводили с помощью такого же способа, как описанный в Примере получения 12, чтобы, наконец, получить сравнительные конъюгаты 6 и 9 (иногда далее в данной заявке также просто называют конъюгатами FIN). Молекулярную массу измеряли с помощью устройства для ЖХ/МС (приобретали в Waters Corp., модель: LCT Premier). Подтвердили, что синтезированный конъюгат FIN-siHBa1M1SP представляет собой целевое разработанное соединение, поскольку измеренные значения соответствуют теоретическим значениям. Его структура представляет собой структуру, представленную формулой (903):
Формула (903)
где Nu представляет собой миРНК в сравнительных конъюгатах 6 или 9.
[383] После получения описанных выше конъюгатов, их лиофилизировали с получением твердого порошка с помощью стандартного процесса и хранили до момента применения. Когда потребуется, их можно растворить, например, с помощью воды для инъекций или нормального солевого раствора, с получением раствора с необходимой концентрацией.
Экспериментальный пример 1. В данном эксперименте проиллюстрирована токсичность конъюгатов миРНК согласно настоящему описанию.
[384] Конъюгат 24 вводили подкожно каждой мыши C57BL/6J, соответственно, при этом разовая доза составляла 100 мг/кг или 200 мг/кг (по миРНК, в виде 0,9 % по массе водного раствора NaCl, каждой вводили 10 мл/кг при концентрации 10 мг/мл или 20 мг/мл). В течение периода введения при непрерывном наблюдении не происходила гибель животного, не наблюдали клинических симптомов, связанных с нежелательными ответами на лекарственное средство, и не были выявлены отклонения от нормы при анализе клинической патологии или патологоанатомического исследования, оба из которых проводили через 24 ч после введения. Таким образом, представленные выше результаты свидетельствуют об относительно низкой токсичности конъюгатов согласно настоящему описанию на уровне животных.
Экспериментальный пример 2. В данном эксперименте проиллюстрирована стабильность конъюгатов согласно настоящему описанию.
Экспериментальный пример 2-1. Стабильность в лизате лизосом in vitro.
[385] Конъюгаты 24, 25, 42, 43, 62, 78 и Сопоставимую последовательность 1 (каждый предложен в 0,9% по массе водном растворе NaCl при концентрации 20 мкМ в отношении миРНК, 12 мкл для каждой группы, соответственно) отдельно хорошо смешивали с 27,2 мкл водного раствора цитрата натрия (pH 5,0), 4,08 мкл деионизированной воды и 2,72 мкл тритосом крысы (приобретали в Xenotech Inc., кат. R0610LT, № 1610069, в конечной концентрации 0,2 мЕд./мкл) и инкубировали при постоянной температуре, равной 37°C. 5 мкл образцов отбирали в каждый момент времени 0 ч, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч и 8 ч, соответственно, каждый добавляли в 15 мкл 9 М водного раствора мочевины для денатурации, добавляли 4 мкл загрузочного буфера (приобретали в Solarbio Inc., кат. № 20160830), затем незамедлительно криоконсервировали в морозильной камере при -80°C, чтобы погасить реакцию. 0 ч представляет собой момент времени, когда образцы хорошо смешивали с лизатом лизосом и незамедлительно вынимали. Образцы, не обработанные лизатом лизосом, 1,5 мкл для каждого из конъюгатов, описанных выше, в равных молях (20 мкМ) хорошо смешивали с 7,5 мкл водного раствора цитрата натрия (pH 5,0) и 1 мкл деионизированной воды, каждый из них добавляли в 15 мкл 9 М водного раствора мочевины для денатурации, добавляли 4 мкл загрузочного буфера (приобретали в Solarbio Inc., кат. № 20160830), затем незамедлительно криоконсервировали в морозильной камере при -80°C, чтобы погасить реакцию. Контрольные образцы для каждого конъюгата обозначали Контр. на электрофореграмме. Получали 16 % по массе неденатурирующий полиакриламидный гель. Каждый криоконсервированный образец целиком смешивали с 4 мкл загрузочного буфера (приобретали в Solarbio Inc., водный раствор 20 мМ ЭДТА, 36% по массе глицерина и 0,06 % по массе бромфенолового синего), а затем 20 мкл смеси загружали на гель для проведения электрофореза в течение 10 минут при 20 мА, а затем 30 минут при 40 мА. После окончания электрофореза гель окрашивали красителем Gelred (BioTium, кат. № 13G1203) в течение 10 минут, а затем визуализировали. Результаты представлены на фиг. 1A. Сопоставимая последовательность 1 представлена далее: смысловая: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (SEQ ID NO: 250); антисмысловая цепь: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (SEQ ID NO: 251).
[386] Следуя такому же способу, измеряли стабильность конъюгатов 105, 109, 111 и 115 в течение 6 часов, и результат представили на фиг. 1B.
[387] На фиг. 1A и 1B представлен полуколичественный результат анализа стабильности конъюгатов миРНК в тритосоме in vitro. Продемонстрировали, что конъюгаты согласно настоящему описанию могут оставаться недеградированными в течение длительного времени в тритосоме, проявляя хорошую стабильность.
Экспериментальный пример 2-2. Стабильность в плазме человека in vitro.
[388] Конъюгаты 24, 25, 42, 43, 62, 78 и Сопоставимую последовательность 1 (каждый предложен в 0,9% по массе водном растворе NaCl при концентрации 20 мкМ в отношении миРНК, 12 мкл для каждой группы) отдельно хорошо смешивали с 108 мкл 90% плазмы человека (разбавленной в ФБР) и инкубировали при постоянной температуре, равной 37°C. 10 мкл образцов отбирали в каждый момент времени 0 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч, соответственно, и незамедлительно замораживали в жидком азоте и криоконсервировали в морозильной камере при -80°C для дальнейшего применения. Тем временем, каждый из описанных выше конъюгатов в равных молях (2 мкМ, 2 мкл) хорошо смешивали с 8 мкл 1x ФБР, тем самым получая 10 мкл образцов, не обработанных плазмой человека (обозначены Контр.) Получали 20% по массе неденатурирующий полиакриламидный гель. Каждый криоконсервированный образец целиком смешивали с 4 мкл загрузочного буфера (водный раствор 20 мМ ЭДТА, 36 % по массе глицерина и 0,06 % по массе бромфенолового синего), а затем загружали на гель для проведения электрофореза в течение 60 минут при постоянном токе 80 мА. После окончания электрофореза гель окрашивали 1x красителем Sybr Gold (Invitrogen, кат. № 11494) в течение 15 минут, а затем визуализировали. Результаты представлены на фиг. 2A. Сопоставимая последовательность 1 представлена далее: смысловая: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (SEQ ID NO: 250); антисмысловая цепь: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (SEQ ID NO: 251).
[389] Следуя такому же способу измеряли стабильность конъюгатов 105, 109, 111 и 115 в течение 72 часов и результаты представили на фиг. 2B.
[390] На фиг. 2A и 2B представлен полуколичественный результат анализа стабильности исследованных конъюгатов миРНК в плазме человека in vitro. Продемонстрировали, что в плазме человека конъюгаты согласно настоящему описанию остаются недеградированными в течение до 72 часов, проявляя хорошую стабильность в плазме человека.
Экспериментальный пример 2-3. Стабильность в плазме обезьяны in vitro.
[391] Конъюгаты 24, 25, 42, 43, 62, 78 и Сопоставимую последовательность 2 (каждый предложен в 0,9% по массе водном растворе NaCl при концентрации 20 мкМ, соответственно, в отношении миРНК, 12 мкл для каждой группы, причем Сопоставимая последовательность 2 представляет собой миРНК со смысловой цепью, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, и антисмысловой цепью, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 81, при этом она не конъюгирована с какой-либо конъюгирующей молекулой) отдельно хорошо смешивали с 108 мкл 90% плазмы яванского макака (Плазма обезьяны, приобретенная у HONGQUAN Bio, кат. № HQ70082, разбавленная в ФБР) и инкубировали при постоянной температуре, равной 37°C. 10 мкл образцов отбирали в каждый момент времени 0 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч, соответственно, и незамедлительно замораживали в жидком азоте и криоконсервировали в морозильной камере при -80°C. После отбора образцов в каждый момент времени каждый образец разбавляли в 5 раз 1×ФБР (pH 7,4), а затем брали в объеме 10 мкл для дальнейшего применения. Тем временем, каждый из описанных выше конъюгатов в равных молях (2 мкМ, 2 мкл) хорошо смешивали с 8 мкл 1x ФБР, тем самым получая 10 мкл образцов, не обработанных плазмой обезьяны (обозначены Контр.). Получали 20% по массе неденатурирующий полиакриламидный гель. Каждый из разбавленных образцов целиком смешивали с 4 мкл загрузочного буфера (водный раствор 20 мМ ЭДТА, 36 % по массе глицерина и 0,06 % по массе бромфенолового синего), а затем загружали на гель для проведения электрофореза в течение 60 минут при постоянном токе 80 мА. После окончания электрофореза гель окрашивали 1x красителем Sybr Gold (Invitrogen, кат. № 11494) в течение 15 минут, а затем визуализировали. Результаты представлены на фиг. 3A.
[392] Стабильность конъюгатов 105, 109, 111 и 115 в течение 72 часов измеряли, следуя такому же способу, и результат представили на фиг. 3B.
[393] На фиг. 3A и 3B представлен полуколичественный результат анализа стабильности исследованных конъюгатов миРНК в плазме обезьяны in vitro. Продемонстрировали, что в плазме яванского макака конъюгаты согласно настоящему описанию остаются недеградированными в течение до 72 часов, проявляя хорошую стабильность в плазме обезьяны.
Экспериментальный пример 3. В данном эксперименте проиллюстрирована фармакокинетика конъюгатов 24 и 25 у крыс in vivo.
[394] В данном экспериментальном примере Конъюгаты 24 и 25 вводили крысам в каждой экспериментальной группе (10 крыс в каждой группе, половина самок и половина самцов) путем подкожной инъекции, соответственно, при этом разовая доза составляла 10 мг/кг и 50 мг/кг. Затем концентрацию лекарственного средства в плазме, ткани печени и почки крыс измеряли в каждый момент времени.
[395] Сначала крыс SD произвольно делили на группы в соответствии с их массой тела и полом, используя систему данных PRISTIMA 7.2.0, а затем, соответственно, вводили конъюгаты в соответствии с разработанной дозировкой. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 10 мг/кг и 50 мг/кг, соответственно, в виде 1 мг/мл и 5 мг/мл 0,9% водного раствора NaCl и в объеме 10 мл/кг. Цельную кровь крыс собирали из яремной вены перед введением и через 5 минут (±30 секунд), 30 минут (±1 минута), 1 час (±2 минуты), 2 часа (±2 минуты), 6 часов (±5 минут), 24 часа (±10 минут), 48 часов (±20 минут), 72 часа (±20 минут), 120 часов (±30 минут) и 168 часов (±30 минут) после введения. Затем образцы цельной крови центрифугировали при 2 - 8°C при 1800 x g в течение 10 минут, чтобы отделить плазму. Приблизительно 70 мкл объем образца плазмы помещали в одну пробирку, а оставшуюся часть того же образца помещали в другую, обе из которых криоконсервировали при от -70°C до -86°C для контроля. Ткани печени и почки крыс собирали приблизительно через 24, 48, 72, 120 и 168 часов после введения с помощью способа, включающего обезболивание крыс с помощью пентобарбитала натрия в соответствии с их массой тела (путем интраперитонеальной инъекции 60 мг/кг), умерщвление крыс путем сбора крови из брюшной аорты и проведение патологоанатомического исследования. Из печени и почки каждой крысы брали образец и хранили в криопробирке емкостью 1 мл при температуре ниже -68°C до момента измерения и анализа.
[396] Концентрации конъюгатов 24 и 25 в плазме, ткани печени и почки крыс количественно измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметирическим детектором (ВЭЖХ-ФЛД) в соответствии со следующими этапами:
(1) перемалывание до тех пор, пока не получат кусочки ткани массой не более 80 мг, затем добавление раствора для лизирования тканей и клеток (поставщик: Epicentre, кат. № MTC096H) с получением гомогената ткани при концентрации 66,7 мг/мл;
(2) обработку гомогената ткани ультразвуком (150 Вт, 30 с), чтобы разрушить клетки;
(3) для каждой группы образцов ткани, добавление 75 мкл образцов ткани в 96-луночный планшет для ПЦР, добавление 5 мкл протеиназы K (поставщик: Invitrogen, кат. № 25530-015) и 10 мкл смешанного водного раствора 10% по массе ацетонитрила и 0,01% по массе твин 20;
для каждой группы образцов плазмы, добавление 20 мкл плазмы в 96-луночный планшет для ПЦР, добавление 45 мкл раствора для лизирования тканей и клеток, 5 мкл протеиназы K и 20 мкл смешанной жидкости 10% по массе ацетонитрила и 0,01% по массе твин 20;
(4) закупоривание планшетов, помещение их в устройство для ПЦР (поставщик: Applied Biosystems, модель: Система ПЦР GeneAmp® 9700) и инкубация при 65°C в течение 45 минут;
(5) после окончания инкубации, добавление 10 мкл 3 М водного раствора KCl (поставщик: Sigma-aldrich, кат. № 60135-250ML), тщательное встряхивание и центрифугирование при 3200 rcf при 4°C в течение 15 минут;
(6) для каждой группы образцов ткани, добавление 80 мкл супернатанта в 120 мкл гибридизационной смеси (состав: 0,5 мл 6 мкМ ПНК-зонда (поставщик: TAHE-PNA), 1 мл 200 мМ Trizma/pH = 8, 5 мл 8 М водного раствора мочевины, 3,5 мл H2O, 2 мл ацетонитрила);
для каждой группы образцов плазмы, добавление 40 мкл супернатанта в 160 мкл гибридизационной смеси (состав: 0,5 мл 6 мкМ ПНК-зонда, 1 мл 200 мМ Trizma/pH = 8, 5 мл 8 М водного раствора мочевины, 7,5 мл H2O, 2 мл ацетонитрила);
(7) закупоривание планшетов и помещение их в устройство ПЦР, инкубация при 95°C в течение 15 минут, затем незамедлительное помещение на лед на 5 минут;
(8) перенос образцов в новые 96-луночные планшеты с коническим дном, тщательное встряхивание и центрифугирование при 3200 rcf в течение 1 минуты;
(9) ввод образцов для измерения и количественного анализа с применением ВЭЖХ-ФЛД (поставщик жидкофазной системы: Thermo Fisher, модель хроматографа: Ultimate 3000).
[397] Результаты анализа можно найти на фиг. 4 - 11. На фиг. 4 - 7 показаны метаболические профили в динамике ФК/ТК концентраций в плазме крыс и ФК/ТК концентраций в ткани печени и почки крыс для Конъюгата 24, соответственно; На фиг. 8 - 11 показаны метаболические профили в динамике ФК/ТК концентраций в плазме крысы и ФК/ТК концентраций в ткани печени и почки крысы для Конъюгата 25, соответственно. В частности:
На фиг. 4 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в плазме крысы для Конъюгата 24 при дозировке 10 мг/кг.
На фиг. 5 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в тканях для Конъюгата 24 в печени и почке крысы при дозировке 10 мг/кг.
На фиг. 6 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в плазме крысы для Конъюгата 24 при дозировке 50 мг/кг.
На фиг. 7 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в тканях для Конъюгата 24 в печени и почке крысы при дозировке 50 мг/кг.
На фиг. 8 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в плазме крысы для Конъюгата 25 крысы при дозировке 10 мг/кг.
На фиг. 9 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в тканях для Конъюгата 25 в печени и почке крысы при дозировке 10 мг/кг.
На фиг. 10 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в плазме крысы для Конъюгата 25 крысы при дозировке 50 мг/кг.
На фиг. 11 представлен метаболический профиль в динамике, показывающий ФК/ТК концентраций в тканях для Конъюгата 25 в печени и почке крысы при дозировке 50 мг/кг.
[398] Как можно видеть по результатам на ФИГ. 4 - 11, концентрации Конъюгатов 24 и 25 в плазме крысы быстро спадали ниже предела обнаружения в течение нескольких часов, тогда как их концентрации поддерживались на относительно стабильном уровне в течение по меньшей мере 168 часов в ткани печени крыс, как при низкой дозировке (10 мг/кг), так и при относительно высокой дозировке (50 мг/кг). Это показывает, что конъюгат миРНК, полученный путем конъюгирования Конъюгирующей молекулы L-9, может специфично и значительно накопиться в печени и оставаться стабильным, проявляя высокую степень нацеливания.
Экспериментальный пример 4. В данном эксперименте продемонстрирован эффект ингибирования целевой мРНК, вызванный конъюгатами, образованными из различных конъюгированных молекул, у мышей C57BL/6J.
[399] Сначала мышей C57BL/6J (все самки) произвольно делили на группы. Экспериментальные группы были пронумерованы: Конъюгат 158 (5 мышей), Сопоставимый конъюгат 14 (5 мышей) и контрольная группа ФБР (8 мышей), соответственно. Всем животным вводили дозу в соответствии с массой тела, и им подкожно вводили различные разовые дозы 1 мг/кг или 0,1 мг/кг. Объем вводимой дозы составлял 5 мл/кг. Для различных доз конъюгаты растворяли в 0,9% водного раствора хлорида натрия при концентрации 0,2 мг/мл и 0,02 мг/мл. Животных умерщвляли через 72 ч после введения и собирали печень; ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей, и общую РНК экстрагировали с помощью RNAVzol (VIGOROUS, партия: 161G) в соответствии со стандартной процедурой экстрагирования общей РНК.
[400] Уровень экспрессии мРНК TTR в ткани печени детектировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции. В частности, экстрагировную общую РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК, применяя систему для обратной транскрипции (Promega, партия №0000223677, № A3500), следуя инструкциям. Устройство для количественной флуоресцентной ПЦР (ABI step One) затем применяли для детектирования эффективности ингибиторного действия миРНК на экспрессию мРНК mTTR в ткани печени. В данном способе детектирования ген GAPDH использовали в качестве гена внутреннего контроля, и экспрессию mTTR и GAPDH детектировали, применяя праймеры для TTR и праймеры для GAPDH, соответственно.
[401] Последовательности детектирующих праймеров представлены в таблице 4.
Таблица 4. Последовательности детектирующих праймеров.
(SEQ ID NO: 187)
(SEQ ID NO: 188)
(SEQ ID NO: 189)
(SEQ ID NO: 190)
[402] В данном методе ПЦР в реальном времени экспрессия мРНК mTTR выражена в проценте от оставшейся величины экспрессии гена TTR, и ее рассчитывают, как описано далее:
Оставшаяся величина экспрессии гена TTR = (число копий гена TTR в тестируемой группе/число копий GAPDH в тестируемой группе)/(число копий гена TTR в контрольной группе/число копий GAPDH в контрольной группе) × 100%
[403] Степень ингибирования мРНК конъюгатом затем рассчитывали в соответствии со следующей формулой:
[404] Коэффициент ингибирования мРНК = (1- оставшаяся величина экспрессии гена TTR) × 100%,
[405] Где контрольная группа представляла собой мышей, которым вводили ФБР в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5. Эффект ингибирования мРНК mTTR у мышей.
[406] Результат демонстрирует, что несмотря на одинаковые последовательности миРНК и модификации, коэффициент ингибирования целевой мРНК конъюгатом 158 был значительно выше, чем таковой для Сопоставимого конъюгата 14.
[407] В следующих экспериментальных примерах с 5 по 11 свойства и действия конъюгатов миРНК, представленных в таблицах 3A - 3F, экспериментально проверяли в соответствии с взаимосвязью целевого положения миРНК и последовательности.
Экспериментальный пример 5. Эксперимент по проверке действия конъюгатов миРНК, представленных в таблице 3A.
Экспериментальный пример 5-1. Эксперимент по проверке нецелевых действий конъюгата 26.
[408] В соответствии со способом, описанным Kumico Ui-Tei и др., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008, 36(7), 2136-2151, конструировали плазмиды для детектирования и котрансфицировали ими клетки HEK293A совместно с конъюгатами миРНК, которые нужно детектировать; и уровень экспрессии двойного репортерного гена люциферазы измеряли, применяя набор для детектирования двойного репортера люциферазы. Конкретные этапы описаны далее.
[409] Конструирование плазмид для детектирования.
[410] Конструировали четыре рекомбинантные плазмиды, применяя плазмиду psiCHECK™-2 (Promega™), в которой GSCM экспрессировалась как целевая плазмида; и PSCM, GSSM и PSSM экспрессировались как нецелевые плазмиды:
[411] (1) GSCM, содержащая целевую последовательность, целевая последовательность полностью комплементарно спаривается со всеми 21 последовательностями нуклеотидов антисмысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать.
[412] (2) PSCM, содержащая целевую последовательность, целевая последовательность полностью комплементарно спаривается со всеми 21 последовательностями нуклеотидов смысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать.
[413] (3) GSSM, содержащая целевую последовательность, целевая последовательность полностью комплементарно спаривается с последовательностью нуклеотидов в положениях 1 - 8 с 5'-конца антисмысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать. Последовательность нуклеотидов в положениях 9 - 21 с 5'-конца антисмысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать, комплементарно не совпадает с соответствующей целевой последовательностью. Правило несовпадения: нуклеотид G, C, A или U в любом положении между 9 и 21 с 5'-конца антисмысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать, соответственно, несовпадает с нуклеотидами T, A, C или G в соответствующем положении целевой последовательности.
[414] (4) PSSM, содержащая целевую последовательность, целевая последовательность полностью комплементарно спаривается с последовательностью нуклеотидов в положениях 1 - 8 с 5'-конца смысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать. Последовательность нуклеотидов в положениях 9 - 21 с 5'-конца смысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать, комплементарно не совпадает с соответствующей целевой последовательностью. Правило несовпадения: нуклеотид G, C, A или U в любом положении между 9 и 21 с 5'-конца смысловой цепи в конъюгате, который нужно детектировать, соответственно, несовпадает с нуклеотидами T, A, C или G в соответствующем положении целевой последовательности.
[415] Целевую последовательность встраивали в сайт Xho I/Not I плазмиды psiCHECKTM-2.
[416] Трансфекция.
[417] В 96-луночном планшете проводили котрансфекцию миРНК и каждой из описанных выше плазмид, следуя инструкциям к липофектамину LipofectamineTM 2000 (Invitrogen), каждой плазмидой с 11 группами соответствующих миРНК при определенных концентрациях, соответственно. В частности, трансфицировали 10 нг плазмиды на лунку; и конечная концентрация на лунку котрансфицированной миРНК составляла от 100 нМ до 0,0001 нМ (4-кратные серийные разведения), 3 повторные лунки на группу, применяли 0,2 мкл LipofectamineTM 2000 на лунку.
[418] Детектирование.
[419] Через 24 часа после котрансфекции клетки HEK293A лизировали, используя набор для анализа двойного репортерного гена люциферазы (Promega, кат. № E2940), в соответствии с инструкцией по применению, для детектирования уровня экспрессии двойного репортерного гена люциферазы. Для каждой тестируемой группы с определенной концентрацией, необработанные конъюгатом образцы использовали в качестве контроля (контр). Уровень белка люциферазы Renilla (Ren) нормировали на уровень белка люциферазы светлячка (светл). Кривые доза-ответ строили по результатам активности, измеренным при различных концентрациях миРНК, и указанные кривые строили, применяя функцию log(ингибитор) относительно ответа - переменный уклон в программном обеспечении Graphpad 5.0, выраженную формулой ниже:
где
Y представляет собой уровень экспрессии оставшейся мРНК,
X представляет собой логарифм концентрации трансфицированной миРНК,
Bot представляет собой значение Y снизу от асимптоты,
Top представляет собой значение Y сверху от асимптоты,
LogIC50 представляет собой значение X, при котором Y принимает медианное значение между верхним и нижним от асимптоты, и HillSlope представляет собой уклон кривой.
[420] IC50 конъюгата, которую нужно детектировать, соответствующую GSCM, определяли путем расчета, основанного на кривой доза-эффект, а затем сравнивали с таковой для PSCM, GSSM или PSSM.
[421] Для Конъюгата 24 результаты представлены на фигурах 12A - 12D, и значение IC50 конъюгата 24, соответствующее GSCM, рассчитали как 0,0019 нМ; по сравнению с PSCM, GSSM или PSSM, Конъюгат 24 не проявил значительного ингибиторного действия при каждой концентрации миРНК, указывая на то, что у конъюгата миРНК согласно настоящему описанию относительно высокая активность in vitro и низкий уровень нецелевого действия.
Экспериментальный пример 5-2. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3A, экспрессии мРНК HBV in vivo.
[422] В данном экспериментальном примере исследовали эффективности ингибирования конъюгатами 16 и 24 экспрессии мРНК HBV в трансгенных по HBV мышах C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J.
[423] Сначала мышей C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J произвольно делили на группы на основании содержания HBsAg в сыворотке (все самки, 4 мыши в каждой группе) и соответственно маркировали как Конъюгат 16 и Конъюгат 24, и добавляли группу, которой вводили физиологический солевой раствор (ФР), в качестве контрольной группы. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 1 мг/кг, соответственно, при концентрации конъюгата 0,2 мг/мл и 0,02 мг/мл в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме дозы 5 мл/кг. Животных умерщвляли в День 14 после введения. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol, следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[424] Уровень экспрессии мРНК HBV в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК, применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулями миРНК экспрессии мРНК HBV в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР ген β-актина использовали в качестве гена внутреннего контроля, HBV и β-актин детектировали, применяя праймеры для HBV и β-актина, соответственно.
[425] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 5A.
Таблица 5A. Последовательности праймеров для детектирования.
(SEQ ID NO: 187)
(SEQ ID NO: 188)
(SEQ ID NO: 192)
[426] В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР экспрессию мРНК HBV выражали в виде оставшейся экспрессии гена HBV и рассчитывали с помощью следующего уравнения:
Оставшаяся экспрессия гена HBV = (число копий гена HBV в тестируемой группе/число копий гена β-актина в тестируемой группе)/(число копий гена HBV в контрольной группе/число копий гена β-актина в контрольной группе) × 100%, которая обозначена как экспрессия мРНК HBV X/β-актина.
[427] Затем степень ингибирования конъюгатом по отношению к мРНК рассчитывали в соответствии со следующим уравнением:
Степень ингибирования по отношению к мРНК = (1- оставшаяся экспрессия гена HBV) × 100%,
где контрольная группа представляла собой группу контрольных мышей, которым вводили ФР, в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК, соответственно. Результаты представлены на фиг. 13.
[428] В других экспериментах, далее проводили два анализа, следуя приведенному ниже протоколу:
применяли описанный выше способ, за исключением того, что конъюгированную миРНК, которую вводили для анализа, заменяли на Конъюгат 17, 25, 159 и 160, и собирали данные в день 7; и
применяли описанный выше способ, за исключением того, что конъюгированную миРНК, которую вводили для анализа, заменяли на Конъюгат 24, 161, 162 и 163, и собирали данные в день 28, и каждый конъюгат вводили в дозировках, составляющих 1 мг/кг и 0,3 мг/кг (причем объем дозы оставался таким же, тогда как концентрацию раствора конъюгата изменяли соответствующим образом). Результаты данных анализов, соответственно, представлены на фиг. 14 и 15.
[429] По описанным выше результатам можно увидеть, что в нескольких экспериментах с различными моментами времени тестирования, все описанные выше конъюгаты согласно настоящему описанию проявили высокую ингибиторную активность в отношении экспрессии мРНК HBV у мышей in vivo.
Экспериментальный пример 5-3. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами миРНК с различными конъюгирующими молекулами, представленными в таблице 3A, экспрессии ДНК HBsAg и HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей.
[430] Согласно способу, описанному в Экспериментальном примере 4, проведенному на мышах 44Bri HBV, Последовательности для детектирования из таблицы 5A использовали в качестве праймеров для измерения эффективности ингибирования конъюгатами 25, 164, 165 и 166 в отношении целевой мРНК. Результаты данного эксперимента, соответственно, представлены в таблице 6A.
Таблица 6A. Эффективность ингибирования конъюгатами миРНК в отношении целевой мРНК.
[431] В таблице 6A можно увидеть, что конъюгаты миРНК, образованные различными конъюгирующими молекулами согласно настоящему описанию, проявляют превосходную эффективность ингибирования в отношении целевой мРНК у мышей in vivo.
Экспериментальный пример 5-4. В данном эксперименте проиллюстрирован анализ зависимости от времени эффективности ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3A, в отношении ДНК HBsAg и HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей.
[432] Использовали модель на мышах AAV-HBV. После успешного создания моделей на животных, данных мышей произвольно делили на группы на основании содержания HBsAg в сыворотке (5 мышей в каждой группе). Конъюгаты 24, 25 и Сопоставимый конъюгат 15, соответственно, вводили каждой группе, и ФР использовали в качестве пустого контроля. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно в дозировке 3 мг/кг, и предоставили в концентрации 0,6 мг/мл в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме 5 мл/кг. Кровь брали из глазничного венозного сплетения мыши перед введением и в Дни 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 154, 168 и 182 после введения, и уровень HBsAg в сыворотке измеряли в каждый момент времени. Во время данного эксперимента анализ субъекта заканчивали после того, как содержание HBsAg в сыворотке оказывалось близким или превышающим исходное значение его результата тестирования.
[433] Количество крови, взятой из глазниц, каждый раз составляло приблизительно 100 мкл, и количество сыворотки составляло не менее 20 мкл после центрифугирования. Уровень экспрессии HBsAg в сыворотке измеряли, применяя набор HBsAg CLIA (Autobio, CL0310). Уровень экспрессии ДНК HBV измеряли путем экстрагирования ДНК из сыворотки, руководствуясь инструкцией к набору для выделения ДНК из крови QIAamp 96 DNA Blood, с последующей количественной ПЦР.
[434] Нормированная экспрессия HBsAg = (содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении HBsAg = (1 - содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%, где содержание HBsAg выражали в эквивалентах (МЕ) HBsAg на миллилитр (мл) сыворотки.
[435] Нормированная экспрессия ДНК HBV = (содержание ДНК HBV после введения/содержание ДНК HBV до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении ДНК HBV = (1 - содержание ДНК HBV после введения/содержание ДНК HBV до введения) × 100%,
где содержание ДНК HBV выражено в копиях ДНК HBV на миллилитр (мл) сыворотки.
[436] Результаты представлены на фиг. 16 и 17. По результатам, представленным на фиг. 16, можно увидеть, что для группы отрицательного контроля, которой вводили ФР, не выявили ингибиторного действия в различные моменты времени после введения; напротив, для обоих Конъюгатов 24 и 25 выявили превосходное ингибиторное действие против HBsAg в различные моменты времени после введения. В частности, Конъюгат 24 при дозе 3 мг/кг стабильно проявлял высокую степень ингибирования HBsAg в сыворотке в течение периода, составляющего до 140 дней, указывая на то, что он может стабильно и эффективно ингибировать экспрессию гена HBV в течение более длительного периода.
[437] По результатам, представленным на фиг. 17, можно увидеть, что конъюгат миРНК в каждом примере также проявил эффективное ингибирование по отношению к экспрессии ДНК HBV и сохранял относительно высокую степень ингибирования в течение периода вплоть до 84 дней.
[438] Напротив, хотя Сравнительные конъюгаты 15 достигают приблизительно такого же ингибиторного действия в отношении мРНК, как в каждом примере в первые 28 дней, после этого их ингибиторные действия заметно уменьшаются, таким образом, продолжительность их ингибиторного действия, показанная на фиг. 16 и фиг. 17, значительно короче, чем таковая для конъюгатов 24 и 25 при том же уровне дозы.
[439] Следуя таким же способам, как описанные выше, проводили четыре дополнительных теста, в которых измеряли HBsAg в сыворотке, за исключением того, что:
Моделям на мышах с низкой концентрацией AAV-HBV вводили дозу 3 мг/кг и 1 мг/кг конъюгата 25, соответственно, ФР использовали в качестве контроля, тест продолжался до дня 140, и результаты представлены на фиг. 18;
Моделям M-Tg вводили дозу 3 мг/кг и 1 мг/кг Конъюгатов 17 и 25, соответственно, ФБР вводили в качестве контроля, тест продолжался до дня 70, и результаты представлены на фиг. 19;
Моделям M-Tg вводили дозу 5 мг/кг, 1 мг/кг и 0,2 мг/кг Конъюгата 26 и 5 мг/кг Сопоставимого конъюгата 15, соответственно, ФБР вводили в качестве контроля, тест продолжался до дня 78, и результаты представлены на фиг. 20;
1,28-копийным моделям вводили дозу 3 мг/кг и 1 мг/кг Конъюгата 24, соответственно, тест продолжался до дня 210, и результаты представлены на фиг. 21.
[440] Для различных указанных выше дозировок, каждый конъюгат вводили в одинаковом объеме дозы, тогда как концентрацию раствора конъюгата изменяли в отдельности, чтобы ввести соответствующую дозу.
[441] По результатам, представленным на фиг. 18 - 21, можно увидеть, что конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению проявили длительную и действенную эффективность ингибирования в отношении HBsAg в сыворотке в различных моделях на животных, и выявили регулярную зависимость от дозы.
Экспериментальный пример 6. Эксперимент по проверке действия конъюгатов миРНК, представленных в таблицах 3B - 3D.
Экспериментальный пример 6-1. Анализ нецелевого действия Конъюгатов 43, 62 и 78.
В соответствии со способами, описанными в Экспериментальном примере 5-1, отдельно исследовали нецелевое действие конъюгатов 43, 62 и 78 за исключением того, что: для каждого конъюгата целевую последовательность, полностью комплементарно спаривающуюся с последовательностью антисмысловой цепи миРНК в соответствующем конъюгате, использовали для конструирования целевой плазмиды GSCM, тогда как целевые последовательности, полностью совпадающие с последовательностью антисмысловой цепи, комплементарно спаривающиеся с положениями 1 - 8 последовательности антисмысловой цепи или совпадающие с положениями 1 - 8 последовательности антисмысловой цепи миРНК в соответствующем конъюгате, соответственно, использовали для конструирования нецелевых плазмид GSSM, PSCM и PSSM. Результаты представлены на фиг. 22 - 24, соответственно. По результатам, представленным на фиг. 22 - 24, можно увидеть, что все описанные выше конъюгаты не только оказывают превосходное ингибиторное действие в отношении целевой мРНК, но также проявляют низкий уровень нецелевых действий.
Экспериментальный пример 6-2. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами согласно настоящему описанию экспрессии мРНК HBV у мышей in vivo.
[442] В данном экспериментальном примере исследовали эффективности ингибирования конъюгатами 25, 42, 43, 62 и 78 экспрессии мРНК HBV в трансгенных по HBV мышах C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J.
[443] Сначала мышей C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J произвольно делили на группы на основании содержания HBsAg в сыворотке (все самки, 4 мыши в каждой группе) и маркировали отдельно, и группу ФР добавляли в качестве контрольной группы. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу конъюгата 24 или 42 вводили подкожно, каждый в дозировке 1 мг/кг или 0,1 мл/кг, соответственно, в виде 0,2 мг/мл и 0,02 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме дозы 5 мл/кг. Животных умерщвляли в День 7 после введения. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol, следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[444] Уровень экспрессии мРНК HBV в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК, применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулами миРНК экспрессии мРНК HBV в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР ген β-актина использовали в качестве гена внутреннего контроля, HBV и β-актин детектировали, применяя праймеры для HBV и β-актина, соответственно.
[445] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 5A.
[446] В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР расчет экспрессии мРНК HBV, а также степени ингибирования мРНК для конъюгатов соответствовали таковым в Экспериментальном примере 5-2,
где контрольная группа представляла собой группу контрольных мышей, которым вводили ФР в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК, соответственно. Результаты представлены на фиг. 25.
[447] В других экспериментах далее проводили два анализа, следуя приведенному ниже протоколу:
[448] применяли описанный выше способ, за исключением того, что конъюгированную миРНК, которую вводили для анализа, заменяли на Конъюгат 43, 62, 78 и 25, и собирали данные в день 7, результаты представлены на фиг. 26; и
[449] применяли описанный выше способ, за исключением того, что конъюгированную миРНК, которую вводили для анализа, заменяли на Конъюгат 42, 43 и 25, и каждый из Конъюгатов 42 и 25 вводили в дозировках, составляющих 1 мг/кг и 0,1 мг/кг (причем объем дозы оставался таким же, тогда как концентрацию раствора конъюгата изменяли соответствующим образом). Более того, последовательности праймеров для детектирования заменяли на последовательности, представленные в таблице 5B. Результаты представлены на фиг. 27.
Таблица 5B. Последовательности праймеров для детектирования.
(SEQ ID NO: 187)
(SEQ ID NO: 188)
(SEQ ID NO: 192)
[450] На фиг. 26 и 27 можно увидеть, что все описанные выше конъюгаты согласно настоящему описанию проявили высокую ингибиторную активность в отношении экспрессии мРНК HBV у мышей in vivo. Более того, их ингибиторное действие в отношении различных видов мРНК HBV остается практически одинаковым.
Экспериментальный пример 6-3. В данном эксперименте проиллюстрирован анализ зависимости от времени эффективности ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3B, экспрессии ДНК HBsAg и HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей.
[451] Использовали модель на мышах с низкой концентрацией AAV-HBV. После успешного создания моделей на животных, данных мышей произвольно делили на группы на основании содержания HBsAg в сыворотке (5 мышей в каждой группе). Конъюгат 43, соответственно, вводили каждой группе, и ФБР использовали в качестве пустого контроля. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 3 мг/кг или 1 мг/кг при концентрации 0,6 мг/мл или 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме 5 мл/кг. Кровь брали из глазничного венозного сплетения мыши до введения и в Дни 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 126 и 140 после введения, и уровень HBsAg в сыворотке измеряли в каждый момент времени.
[452] Количество крови, взятой из глазниц, каждый раз составляло приблизительно 100 мкл, и количество сыворотки составляло не менее 20 мкл после центрифугирования. Содержание HBsAg в сыворотке измеряли, применяя набор HBsAg CLIA (Autobio, CL0310).
[453] Нормированная экспрессия HBsAg = (содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении HBsAg = (1 - содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%, где содержание HBsAg выражали в эквивалентах (МЕ) HBsAg на миллилитр (мл) сыворотки.
[454] Результаты представлены на фиг. 28. По результатам, представленным на фиг. 28, можно увидеть, что в группе отрицательного контроля, которой вводили ФР, не выявили ингибиторного действия в различные моменты времени после введения; наоборот, Конъюгат 43 оказывал превосходное ингибиторное действие в отношении HBsAg в различные моменты времени после введения, и стабильно проявлял высокую степень ингибирования HBsAg в сыворотке в течение периода, составляющего до 100 дней, указывая на то, что он может стабильно и эффективно ингибировать экспрессию гена HBV в течение более длительного периода.
[455] В дополнительных экспериментах, согласно описанным выше способам, модели на мышах M-tg вводили дозу 3 мг/кг и 1 мг/кг Конъюгатов 24, 62 и 78, соответственно, при концентрации 0,6 мг/мл или 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме 5 мл/кг. Тест продолжался до дня 85, и результаты представлены на фиг. 29 и 30.
[456] По результатам на фиг. 29 можно увидеть, что все Конъюгаты 24, 62 и 78 проявили длительную и действенную эффективность ингибирования в отношении HBsAg в сыворотке в течение вплоть до 85 дней. По результатам на фиг. 30, в День 85 после введения Конъюгаты 24 и 78 при дозировке 3 мг/кг все еще проявляли 68,6% и 62% ингибирования мРНК HBV, соответственно.
[457] В дополнительных экспериментах, согласно описанным выше способам, мышам 1,28-копийной модели вводили дозу 3 мг/кг и 1 мг/кг Конъюгата 43, соответственно, при концентрации 0,6 мг/мл или 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме 5 мл/кг. Тест продолжался до дня 85. Ингибиторное действие в отношении ДНК HBsAg и HBV измеряли согласно Экспериментальному примеру 5-4, и результаты представлены на фиг. 31 и 32.
[458] По результатам, представленным на фиг. 31 и 32, можно увидеть, что в 1,28-копийной модели на мышах Конъюгат 43 проявил непрерывное эффективное ингибирование экспрессии HBV, а также ДНК HBV в течение вплоть до 85 дней.
Экспериментальный пример 7. Эксперимент по проверке действия конъюгатов 167 и 168.
Экспериментальный пример 7-1. В данном эксперименте проиллюстрировано, что конъюгат миРНК согласно настоящему описанию не только проявляет относительно высокую активность in vitro, но также проявляет низкое нецелевое действие.
[459] В данном экспериментальном примере Конъюгат 168 исследовали в системе in vitro psiCHECK для выявления целевой активности и нецелевого действия. Говоря более конкретно, исследовали активность Конъюгата 168 в отношении нацеливания на полностью соответствующую целевую последовательность (в которой последовательность нуклеотидов полностью комплементарна или совпадает с последовательностью нуклеотидов по всей длине антисмысловой цепи Конъюгата 168) или нацеливания на затравочную область, соответствующую целевой последовательности (в которой последовательность нуклеотидов комплементарна или совпадает с последовательностью нуклеотидов в положениях 1 - 8 антисмысловой цепи конъюгата 168).
[460] Исследовали Конъюгат 168 в соответствии со способами, описанными в Экспериментальном примере 5-1, за исключением того, что целевую последовательность, полностью комплементарно спаривающуюся с последовательностью антисмысловой цепи миРНК в Конъюгате 168, использовали для конструирования целевой плазмиды GSCM, тогда как целевые последовательности, полностью совпадающие с последовательностью антисмысловой цепи, комплементарно спаривающиеся с положениями 1 - 8 последовательности антисмысловой цепи или совпадающие с положениями 1 - 8 последовательности антисмысловой цепи миРНК в Конъюгате 168, соответственно, использовали для конструирования нецелевых плазмид GSSM, PSCM и PSSM. По результатам теста можно увидеть, что все описанные выше конъюгаты не только оказывают превосходное ингибиторное действие в отношении целевой мРНК (с IC50 = 0,0513 нМ), но также проявляют низкий уровень нецелевых действий.
Экспериментальный пример 7-2. В данном эксперименте проиллюстрирована стабильность конъюгатов миРНК в лизате лизосом in vitro.
[461] Конъюгаты 167 и Сопоставимую последовательность 1, полученную в Примере получения 1 (каждый предложен в 0,9% по массе водном растворе NaCl при концентрации 20 мкМ в отношении миРНК, 6 мкл для каждой группы, соответственно, и Сопоставимую последовательность 1 обозначали ОК), отдельно хорошо смешивали с 27,2 мкл водного раствора цитрата натрия (pH 5,0), 4,08 мкл деионизированной воды и 2,72 мкл тритосом крысы (приобретали в Xenotech Inc., кат. № R0610LT, в конечной концентрации 0,2 мЕд./мкл), и инкубировали при постоянной температуре, равной 37°C. 5 мкл образцов отбирали в каждый момент времени 0 ч, 1 ч, 2 ч, 6 ч и 24 ч, соответственно, каждый из них добавляли в 15 мкл 9 М водного раствора мочевины для денатурации, и незамедлительно криоконсервировали в морозильной камере при -80°C для дальнейшего применения, причем 0 ч представляет собой момент времени, в который конъюгат миРНК хорошо смешивали с лизатом лизосом и незамедлительно вынимали для тестирования. Тем временем, для Конъюгата 167 и Сопоставимой последовательности 1, равное молярное соотношение миРНК (20 мкМ, 1,5 мкл) отдельно хорошо смешивали с 7,5 мкл водного раствора цитрата натрия (pH 5,0) и 1 мкл деионизированной воды, затем добавляли к 30 мкл 9 М водного раствора мочевины для денатурации, а затем хорошо смешивали с 8 мкл 6x загрузочного буфера (водный раствор 20 мМ ЭДТА, 36 % по массе глицерина и 0,06 % по массе бромфенолового синего), и незамедлительно криоконсервировали в морозильной камере при -80°C, чтобы погасить реакцию, таким образом получая образцы для тестирования, которые не обработаны лизатом лизосом (обозначали М на электрофореграмме). Получали 16% по массе неденатурирующий полиакриламидный гель. 20 мкл каждого образца для тестирования отдельно загружали на гель для проведения электрофореза в течение 60 минут при постоянном токе 80 мА. После окончания электрофореза гель окрашивали 1x красителем Sybr Gole (Invitrogen, кат. № 11494) в течение 15 минут, а затем визуализировали. Результаты представлены на фиг. 33.
[462] Стабильность в лизате лизосом, полученных из крыс, Конъюгата 167 и Сопоставимой последовательности 1 (обозначили ОК на фиг. 34) измеряли, следуя такому же способу, за исключением того, что лизат лизосом, полученных из человека, заменяли на лизат лизосом, полученных из крыс (тритосомы из печени крысы приобретали в Xenotech Inc., кат. № R0610.LT, в конечной концентрации 0,2 мЕд./мкл). Результат представили на фиг. 34.
[463] На фиг. 33 и 34 показано, что конъюгаты согласно настоящему описанию могут оставаться недеградированными в течение по меньшей мере 24 часов в лизате лизосом, полученных как из человека, так и из крыс, проявляя хорошую стабильность.
Экспериментальный пример 7-3. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами согласно настоящему описанию экспрессии мРНК HBV у мышей in vivo.
[464] В данном экспериментальном примере исследовали эффективности ингибирования конъюгатами 167 и 168 экспрессии мРНК HBV в трансгенных по HBV мышах C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J.
[465] Сначала мышей C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J произвольно делили на группы на основании содержания HBsAg в сыворотке (все самки, 5 мышей в каждой группе) и группу ФБР, и отдельно вводили Конъюгаты 167 и 168. При этом 5 мг/кг 1x ФБР вводили подкожно каждому животному в группе ФБР. Для Конъюгатов 167 или 168, разовую дозу конъюгата вводили подкожно, каждый в дозировке 1 мг/кг в виде 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и в объеме дозы 5 мл/кг. Животных умерщвляли в День 28 после введения. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol, следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[466] Уровень экспрессии мРНК HBV в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК, применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулами миРНК экспрессии мРНК HBV в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР ген β-актина использовали в качестве гена внутреннего контроля, HBV и β-актин детектировали, применяя праймеры для HBV и β-актина, соответственно.
[467] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 5G.
Таблица 5G. Последовательности праймеров для детектирования.
(SEQ ID NO: 238)
(SEQ ID NO: 239)
(SEQ ID NO: 240)
(SEQ ID NO: 241)
[468] В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР расчет экспрессии мРНК HBV, а также степени ингибирования мРНК для конъюгатов соответствовали таковым в Экспериментальном примере 5-2. Результаты представлены в таблице 6G.
[469] В других экспериментах, применяли описанный выше способ, за исключением того, что конъюгированную миРНК, которую вводили для анализа, заменяли на Конъюгат 167 и 168, и изменяли дозировку введения, результаты представлены в таблице 6G.
Таблица 6G. Ингибирование экспрессии мРНК HBV конъюгатами миРНК в печени мыши.
[470] По результатам выше можно увидеть, что все описанные выше конъюгаты согласно настоящему описанию проявили высокую ингибиторную активность в отношении экспрессии мРНК HBV у мышей in vivo, иллюстрируя хорошую эффективность доставки in vivo конъюгатов миРНК согласно настоящему описанию.
Экспериментальный пример 7-4. В данном эксперименте проиллюстрирован анализ зависимости от времени эффективности ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3B, экспрессии ДНК HBsAg и HBV в сыворотке трансгенных по HBV мышей.
[471] В 1,28-копийных моделях данных мышей произвольно делили на группы (6 мышей в каждой группе, половина самок и половина самцов). Каждой группе вводили нормальный солевой раствор и различные дозировки конъюгата 168, соответственно, и группам ФР вводили подкожно 5 мл/кг нормального солевого раствора. Для групп, которым вводили конъюгат, дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 3 мг/кг или 1 мг/кг, при концентрации 0,6 мг/мл или 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и объеме 5 мл/кг. Кровь брали из глазничного венозного сплетения мыши до введения и в Дни 7, 13, 21, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126, 140 и 154 после введения, и измеряли уровень в сыворотке HBsAg, HBeAg, а также ДНК HBV в каждый момент времени.
[472] Количество крови, взятой из глазниц, каждый раз составляло приблизительно 100 мкл, и количество сыворотки составляло не менее 20 мкл после центрифугирования. Содержание HBsAg в сыворотке измеряли, применяя набор HBsAg CLIA (Autobio, CL0310). Содержание HBeAg в сыворотке измеряли, применяя набор HBeAg CLIA (Autobio, CL0310). Уровень экспрессии ДНК HBV измеряли путем экстрагирования ДНК из сыворотки, руководствуясь инструкцией к набору QIAamp 96 DNA Blood, с последующей количественной ПЦР.
[473] Нормированная экспрессия HBsAg = (содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении HBsAg = (1 - содержание HBsAg после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%, где содержание HBsAg выражали в эквивалентах (МЕ) HBsAg на миллилитр (мл) сыворотки.
[474] Нормированная экспрессия HBeAg = (содержание HBeAg после введения/содержание HBeAg до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении HBeAg = (1 - содержание HBeAg после введения/содержание HBeAg до введения) × 100%, где содержание HBeAg выражали в эквивалентах (МЕ) HBeAg на миллилитр (мл) сыворотки.
[475] Нормированная экспрессия ДНК HBV = (содержание ДНК HBV после введения/содержание HBsAg до введения) × 100%.
Степень ингибирования в отношении ДНК HBV = (1 - содержание ДНК HBV после введения/содержание ДНК HBV до введения) × 100%,
причем содержание ДНК HBV выражено в копиях ДНК HBV на миллилитр (мл) сыворотки.
[476] Результаты представлены на фиг. 35 - 37. По результатам, представленным на фиг. 35, можно увидеть, что группа отрицательного контроля, которой вводили ФР, не проявила ингибиторного действия в различные моменты времени после введения; напротив, обе группы конъюгата 168 проявили превосходное ингибиторное действие в отношении HBsAg в различные моменты времени после введения, особенно группа, которой вводили 3 мг/кг, стабильно проявляла степень ингибирования более 90% в отношении HBsAg в сыворотке в течение периода, составляющего до 100 дней, указывая на то, что данный конъюгат может стабильно и эффективно ингибировать экспрессию гена HBV в течение более длительного периода.
[477] По результатам, представленным на фиг. 36, можно увидеть, что конъюгаты миРНК также могут ингибировать экспрессию HBeAg. Причем обе группы 3 мг/кг стабильно проявляли степень ингибирования более 50% в отношении HBsAg в сыворотке в течение периода, составляющего до 70 дней.
[478] По результатам на фиг. 37 можно увидеть, что конъюгаты также проявили действенную эффективность ингибирования экспрессии ДНК HBV и проявили относительно высокую степень ингибирования ДНК HBV в течение периода, составляющего до 154 дней.
Экспериментальный пример 8. Эксперимент по проверке действия конъюгатов миРНК, представленных в таблице 3E.
Экспериментальный пример 8-1. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3E, экспрессии мРНК ANGPTL3 in vivo.
[479] В данном экспериментальном примере исследовали соотношения ингибирования для Конъюгатов 105, 109, 111 и 115 уровня экспрессии ANGPTL3 в ткани печени нормальных мышей BALB/c.
[480] Нормальных мышей BALB/c (возраст 6 - 8 недель, приобретали в Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) произвольно делили на группы (5 мышей в каждой группе). Конъюгаты 105, 109, 111, 115 и ФБР отдельно вводили мышам в каждой группе. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 3 мг/кг и 0,3 мг/кг (по количеству миРНК) в виде 0,3 мг/мл и 0,03 мг/мл 0,9% по массе водного раствора NaCl и в объеме дозы 10 мл/кг для конъюгатов миРНК. Мышей умерщвляли группами, соответственно, в День 14 и День 28 после введения. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol (Thermo Fisher), следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[481] Уровень экспрессии мРНК ANGPTL3 в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулами миРНК экспрессии мРНК ANGPTL3 в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР, ген GAPDH использовали в качестве гена внутреннего контроля и ANGPTL3 и GAPDH детектировали, применяя праймеры для ANGPTL3 и GAPDH, соответственно.
[482] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 5E.
(SEQ ID NO: 199)
(SEQ ID NO: 200)
(SEQ ID NO: 201)
(SEQ ID NO: 202)
[483] Экспрессию мРНК ANGPTL3 рассчитывали с помощью уравнения: экспрессия мРНК ANGPTL3 = (экспрессия мРНК ANGPTL3 в тестируемой группе/экспрессия мРНК GAPDH в тестируемой группе)/(экспрессия мРНК ANGPTL3 в контрольной группе/экспрессия мРНК GAPDH в контрольной группе) × 100%.
[484] Соотношение ингибирования мРНК ANGPTL3 конъюгатами рассчитывали с помощью уравнения: экспрессия мРНК ANGPTL3 = (1 - экспрессия мРНК ANGPTL3 в тестируемой группе/экспрессия мРНК GAPDH в тестируемой группе)/(экспрессия мРНК ANGPTL3 в контрольной группе/экспрессия мРНК GAPDH в контрольной группе) × 100%. Контрольная группа представляла собой группу контрольных мышей, которым вводили ФБР в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК, соответственно. Результаты представлены на фиг. 38A и 38B.
[485] По результатам на фиг. 38A и 38B можно увидеть, что все описанные выше конъюгаты миРНК проявляют превосходную ингибиторную активность в отношении экспрессии мРНК ANGPTL3.
[486] Кровь (приблизительно 100 мкл) брали из глазниц экспериментальных субъектов, описанных выше, и центрифугировали с получением сыворотки. Содержание общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке дополнительно измеряли, применяя полностью автоматический биохимический анализатор сыворотки PM1P000/3 (SABA, Италия). Результаты для липидов крови нормировали, и соотношение ингибирования в отношении уровней липидов крови рассчитывали с помощью уравнения: соотношение ингибирования = (1 - содержание липидов крови в тестируемой группе после введения/содержание липидов крови в тестируемой группе до введения) × 100%. Липиды крови относятся к общему холестерину или триглицериду. Результаты тестов представлены на фиг. 39A и 39B.
[487] По результатам на фиг. 39A и 39B можно увидеть, что в сыворотке мышей, которых лечили различными дозировками Конъюгатов 105, 109, 111 и 115, содержание как холестерина (ОХ), так и триглицеридов (ТГ) значительно снижалось, и снижение уровня липидов крови наблюдали в течение до по меньшей мере 28 дней после введения.
Экспериментальный пример 8-2. В данном эксперименте проиллюстрировано действие на липиды крови конъюгатов миРНК согласно настоящему описанию.
[488] Мышей Tg(APOC3)3707Bres произвольно делили на группы на основании содержания ТГ > 2 ммоль/л (5 мышей в каждой группе), и каждой группе отдельно вводили отрицательный контроль ФБР и Конъюгат 115. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Вводили подкожно разовую дозу конъюгатов, каждый в дозировке 3 мг/кг или 1 мг/кг, каждый в виде 0,6 мг/мл или 0,2 мг/мл конъюгата в 0,9% по массе водного раствора NaCl и в объеме дозы 5 мл/кг. Кровь брали из глазниц мышей перед введением и через 7, 14, 21, 28, 35, 56, 70, 84, 98, 112, 126, 140, 154 и 168 дней после введения, и измеряли содержания ОХ и ТГ в сыворотке.
[489] Количество крови, взятой из глазниц, составляло приблизительно 0,1 мл каждый раз, и количество сыворотки составляло не менее 20 мкл после центрифугирования. Содержание общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке измеряли, применяя полностью автоматический биохимический анализатор сыворотки PM1P000/3 (SABA, Италия).
[490] Результаты для липидов крови нормировали: нормированные уровни липидов крови = (содержание липидов крови в тестируемой группе после введения/содержание липидов крови в тестируемой группе до введения), и соотношение ингибирования в отношении уровней липидов крови = (1 - содержание липидов крови в тестируемой группе после введения/содержание липидов крови в тестируемой группе до введения) × 100%. Результаты тестов представлены на фиг. 40A и 40B.
[491] По результатам на фиг. 40A и 40B можно увидеть, что в различные моменты времени после введения Конъюгат 115 проявил значительное действие в отношении снижения ТГ и ОХ в течение до 168 дней, свидетельствуя о стабильном и эффективном ингибировании в течение длительного времени в отношении экспрессии гена ANGPTL3 у мышей in vivo.
[492] В других экспериментах применяли описанный выше способ, за исключением того, что: использовали модель на мышах ob/ob; Конъюгаты 111, 115 и Сопоставимый конъюгат 16 вводили отдельно, каждый при дозировке 3 мг/кг и 1 мг/кг; и данные собирали в дни 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 41 после введения. Результаты представлены на фиг. 41A - 41B.
[493] По результатам на фиг. 41A - 41B можно увидеть, что Конъюгаты 111 и 115 согласно настоящему описанию могут непрерывно снижать уровень липидов крови у мышей ob/ob in vivo в течение 41 дня, проявив превосходную ингибиторную активность.
[494] В других экспериментах применяли описанный выше способ, за исключением того, что: Конъюгат 111 и Сопоставимый конъюгат 16 вводили отдельно, каждый при дозировке 3 мг/кг и 1 мг/кг, соответственно, в виде 0,6 мг/мл и 0,2 мг/мл 0,9% по массе водного раствора NaCl, и объем дозы составлял 5 мл/кг; и значения ОХ и ТГ проверяли в дни 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 56 и 70 после введения. Результаты представлены на фиг. 42A - 42D.
[495] По результатам на фиг. 42A - 42D можно увидеть, что Конъюгат 111 согласно настоящему описанию может лучше непрерывно снижать уровень липидов крови в течение 70 дней, по сравнению с Сопоставимым конъюгатом 16 при том же уровне дозировки.
Экспериментальный пример 8-3. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами миРНК с различными конъюгирующими молекулами, представленными в таблице 3A, экспрессии мРНК ANGPTL3 и влияния на липиды крови у отличных от человека приматов.
[496] В отношении обезьян с метаболическим синдромом (все самцы), 12 животных делили на следующие группы: 8 в экспериментальной группе, которым вводили дозу Конъюгата 169, и 4 в контрольной группе, которым вводили дозу Конъюгата 25; проверяли базовые данные для указанных обезьян и наблюдали их в течение 3 недель, еженедельно брали кровь, измеряли уровень липидов крови (ТГ, ОХ, ЛПВП). Впоследствии вводили Конъюгат 169 и Конъюгат 25 (в качестве сопоставимого конъюгата, так как миРНК в нем нацелена на полностью постороннюю мРНК). Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 9 мг/кг (по количеству миРНК) в виде 100 мг/мл 0,9% по массе водного раствора NaCl и в объеме дозы не более 2 мл для каждого места введения. Кровь брали до и через 7, 14, 21, 28 и 35 дней после введения, уровень ТГ и ОХ в сыворотке исследовали в каждый момент времени.
[497] Результаты для липидов крови нормировали, нормированные уровни липидов крови = (содержание липидов крови в тестируемой группе после введения/содержание липидов крови в тестируемой группе до введения), и соотношение ингибирования в отношении уровней липидов крови = (1 - содержание липидов крови в тестируемой группе после введения/содержание липидов крови в тестируемой группе до введения) × 100%. При этом содержание липидов крови в тестируемой группе до введения представляет собой среднее значение липидов крови в течение 3 недель до введения и отмечено в Д0 на фиг. 43A и 43B.
[498] В день 0 (сам день введения) и день 28 проводили чрескожную чреспеченочную биопсию для измерения уровня экспрессии мРНК ANGPTL3 в ткани печени. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol, следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[499] Уровень экспрессии мРНК ANGPTL3 в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК, применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулами миРНК экспрессии мРНК ANGPTL3 в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР ген GAPDH использовали в качестве гена внутреннего контроля, ANGPTL3 и GAPDH детектировали, применяя праймеры для HBV и GAPDH, соответственно.
[500] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 6E.
Таблица 6E. Последовательности праймеров для детектирования.
(SEQ ID NO: 242)
(SEQ ID NO: 243)
(SEQ ID NO: 244)
(SEQ ID NO: 245)
[501] Расчет экспрессии мРНК ANGPTL3 и соотношение ингибирования мРНК ANGPTL3 соответствовали Экспериментальному примеру (8-1). Контрольная группа представляла собой группу контрольных обезьян, которым вводили ФБР в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу обезьян, которым вводили различные конъюгаты миРНК, соответственно. Результаты представлены на фиг. 43A - 43C.
[502] По результатам на фиг. 43A - 43C можно увидеть, что для Конъюгата 169 выявили значимое снижение уровней ТГ и ингибирование экспрессии гена ANGPTL3, он снижал на 82,7% уровень мРНК гена ANGPTL3 в День 28 после введения.
Экспериментальный пример 9. Эксперимент по проверке действия конъюгатов миРНК, представленных в таблице 3F.
Экспериментальный пример 9-1. В данном эксперименте проиллюстрирована эффективность ингибирования конъюгатами миРНК, представленными в таблице 3F, экспрессии мРНК APOC3 in vivo.
[503] В данном экспериментальном примере исследовали соотношения ингибирования для Конъюгата 144 в отношении уровня экспрессии APOC3 в ткани печени трансгенных по APOC3 человека мышей (B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, приобретали в Jackson Lab) in vivo.
[504] Трансгенных по APOC3 человека мышей (возраст 6 - 8 недель, триглицерид > 2 ммоль/л) произвольно делили на группы (5 мышей в каждой группе). Конъюгаты 144 и Конъюгат 25 (в качестве сопоставимого конъюгата, так как миРНК в нем нацелена на полностью постороннюю мРНК) вводили мышам в каждой группе, соответственно. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, при этом дозировка составляла 1 мг/кг и 0,1 мг/кг (по количеству миРНК), соответственно, в виде 0,2 мг/мл и 0,02 мг/мл 0,9% по массе водного раствора NaCl и при объеме дозы 5 мл/кг для конъюгатов миРНК. Мышей умерщвляли в День 14 после введения. Печень собирали и хранили в RNA later (Sigma Aldrich), и ткань печени гомогенизовали с помощью гомогенизатора тканей. Затем общую РНК экстрагировали и получали, применяя Trizol (Thermo Fisher), следуя стандартной процедуре экстрагирования общей РНК.
[505] Уровень экспрессии мРНК APOC3 в ткани печени измеряли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. В частности, экстрагированную общую РНК обратно транскрибировали с получением кДНК, применяя набор для обратной транскрипции ImProm-II™ (Promega), в соответствии с инструкцией к набору, а затем измеряли эффективность ингибирования молекулами миРНК экспрессии мРНК APOC3 в ткани печени, применяя набор для флуоресцентной количественной ПЦР (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd). В данном способе флуоресцентной количественной ПЦР ген β-актина использовали в качестве гена внутреннего контроля и детектировали APOC3 и β-актин, применяя праймеры для APOC3 и β-актина, соответственно.
[506] Последовательности праймеров для детектирования представлены в таблице 7F.
Таблица 7F. Последовательности праймеров для детектирования.
(SEQ ID NO: 248)
(SEQ ID NO: 249)
(SEQ ID NO: 246)
(SEQ ID NO: 247)
[507] Экспрессию мРНК APOC3 рассчитывали с помощью уравнения: экспрессия мРНК APOC3 = (экспрессия мРНК APOC3 в тестируемой группе/экспрессия мРНК β-актина в тестируемой группе)/(экспрессия мРНК APOC3 в контрольной группе/экспрессия мРНК β-актина в контрольной группе) × 100%.
[508] Соотношение ингибирования для конъюгатов в отношении экспрессии мРНК APOC3 рассчитывали с помощью уравнения: соотношение ингибирования = [1-(экспрессия мРНК APOC3 в тестируемой группе/экспрессия мРНК β-актина в тестируемой группе)/(экспрессия мРНК APOC3 в контрольной группе/экспрессия мРНК β-актина в контрольной группе) × 100%. Здесь контрольная группа представляла собой группу контрольных мышей, которым вводили ФБР в данном эксперименте, и каждая тестируемая группа представляла собой группу мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК, соответственно. Результаты представлены на фиг. 44A.
[509] По результатам, представленным на фиг. 44A, можно увидеть, что Конъюгаты 144 проявили превосходную ингибиторную активность в отношении экспрессии гена APOC3 человека в трансгенных мышах in vivo.
Экспериментальный пример 9-2. В данном эксперименте проиллюстрировано влияние конъюгата миРНК в Конъюгатах 144 на содержание липидов в крови in vivo.
[510] В данном экспериментальном примере исследовали влияние in vivo конъюгата миРНК в Конъюгате 144 на содержание общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке трансгенных по APOC3 человека мышей (B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, приобретали в Jackson Lab).
[511] Трансгенных по APOC3 человека мышей (возраст 6 - 8 недель, содержание ТГ > 2 ммоль/л) произвольно делили на группы (7 мышей в каждой группе): (1) контрольную группу ФР; (2) группу 3 мг/кг Конъюгата 144; (3) группу 1 мг/кг Конъюгата 144. Дозировки лекарственного средства для всех животных рассчитывали в соответствии с массой тела. Разовую дозу вводили подкожно, соответственно, в виде 0,6 мг/мл и 0,2 мг/мл 0,9% по массе водного раствора NaCl в объеме 5 мл/кг для конъюгата миРНК.
[512] Кровь (приблизительно 100 мкл) брали из глазниц до введения (регистрировали как День 0) и в Дни 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63, 77, 91, 112, 133, 147, 154, 161, 175 и 189 после введения, соответственно, и центрифугировали с получением сыворотки. Содержание общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке дополнительно измеряли, применяя полностью автоматический биохимический анализатор сыворотки PM1P000/3 (SABA, Италия). Результаты для липидов крови нормировали, и нормированные уровни липидов крови, а также соотношение ингибирования для уровней липидов крови соответствовали таковым в Экспериментальном примере 8-3. Результаты тестов представлены на фиг. 44B и 44C.
[513] На фиг. 44B и 44C можно увидеть, что Конъюгат 144 оказал значимое понижающее действие на содержание ТГ и уровень ОХ в сыворотке мышей в течение вплоть до 189 дней, что свидетельствует о длительном, стабильном и эффективном ингибировании экспрессии гена APOC3 человека.
[514] В других экспериментах применяли описанный выше способ, за исключением того, что вводили Конъюгат 170, каждый при дозировке 0,1, 0,3, 1, 3 и 9 мг/кг (при одинаковом объеме дозы и измененной соответствующим образом концентрации конъюгатов в растворе); и данные собирали в течение до 112 дней после введения. Результаты представлены на фиг. 45A и 45B.
[515] По результатам на фиг. 45A и 45B можно увидеть, что Конъюгаты 170 могут непрерывно снижать уровень липидов крови и мРНК ANGPTL3 в трансгенных мышах in vivo в течение вплоть до 112 дней, и у указанного снижения наблюдается значимая зависимость от дозы.
[516] В других экспериментах применяли описанный выше способ для измерения содержания общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке мышей, за исключением того, что вводили Конъюгаты 144, 170 и 171, а также Сопоставимый конъюгат 4, каждый при дозировке 1 мг/кг и 3 мг/кг (при одинаковом объеме дозы и измененной соответствующим образом концентрации конъюгатов в растворе); и данные собирали в течение до 112 дней после введения. Результаты представлены на фиг. 46A - 46D.
[517] По результатам на фиг. 46A - 46D можно увидеть, что Конъюгаты 144, 170 и 171 проявили способность непрерывно снижать уровень липидов крови в трансгенных мышах в течение до 112 дней, и продолжительность такого снижения, в целом, была лучше по сравнению с Сопоставимым конъюгатом 4.
[518] Выше подробно описаны варианты реализации настоящего изобретения, но настоящее изобретение не ограничено конкретными подробностями описанных выше вариантов реализации. Можно сделать различные простые варианты технического решения настоящего изобретения в рамках объема технического принципа настоящего изобретения, и данные простые варианты входят в объем настоящего изобретения.
[519] Стоит отметить, что каждую из конкретных технических особенностей, описанных в вариантах реализации выше, можно комбинировать любым подходящим способом, если это не вызывает противоречия. Для того чтобы избежать ненужных повторений, различные возможные способы комбинирования более не описаны в настоящем описании.
[520] Кроме того, множество различных вариантов реализации настоящего изобретения также можно осуществить в любой комбинации, если это не противоречит идее настоящего изобретения, которые также должны расцениваться как раскрытие настоящего изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Suzhou Ribo Life Science Co.,Ltd.
<120> КОНЪЮГАТЫ И ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
<130> DP1P182407ZX
<150> CN201711479058.9
<151> 2017-12-29
<150> CN201811165363.5
<151> 2018-09-30
<160> 251
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa1
<400> 1
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 2
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1
<400> 2
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 3
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa2
<400> 3
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 4
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2
<400> 4
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 5
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa1M1
<400> 5
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 6
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M1
<400> 6
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 7
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa1M2
<400> 7
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 8
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M2
<400> 8
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa2M1
<400> 9
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 10
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M1
<400> 10
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 11
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa2M2
<400> 11
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 12
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M2
<400> 12
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 13
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa1M1S
<400> 13
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 14
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M1S
<400> 14
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 15
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa1M2S
<400> 15
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 16
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M2S
<400> 16
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 17
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa2M1S
<400> 17
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 18
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M1S
<400> 18
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 19
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBa2M2S
<400> 19
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 20
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M2S
<400> 20
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 21
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M1P1
<400> 21
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 22
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M2P1
<400> 22
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 23
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M1P1
<400> 23
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 24
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M2P1
<400> 24
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 25
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M1SP1
<400> 25
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 26
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa1M2SP1
<400> 26
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 27
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M1SP1
<400> 27
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 28
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBa2M2SP1
<400> 28
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 29
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBb1
<400> 29
ugcuaugccu caucuucua 19
<210> 30
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1
<400> 30
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 31
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2
<400> 31
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 32
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBb1M1
<400> 32
ugcuaugccu caucuucua 19
<210> 33
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M1
<400> 33
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 34
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M1
<400> 34
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 35
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBb1M2
<400> 35
ugcuaugccu caucuucua 19
<210> 36
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M2
<400> 36
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 37
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M2
<400> 37
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 38
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBb1M1S
<400> 38
ugcuaugccu caucuucua 19
<210> 39
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M1S
<400> 39
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 40
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M1S
<400> 40
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 41
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBb1M2S
<400> 41
ugcuaugccu caucuucua 19
<210> 42
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M2S
<400> 42
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 43
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M2S
<400> 43
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 44
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M1P1
<400> 44
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 45
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M1P1
<400> 45
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 46
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M2P1
<400> 46
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 47
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M2P1
<400> 47
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 48
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M1SP1
<400> 48
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 49
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M1SP1
<400> 49
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 50
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb1M2SP1
<400> 50
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 51
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBb2M2SP1
<400> 51
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 52
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBc1
<400> 52
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 53
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1
<400> 53
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 54
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBc1M1
<400> 54
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 55
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M1
<400> 55
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 56
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBc1M2
<400> 56
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 57
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M2
<400> 57
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 58
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBc1M1S
<400> 58
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 59
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M1S
<400> 59
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 60
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBc1M2S
<400> 60
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 61
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M2S
<400> 61
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 62
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M1P1
<400> 62
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 63
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M2P1
<400> 63
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 64
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M1SP1
<400> 64
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 65
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBc1M2SP1
<400> 65
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 66
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBd1
<400> 66
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 67
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1
<400> 67
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 68
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBd1M1
<400> 68
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 69
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M1
<400> 69
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 70
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBd1M2
<400> 70
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 71
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M2
<400> 71
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 72
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBd1M1S
<400> 72
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 73
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M1S
<400> 73
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 74
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siHBd1M2S
<400> 74
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 75
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M2S
<400> 75
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 76
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M1P1
<400> 76
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 77
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M2P1
<400> 77
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 78
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M1SP1
<400> 78
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 79
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siHBd1M2SP1
<400> 79
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 80
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN1
<400> 80
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 81
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1
<400> 81
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 82
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN2
<400> 82
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 83
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2
<400> 83
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 84
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN1M1
<400> 84
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 85
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M1
<400> 85
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 86
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN2M1
<400> 86
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 87
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M1
<400> 87
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 88
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M2
<400> 88
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 89
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M2
<400> 89
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 90
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN1M3
<400> 90
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 91
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN2M3
<400> 91
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 92
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN1M1S
<400> 92
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 93
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M1S
<400> 93
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 94
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN2M1S
<400> 94
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 95
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M1S
<400> 95
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 96
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M2S
<400> 96
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 97
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M2S
<400> 97
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 98
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN1M3S
<400> 98
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 99
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAN2M3S
<400> 99
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 100
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M1P1
<400> 100
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 101
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M1P1
<400> 101
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 102
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M2P1
<400> 102
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 103
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M2P1
<400> 103
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 104
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M1SP1
<400> 104
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 105
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M1SP1
<400> 105
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 106
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN1M3SP1
<400> 106
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 107
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAN2M3SP1
<400> 107
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 108
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP1
<400> 108
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 109
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1
<400> 109
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 110
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP2
<400> 110
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 111
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2
<400> 111
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 112
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP1M1
<400> 112
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 113
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M1
<400> 113
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 114
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP2M1
<400> 114
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 115
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M1
<400> 115
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 116
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP1M2
<400> 116
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 117
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M2
<400> 117
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 118
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP2M2
<400> 118
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 119
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M2
<400> 119
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 120
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP1M1S
<400> 120
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 121
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M1S
<400> 121
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 122
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP2M1S
<400> 122
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 123
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M1S
<400> 123
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 124
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP1M2S
<400> 124
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 125
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M2S
<400> 125
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 126
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для siAP2M2S
<400> 126
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 127
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M2S
<400> 127
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 128
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M1P1
<400> 128
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 129
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M1P1
<400> 129
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 130
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M2P1
<400> 130
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 131
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M2P1
<400> 131
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 132
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M1SP1
<400> 132
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 133
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M1SP1
<400> 133
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 134
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP1M2SP1
<400> 134
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 135
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для siAP2M2SP1
<400> 135
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 136
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M1P
<400> 136
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 137
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M2P
<400> 137
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 138
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa2M1P
<400> 138
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 139
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa2M2P
<400> 139
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 140
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M1SP
<400> 140
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 141
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M2SP
<400> 141
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 142
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa2M1SP
<400> 142
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 143
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa2M2SP
<400> 143
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 144
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBa1M3SP
<400> 144
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 145
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M4SP
<400> 145
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 146
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb1M1SP
<400> 146
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 147
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb2M1SP
<400> 147
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 148
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb1M2SP
<400> 148
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 149
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb2M2SP
<400> 149
uagaagauga ggcauagcau u 21
<210> 150
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBb1M3SP
<400> 150
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 151
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb1M4SP
<400> 151
uagaagauga ggcauagcag c 21
<210> 152
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBb4M1SP
<400> 152
gcugcuaugc cucaucuucu a 21
<210> 153
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBb4M1SP
<400> 153
uagaagauga ggcauagcag cgc 23
<210> 154
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBc1M1SP
<400> 154
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 155
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBc1M2SP
<400> 155
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 156
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBc1M3SP
<400> 156
ucugugccuu cucaucuga 19
<210> 157
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBc1M4SP
<400> 157
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 158
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBc2M1SP
<400> 158
cgucugugcc uucucaucug a 21
<210> 159
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBc2M1SP
<400> 159
ucagaugaga aggcacagac ggg 23
<210> 160
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBd1M1SP
<400> 160
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 161
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBd1M2SP
<400> 161
uugaagcgaa gugcacacgg u 21
<210> 162
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBd1M3SP
<400> 162
cgugugcacu ucgcuucaa 19
<210> 163
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBd1M4SP
<400> 163
ucagaugaga aggcacagac g 21
<210> 164
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBd2M1SP
<400> 164
accgugugca cuucgcuuca a 21
<210> 165
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBd2M1SP
<400> 165
uugaagcgaa gugcacacgg ucc 23
<210> 166
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M1P
<400> 166
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 167
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN2M1P
<400> 167
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 168
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M2P
<400> 168
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 169
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN2M2P
<400> 169
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 170
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M1SP
<400> 170
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 171
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN2M1SP
<400> 171
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 172
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M2SP
<400> 172
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 173
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN2M2SP
<400> 173
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 174
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M4S
<400> 174
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 175
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M4SP
<400> 175
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 176
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siAN1M5S
<400> 176
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 177
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M5S
<400> 177
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 178
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN1M5SP
<400> 178
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 179
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M1P
<400> 179
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 180
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP2M1P
<400> 180
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 181
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M2P
<400> 181
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 182
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP2M2P
<400> 182
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 183
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M1SP
<400> 183
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 184
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP2M1SP
<400> 184
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 185
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M2SP
<400> 185
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 186
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP2M2SP
<400> 186
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 187
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для mTTR
<400> 187
ccgtctgtgc cttctcatct 20
<210> 188
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для mTTR
<400> 188
taatctcctc ccccaactcc 20
<210> 189
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для GAPDH
<400> 189
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 190
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для GAPDH
<400> 190
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 191
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для b-актина
<400> 191
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 192
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для b-актина
<400> 192
ttctgaccca ttcccaccat caca 24
<210> 193
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для HBV
<400> 193
cgtttctcct ggctcagttt a 21
<210> 194
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для HBV
<400> 194
cagcggtaaa aagggactca a 21
<210> 195
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для AD-65695
<400> 195
acauauuuga ucagucuuuu u 21
<210> 196
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для AD-65695
<400> 196
aaaaagacug aucaaauaug uug 23
<210> 197
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для AD-69535
<400> 197
gcuuaaaagg gacaguauuc a 21
<210> 198
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для AD-69535
<400> 198
ugaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 199
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для ANGPTL3 мыши
<400> 199
gaggagcagc taaccaactt aat 23
<210> 200
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для ANGPTL3 мыши
<400> 200
tctgcatgtg ctgttgactt aat 23
<210> 201
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для GAPDH мыши
<400> 201
aactttggca ttgtggaagg gctc 24
<210> 202
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для GAPDH мыши
<400> 202
tggaagagtg ggagttgctg ttga 24
<210> 203
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для W8-siAN1M3SPs
<400> 203
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 204
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-simTTR
<400> 204
aacaguguuc uugcucuaua a 21
<210> 205
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-simTTR
<400> 205
uuauagagca agaacacugu uuu 23
<210> 206
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBa1M2Sps
<400> 206
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 207
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M2Sps
<400> 207
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 208
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10- siHBa1M2Sp
<400> 208
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 209
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10- siHBa1M2Sp
<400> 209
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 210
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBa1M1Sp
<400> 210
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 211
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M1Sp
<400> 211
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 212
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10- siHBa1M1SpsT
<400> 212
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 213
<211> 20
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10- siHBa1M1SpsT
<400> 213
uugaaguaug ccucaagguu 20
<210> 214
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siHBa1M1Sps
<400> 214
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 215
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siHBa1M1Sps
<400> 215
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 216
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для P10-siHBa1M2SP
<400> 216
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 217
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для P10-siHBa1M2SP
<400> 217
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 218
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для W8-siHBa1M2SP
<400> 218
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 219
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для W8-siHBa1M2SP
<400> 219
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 220
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для Z5-siHBa1M2SP
<400> 220
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 221
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для Z5-siHBa1M2SP
<400> 221
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 222
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siP1M1Sp
<400> 222
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 223
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siP1M1Sp
<400> 223
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 224
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siP1M1SP
<400> 224
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 225
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siP1M1SP
<400> 225
uauucguuga cauacuuucu u 21
<210> 226
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siAN2M1Sp
<400> 226
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 227
<211> 23
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAN2M1Sp
<400> 227
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
<210> 228
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siAP1M1Sp
<400> 228
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 229
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M1Sp
<400> 229
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 230
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для L10-siAP1M1Sps
<400> 230
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 231
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для L10-siAP1M1Sps
<400> 231
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 232
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для K4-simTTR
<400> 232
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 233
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для K4-simTTR
<400> 233
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 234
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для AD-66810
<400> 234
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 235
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для AD-66810
<400> 235
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 236
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для X2M2
<400> 236
ccuugaggca uacuucaaat t 21
<210> 237
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для X2M2
<400> 237
uuugaaguau gccucaaggt t 21
<210> 238
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для HBV
<400> 238
gtcttttggg ttttgctgcc 20
<210> 239
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для HBV
<400> 239
gcaacggggt aaaggttcag 20
<210> 240
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для b-актина
<400> 240
ggtcggagtc aacggattt 19
<210> 241
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для b-актина
<400> 241
ccagcatcgc cccacttga 19
<210> 242
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для ANGPTL3 обезьяны
<400> 242
ctggtggtgg catgatgagt 20
<210> 243
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для ANGPTL3 обезьяны
<400> 243
ctcttctccg ctctggctta g 21
<210> 244
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для GAPDH обезьяны
<400> 244
gggagccaaa agggtcatca 20
<210> 245
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для GAPDH обезьяны
<400> 245
cgtggactgt ggtcatgagt 20
<210> 246
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для b-актина мыши
<400> 246
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 247
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для b-актина мыши
<400> 247
ttctgaccca ttcccaccat caca 24
<210> 248
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для APOC3 человека
<400> 248
gtgaccgatg gcttcagttc 20
<210> 249
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для APOC3 человека
<400> 249
atggataggc aggtggactt 20
<210> 250
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая последовательность для сопоставимой последовательности 1
<400> 250
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 251
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловая последовательность для сопоставимой последовательности 1
<400> 251
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<---
Изобретение относится к соединению, обладающему структурой, представленной формулой (321). В формуле (321): n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4; каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10; каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, метила и этила; R4 представляет собой группу, способную связываться с активным лекарственным средством или активным агентом ковалентной связью, где активное лекарственное средство или активный агент представляет собой олигонуклеотид, а связь представляет собой фосфодиэфирную связь; каждый L1 представляет собой соединенную комбинацию по меньшей мере двух из групп A1, A4, A8, A10 и A11: где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20; каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20; и 
представляет собой место присоединения группы к остальной части молекулы; каждый S1 независимо представляет собой M1, в котором любой активный гидроксил, если он есть, защищен защитной группой для гидроксила; каждый M1 представляет собой лиганд, способный связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности клеток печени (ASGPR). Также предложены конъюгат, применение конъюгата и способ ингибирования экспрессии определенного гена в гепатоцитах. Изобретение позволяет получить конъюгат, который может специфично нацеливаться на гепатоциты, за счет чего эффективно решает задачи, связанные с доставкой лекарственных средств на основе олигонуклеотидов in vivo, и обладает низкой токсичностью и превосходной эффективностью доставки, при этом поддерживая высокую стабильность доставляемого олигонуклеотида. 4 н. и 31 з.п. ф-лы, 67 ил., 24 табл., 37 пр.
1. Соединение, обладающее структурой, представленной формулой (321):
Формула (321)
где
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, метила и этила;
R4 представляет собой группу, способную связываться с активным лекарственным средством или активным агентом ковалентной связью, где активное лекарственное средство или активный агент представляет собой олигонуклеотид, а связь представляет собой фосфодиэфирную связь;
каждый L1 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила), причем L1 представляет собой соединенную комбинацию по меньшей мере двух из групп A1, A4, A8, A10 и A11:
где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый Rb независимо представляет собой C1-C10 алкил; и
представляет собой место присоединения группы к остальной части молекулы;
каждый S1 независимо представляет собой M1, в котором любой активный гидроксил, если он есть, защищен защитной группой для гидроксила;
каждый M1 представляет собой лиганд, способный связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности клеток печени (ASGPR).
2. Соединение по п. 1, характеризующееся тем, что длина L1 составляет от 3 до 25 атомов, причем длина L1 относится к количеству образующих цепь атомов в L1 в наиболее длинной цепи атомов, образованной от атома, связанного с атомом N на азотистом остове, до атома, связанного с S1; или длина L1 составляет от 4 до 15 атомов.
3. Соединение по п. 1, характеризующееся тем, что каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 5; или m1 = m2 = m3.
4. Соединение по п. 1, характеризующееся тем, что каждый M1 независимо выбран из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-н-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы и L-4-тиорибозы.
5. Соединение по п. 1, характеризующееся тем, что R4 содержит первую функциональную группу, которая может реагировать с группой на олигонуклеотиде или нуклеотиде с образованием фосфоэфирной связи; или R4 дополнительно содержит вторую функциональную группу, которая способна образовывать ковалентную связь с гидрокси-группой или аминогруппой, или представляет собой твердофазную подложку, присоединенную к остальной части молекулы ковалентной связью, образованной гидрокси-группой или аминогруппой.
6. Соединение по п. 5, характеризующееся тем, что первая функциональная группа представляет собой фосфорамидит, гидрокси или защищенную гидрокси.
7. Соединение по п. 5, характеризующееся тем, что вторая функциональная группа представляет собой фосфорамидитную группу, карбоксил или карбоксилат.
8. Соединение по п. 5, характеризующееся тем, что указанное соединение имеет структуру, представленную формулой (403) - (442):
,
(403)
,
(404)
,
(405)
,
(406)
,
(407)
,
(408)
,
(409)
,
(410)
,
(411)
,
(412)
,
(413)
,
(414)
,
(415)
,
(416)
,
(417)
,
(418)
,
(419)
,
(420)
,
(421)
,
(422)
,
(423)
,
(424)
,
(425)
,
(426)
,
(427)
(428)
(429)
(430)
(431)
(432)
(433)
(434)
(435)
(436)
(437)
(438)
(439)
(440)
(441)
,
(442)
где X представляет собой O или NH, M+ представляет собой катион, Rk представляет собой защитную группу для гидрокси, SPS представляет собой твердофазную подложку.
9. Соединение согласно п. 8, характеризующееся тем, что M+ представляет собой катион щелочного металла, катион аммония, катион, образованный из третичного амина, или катион четвертичного аммония, Rk представляет собой тритил, 4-метокситритил, 4,4'-диметокситритил или 4,4',4''-триметокситритил, и SPS представляет собой смолу.
10. Соединение по п. 1, характеризующееся тем, что рецептор представляет собой рецептор на поверхности гепатоцитов; или рецептор дополнительно представляет собой асиалогликопротеиновый рецептор на гепатоцитах человека.
11. Конъюгат, имеющий структуру, представленную формулой (1):
Формула (1),
где
n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;
каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый из R10, R11, R12, R13, R14 и R15 независимо выбран из H, метила и этила;
R3 представляет собой активное лекарственное средство, причем R3 включает функциональный олигонуклеотид; или R3 представляет собой группу, имеющую структуру, представленную формулой A59:
(A59),
где E1 представляет собой OH, SH или BH2, и Nu представляет собой функциональный олигонуклеотид;
R2 представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 20 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и где R2 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила);
каждый L1 независимо представляет собой линейный алкилен длиной от 1 до 70 атомов углерода, в котором один или более атомов углерода необязательно заменены на любую одну или более групп, выбранных из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 алкенилена, C2-C10 алкинилена, C6-C10 арилена, C3-C18 гетероциклилена и C5-C10 гетероарилена, и при этом L1 необязательно замещен любым одним или более элементами группы, состоящей из: C1-C10 алкила, C6-C10 арила, C5-C10 гетероарила, C1-C10 галогеналкила, OC1-C10 алкила, OC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилOH, OC1-C10 галогеналкила, SC1-C10 алкила, SC1-C10 алкилфенила, -C1-C10 алкилSH, SC1-C10 галогеналкила, галогена, OH, -SH, NH2, C1-C10 алкилNH2, N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), NH(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкилфенила), NH(C1-C10 алкилфенила), циано, нитро, CO2H, C(O)OC1-C10 алкила, CON(C1-C10 алкил)(C1-C10 алкила), CONH(C1-C10 алкила), CONH2, NHC(O)(C1-C10 алкила), NHC(O)(фенила), N(C1-C10 алкил)C(O)(C1-C10 алкила), N(C1-C10 алкил)C(O)(фенила), C(O)C1-C10 алкила, C(O)C1-C10 алкилфенила, C(O)C1-C10 галогеналкила, OC(O)C1-C10 алкила, -SO2(C1-C10 алкила), -SO2(фенила), -SO2(C1-C10 галогеналкила), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 алкила), SO2NH(фенила), -NHSO2(C1-C10 алкила), -NHSO2(фенила) и NHSO2(C1-C10 галогеналкила), причем L1 представляет собой соединенную комбинацию по меньшей мере двух из групп A1, A4, A8, A10 и A11:
где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;
каждый Rb независимо представляет собой C1-C10 алкил; и
представляет собой место присоединения группы к остальной части молекулы;
каждый M1 представляет собой лиганд, способный связываться с асиалогликопротеиновыми рецепторами на поверхности клеток печени (ASGPR).
12. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что длина L1 составляет от 3 до 25 атомов; или длина L1 составляет от 4 до 15 атомов.
13. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что каждый из m1, m2 и m3 независимо представляет собой целое число от 2 до 5; или m1 = m2 = m3.
14. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что каждый M1 независимо представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид или полисахарид; или каждый M1 независимо выбран из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-н-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы и L-4-тиорибозы.
15. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что R2 образует фосфоэфирную связь с атомом P в R3.
16. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что конъюгат имеет структуру, представленную формулой (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21) или (22):
Формула (3)
Формула (4)
Формула (5)
Формула (6)
Формула (7)
Формула (8)
Формула (9)
Формула (10)
Формула (11)
Формула (12)
Формула (13)
Формула (14)
Формула (15)
Формула (16)
Формула (17)
Формула (18)
Формула (19)
Формула (20)
Формула (21)
.
Формула (22)
17. Конъюгат по п. 11, характеризующийся тем, что функциональный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК, микроРНК, анти-микроРНК, антагониста микроРНК, миметиков микроРНК, олигонуклеотидной ловушки, иммуностимулятора, G-квадруплекса, изменяющей сплайсинг, одноцепочечной РНК, антисмысловой нуклеиновой кислоты, аптамера нуклеиновой кислоты, РНК петля-на-стебле, фрагментов мРНК, активирующей РНК или ДНК.
18. Конъюгат по п. 17, характеризующийся тем, что функциональный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, атом P в формуле A59 связан с 3’-концом одноцепочечного олигонуклеотида; или функциональный олигонуклеотид представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий смысловую цепь и антисмысловую цепь, атом P в формуле A59 связан с 3’- концевым участком смысловой цепи.
19. Конъюгат по п. 17, характеризующийся тем, что каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; указанная миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем смысловая цепь содержит последовательность нуклеотидов 1, и антисмысловая цепь содержит последовательность нуклеотидов 2, обе из которых имеют длину 19 нуклеотидов, и которые по меньшей мере частично обратно комплементарны для образования двухцепочечного комплементарного участка; последовательность нуклеотидов 2 по меньшей мере частично комплементарна первому фрагменту последовательности нуклеотидов, который относится к фрагменту нуклеотида в целевой мРНК; и целевая мРНК относится к мРНК гена, который аберрантно экспрессируется в гепатоцитах.
20. Конъюгат по п. 19, характеризующийся тем, что целевая мРНК представляет собой мРНК, соответствующую ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV или HCV.
21. Конъюгат по п. 19, характеризующийся тем, что последовательность нуклеотидов 1 имеет такую же длину как и первый фрагмент последовательности нуклеотидов и отличается не более чем 3 нуклеотидами от первого фрагмента последовательности нуклеотидов; последовательность нуклеотидов 2 имеет такую же длину как и последовательность нуклеотидов B и отличается не более чем 3 нуклеотидами от последовательности нуклеотидов B, которая относится к последовательности нуклеотидов, полностью обратно комплементарной первому фрагменту последовательности нуклеотидов.
22. Конъюгат по п. 21, характеризующийся тем, что различия в нуклеотидах между последовательностью нуклеотидов 2 и последовательностью нуклеотидов B включают различие в положении первого нуклеотида Z' в последовательности нуклеотидов 2 в направлении от 5’-конца к 3’-концу.
23. Конъюгат по п. 22, характеризующийся тем, что смысловая цепь дополнительно содержит последовательность нуклеотидов 3, и антисмысловая цепь дополнительно содержит последовательность нуклеотидов 4; последовательности нуклеотидов 3 и 4 имеют идентичную длину, составляющую 1 - 4 нуклеотида; последовательность нуклеотидов 3 связана с 5’-концом последовательности нуклеотидов 1, и последовательность нуклеотидов 4 связана с 3’-концом последовательности нуклеотидов 2; последовательность нуклеотидов 4 комплементарна второму фрагменту последовательности нуклеотидов; второй фрагмент последовательности нуклеотидов относится к последовательности нуклеотидов, расположенной рядом с первым фрагментом последовательности нуклеотидов в целевой мРНК, и имеет такую же длину как последовательность нуклеотидов 4; и последовательность нуклеотидов 3 по существу обратно комплементарна или полностью обратно комплементарна последовательности нуклеотидов 4.
24. Конъюгат по п. 19 или 23, характеризующийся тем, что миРНК дополнительно содержит последовательность нуклеотидов 5, которая имеет длину 1 - 3 нуклеотида и связана с 3’-концом антисмысловой цепи, образуя, таким образом, 3’-липкий конец антисмысловой цепи.
25. Конъюгат по п. 19, характеризующийся тем, что каждый нуклеотид в смысловой и антисмысловой цепи независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид или не фтор-модифицированный нуклеотид, где модифицированный фтором нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному в результате замещения 2'-гидрокси-группы его рибозной группы фтор-содержащей группой; причем не фтор-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному в результате замещения 2'-гидрокси-группы его рибозной группы группой, отличной от фтора, или аналог нуклеотида, где указанный аналог нуклеотида относится к группе, способной заменить нуклеотид в нуклеиновой кислоте, при этом имеющей структуру, отличную от любого одного из рибонуклеотида аденина, рибонуклеотида гуанина, рибонуклеотида цитозина, рибонуклеотида урацила или дезоксирибонуклеотида тимина.
26. Конъюгат по п. 25, характеризующийся тем, что как смысловая, так и антисмысловая цепь содержит модифицированные фтором и не фтор-модифицированные нуклеотиды, указанные модифицированные фтором нуклеотиды присутствуют в последовательности нуклеотидов 1 и последовательности нуклеотидов 2, не более 5 модифицированных фтором нуклеотидов присутствуют в последовательности нуклеотидов 1, и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 в последовательности нуклеотидов 1 представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; не более 7 модифицированных фтором нуклеотидов присутствуют в последовательности нуклеотидов 2, и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 в последовательности нуклеотидов 2 представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.
27. Конъюгат по п. 25, характеризующийся тем, что каждый не фтор-модифицированный нуклеотид представляет собой модифицированный метокси-группой нуклеотид, причем модифицированный метокси-группой нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному в результате замещения 2'-гидрокси-группы его рибозной группы метоксигруппой.
28. Конъюгат по п. 19, характеризующийся тем, что в миРНК по меньшей мере одна фосфатная группа представляет собой фосфотиоатную группу, и фосфоротиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из следующих положений:
между первым нуклеотидом и вторым нуклеотидом с 5’-конца смысловой цепи;
между вторым нуклеотидом и третьим нуклеотидом с 5’-конца смысловой цепи;
между первым нуклеотидом и вторым нуклеотидом с 3’-конца смысловой цепи;
между вторым нуклеотидом и третьим нуклеотидом с 3’-конца смысловой цепи;
между первым нуклеотидом и вторым нуклеотидом с 5’-конца антисмысловой цепи;
между вторым нуклеотидом и третьим нуклеотидом с 5’-конца антисмысловой цепи;
между первым нуклеотидом и вторым нуклеотидом с 3’-конца антисмысловой цепи; и
между вторым нуклеотидом и третьим нуклеотидом с 3’-конца антисмысловой цепи.
29. Конъюгат по п. 19, характеризующийся тем, что нуклеотид на 5’-конце антисмысловой цепи представляет собой нуклеотид с 5’-фосфатом или модифицированный аналогом 5’-фосфата нуклеотид.
30. Применение конъюгата согласно любому из пп. 11-29 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения патологического состояния или заболевания, вызванного экспрессией определенного гена в гепатоцитах.
31. Применение по п. 30, характеризующееся тем, что определенный ген выбран из группы, состоящей из гена вируса гепатита B, гена подобного ангиопоэтину белка 3 и гена аполипопротеина C3.
32. Применение по п. 30, характеризующееся тем, что заболевание выбрано из группы, состоящей из хронического заболевания печени, гепатита, фиброза печени, пролиферативных заболеваний печени и дислипидемии.
33. Применение по п. 32, характеризующееся тем, что дислипидемия представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию или атеросклероз.
34. Способ ингибирования экспрессии определенного гена в гепатоцитах, включающий приведение в контакт конъюгата согласно любому из пп. 11-29 с гепатоцитами.
35. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что определенный ген представляет собой ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV или HCV.
| WO 2015188197 A2, 10.12.2015 | |||
| WO 2010012244 A1, 04.02.2010 | |||
| WO 2011154331 A1, 15.12.2011 | |||
| WO 2015015496 A1, 05.02.2015 | |||
| WO 2012139469 A1, 18.10.2012 | |||
| US 20150093444 A1, 02.04.2015 | |||
| WO 00/27795 A1, 18.05.2000 | |||
| RU 2013117285 A, 27.01.2015 | |||
| RU 2015133167 A, 06.03.2017. |
